Summary
Bu protokol, dışkı pelet üretimini ölçerek odun sıkıcı kabuklu Limnoria'nın beslenme oranını değerlendirmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem uzman olmayan laboratuvarlarda kullanılmak üzere tasarlanmıştır ve deniz koşullarında gelişmiş ahşap dayanıklılığını değerlendirmek için standart test protokollerine dahil olma potansiyeline sahiptir.
Abstract
Odun sıkıcı omurgasızlar, deniz kerestelerini ve ahşap kıyı altyapısını hızla yok ederek her yıl dünya çapında milyarlarca dolarlık hasara neden oluyor. Creosote ve kromlu bakır arsenat (CCA) gibi geniş spektrumlu biyositlere sahip ahşabın tedavileri artık mevzuat tarafından deniz kullanımında kısıtlandığı için, doğal olarak dayanıklı kereste türleri ve ahşabın yeni koruma yöntemleri gereklidir. Bu yöntemler, ahşap koruyucuların deniz borerlerine karşı test etmek için Avrupa standardı olan EN 275 gibi düzenleyici standartları karşılamak için testlerden geçer. Dayanıklı kereste türlerinin veya ahşap koruyucu tedavilerin ilk araştırması, tipik olarak maliyetli, uzun vadeli çabalar olan deniz sahası denemelerine göre birçok avantaj sunan laboratuvar testleri ile hızlı ve ucuz bir şekilde elde edilebilir. Birçok Limnoria türü (gribble) deniz odunu sıkıcı kabuklulardır. Limnoria , deniz odun borerleri tarafından ahşabın biyobozunurluğunun laboratuvar testlerinde, kovalarda yetiştirilmesinin pratikliği ve odundaki beslenme oranlarını ölçme kolaylığı nedeniyle kullanım için idealdir. Burada, kumlama kullanarak ahşap biyobozunurluğunu değerlendirmek için standart bir laboratuvar testi özetliyoruz.
Introduction
Ahşap borerler deniz savunması, iskeleler ve su ürünleri yapıları gibi deniz ahşap yapılarına büyük zarar verebilir; dünya çapında yılda milyarlarca dolara mal olan değiştirme veya restorasyon1,2,3. Bu yapıları korumak için, kereste genellikle biyobozunurluğunu azaltmak için tedavi edilir. Bununla birlikte, Avustralya, AB, İngiltere ve ABD'de geniş spektrumlu biyositlerin deniz ortamında kullanımının kısıtlanması nedeniyle, borerlere doğal olarak dayanıklı olan yeni modifikasyon teknikleri ve ahşap türleri 4,5,6,7'den sonra aranmaktadır. Deniz ortamında ahşabın korunmasına yönelik yeni teknikler, düzenleyici standartları karşılamak ve herhangi bir kimyasal koruyucunun sızması gibi tehlikelerden kaynaklanan çevresel etkileri sınırlamak için kapsamlı testler gerektirir. Örneğin, 1992'den kalma mevcut Avrupa standardı olan EN 275, deniz odun-borer hasarına karşı ahşap koruma tedavilerini değerlendirmek için kullanılır8,9. Bu standart, CCA4,5,6,7 ve creosote10 gibi biyosidal bileşiklerin kullanımına karşı diğer mevzuatlarla birlikte, sürdürülebilir, toksik olmayan ahşap koruma yöntemlerini ve biyosidal tedavilerin yerini almak için doğal olarak dayanıklı kereste türlerinin kullanılmasını gerektirir11,12 . EN 275'te belirtilenler gibi deniz denemeleri uzun pozlama süreleri gerektirir ve bu nedenle anlamlı sonuçlar vermek için pahalı ve yavaştır. Bununla birlikte, laboratuvar testleri, kereste ürünlerini deniz odun-borer saldırısına karşı koruma test yöntemlerine çok daha hızlı bir alternatif sunarak, tedavi programlarındaki ayarlamaların hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar13. Bu hızlı laboratuvar deneyinden elde edilen sonuçlar, ahşabın yeni modifikasyon süreçlerini bilgilendirmek ve doğal dayanıklılığı olan kereste türlerini borer hasarına belirlemek için tasarlanmıştır. Düşük bir beslenme oranı ve canlılık, potansiyel ürünlerde direncin arttığını gösterebilir ve bu bilgiler daha sonra tasarımları geliştirmelerine izin vermek için endüstri ortaklarına geri beslenebilir. Yöntemimiz, endüstride istenen çevik ve hızlı bir yanıt sağlar ve umut verici ürünler belirlendikten sonra, sonuçlar deniz denemelerinden elde edilenlerle desteklenebilir.
Gribbles (Limnoria), Limnoriidae familyasında bulunan bir izopod kabuklu cinsidir. İngiltere'de Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata ve Limnoria quadripunctata16 olmak üzere üç yaygın tür bulunan dünya çapında 13.14.15 Limnoria türü vardır. Deniz suyuna batırılmış ahşap yüzeyinde tüneller açtılar ve genellikle ekonomik olarak önemli hasara neden oldular. Gribbles kıyı İngiltere sularında oldukça boldur ve laboratuvar koşullarında bakımı kolaydır, bu da onları deniz odunu sıkıcı omurgasızlar tarafından ahşap biyobozunurluğunun incelenmesi için ideal organizmalar haline getirir. Gribbles'ın beslenme oranlarını ve canlılığını farklı kereste türleri ve ahşap koruma yöntemleri üzerinde değerlendirmek, biyobozunurluğa karşı dirençlerinin etkinliğini belirleyebilir. Aşağıdaki protokol, Borges ve meslektaşları tarafından açıklanandan geliştirilen gribble besleme oranlarını ölçmek için standart bir yöntem belirlemeye başlar12,17, ayrıca süreci uzman olmayan laboratuvarlarda çalıştırılamaz hale getirmek için görüntü analizinin başlatılmasını kolaylaştırır. Görüntü analizi, çok sayıda numunenin manuel olarak sayılmasının pratik sınırlamalarını azaltmak için de kullanılır. İngiliz EN350-1:1994 standardına göre uzun süreli deniz testlerinde dayanıklılık, Pinus sylvestris sapwood18'e atıfta bulunularak derecelendirilmektedir. Burada sunulan kısa süreli laboratuvar testinde, ekki (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), kayın (Fagus sylvatica L), tatlı kestane (Castanea sativa Mill) ve terebentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied) türlerinin kalp odunlarını test etmek için kontrol olarak İskoç çamı (Pinus sylvestris L) sapwood'u kullanıyoruz. Ortalama faekal pelet üretimi ve ahşap türleri başına sekiz kopya arasında canlılık dayanıklılığın bir göstergesi olarak kullanılmıştır. Limnoria quadripunctata gribble türleri ve doğal olarak dayanıklı kereste türleri kullanarak tipik bir değerlendirmeden toplanan açıklayıcı veriler sunuyoruz. Menzies (1951) tarafından sağlanan anahtarlar tarafından tanımlanan Limnoria quadripunctata, ailenin en iyi çalışılmış üyesi olması ve biyobozunurluk denemelerinde kullanılmak üzere bir model tür olarak iyi kurulmuş olması nedeniyle biyobozunurluk denemeleri için en uygun tür olarak seçildi. Bu protokol, kullanılan kontrolün aynı türün tedavi edilmemiş replikasyonları olması gerektiği halde, farklı tedavilerin ormanlarını test etmek için de geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Test Çubuklarının Hazırlanması
- Herhangi bir işlem işlemi tamamlandıktan sonra, kuru ahşabı 2 mm x 4 mm x 20 mm boyutlarında test çubukları halinde kesin (Şekil 1). Hava kuru, laboratuvar koşullarında sabit bir ağırlığa yapışır. Test edilen her ahşabın en az 5 çoğaltmasını kullanın.
Şekil 1: Gribble besleme oranlarını değerlendirmek için kısa süreli laboratuvar testlerinde kullanılan test çubukları. 2 mm x 4 mm x 20 mm boyutlarında test ahşap çubuklar. Soldan sağa: ekki, terebentin, tatlı kestane ve kayın kalp ağacı ve İskoç çam ağacı. Ölçek çubuğu 4 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Vakum Emprenye
- Ahşap hazırlama sonrası (yani, varsa kesme ve arıtma), çubukları gıda açısından güvenli bir plastik kapta, vakum kurutucunun içine bir ağın altına yerleştirin ve vakum yağı kaplaması ile kolaylaştırılan sıkı bir conta olmasını sağlayan kapağı değiştirin (Şekil 2).
- Kurutucu ve pompayı birbirine bağlayan boru arasına açık havaya giden üçüncü bir tüple üç yönlü bir vana takın (Şekil 2). Üç yönlü vananın havaya kapalı olduğundan emin olun ve vakum kurutucu içinde -0,75 ila -1,0 bar arasında bir vakum elde etmek için pompayı çalıştırın ve bu vakumu 45 dakika - 1 saat tutun.
- Üçüncü tüpün açık ucunun bir deniz suyu kabına batırın. Pompayı kapatın ve pompaya giden vanayı kapatın, ardından deniz suyu vakum tarafından kurutucuya çekilene kadar vanayı yavaşça açın. Suyun plastik kabı doldurana kadar akmasına izin verin, ağ seviyesinin üzerinde.
- Daha sonra tüpü konteynerdeki deniz suyundan çekin, kurutucu atmosferik basınca dönene kadar havanın girmesine izin verin. Çubukları plastik kabın dibine batana kadar ağın altına batırın.
Şekil 2: Laboratuvar besleme tahlilleri sırasında kum torbalarına beslenmeye hazırlık olarak ahşap çubukları deniz suyu ile emprenye etmek için kullanılan ekipman. A) Vakum kurutucu; B) Pompa; C) Vakum kurutucu için basınç göstergesi; D) Vakum kurutucu, pompa ve açık hava veya deniz suyuna (turuncu tüp) giden üç yönlü vana. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Liç Ahşap
- Deniz suyuna doymuş test çubuklarını 50 mL tüplerde bulunan deniz suyuna batırın (Şekil 3). Suyu 20 günlük bir süre için düzenli olarak değiştirin.
NOT: Liç işlemi, işlenmiş veya doğal ormanlar da dahil olmak üzere test edilen deneysel ahşaplar için geçerlidir.
- Deniz suyuna doymuş test çubuklarını 50 mL tüplerde bulunan deniz suyuna batırın (Şekil 3). Suyu 20 günlük bir süre için düzenli olarak değiştirin.
Şekil 3: Laboratuvar besleme tahlilleri sırasında kumsallara beslenmeye hazırlanmak için ahşap çubuklardan liç. Düzenli su değişimi (1-3 gün) ile 50 ml Falcon tüpünde bulunan deniz suyuna tamamen batırılmış ahşap, belirgin renkli liç üretti. Soldan sağa liç kalp ağacı; tatlı kestane, terebentin, ekki ve kayın ve İskoç çam sapwood. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Gribble Ayıklama
- Istila edilmiş bir ahşap bloktan tek tek gribble örnekleri çıkarın. Bir çift ince tokmak ve ince (000/0,4 mm veya daha küçük boyut) bir boya fırçası kullanın. Kumlu yuvayı kümeslerle kaplayan herhangi bir ahşabı dikkatlice soyun
NOT: Yuvalar ahşabın yüzeyinde bulunur ve küçük deliklerle tanımlanabilir (Şekil 4). - Kum dalaşı ortaya çıktıktan sonra, bireyleri alttan hafifçe almak ve deniz suyuyla dolu bir petri kabına biriktirmek için bir boya fırçası kullanın. Türleri tanımlamak ve ayıklanırken herhangi bir hasara yol açtığına emin olmak için mikroskop altında gribble'ı kontrol edin.
NOT: Pleopodları dövmek canlılık belirtisidir.- Gravid dişiler daha az beslenme kapasitesine sahip olduğu için yumurta kara düşünen dişileri atın.
Şekil 4: İki tipik havalandırma deliği ile bir gribble yuvası görüntüsü. L. Quadripunctata, 2 mm x 4 mm x 20 mm büyüklüğünde Radiata çam ağacının bir çubuğu üzerinde yuva. Yuva girişinin yanında iki küçük havalandırma deliği görülebilir. Ölçek çubuğu 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Limnoria quadripunctata'yı tanımlama
- Limnoria quadripunctata'yı stereomikroskop altında, beşinci pleonit19'daki X şeklindeki bir karineye ek olarak, kare desenli olarak düzenlenmiş dört farklı tüberkül tarafından tanımlayın (Şekil 5).
Şekil 5: Limnoria quadripunctata tanımlayıcı özellikler. Dorsal yüzey Limnoria quadripunctata görüntüsü, x20 büyütmede stereomikroskop üzerine çekilmiştir. Kırmızı okla gösterilen özellikleri tanımlamak - X şeklindeki karina ve mavi oku gösterir - pleotelson üzerinde dört tüberkül gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Kuyu Plakalarının Hazırlanması
- 20 mm çapında kuyulara sahip çok kuyulu plakalarda, kuyu başına 32-35 PSU arasında bir test çubuğu ve 5 mL filtresiz deniz suyu yerleştirin (Şekil 6).
- Her ahşap türünün plaka başına en az bir kez temsil edildiği şekilde, kuyu plakası boyunca sistematik olarak ahşap tedavileri / türleri yerleştirin. Kuyu başına bir gribble ekleyin.
NOT: Sıcaklık L türleri için 20 °C ± 2 °C'de bir inkübatörde sabit tutulmalıdır. quadripunctata, diğer Limnoria türleri, belirli türlere uyacak şekilde yapılan sıcaklık ayarlamaları ile kullanılabilir. - Fotoperiod'un gribble besleme oranı üzerinde bir etkisi olmadığı için plakaları sabit karanlık koşullarda tutun15.
Şekil 6: Gribble besleme tahlilleri için deneysel kurulum. Gribble besleme oranının laboratuvar testinde kullanılan 12 çok kuyulu plaka örneği. Her kuyuda 5 ml deniz suyu ve farklı ahşap türlerinden bir test çubuğu (20 mm x 4 mm x 2 mm) bulunur; İskoç Çam sapwood ve ekki, kayın, tatlı kestane ve terebentin kalp ağacı. Ölçek çubuğu 20 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Faecal Peletleri Toplamak ve Saymak ve Canlılığı Değerlendirmek.
- Haftada iki kez, test çubuğunu ve her bir gribble'ı (kuyu başına bir) kuyu plakasından çıkarın ve taze önceden hazırlanmış bir kuyu plakasına yerleştirin (kuyu başına 5 mL deniz suyu içerir [32-35 PSU, 18-22 °C]).
- Aktarmadan önce çubuktan herhangi bir faekal peletleri hafifçe fırçalamak ve faekal peletleri orijinal kuyuda tutmak için bir boya fırçası kullanın.
NOT: Gribble'ı taze bir kuyu plakasına aktarmadan önce, canlılık 1-5 ölçeğinde değerlendirilebilir; 1= ölü, 2 = pasif, ahşap üzerinde değil, 3 = aktif olarak yüzen veya dövülen pleopodlar, ahşap üzerinde değil, 4 = ahşabın yüzeyinde sürünme, 5 = ahşaba göm. - Görüntü İşleme
- Herhangi bir topak ayırmak için ince bir boya fırçası kullanın, böylece tek tek peletler görülebilir ve peletleri kuyunun kenarlarından uzağa fırçalayın. Stereo mikroskop altında, büyütme x4'te ayrıntılı bir fotoğraf çekin ve bir bilgisayara yükleyin (Şekil 7).
NOT: Peletlerin odakta olduğundan ve arka planın su yüzeyinde gölge veya ışık yansıması olmadan düzgün olduğundan emin olun.
- Herhangi bir topak ayırmak için ince bir boya fırçası kullanın, böylece tek tek peletler görülebilir ve peletleri kuyunun kenarlarından uzağa fırçalayın. Stereo mikroskop altında, büyütme x4'te ayrıntılı bir fotoğraf çekin ve bir bilgisayara yükleyin (Şekil 7).
Şekil 7: Gribble faecal peletlerin görüntüsü. L. quadripunctata faecal peletler (küçük, silindirik, kahverengi peletler) Radiata çam ağacı ile beslenmekten çok kuyulu bir tabakta. x4 büyütmede çekilmiş. Görüntü analizi için manipülasyondan önceki görüntüler (bkz. Şekil 7). A) ImageJ'de otomatik sayım için kullanılacak uygun bir görüntü örneği. Peletler yeterince yayılır ve kuyunun kenarlarından uzaklaşır. Kuyu ortalanmıştır ve herhangi bir engel veya yansıma yoktur. B) Görüntü analizi için uygun olmayan bir görüntü örneği. Kuyu ortadan kalkmış, alt yarısını kesiyor. Mavi (noktalı) daire, su yüzeyinden ışık yansımasını gösterir. Turuncu (katı) daire, birbirine çok yakın ve kuyunun kenarına çok yakın bir şekilde topaklanmış peletleri gösterir. Kırmızı (kesikli) daire, çıkarılmamış bir ahşap yonga gösterir. Ölçek çubuğu 10 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- ImageJ Kullanarak Faecal Pelet Sayısı Oluşturma İşlemi.
- ImageJ'i (03/08/21, 1.8.0_172 itibariyle en son sürüm) https://imagej.nih.gov/ij/download.html'den indirin veya bilgisayarın tarayıcısından çalıştırın.
- Sürükleyip bırakarak veya Dosya | seçerek görüntü yığınını karşıya yükleme | al Görüntü sırası | Göz atın. Parametreleri değiştirmeyin ve Tamam'ı seçin.
- Ardından, faekal peletleri içeren kuyunun alt bölümünü seçmek için daire aracını kullanın. Kuyu kenarlarını kaldırın, | Düzenle'yi seçin Dışarısı temiz. Görüntüyü ikili yap, İşlem |'nı seçin İkili yapın.
- Analiz | seçerek kalibre etme Ölçeği ayarlayın ve görüntü için milimetre başına piksel sayısını seçin (örneğin 10 piksel = 1 mm). Peletleri sayın, Analiz |'nı seçin Parçacıkları analiz edin.
- Boyut (birim2) yanındaki kutuda, daha önce ayarlanan birim ölçeğini kullanarak en küçük boyutlu peletle aynı olan bir alt eşik seçin (örneğin, 10 piksel = 1 mm ve en küçük pelet 0,5 mm ise, 5 sonsuzluğu seçin).
- Göster açılan kutusunda Anahatlar'ı seçin ve Özetle'yi işaretleyip Tamam'a basın (Şekil 8).
NOT: Daha fazla bilgi https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html
Şekil 8: ImageJ'de faekal peletleri saymak için kullanılan işlemin akış şeması. A) ImageJ'nin Dosya sekmesinde bir görüntü dizisi içe aktarma. B) Yerel bir cihazdan bir dizi görüntü almak için 'Görüntü Sırasını İçeri Aktar' iletişim kutusundaki gözat düğmesi. C) Faekal pelet içeren alanı seçmek için daire aracını kullanmak D) Seçili alanın dışını kaldırmak için düzenleme sekmesi alanındaki dış düğmeyi temizleyin. E) İşlem sekmesinde ikili düğme yapın. F) Analiz sekmesinde ölçek düğmesini ayarlayın. Piksel cinsinden uzaklık, piksel sayısının bir ölçü birimine (mm) eşdeğerdir. G) Analiz sekmesindeki parçacıkları analiz etme düğmesi. Boyut (birim^2), piksel cinsinden faecal pelet boyutunun alt eşiğine sonsuzluğa ayarlanır. 'Anahatları' göster ve 'özetle' seçilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
-
Veri Analizi
- Pelet sayılarını günde peletlere dönüştürün, bu da beslenme hızının dolaylı ve dolaylı ölçüsünü verir. Tüylenmenin meydana geldiği günlerde, herhangi bir ürküten kişiden gelen verileri atın (Şekil 9).
NOT: Tüylenme 1-3 gün içinde gerçekleşir ve dış iskeletin tam bir tüylenme görüldüğünde tanımlanabilir.
- Pelet sayılarını günde peletlere dönüştürün, bu da beslenme hızının dolaylı ve dolaylı ölçüsünü verir. Tüylenmenin meydana geldiği günlerde, herhangi bir ürküten kişiden gelen verileri atın (Şekil 9).
Şekil 9: Bir gribble moult örneği. Gribble (L. quadripunctata) tüylenme, 20 mm x 4 mm x 2 mm büyüklüğünde bir Radiata çam ağacı test çubuğu üzerinde. Moults kırmızı daireler tarafından gösterilir. Ölçek çubuğu 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'nin beslenme deneyi. quadripunctata 20 gün boyunca gerçekleştirildi, Kasım 2020'de beş farklı ahşap türü (İskoç çamı (Pinus sylvestris L) sapwood ve kayın ağacı (Fagus sylvatica L), ekki (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), tatlı kestane (Castanea sativa Mil) ve terebentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (Bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak. Ahşap türleri başına sekiz çoğaltma çubuğu kullanıldı ve bir Limnoria quadripunctata örneği çubuk başına beslendi. Tüm kumlamalar, İngiltere Portsmouth Üniversitesi Deniz Bilimleri Enstitüsü'nde akvaryumlarda tutulan hisse senetlerinden elde edildi. Hisse senetleri düzenli olarak İngiltere'nin güney kıyısından vahşi koleksiyonlarla desteklenmektedir. Hayvanlar, deneyden önce istikrarlı ve tutarlı kültür koşullarına iyi uyum içindedir. Ahşap çubuklar (20 mm x 4 mm x 2 mm) besleme denemesi öncesinde iki hafta boyunca deniz suyunda liçlenmiştir. Bir kumluk, bir test çubuğu ve 5 mL deniz suyu kuyu başına 12 çok kuyulu plakaya yerleştirildi ve 20 °C (± 0,2 °C) sabit koşullarda ve sabit karanlık koşullarda bir inkübatörde tutuldu. Faekal peletler her 2 ila 5 günde bir sayıldı ve toplandı, her koleksiyonda tam su değişiklikleri yapıldı. Her ahşap türünün sekiz çoğaltması kullanıldı ve her biri ayrı bir kumru ile toplam kırk çubuk verildi. Ahşabın sızması için kullanılan ve deney boyunca kullanılan deniz suyu, örneklerin arka tarafında kullanılan akvaryumdan doğrudan elde edildi. Deniz suyu koşulları akvaryumda ve inkübatörde stabildir. Kuyu başına kullanılan az miktardaki sudan buharlaşma, kuyu plakalarının kapak tasarımı ve her 2-5 günde bir meydana gelen tam su değişiklikleri ile en aza indiriliyor.
Peletler, Resim J (sürüm 1.8.0_112) kullanılarak otomatik olarak sayıldı.
Kontrol olarak İskoç çam sapwood ahşabı ile beslenen gribble, pelet üretiminin kayın tarafından ele geçirildiği 20. Ekki, test edilen tüm ahşap türlerinin günde en düşük faekal peletlerini üretti. İkinci en yüksek faekal pelet üretimi kayın üzerinde görülürken, onu tatlı kestane ve terebentin izledi. 5. günden 7. güne kadar tüm türlerde faekal pelet üretiminde artış oldu. Pelet üretimi, ekki dışındaki tüm türlerde, muhtemelen su değişimleri arasındaki sürenin artması nedeniyle 7. Bundan sonra, faekal pelet üretimi ahşap türlerinin her biri arasında oldukça tutarlı kaldı. 14. günden itibaren İskoç çamı günlük faekal pelet üretiminde azalırken, kayın arttı (Şekil 10).
Şekil 10: L. quadripunctata tarafından farklı ahşap türleri kullanılarak üretilen günlük faekal pelet sayısı (n=40) (ortalama ± SE), 20 gün boyunca. Terebentin, tatlı kestane, kayın ve ekki heartwood test edildi, İskoç çam sapwood kontrol olarak kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Skorun en yüksek canlılığı (5), ölen birey dışında İskoç çam ağacıyla beslenen çoğu bireyde görüldü. 5, ahşaba yuva yapmış hayvanları gösterir ve bu sadece İskoç çam ağacı ve kayın kalp ağacında görülmüştür. İskoç çamı için 12. Tatlı kestane en yüksek ölüm oranına sahipti, ancak zamanla artmadı. Yaşayan bireylerin geri kalanı, iki bireyin ahşaptan uzak olduğu 14. Ekki ve terebentin ayrıca, terebentin için 14. Mortalite, ahşap türlerinin hiçbirine zaman içinde bir artış göstermedi. Sadece yuvalamanın İskoç çamı ve kayın üzerinde arttığı görülürken, diğer üç ağaç türü çoğunlukla 4 canlılıkta kalmıştır (Şekil 11).
Şekil 11: Bireylerin zaman içinde canlılığı, çoğalanların bir yüzdesi olarak, farklı ahşap türlerinden besleniyor. Terebentin, tatlı kestane, kayın ve ekki heartwood test edildi, İskoç çam sapwood kontrol olarak kullanıldı. Ahşap türleri başına sekiz kopyadan, farklı canlılıklardaki yüzde 20 günlük deneysel süre boyunca çizildi. Koyu mavi 5 (yuvalama), açık mavi 4 (ahşap üzerinde), gri 3 (ahşap kapalı ama aktif), mor 2 (ahşap ve pasif) canlılık ve siyah 1 veya ölü bireylerin canlılığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu test yönteminin sonuçları, deniz odun-borer hasarına karşı direnci artan ahşap türlerini veya tedavilerini tanımlamak için kullanılabilir. Daha sonra, Avrupa Standardı EN 275'te açıklandığı gibi deniz saha denemeleri yapılabilir ve dayanıklı olmayan kontrol ahşabına kıyasla dayanıklılık derecelendirilebilir (0= 'saldırı yok', 1= 'hafif saldırı', 2= 'ılımlı saldırı', 3= 'şiddetli saldırı', 4='başarısızlık'20).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beslenme deneyinde kullanılacak gribble örneklerini seçmeden önce, bireyler uygunluklarını değerlendirmek için taranmalıdır. Boyut farklılıkları nedeniyle bireyler arasında beslenme oranında bazı farklılıklar olabilir, bu nedenle sadece tamamen yetişkin örnekler seçilmelidir. Borges ve ark., 200917 yılları arasında bireylerin beslenme oranı arasında 1,5 mm ile 3 mm uzunluğunda anlamlı bir fark saptanmıştır. Dişi Limnoria yumurtalarını kuluçkaya yakar, bu süre zarfında beslenme oranı azalır. Bu nedenle, herhangi bir kuluçka dişi, numuneleri seçerken kontrol edilmeli ve atılmalıdır. Benzer şekilde, tüylenme bireyleri de daha düşük bir beslenme oranına sahip olacaktır21. Bu nedenle, faekal pelet, bireylerin tüylerinin atıldığı günlerde sayılır17. Tüyler bir günden fazla sürdükçe, pelet toplama günlerinde tam bir dış iskelet moult görülebildiğinde tüyler sayılır. Limnoria, yuvalarını oluştururken, faekal pelet üretiminin artmasına sahiptir ve ayrıca daha fazla frass üretecektir (faekal peletlere dahil olmayan ince ahşap atıkları). Frass yüksek seviyeleri faekal peletlerin tanımlanmasını engelleyebilir, ancak otomatik sayım için görüntü yakalamadan önce bir pipet veya ince boya fırçası kullanılarak stereomikroskop gözlemi altında dikkatlice çıkarılabilir. Alternatif olarak, peletler manuel olarak sayılabilir.
ImageJ yazılımı, görüntü işleme için kaliteli, odakta görüntüler gerektirir. Bu amaçla, faekal peletlerin kuyu duvarları tarafından engellenmediği görüntüler yakalanmalı ve bireysel faekal peletleri ayırmak için bir boya fırçası kullanılmalıdır. Görüntünün arka planı, görüntü ImageJ'de işlenmek üzere ikiliye dönüştürüldüğünde müdahale edecek ışık veya gölge alanı olmadan tekdüze olmalıdır. Görüntü işlemeden önce kontrastı veya ışığı ayarlamaya gerek yoktur. Bir görüntü yığını içe aktarılırken, tüm fotoğrafların aynı düzlemde alınması gerekir, böylece işlem yaparken hata oluşmaz.
Deniz suyu ile ahşabı emprenye eden vakum, ahşabın batmasına ve kumlama için kolayca erişilebilir hale gelmesine neden olur. Ahşabı kumlamalara maruz bırakmadan önce liçleme, beslenme oranlarını etkileyebilecek veya mortaliteye neden olabilecek suda çözünen ekstraktifleri temizleyecektir12. Sudaki ekstraktiflere bağlı mortalite, ekstraktiflerin hızla seyreltileceği denizde beklenecek mortaliteyi temsil etmez. Kuyu plakaları, test edilen gribble türleri için en uygun olan sabit bir sıcaklıkta tutulmalıdır. Yaygın güney İngiliz türü, L. quadripunctata, 15 ila 25 ° C arasında iyi beslenir ve 20 ° C17'de optimum besleme oranına sahiptir, böylece iyi plakalar 0,5 ° C'± sabit bir inkübatörde rahatça tutulabilir.
Besleme kumluğunun canlılığını değerlendirmek, ahşap tedavilerinin veya doğal olarak dayanıklı kerestelerin alt veya ölümcül öncesi etkilerini algılar. 5'in yüksek canlılığı, gribble'ın ahşaba yuva yaparak doğal davranış sergilediğini ve onunla temastan olumsuz bir etkiye maruz kalmadığını gösterir. 4'lük bir canlılık, ahşaba gömülmemiş olsa da, gribble'ın yüzeyi boyunca sürünmesi için hala rahat olduğunu göstermektedir. Ahşap üzerinde olmayan, bunun yerine aktif olarak suda yüzen veya sabit olan ancak hızla atan bacaklar ve plepodlarla kumlama için 3 puan verilir. 2'nin düşük canlılığı, gribble'ın açığa çıkardığı ve/ veya çok az enerjiye sahip olduğu anlamına gelir. Bu, uzun süreli düşük beslenme hızından veya suya çiken veya besleme sırasında erişilebilir hale gelen ekstraktiflerden ortaya çıkabilir. 7-8 hafta sonra yüksek mortalite görülürse, aç kalan gribbles (sadece 5 ml deniz suyu ve odun olmadan kuyularda tutulur) bu uzun süre (kişisel gözlem) hayatta kalabileceğinden, bu açlıktan kaynaklanabilir.
Daha uzun süreli deniz sahası denemelerinin aksine kısa süreli bir laboratuvar testi kullanmanın yararları, yeni tedavilerin ve ahşap ürünlerinin ticari olarak kullanılma potansiyellerini belirlemek için hızla test edilebilmesidir. Ayrıca, bu tür tahliller tedavi süreçlerinin hızlı optimizasyonunu kolaylaştırabilir. Bir kontrol ahşabına kıyasla önemli ölçüde daha düşük bir faekal pelet üretimi görülürse, test deniz denemeleri ile desteklenebilir. Slevin ve ark., 201523 ve Westin ve ark., 201624, aynı ahşabı iki farklı ortamda test ederek laboratuvar ve saha değerlendirmeleri arasında iyi bir korelasyon göstermektedir ve bu da eskisinin yetenekli bir tahmin yeteneğini göstermektedir. Kısa süreli bir test birkaç hafta boyunca çalıştırılabilir. Aç kumlamalar, farklı orman türlerine mortalite yanıtını araştırırsanız ek karşılaştırma sağlayabilecek odun (kişisel gözlem) olmadan iyi havalandırılmış suda tutulduğunda 7-8 hafta hayatta kalabilir. Bununla birlikte, son, yayınlanmamış gözlemler yoluyla, ölüm oranının oluşmaya başladığı zamanlar dışında, 20 günden daha uzun bir süre boyunca faekal pelet üretiminde önemli bir dalgalanma yoktur. Buna ek olarak, Borges ve ark., 2008 ve 2009 tarafından kullanılanlar gibi önceki yöntemler 15 gün boyunca çalışır. Bu nedenle, 20 gün, ahşap dayanıklılığının endikasyonunun sağlanması için hızlı bir laboratuvar tabanlı test için yeterli bir süredir.
Bu yöntem kısa süreli denemeler için uygun olmakla birlikte, bulgular uzun süreli deniz sahası deneyleri ile tamamlanmalıdır. Laboratuvar koşulları, deniz ortamında ahşabı etkileyebilecek biyotik ve abiyotik faktörlerin çeşitliliğini çoğaltamaz. Biyofouling organizmalar, diğer deniz odun-borer türleri (gemi kurtları gibi) ile birlikte hala mevcut olabilir ve ahşaba zarar verebilir25,26. Ek olarak, dalga tarafından atılan zona veya kumdan kaynaklanan aşınma ahşabı aşındırabilir ve daha sonra gribbles27 için erişilebilir hale gelebilir. Bununla birlikte, standart bir laboratuvar yöntemi, deniz uygulamaları için umut vaat eden yeni ürünlerin ilk taramaını sağlayabilir. Faekal pelet üretimi ve canlılığı değerlendirilerek, gribble besleme oranını azaltmada daha iyi olan ormanlar tanımlanabilir.
CCA ve creosote gibi ahşap koruyucuların düzenlemeleri ve kısıtlamaları nedeniyle, bu tedavilerin yerini alacak yeni ürünler bulmak önemlidir. Kereste, deniz ortamında yüksek düzeyde biyobozunurluka maruz kalır, ancak hala mevcut en yenilenebilir inşaat malzemelerinden biridir ve deniz suyundaki gücünü ve yapısını iyi korur27,28. Sadece biyobozunurluklara dayanıklı kereste maliyetleri azaltmakla kalmayacak, aynı zamanda üretim sırasında yüksek enerji girişi gerektiren beton veya çelik gibi alternatif malzemeler veya çevredeki ekosistemi etkileyebilecek geniş spektrumlu biyosit koruyucular kullanmaktan daha çevre dostu olacak31,32,33,34,35,36, 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.
Acknowledgments
Norveç Araştırma Konseyi'ne (Oslo Bölge Fonu, Alcofur rffofjor 269707) ve Portsmouth Üniversitesi'ne (Fen Fakültesi Doktora araştırma bursları) Lucy Martin'in çalışmaları için fon sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca, temsili sonuçları elde etmek için kullanılan ahşabı sağlayan Gervais S. Sawyer'a. Terebentin British Columbia Üniversitesi'nden Prof. Philip Evans tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 150200 | |
| 50ml Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Adjustable volume pipette | Fisher Scientific | FBE10000 | 1-10 ml |
| Beech | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Fagus sylvatica | Taxonomic authority: L |
| Ekki | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Lophira alata | Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn. |
| Forceps | Fisher Scientific | 10098140 | |
| Incubator | LMS LTD | INC5009 | |
| Microporous specimen capsules | Electron Microscopy Sciences | 70187-20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Scots Pine | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Pinus sylvestris | Taxonomic authority: L. |
| Size 00000 paintbrush | Hobby Craft | 5674331001 | Size 000 or 0000 also acceptable |
| Sweet Chestnut | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Castanea sativa | Taxonomic authority: Mill |
| Turpentine | P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) | Syncarpia glomulifera | Taxonomic authority: (Sm.) Nied. |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific | 15544635 |
References
- Morrell, J. J. Protection of wood-based materials. Handbook of environmental degradation of materials, 3rd ed. Kutz, M. , Elsevier Science and Technology Books. Oxford. 343-368 (2018).
- Distel, D. L. The biology of marine wood boring bivalves and their bacterial endosymbionts. Wood deterioration and preservation. Goodell, B., Nicholas, D., Schultz, T. , American Chemical Society. Washington, D.C. 253-271 (2003).
- Buslov, V., Scola, P. Inspection and structural evaluation of timber pier: case study. Journal of Structural Engineering. 117 (9), 2725-2741 (1991).
- US EPA. Registration Eligibility Decision for Chromated Arsenicals. List A, Case No. 0132. US EPA - Office of prevention, pesticides and toxic substances. , Available from: https://swap.stanford.edu/20110202084/http://www.epa.gov/oppsrrd1/reregistration/REDs/cca_red.pdf 800-807 (2008).
- Arsenic timber treatments (CCA and arsenic trioxide) review scope document, Review series 03.1. ISSN number 1443. Australian pesticides and veterinary medicines authority. , Available from: https://apvma.gov.au/sites/default/files/publication/14296-arsenic-timber-review-scope.pdf (2003).
- Commission directive 2003/2/EC of 6 January 2003 relating to restrictions on the marketing and use of arsenic (tenth adaptation to technical progress to Council Deretive 76/769/EEC). Official Journal of the European Communities. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2003/2/adopted (2003).
- The Hazardous Waste (England and Wales) Regulations 2005 No.894. Environmental Protection England and Wales. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/uksi/2005/894/contents/made (2005).
- Palanti, S., Cragg, S. M., Plarre, R. Resistance against marine borers: About the revision of EN 275 and the attempt for a new laboratory standard for Limnoria. International Research Group on Wood Preservation, Document No. IRG/WP 20-20669. , (2020).
- The European Commission for Standardization. EN 275:1992. Wood preservatives- Determination of the protective effectiveness against marine wood borers. The European Commission for Standardization (CEN). , (1992).
- European Commission. Directive 98/8/EC concerning the placing of biocidal products on the market. Communication and Information Resource Centre for Administrations, Businesses and Citizens. , (2010).
- Mantanis, G. I. Chemical modification of wood by acetylation or furfurylation: A review of the present scaled-up technologies. BioResources. 12 (2), 4478-4489 (2017).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Bergot, J., Williams, J. R., Shayler, B., Sawyer, G. S. Laboratory screening of tropical hardwoods for natural resistance to the marine borer Limnoria quadripunctata: The role of leachable and non-leachable factors. Holzforschung. 62 (1), 99-111 (2008).
- Cragg, S. M., Pitman, A., Henderson, S. Developments in the understanding of the biology of marine wood boring crustaceans and in methods of controlling them. International Biodeterioration & Biodegradation. 43 (4), 197-205 (1999).
- Cookson, L. J., Vic, M. D. C.
- Cookson, L. Australasian species of Limnoriidae (Crustacea: Isopoda). Memoirs of the Museum of Victoria. 52 (2), 137 (1991).
- Jones, L. T. The geographical and vertical distribution of British Limnoria [Crustacea: Isopoda]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 43 (3), 589-603 (1963).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Busch, S. A laboratory assay for measuring feeding and mortality of the marine wood borer Limnoria under forced feeding conditions: A basis for a standard test method. International Biodeterioration & Biodegradation. 63 (3), 289-296 (2009).
- BSI Standards Publication. BS EN 350:2016. Durability of wood and wood-based products - Testing and classification of the durability to biological agents of wood and wood-based materials. BSI Standards Publication. , (2016).
- Menzies, R. The phylogeny, systematics, distribution, and natural history of limnoria. , University of Southern California. Dosctoal dissertation 196-208 (1951).
- Palanti, S., Feci, E., Anichini, M. Comparison between four tropical wood species for their resistance to marine borers (Teredo spp and Limnoria spp) in the Strait of Messina. International Biodeterioration & Biodegradation. 104, 472-476 (2015).
- Delgery, C. C., Cragg, S. M., Busch, S., Morgan, E. Effects of the epibiotic heterotrich ciliate Mirofolliculina limnoriae and moulting on the faecal pellet production by the wood-boring isopods Limnoria tripunctata and Limnoria quadripunctata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 334 (2), 165-173 (2006).
- Morrell, J. J., Helsing, G. G., Graham, R. D. Marine wood maintenance manual: a guide for proper use of Douglas-fir in marine exposures. Forest Research Laboratory. , Oregon State University. Corvallis. Research Bulletin 48 (1984).
- Slevin, C. R., Westin, M., Lande, S., Cragg, S. Laboratory and marine trials of resistance of furfurylated wood to marine borers. Eighth European Conference on Wood Modification. , Aalto University. 464-471 (2015).
- Westin, M., et al. Marine borer resistance of acetylated and furfurylated wood - results from up to 16 years of field exposure. International Research Group on Wood Preservation. , Document No. IRG/WP 16-40756 (2016).
- Westin, M., Rapp, A., Field Nilsson, T. Field test of resistance of modified wood to marine borers. Wood Material Science and Engineering. 1 (1), 34-38 (2006).
- Borges, L. M. S. Biodegradation of wood exposed in the marine environment: Evaluation of the hazard posed by marine wood-borers in fifteen European sites. International Biodeterioration & Biodegradation. 96 (1), 97-104 (2014).
- Treu, A., et al. Durability and protection of timber structures in marine environments in Europe: An overview. BioResources. 14 (4), 10161-10184 (2019).
- Williams, J. R., Sawyer, G. S., Cragg, S. M., Simm, J. A questionnaire survey to establish the perceptions of UK specifiers concerning the key material attributes of timber for use in marine and freshwater engineering. Journal of the Institute of Wood Science. 17 (1), 41-50 (2005).
- Purnell, P. The carbon footprint of reinforced concrete. Advances in Cement Research. 25 (6), 362-368 (2013).
- Hill, C. A. S. The environmental consequences concerning the use of timber in the built environment. Frontiers in Built Environment. 5, 129 (2019).
- Mercer, T. G., Frostick, L. E. Leaching characteristics of CCA-treated wood waste: a UK study. Science of the Total Environment. 427, 165-174 (2012).
- Brown, C. J., Eaton, R. A., Thorp, C. H. Effects of chromated copper arsenate (CCA) wood preservative on early fouling community formation. Marine Pollution Bulletin. 42 (11), 1103-1113 (2001).
- Brown, C. J., Eaton, R. A. Toxicity of chromated copper arsenate (CCA)-treated wood to non-target marine fouling communities in Langstone Harbour, Portsmouth, UK. Marine Pollution Bulletin. 42 (4), 310-318 (2001).
- Brown, C. J., Albuquerque, R. M., Cragg, S. M., Eaton, R. A. Effects of CCA (copper-chrome-arsenic) preservative treatment of wood on the settlement and recruitment of wood of barnacles and tube building polychaete worms. Biofouling. 15 (1-3), 151-164 (2000).
- Lebow, S. T., Foster, D. O., Lebow, P. K. Release of copper, chromium and arsenic from treated southern pine exposed in seawater and freshwater. Forest Products Journal. 49 (7), 80-89 (1999).
- Smith, P. T. Risk to human health and estuarine posed by pulling out creosote-treated timber on oyster farms. Aquatic Toxicology. 86 (2), 287-298 (2008).
- Brown, C. J., et al. Assessment of Effects of Chromated Copper Arsenate (CCA)-Treated Timber on Nontarget Epibiota by Investigation of Fouling Community Development at Seven European Sites. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45 (1), 0037-0047 (2003).
