Summary
Denne protokol præsenterer en metode til vurdering af fodringshastigheden for den træborende krebsdyr Limnoria ved at måle fækal pelletproduktion. Denne metode er designet til brug i ikke-specialiserede laboratorier og har potentiale til inkorporering i standard test protokoller, til at evaluere forbedret træ holdbarhed under marine forhold.
Abstract
Træborende hvirvelløse dyr ødelægger hurtigt skibstræ og trækystinfrastruktur og forårsager skader for milliarder af dollars rundt om i verden hvert år. Da behandlinger af træ med bredspektrede biocider, såsom creosot og kromateret kobberarsenat (CCA), nu er begrænset i havbrug ved lovgivning, er der behov for naturligt holdbare træarter og nye konserveringsmetoder for træ. Disse metoder underkastes test for at opfylde lovgivningsmæssige standarder, såsom den europæiske standard for afprøvning af træbeskyttelsesmidler mod havborere, EN 275. Indledende undersøgelse af holdbare træarter eller træbeskyttelsesbehandlinger kan opnås hurtigt og billigt gennem laboratorieundersøgelser, hvilket giver mange fordele i forhold til forsøg med havfelt, der typisk er dyre, langsigtede bestræbelser. Mange arter af Limnoria (gribble) er marine træ-kedelige krebsdyr. Limnoria er ideelle til brug i laboratorieundersøgelser af bionedbrydning af træ af marine træborere på grund af det praktiske i at opdrætte dem i akvarier og den nemme at måle deres fodringshastigheder på træ. Heri skitserer vi en standardiserbar laboratorietest til vurdering af trænedbrydning ved hjælp af gribble.
Introduction
Træborere kan forårsage omfattende skader på marine trækonstruktioner, såsom havforsvar, moler og akvakulturstrukturer; udskiftning eller restaurering, som koster milliarder af dollars om året på verdensplan1,2,3. For at beskytte disse strukturer behandles træ ofte for at reducere bionedbrydningen. På grund af begrænsningen af brugen af bredspektrede biocider i Australien, EU, DET FORENEDE KONGERIGE og USA i havmiljøet søges der imidlertid nye modifikationsteknikker og træarter, der er naturligt holdbare for borerne, efter 4,5,6,7. Nye teknikker til bevarelse af træ i havmiljøet kræver grundige undersøgelser for at opfylde de lovgivningsmæssige standarder og begrænse miljøpåvirkninger fra farer såsom udvaskning af kemisk konserveringsmiddel. F.eks. anvendes den europæiske standard, EN 275, som er den nuværende europæiske standard fra 1992, til at evaluere træbevarelsesbehandlinger mod skader på havtræsbor8,9. Denne standard kræver sammen med andre lovgivninger mod anvendelse af biocidholdige forbindelser, såsom CCA4, 5,6,7 og creosot10, bæredygtige, ikke-giftige metoder til træbeskyttelse og anvendelse af naturligt holdbare træarter til erstatning for biocidholdige behandlinger11,12 . Marineforsøg, som dem, der er angivet i EN 275, kræver lange eksponeringsperioder og er derfor dyre og langsomme til at give meningsfulde resultater. Laboratorieundersøgelser er imidlertid et meget hurtigere alternativ til testmetoder til konservering af træprodukter mod angreb fra marine træborer, hvilket muliggør en hurtig evaluering af justeringer af behandlingsplaner13. Resultaterne fra dette hurtige laboratorieforsøg er designet til at informere nye modifikationsprocesser af træ og til at identificere træarter med naturlig holdbarhed til borerskader. En lav fodringshastighed og vitalitet kan indikere øget modstand i potentielle produkter, og disse oplysninger kan derefter føres tilbage til industripartnere for at give dem mulighed for at forbedre design. Vores metode giver mulighed for en adræt og hurtig reaktion, der er ønskelig i industrien, og når lovende produkter er blevet identificeret, kan resultaterne suppleres med resultaterne fra marine forsøg.
Gribbles (Limnoria) er en slægt af isopod krebsdyr i familien Limnoriidae. Der er over 60 arter af Limnoria på verdensplan13,14,15, med tre almindelige arter findes i Storbritannien, Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata og Limnoria quadripunctata16. De bar tunneler på overfladen af træ, der er nedsænket i havvand, ofte forårsager økonomisk betydelig skade. Gribbles er meget rigelige i kystnære britiske farvande og er nemme at vedligeholde under laboratorieforhold, hvilket gør dem ideelle organismer til undersøgelse af trænedbrydning af marine træborende hvirvelløse dyr. En vurdering af foderprocenten og gribbles' levedygtighed på forskellige træarter og træbevarelsesmetoder kan bestemme effekten af deres modstandsdygtighed over for bionedbrydning. Følgende protokol indeholder en standardmetode til måling af gribble fodringshastigheder, der er udviklet ud fra den, der er beskrevet af Borges og kolleger12,17, ud over at strømline indførelsen af billedanalyse for at gøre processen anvendelig i ikke-specialiserede laboratorier. Billedanalyse bruges også til at reducere de praktiske begrænsninger ved manuelt at tælle et stort antal prøver. Holdbarhed i langsigtede marine test, i henhold til den britiske Standard EN350-1:1994, er klassificeret med henvisning til Pinus sylvestris sapwood18. I den kortsigtede laboratorieundersøgelse, der præsenteres her, bruger vi skotsk fyr (Pinus sylvestris L) sapwood som en kontrol til at teste kernetræ af arten ekki (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), bøg (Fagus sylvatica L), sød kastanje (Castanea sativa Mill) og terpentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied). Gennemsnitlig fækal pelletproduktion og vitalitet blandt otte gentagelser pr. træart blev brugt som indikator for holdbarhed. Vi leverer illustrative data indsamlet fra en typisk evaluering ved hjælp af gribble art Limnoria quadripunctata og en række naturligt holdbare træarter. Limnoria quadripunctata, identificeret ved nøglerne fra Menzies (1951), blev valgt som den optimale art til bionedbrydningsforsøg på grund af det faktum, at det er det mest veloplærte medlem af familien og er veletableret som en modelart til brug i bionedbrydningsforsøg. Denne protokol gælder også for afprøvning af træsorter af forskellige behandlinger, selv om den anvendte kontrol bør være ubehandlede replikationer af samme art.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af testpinde
- Når alle behandlingsprocesser er afsluttet, skæres tørt træ i testpinde til størrelse 2 mm x 4 mm x 20 mm (figur 1). Lufttørring klæber til en konstant vægt under laboratorieforhold. Brug mindst 5 kopier af hvert træ, der testes.
Figur 1: Testpinde, der anvendes til kortvarig laboratorieundersøgelser til at vurdere gribble fodringshastigheder. Test træpinde størrelse 2 mm x 4 mm x 20 mm. Fra venstre mod højre: ekki, terpentin, sød kastanje og bøg kernetræ og skotsk fyrretræ. Skalalinje 4 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Vakuumimprægnering
- Efterbehandling af træ (dvs. skæring og behandling, hvis det er relevant), skal du placere pinde under et net i en fødevaresikker plastbeholder inde i vakuumafsikkatoren og udskifte låget for at sikre, at der er en tæt forsegling, lettet af en belægning af vakuumfedt (figur 2).
- Fastgør en trevejsventil mellem slangen, der forbinder udtørreren og pumpen, med et tredje rør, der fører til fri luft (figur 2). Sørg for, at trevejsventilen er lukket for luften og kør pumpen for at opnå et vakuum på mellem -0,75 til -1,0 stang i vakuumafsikkatoren og hold dette vakuum i 45 minutter - 1 time.
- Dyk den åbne ende af det tredje rør ned i en beholder med havvand. Sluk for pumpen, og luk ventilen, der fører til pumpen, og åbn derefter langsomt ventilen, indtil havvandet trækkes af vakuumet ind i udtørreren. Lad vandet flyde, indtil det fylder plastbeholderen, over maskens niveau.
- Træk derefter røret ud af havvandet i beholderen, så luften kan komme ind, indtil udtørreren vender tilbage til atmosfærisk tryk. Hold pindene nedsænket under masken, indtil de synker til bunden af plastbeholderen.
Figur 2: Udstyr, der anvendes til at støvsuge imprægnerede træpinde med havvand som forberedelse til fodring til gribbles under en laboratoriefodringsanalyse. A) Vakuumafsikkator; B) Pumpe; C) Trykmåler for vakuumafsikkatoren; D) Den trevejsventil, der fører til vakuumafsikkatoren, pumpen og til udendørs eller havvand (orange rør). Klik her for at se en større version af dette tal.
- Udvaskning træ
- Dyk havvandsmættede testpinde i havvand indeholdt i 50 mL-rør (figur 3). Udskift vandet regelmæssigt i en periode på 20 dage.
BEMÆRK: Udvaskningsprocessen gælder for forsøgstræ, der er under test, herunder behandlet eller naturlig træ.
- Dyk havvandsmættede testpinde i havvand indeholdt i 50 mL-rør (figur 3). Udskift vandet regelmæssigt i en periode på 20 dage.
Figur 3: Perkotel fra træpinde til forberedelse til fodring til gribbles under en laboratoriefodringsanalyse. Træ, der var helt nedsænket i havvand indeholdt i en 50 ml Falcon rør, med regelmæssig vandforandlse (1-3 dage), produceret tydeligt farvet perkoat. Fra venstre mod højre udvasken fra kernetræ af; sød kastanje, terpentin, ekki, og bøg og skotsk fyrretræ. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Udvinding af Gribble
- Uddrag enkelte prøver af gribble fra en inficeret træblok. Brug et par fine sammenkrøpper og en tynd (størrelse 000/0,4 mm eller mindre) pensel. Skræl forsigtigt alt træ, der dækker gribblegraven med sammentøverne
BEMÆRK: Burrows findes på overfladen af træ og kan identificeres ved små huller (figur 4). - Når gribble er blevet udsat, skal du bruge en pensel til forsigtigt at afhente personer nedefra og deponere i en petriskål fyldt med havvand. Kontroller, at der er tale om en fejl under et mikroskop for at identificere arter og for at sikre, at der ikke skete skade under udvinding.
BEMÆRK: At slå pleopoder er et tegn på vitalitet.- Kassér alle hunner rugende æg som gravid hunner har en reduceret fodringskapacitet.
Figur 4: Billede af en gribble burrow med to typiske ventilationshuller. L. quadripunctata burrow på en pind radiata fyrretræ, størrelse 2 mm x 4 mm x 20 mm. To mindre ventilationshuller kan ses ved siden af gravindgangen. Skalalinje 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Identifikation af Limnoria quadripunctata
- Identificer Limnoria quadripunctata under et stereomikroskop af de fire forskellige tuberkler, arrangeret i et firkantet mønster, på dyrets pleotelson ud over en X-formet carina på den femte pleonit19 (Figur 5).
Figur 5: Limnoria quadripunctata identificerende funktioner. Billede af dorsal overflade Limnoria quadripunctata, taget på et stereomikroskop ved x20 forstørrelse. Identifikationsfunktioner vist med rød pil - angiver den X-formede carina og blå pil - angiver fire tuberkler på pleotelson. Skalalinje 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Forberedelse af brøndplader
- I multi-brønd plader med brønde af diameter 20 mm, placere en testpind og 5 mL ufiltreret havvand, mellem 32-35 PSU, per brønd (Figur 6).
- Placer behandlinger/træarter systematisk i hele brøndpladen, så hver type træ er repræsenteret mindst én gang pr. plade. Tilføj en gribble per brønd.
BEMÆRK: Temperaturen skal holdes stabil i en inkubator ved 20 °C ± 2 °C for arten L. quadripunctata, andre arter af Limnoria kan bruges med justeringer af temperaturen, der passer til de specifikke arter. - Hold pladerne under konstante mørke forhold, da fotoperioden ikke har en effekt på gribble fodringshastighed15.
Figur 6: Eksperimentel opsætning til gribble fodringsanalyse. Et eksempel på en 12 multi-brønd plade, der anvendes i laboratoriet test af gribble fodring sats. Hver brønd indeholder 5 ml havvand og en testpind (20 mm x 4 mm x 2 mm) af forskellige træarter; Scots Pine sapwood og ekki, bøg, sød kastanje og terpentin kernetræ. Skalalinje 20 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Indsamling og optælling af fækale pellets og vurdering af vitalitet.
- To gange om ugen skal prøvepinden og hver gribble (en pr. brønd) fjernes fra brøndpladen og placeres i en friskforberedt brøndplade (indeholdende 5 mL havvand pr. brønd (32-35 PSU, 18-22 °C]).
- Brug en pensel til forsigtigt at børste eventuelle fækale pellets fra pinden, før du overfører og bevare fækale pellets i den oprindelige brønd.
BEMÆRK: Før gribblen overføres til en frisk brøndplade, kan vitaliteten vurderes på en skala fra 1-5; 1= død, 2 = passiv, ikke på træet, 3 = aktivt svømning eller slå pleopoder, ikke på træet, 4 = kravle på overfladen af træet, 5 = gravet ind i træet. - Billedbehandling
- Brug en fin pensel til at adskille eventuelle klumper, så de enkelte pellets er synlige og børste pellets væk fra selve kanterne af brønden. Tag et detaljeret fotografi under et stereomikroskop ved forstørrelse x4, og overfør til en computer (figur 7).
BEMÆRK: Sørg for, at pellets er i fokus, og baggrunden er ensartet, uden skygger eller lys refleksioner på overfladen af vandet.
- Brug en fin pensel til at adskille eventuelle klumper, så de enkelte pellets er synlige og børste pellets væk fra selve kanterne af brønden. Tag et detaljeret fotografi under et stereomikroskop ved forstørrelse x4, og overfør til en computer (figur 7).
Figur 7: Billede af gribble fækale pellets. L. quadripunctata fækale pellets (små, cylindriske, brune pellets) fra fodring på Radiata fyrretræ i en brønd af en multi-brønd plade. Taget ved x4 forstørrelse. Billeder før manipulation til billedanalyse (se figur 7). A) Eksempel på et passende billede, der skal bruges til automatiseret optælling i ImageJ. Pellets er tilstrækkeligt spredt ud og væk fra kanterne af brønden. Brønden er centreret, og der er ingen forhindringer eller refleksioner. B) Et eksempel på et billede, der er uegnet til billedanalyse. Brønden er off-center, afskære den nederste halvdel. Blå (prikket) cirkel viser lys refleksion fra vandets overflade. Orange (solid) cirkel viser pellets, der er klumpet for tæt sammen og for tæt på kanten af brønden. Rød (stiplet) cirkel viser en flis, der ikke blev fjernet. Skalalinje 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Proces til generer fækal pellettælling ved hjælp af ImageJ.
- Hent ImageJ (seneste version fra 21.03.08-21 af 1.8.0_172) fra https://imagej.nih.gov/ij/download.html eller kør fra computerens browser.
- Overføre en stak billeder ved at trække og slippe eller ved at vælge Fil | Importer | Billedsekvens | Gennemse. Du må ikke ændre nogen parametre, og vælg derefter Okay.
- Brug derefter cirkelværktøjet til at vælge den nederste del af brønden, der indeholder fækale pellets. Fjern brøndkanterne, vælg Rediger | Klar udenfor. Gør billedet binært, vælg | Gør binær.
- Kalibrer ved at vælge Analyse | Angiv skalaen , og vælg antallet af pixel pr. millimeter for billedet (f.eks. 10 pixel = 1 mm). Tæl pellets, vælg Analyse | Analyser partikler.
- I boksen ud for Størrelse (enhed2) skal du vælge en lavere tærskel, der er den samme som den mindste størrelse pellet, ved hjælp af enhedsskalaen, der er sat tidligere (hvis 10 pixels = 1 mm og den mindste pellet er 0,5 mm, skal du vælge 5-uendelig).
- Vælg Dispositioner på rullelisten Vis, og sæt derefter kryds i Oversigt, og tryk på Okay (figur 8).
BEMÆRK: Yderligere oplysninger kan findes på https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html
Figur 8: Et flowdiagram over den proces, der bruges i ImageJ til at tælle fækale pellets. A) Import af en billedsekvens under fanen Filer i ImageJ. B) Knappen Gennemse i dialogboksen 'Importer billedsekvens' for at importere en sekvens af billeder fra en lokal enhed. C) Brug cirkelværktøjet til at vælge område, der indeholder fækale pellets D) Ryd knappen udenfor i redigeringsfaneområdet for at fjerne uden for det markerede område. E) Opret binær knap under knappen Proces. F) Angiv skalering under fanen Analyse. Afstand i pixel svarer til antallet af pixel til én måleenhed (mm). G) Knappen Analyser partikler under fanen Analyse. Størrelse (enhed^2) indstillet til den nedre tærskel for fækal pelletstørrelse, i pixel, til uendeligt. Vis 'dispositioner' og 'oversigter' er valgt. Klik her for at se en større version af dette tal.
-
Dataanalyse
- Konverter pellet tæller til pellets om dagen, hvilket giver og indirekte måling af fodringshastighed. Kassér data fra alle personer, der fældede, på de dage, hvor fældning fandt sted (figur 9).
BEMÆRK: Moulting forekommer over 1-3 dage og kan identificeres, når en fuld moult af exoskelet kan ses.
- Konverter pellet tæller til pellets om dagen, hvilket giver og indirekte måling af fodringshastighed. Kassér data fra alle personer, der fældede, på de dage, hvor fældning fandt sted (figur 9).
Figur 9: Eksempel på en gribble moult. Gribble (L. quadripunctata) moulting, på en Radiata fyrretræ test stick størrelse 20 mm x 4 mm x 2 mm. Moults er angivet med røde cirkler. Skalalinje 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et fodringseksperiment af L. quadripunctata blev udført over 20 dage ved hjælp af fem forskellige træsorter (skotsk fyr (Pinus sylvestris L) saflap og bøgens hjertetræ (Fagus sylvatica L), ekki (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), sød kastanje (Castanea sativa Mil) og terpentin (Syncarpia glomulifera (Sm) Neid)) (Se materialebordet) i november 2020. Otte replika pinde blev brugt pr træarter og en prøve af Limnoria quadripunctata blev fodret pr pind. Alle gribble blev erhvervet fra bestande, der opretholdes i akvarier på Institute of Marine Sciences, University of Portsmouth, UK. Lagre suppleres regelmæssigt med vilde samlinger fra Englands sydkyst. Dyr akklimatiseres godt til de stabile og konsekvente kulturforhold forud for eksperimentet. Træpinde (20 mm x 4 mm x 2 mm) blev udvasket i havvand i to uger før fodringsforsøget. En gribble, en prøvepind og 5 mL havvand blev anbragt pr. brønd i en 12 multi-brønd plade og opbevaret i en inkubator under stabile forhold på 20 °C (± 0,2 °C) og under konstante mørke forhold. Fækale pellets blev talt og indsamlet hver 2 til 5 dage, med fuld vand ændringer på hver samling. Otte kopier af hver træart blev brugt, hvilket giver i alt fyrre pinde med en individuel gribble hver. Havvand, der anvendes til udvaskning af træ og anvendes i hele eksperimentet blev opnået direkte fra akvariet bruges til bageste prøver. Havvandsforhold er stabile i akvariet og stabile i inkubatoren. Fordampning fra den lille mængde vand, der anvendes pr. brønd, minimeres af lågdesignet af brøndpladerne og ændringer i fuld vand, der sker hver 2-5. dag.
Pellets blev talt automatisk ved hjælp af Billede J (version 1.8.0_112).
Gribble fodring på skotsk fyrretræ træ som en kontrol, produceret de mest fækale pellets om dagen konsekvent, bortset fra på dag 20, hvor pellet produktion blev overhalet af bøg. Ekki producerede de laveste fækale pellets om dagen af alle de testede træarter. Den næsthøjeste fækale pelletproduktion blev set på bøg efterfulgt af sød kastanje og terpentin. Der var en stigning i fækal pellet produktion i alle arter fra dag 5 til dag 7. Pelletproduktionen faldt i alle arter, bortset fra ekki, mellem dag 7 og dag 12, muligvis på grund af den øgede tid mellem vandforandringer. Derefter forblev fækal pelletproduktion ret konsistent blandt hver af træarterne. Fra dag 14 faldt skotsk fyr i den daglige fækale pelletproduktion, mens bøgen steg (figur 10).
Figur 10: Antal fækale pellets pr. dag (n=40) (gennemsnit ± SE), der produceres af L. quadripunctata ved hjælp af forskellige træarter, over 20 dage. Terpentin, sød kastanje, bøg og ekki kernetræ testet, med skotsk fyrretræ, der anvendes som en kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den højeste vitalitet score (5) blev set hos de fleste individer fodring på skotsk fyrretræ, bortset fra den ene døde person. 5 angiver dyr, der har gravet sig ned i skoven, og dette blev kun set på skotsk fyrretræ og bøgetræ. Ved dag 12 for skotsk fyr og dag 20 for bøg havde alle levende individer gravet sig ned i træet. Sød kastanje havde den højeste procent dødelighed, men steg ikke over tid. Resten af levende individer opholdt sig i en vitalitet på 4 (kravlende på træoverfladen), bortset fra på dag 14, hvor to personer var væk fra træet (vitalitet på 3). Ekki og terpentin havde også de fleste individer på en vitalitet på 4 i løbet af eksperimentet, bortset fra på dag 14 og dag 5 for terpentin. Dødeligheden viste ikke en stigning over tid på tværs af nogen af træarterne. Kun gravende blev set at stige på skotsk fyr og bøg, mens de tre andre træarter for det meste forblev på en vitalitet på 4 (figur 11).
Figur 11: Enkeltpersoners vitalitet over tid, som en procentdel af replikter, fodring på forskellige træarter. Terpentin, sød kastanje, bøg og ekki kernetræ testet, med skotsk fyrretræ, der anvendes som en kontrol. Af otte gentagelser pr. træart blev procentdelen ved forskellige vitaliteter afbildet i løbet af den 20-dages forsøgsperiode. Mørkeblå repræsenterer en vitalitet på 5 (gravende), lyseblå en vitalitet på 4 (på træ), grå en vitalitet på 3 (off træ, men aktiv), lilla en vitalitet på 2 (off træ og passiv) og sort viser en vitalitet på 1 eller døde individer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Resultater fra denne testmetode kan bruges til at identificere træsorter eller behandlinger, der har en øget modstandsdygtighed over for marine træborerskader. Derefter kan marine feltforsøg, som beskrevet i den europæiske Standard EN 275, udføres, og holdbarheden kan klassificeres (0= 'intet angreb', 1= 'let angreb', 2= 'moderat angreb', 3= 'alvorligt angreb', 4 ='failure'20) ud over sammenligning med ikke-holdbart kontroltræ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Før der vælges gribble-prøver, der skal anvendes i fodringsforsøget, skal enkeltpersoner screenes for at vurdere deres egnethed. Der kan være en vis variation i fodringshastigheden mellem individer på grund af forskelle i størrelse, så der bør kun vælges fuldvoksne voksne prøver. Borges et al., 200917, opdagede ingen signifikant forskel mellem fodringshastigheden for individer mellem 1,5 mm og 3 mm længde. Kvindelige Limnoria ruger deres æg, i hvilken tid har en reduceret fodringshastighed. Derfor bør rugende kvinder kontrolleres for og kasseres, mens du vælger prøver. Tilsvarende vil moulting individer også have en reduceret fodringshastighed21. Derfor tæller fækal pellet på dage, hvor enkeltpersoner moulter, skal kasseres17. Som moulting forekommer i mere end en dag, moults tælles, når en fuld exoskelet moult kan ses på pellet indsamling dage. Limnoria, når de skaber deres burrows, har en øget fækal pelletproduktion og vil også producere mere frass (fint træaffald, der ikke er indarbejdet i fækale pellets). De høje niveauer af frass kan forstyrre identifikation af fækale pellets, men kan omhyggeligt fjernes under stereomikroskop observation, ved hjælp af en pipette eller fin pensel, før billedoptagelse til automatisk optælling. Alternativt kan pellets tælles manuelt.
Softwaren ImageJ kræver kvalitet, in-focus billeder til billedbehandling. Med henblik herpå bør der tages billeder, hvor fækale pellets ikke hindres af brøndvæggene, og en pensel skal bruges til at adskille individuelle fækale pellets. Baggrunden af billedet skal være ensartet uden områder af lys eller skygge, hvilket ville forstyrre, når billedet omdannes til binær til behandling i ImageJ. Der er ingen grund til at justere kontrast eller lys før billedbehandling. Når du importerer en stak billeder, skal alle fotografier tages i det samme plan, så der ikke opstår fejl under behandlingen.
Vakuumimprægnering af træ med havvand får træet til at synke og blive let tilgængeligt for gribble. Udvaskning af træ, før det udsættes for gribbles, vil fjerne vandopløselige ekstraktioner, der kan påvirke deres fodringshastighed eller forårsage dødelighed12. Dødelighed som følge af udvindinger i vandet er ikke repræsentativ for den dødelighed, der kan forventes i havet, hvor udvindingsstoffer hurtigt vil blive fortyndet. Brøndplader skal holdes ved en konstant temperatur, der er optimal for de gribble arter, der testes. Den fælles sydlige britiske art, L. quadripunctata, tilfører godt mellem 15 og 25 °C og har en optimal fodringshastighed ved 20 °C17 , så godt pladerne bekvemt kan opbevares i en inkubator ved en konstant 20 °C ± 0,5 °C.
En vurdering af fodersnebbbbens vitalitet registrerer fremlejemål eller præ-dødelige virkninger af træbehandlinger eller naturligt holdbart træ. En høj vitalitet på 5 indikerer, at gribble demonstrerer naturlig adfærd ved at grave ind i træet og lider ingen negativ effekt af kontakt med det. En vitalitet på 4 viser, at selvom den ikke har gravet ind i træet, er gribble stadig behagelig at kravle langs overfladen. En score på 3 gives til gribble, der ikke er på træet, men i stedet aktivt svømmer i vandet eller er stationære, men med hurtigt slå ben og pleopoder. En lav vitalitet på 2 betyder, at gribble er udsat og / eller har lidt energi. Dette kan skyldes en længere periode med lav fodringshastighed eller fra ekstrahering, der enten udvasker i vandet eller bliver tilgængelig under fodring. Hvis høj dødelighed ses efter 7-8 uger, kan dette skyldes sult, da udsultede gribbles (holdt i brønde med kun 5 ml havvand og intet træ) kan overleve i så lang tid (personlig observation).
Fordelene ved at bruge en kortsigtet laboratorieanalyse i modsætning til langsigtede marine feltforsøg er, at nye behandlinger og træprodukter hurtigt kan testes for at identificere deres potentiale til at blive brugt kommercielt. Desuden kan sådanne analyser lette hurtig optimering af behandlingsprocesser. Hvis en betydeligt lavere fækal pelletproduktion ses sammenlignet med et kontroltræ, kan test suppleres med marine forsøg. Slevin et al., 201523 og Westin et al., 201624 demonstrerer en god sammenhæng mellem laboratorie- og feltvurderinger ved at teste det samme træ i to forskellige indstillinger, hvilket indikerer en dygtig prædiktiv evne hos førstnævnte. En kortsigtet analyse kan køres i flere uger. Udsultede gribbles kan overleve i 7-8 uger, når de holdes i godtsat vand uden træ (personlig observation), som kan give yderligere sammenligning, hvis man undersøger dødeligheden reaktion på forskellige typer af skove. Men gennem de seneste, ikke-offentliggjorte observationer er der ingen signifikant udsving i fækal pelletproduktion over en periode, der er længere end 20 dage, bortset fra når dødeligheden begynder at forekomme. Derudover kører tidligere metoder, som dem, der anvendes af Borges et al., 2008 og 2009, i 15 dage. Derfor er 20 dage tilstrækkelig tid til en hurtig laboratoriebaseret test til at give indikation af træ holdbarhed.
Selv om denne metode er velegnet til kortvarige forsøg, bør resultaterne suppleres med langsigtede eksperimenter i havfeltet. Laboratorieforhold kan ikke kopiere de mange forskellige biotiske og abiotiske faktorer, der kan påvirke træ i havmiljøet. Biofoulerende organismer kan sammen med andre arter af havtræsborere (såsom skibsorm) stadig være til stede og forårsage skade på træet25,26. Derudover kan slid fra bølgekastende helvedesild eller sand slides træ ned, som derefter kan blive tilgængelig for gribbles27. En standardlaboratoriemetode kan dog give en indledende screening af nye produkter, der viser lovende anvendelser til marine anvendelser. Ved at vurdere den fækale pelletproduktion og vitalitet kan der identificeres træsorter, der er bedre til at reducere foderhastigheden.
På grund af regler og begrænsninger af træ konserveringsmidler, såsom CCA og creosot, er det vigtigt at finde nye produkter til at erstatte disse behandlinger. Træ er underlagt en høj grad af bionedbrydning i havmiljøet, men er stadig en af de mest vedvarende byggematerialer til rådighed og bevarer sin styrke og struktur godt i havvand27,28. Ikke alene vil træ, der er modstandsdygtigt over for bionedbrydning, reducere omkostningerne, men vil også være mere miljøvenligt end at anvende alternative materialer som beton eller stål, som kræver høj energitilførsel under fremstillingen29,30, eller bredspektrede biocidbeskyttelsesmidler, der kan udvaske og påvirke det omgivende økosystem31,32,33,34,35,36, 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter relateret til denne undersøgelse.
Acknowledgments
Tak til Norges Forskningsråd (Oslo Regional Fund, Alcofur rffofjor 269707) og University of Portsmouth (Det Naturvidenskabelige Fakultets ph.d.-forskningsstipensar) for at yde støtte til Lucy Martins studier. Også til Gervais S. Sawyer, der leverede det træ, der blev brugt til at generere de repræsentative resultater. Terpentin blev leveret af prof. Philip Evans fra University of British Columbia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 150200 | |
| 50ml Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Adjustable volume pipette | Fisher Scientific | FBE10000 | 1-10 ml |
| Beech | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Fagus sylvatica | Taxonomic authority: L |
| Ekki | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Lophira alata | Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn. |
| Forceps | Fisher Scientific | 10098140 | |
| Incubator | LMS LTD | INC5009 | |
| Microporous specimen capsules | Electron Microscopy Sciences | 70187-20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Scots Pine | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Pinus sylvestris | Taxonomic authority: L. |
| Size 00000 paintbrush | Hobby Craft | 5674331001 | Size 000 or 0000 also acceptable |
| Sweet Chestnut | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Castanea sativa | Taxonomic authority: Mill |
| Turpentine | P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) | Syncarpia glomulifera | Taxonomic authority: (Sm.) Nied. |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific | 15544635 |
References
- Morrell, J. J. Protection of wood-based materials. Handbook of environmental degradation of materials, 3rd ed. Kutz, M. , Elsevier Science and Technology Books. Oxford. 343-368 (2018).
- Distel, D. L. The biology of marine wood boring bivalves and their bacterial endosymbionts. Wood deterioration and preservation. Goodell, B., Nicholas, D., Schultz, T. , American Chemical Society. Washington, D.C. 253-271 (2003).
- Buslov, V., Scola, P. Inspection and structural evaluation of timber pier: case study. Journal of Structural Engineering. 117 (9), 2725-2741 (1991).
- US EPA. Registration Eligibility Decision for Chromated Arsenicals. List A, Case No. 0132. US EPA - Office of prevention, pesticides and toxic substances. , Available from: https://swap.stanford.edu/20110202084/http://www.epa.gov/oppsrrd1/reregistration/REDs/cca_red.pdf 800-807 (2008).
- Arsenic timber treatments (CCA and arsenic trioxide) review scope document, Review series 03.1. ISSN number 1443. Australian pesticides and veterinary medicines authority. , Available from: https://apvma.gov.au/sites/default/files/publication/14296-arsenic-timber-review-scope.pdf (2003).
- Commission directive 2003/2/EC of 6 January 2003 relating to restrictions on the marketing and use of arsenic (tenth adaptation to technical progress to Council Deretive 76/769/EEC). Official Journal of the European Communities. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2003/2/adopted (2003).
- The Hazardous Waste (England and Wales) Regulations 2005 No.894. Environmental Protection England and Wales. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/uksi/2005/894/contents/made (2005).
- Palanti, S., Cragg, S. M., Plarre, R. Resistance against marine borers: About the revision of EN 275 and the attempt for a new laboratory standard for Limnoria. International Research Group on Wood Preservation, Document No. IRG/WP 20-20669. , (2020).
- The European Commission for Standardization. EN 275:1992. Wood preservatives- Determination of the protective effectiveness against marine wood borers. The European Commission for Standardization (CEN). , (1992).
- European Commission. Directive 98/8/EC concerning the placing of biocidal products on the market. Communication and Information Resource Centre for Administrations, Businesses and Citizens. , (2010).
- Mantanis, G. I. Chemical modification of wood by acetylation or furfurylation: A review of the present scaled-up technologies. BioResources. 12 (2), 4478-4489 (2017).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Bergot, J., Williams, J. R., Shayler, B., Sawyer, G. S. Laboratory screening of tropical hardwoods for natural resistance to the marine borer Limnoria quadripunctata: The role of leachable and non-leachable factors. Holzforschung. 62 (1), 99-111 (2008).
- Cragg, S. M., Pitman, A., Henderson, S. Developments in the understanding of the biology of marine wood boring crustaceans and in methods of controlling them. International Biodeterioration & Biodegradation. 43 (4), 197-205 (1999).
- Cookson, L. J., Vic, M. D. C.
- Cookson, L. Australasian species of Limnoriidae (Crustacea: Isopoda). Memoirs of the Museum of Victoria. 52 (2), 137 (1991).
- Jones, L. T. The geographical and vertical distribution of British Limnoria [Crustacea: Isopoda]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 43 (3), 589-603 (1963).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Busch, S. A laboratory assay for measuring feeding and mortality of the marine wood borer Limnoria under forced feeding conditions: A basis for a standard test method. International Biodeterioration & Biodegradation. 63 (3), 289-296 (2009).
- BSI Standards Publication. BS EN 350:2016. Durability of wood and wood-based products - Testing and classification of the durability to biological agents of wood and wood-based materials. BSI Standards Publication. , (2016).
- Menzies, R. The phylogeny, systematics, distribution, and natural history of limnoria. , University of Southern California. Dosctoal dissertation 196-208 (1951).
- Palanti, S., Feci, E., Anichini, M. Comparison between four tropical wood species for their resistance to marine borers (Teredo spp and Limnoria spp) in the Strait of Messina. International Biodeterioration & Biodegradation. 104, 472-476 (2015).
- Delgery, C. C., Cragg, S. M., Busch, S., Morgan, E. Effects of the epibiotic heterotrich ciliate Mirofolliculina limnoriae and moulting on the faecal pellet production by the wood-boring isopods Limnoria tripunctata and Limnoria quadripunctata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 334 (2), 165-173 (2006).
- Morrell, J. J., Helsing, G. G., Graham, R. D. Marine wood maintenance manual: a guide for proper use of Douglas-fir in marine exposures. Forest Research Laboratory. , Oregon State University. Corvallis. Research Bulletin 48 (1984).
- Slevin, C. R., Westin, M., Lande, S., Cragg, S. Laboratory and marine trials of resistance of furfurylated wood to marine borers. Eighth European Conference on Wood Modification. , Aalto University. 464-471 (2015).
- Westin, M., et al. Marine borer resistance of acetylated and furfurylated wood - results from up to 16 years of field exposure. International Research Group on Wood Preservation. , Document No. IRG/WP 16-40756 (2016).
- Westin, M., Rapp, A., Field Nilsson, T. Field test of resistance of modified wood to marine borers. Wood Material Science and Engineering. 1 (1), 34-38 (2006).
- Borges, L. M. S. Biodegradation of wood exposed in the marine environment: Evaluation of the hazard posed by marine wood-borers in fifteen European sites. International Biodeterioration & Biodegradation. 96 (1), 97-104 (2014).
- Treu, A., et al. Durability and protection of timber structures in marine environments in Europe: An overview. BioResources. 14 (4), 10161-10184 (2019).
- Williams, J. R., Sawyer, G. S., Cragg, S. M., Simm, J. A questionnaire survey to establish the perceptions of UK specifiers concerning the key material attributes of timber for use in marine and freshwater engineering. Journal of the Institute of Wood Science. 17 (1), 41-50 (2005).
- Purnell, P. The carbon footprint of reinforced concrete. Advances in Cement Research. 25 (6), 362-368 (2013).
- Hill, C. A. S. The environmental consequences concerning the use of timber in the built environment. Frontiers in Built Environment. 5, 129 (2019).
- Mercer, T. G., Frostick, L. E. Leaching characteristics of CCA-treated wood waste: a UK study. Science of the Total Environment. 427, 165-174 (2012).
- Brown, C. J., Eaton, R. A., Thorp, C. H. Effects of chromated copper arsenate (CCA) wood preservative on early fouling community formation. Marine Pollution Bulletin. 42 (11), 1103-1113 (2001).
- Brown, C. J., Eaton, R. A. Toxicity of chromated copper arsenate (CCA)-treated wood to non-target marine fouling communities in Langstone Harbour, Portsmouth, UK. Marine Pollution Bulletin. 42 (4), 310-318 (2001).
- Brown, C. J., Albuquerque, R. M., Cragg, S. M., Eaton, R. A. Effects of CCA (copper-chrome-arsenic) preservative treatment of wood on the settlement and recruitment of wood of barnacles and tube building polychaete worms. Biofouling. 15 (1-3), 151-164 (2000).
- Lebow, S. T., Foster, D. O., Lebow, P. K. Release of copper, chromium and arsenic from treated southern pine exposed in seawater and freshwater. Forest Products Journal. 49 (7), 80-89 (1999).
- Smith, P. T. Risk to human health and estuarine posed by pulling out creosote-treated timber on oyster farms. Aquatic Toxicology. 86 (2), 287-298 (2008).
- Brown, C. J., et al. Assessment of Effects of Chromated Copper Arsenate (CCA)-Treated Timber on Nontarget Epibiota by Investigation of Fouling Community Development at Seven European Sites. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45 (1), 0037-0047 (2003).
