Summary
Denne protokollen presenterer en metode for å vurdere fôringshastigheten til den treborende krepsdyret Limnoria, ved å måle fekal pelletsproduksjon. Denne metoden er designet for bruk i ikke-spesialiserte laboratorier og har potensial for innlemmelse i standard testprotokoller, for å evaluere forbedret tre holdbarhet under marine forhold.
Abstract
Treborende hvirvelløse dyr ødelegger raskt marine tømmer og kystinfrastruktur i tre, noe som forårsaker milliarder av dollar i skade over hele kloden hvert år. Ettersom behandlinger av tre med bredspektret biocider, som kreosot og kromert kobber arsenat (CCA), nå er begrenset i marin bruk av lovgivning, er det nødvendig med naturlig holdbare tømmerarter og nye bevaringsmetoder for tre. Disse metodene gjennomgår testing for å oppfylle regulatoriske standarder, for eksempel den europeiske standarden for testing av trebeskyttelsesmidler mot marine borers, EN 275. Innledende undersøkelse av holdbare tømmerarter eller trebeskyttelsesbehandlinger kan oppnås raskt og billig gjennom laboratorietesting, noe som gir mange fordeler i forhold til marine feltforsøk som vanligvis er kostbare, langsiktige bestrebelser. Mange arter av Limnoria (gribble) er marine treborende krepsdyr. Limnoria er ideell for bruk i laboratorietesting av biologisk nedbrytning av tre av marine treborere, på grunn av det praktiske med å oppdra dem i akvarier og hvor enkelt det er å måle fôringshastighetene på tre. Her skisserer vi en standardiserbar laboratorietest for å vurdere biologisk nedbrytning av tre ved hjelp av gribble.
Introduction
Treborere kan forårsake omfattende skade på marine trekonstruksjoner, for eksempel sjøforsvar, brygger og akvakulturstrukturer; erstatning eller restaurering som koster milliarder av dollar per år over hele verden1,2,3. For å beskytte disse strukturene blir tømmer ofte behandlet for å redusere biologisk nedbrytning. Men på grunn av begrensningen av bruk av bredspektret biocider i Australia, EU, Storbritannia og USA, i det marine miljøet, er nye modifikasjonsteknikker og treslag som er naturlig holdbare for borers ettertraktet4,5,6,7. Nye teknikker for bevaring av tre i det marine miljøet krever grundig testing for å oppfylle regulatoriske standarder og begrense miljøpåvirkninger fra farer som utvasking av kjemiske konserveringsmidler. For eksempel brukes den europeiske standarden EN 275, som er den nåværende europeiske standarden fra 1992, til å evaluere trebevaringsbehandlinger mot marine treborerskader8,9. Denne standarden, sammen med andre lover mot bruk av biocidforbindelser, som CCA4,5,6,7 og kreosot10, nødvendiggjør bærekraftige, ikke-giftige metoder for trebeskyttelse og bruk av naturlig holdbare trearter for å erstatte biocidbehandlinger11,12 . Marine studier, som de som er spesifisert i EN 275, krever lange eksponeringsperioder og er dermed dyre og trege for å gi meningsfulle resultater. Laboratorietester gir imidlertid et mye raskere alternativ til testmetoder for å bevare treprodukter mot marine treborangrep, noe som muliggjør rask evaluering av justeringer i behandlingsplanene13. Resultater fra dette raske laboratorieforsøket er designet for å informere nye modifikasjonsprosesser av tre og for å identifisere tømmerarter med naturlig holdbarhet for borerskader. En lav fôringshastighet og vitalitet kan indikere økt motstand i potensielle produkter, og denne informasjonen kan deretter mates tilbake til bransjepartnere for å tillate dem å forbedre designene. Vår metode gir en kvikk og rask respons, som er ønskelig i industrien, og når lovende produkter er identifisert, kan resultatene suppleres med de fra marine studier.
Gribbles (Limnoria) er en slekt av isopod krepsdyr i familien Limnoriidae. Det er over 60 arter av Limnoria over hele verden13,14,15, med tre vanlige arter funnet i Storbritannia, Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata og Limnoria quadripunctata16. De bar tunneler på overflaten av tre som er nedsenket i sjøvann, noe som ofte forårsaker økonomisk betydelig skade. Gribbles er svært rikelig i kystnære britiske farvann og er enkle å vedlikeholde under laboratorieforhold, noe som gjør dem ideelle organismer for studiet av trebiodegradering av marine treborende hvirvelløse dyr. Evaluering av fôringshastigheter og vitalitet av gribbles på ulike tømmerarter og trebevaringsmetoder kan bestemme effekten av deres motstand mot biologisk nedbrytning. Følgende protokoll angir en standardmetode for måling av gribble fôringshastigheter, utviklet fra det som beskrives av Borges og kolleger12,17, i tillegg til å effektivisere innføringen av bildeanalyse for å gjøre prosessen operable i ikke-spesialiserte laboratorier. Bildeanalyse brukes også til å redusere de praktiske begrensningene ved manuell telling av et stort antall prøver. Holdbarhet i langsiktig marin testing, i henhold til den britiske standarden EN350-1:1994, er gradert med referanse til Pinus sylvestris sapwood18. I den kortsiktige laboratorietestingen som presenteres her, bruker vi scots furu (Pinus sylvestris L) sapwood som en kontroll for å teste heartwood av arten ekki (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), bøk (Fagus sylvatica L), søt kastanje (Castanea sativa Mill) og terpentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied). Gjennomsnittlig fekal pelletsproduksjon og vitalitet blant åtte repliker per treslag ble brukt som en indikator på holdbarhet. Vi tilbyr illustrative data samlet inn fra en typisk evaluering, ved hjelp av gribble arten Limnoria quadripunctata og en rekke naturlig holdbare tømmerarter. Limnoria quadripunctata, identifisert av nøklene levert av Menzies (1951), ble valgt som den optimale arten for biologisk nedbrytningsstudier på grunn av det faktum at det er det mest studerte medlemmet av familien og er veletablert som modellarter for bruk i biologisk nedbrytningsstudier. Denne protokollen gjelder også for testing av skoger av forskjellige behandlinger, selv om kontrollen som brukes bør være ubehandlede replikasjoner av samme art.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbereder testpinner
- Når noen behandlingsprosesser er fullført, skjær tørt tre i testpinner til størrelse 2 mm x 4 mm x 20 mm (figur 1). Lufttørk holder seg til en konstant vekt, under laboratorieforhold. Bruk minst 5 replikeringer av hvert tre som testes.
Figur 1: Testpinner som brukes i kortsiktig laboratorietesting for å vurdere gribble fôringshastigheter. Test trepinner i størrelse 2 mm x 4 mm x 20 mm. Fra venstre til høyre: ekki, terpentin, søt kastanje og bøkhjerteved og scots furu sapwood. Skalastang 4 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Vakuumimpregnering
- Etter treforberedelse (dvs. kutting og behandling, hvis aktuelt), plasser pinner under et nett i en matsikker plastbeholder, inne i vakuumdesiccatoren og bytt lokket slik at det er en tett forsegling, tilrettelagt av et belegg av vakuumfett (figur 2).
- Fest en treveisventil mellom slangen som forbinder tørkemiddelet og pumpen, med et tredje rør som fører til friluft (figur 2). Sørg for at treveisventilen er lukket for luften og kjør pumpen for å oppnå et vakuum på mellom -0,75 og -1,0 bar i vakuumavsugeren og hold dette vakuumet i 45 minutter - 1 time.
- Senk den åpne enden av det tredje røret ned i en beholder med sjøvann. Slå av pumpen og lukk ventilen som fører til pumpen, og åpne deretter ventilen langsomt til sjøvannet trekkes av vakuumet inn i tørkeapparatet. La vannet strømme til det fyller plastbeholderen, over nettets nivå.
- Trekk deretter røret ut av sjøvannet i beholderen, slik at luft kan komme inn, til tørkeapparatet vender tilbake til atmosfærisk trykk. Hold pinnene nedsenket under nettet til de synker til bunnen av plastbeholderen.
Figur 2: Utstyr som brukes til å støvsuge impregnere trepinner med sjøvann, som forberedelse til fôring til gribbles under en laboratoriefôringsanalyse. A) Vakuumdesiccator; B) Pumpe; C) Trykkmåler for vakuumdesiccator; D) Treveisventilen som fører til vakuumdesiccator, pumpe og til friluft eller sjøvann (oransje rør). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Utvasking av tre
- Senk sjøvannsmettede testpinner i sjøvann i 50 ml rør (figur 3). Skift ut vann regelmessig i en periode på 20 dager.
MERK: Utvaskingsprosessen gjelder for ethvert eksperimentelt tre under test, inkludert behandlet eller naturlig skog.
- Senk sjøvannsmettede testpinner i sjøvann i 50 ml rør (figur 3). Skift ut vann regelmessig i en periode på 20 dager.
Figur 3: Utvask fra trepinner for tilberedning til fôring til gribbles under en laboratoriefôringsanalyse. Tre som var helt nedsenket i sjøvann inneholdt i et 50 ml Falcon-rør, med vanlig vannforandring (1-3 dager), produserte tydelig farget utvasking. Fra venstre til høyre leachate fra heartwood av; søt kastanje, terpentin, ekki og bøk og scots furu sapwood. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Trekke ut Gribble
- Trekk ut individuelle prøver av gribble fra en infisert treblokk. Bruk et par fine tang og en tynn (størrelse 000/0,4 mm eller mindre) pensel. Skrell forsiktig tilbake alt tre som dekker gribble burrow med tangene
MERK: Burrows finnes på overflaten av tre og kan identifiseres med små hull (figur 4). - Når gribble har blitt utsatt, bruk en pensel for å forsiktig plukke opp individer fra undersiden og deponere i en petriskål fylt med sjøvann. Kontroller gribble under et mikroskop for å identifisere arter og for å sikre at ingen skade ble forårsaket under utvinning.
MERK: Å slå pleopoder er et tegn på vitalitet.- Kast noen kvinner brooding egg som gravid kvinner har redusert fôringskapasitet.
Figur 4: Bilde av en gribble burrow med to typiske ventilasjonshull. L. quadripunctata burrow på en pinne av Radiata furu tre, størrelse 2 mm x 4 mm x 20 mm. To mindre ventilasjonshull kan ses ved siden av burrowinngangen. Skalastang 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Identifisere Limnoria quadripunctata
- Identifiser Limnoria quadripunctata under et stereomikroskop av de fire distinkte tuberkulene, arrangert i et firkantet mønster, på dyrets pleotelson i tillegg til en X-formet karina på den femte pleonite19 (figur 5).
Figur 5: Limnoria quadripunctata som identifiserer funksjoner. Bilde av dorsal overflate Limnoria quadripunctata, tatt på et stereomikroskop ved x20 forstørrelse. Identifiserende funksjoner vist med rød pil - indikerer X-formet carina og blå pil - indikerer fire tuberkler på pleotelson. Skalastang 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Klargjøring av brønnplater
- I flerbrønnsplater med diameter 20 mm plasserer du en testpinne og 5 ml ufiltrert sjøvann mellom 32-35 PSU, per brønn (figur 6).
- Plasser behandlinger/treslag systematisk gjennom brønnplaten slik at hver tretype er representert minst én gang per plate. Legg til en gribble per brønn.
MERK: Temperaturen bør holdes stabil i en inkubator ved 20 °C ± 2 °C for arten L. quadripunctata, kan andre arter av Limnoria brukes med justeringer av temperaturen som er gjort for å passe til den spesifikke arten. - Hold platene i konstante mørke forhold, da fotoperiod ikke har effekt på gribble fôringshastighet15.
Figur 6: Eksperimentelt oppsett for gribble fôringsanalyse. Et eksempel på en 12 multi-brønn plate som brukes i laboratoriet testing av gribble fôring rate. Hver brønn inneholder 5 ml sjøvann og en testpinne (20 mm x 4 mm x 2 mm) av forskjellige trearter; Scots Pine sapwood og ekki, bøk, søt kastanje og terpentintre. Skalastang 20 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Innsamling og telling av avføringspellets og vurdering av vitalitet.
- To ganger i uken fjerner du testpinnen og hver gribble (en per brønn) fra brønnplaten og legger den i en nyforberedt brønnplate (som inneholder 5 ml sjøvann per brønn [32-35 PSU, 18-22 °C]).
- Bruk en pensel til forsiktig å børste av eventuelle avføringspellets fra pinnen før du overfører og beholder fekalpellets i den opprinnelige brønnen.
MERK: Før du overfører gribble til en frisk brønnplate, kan vitalitet vurderes på en skala fra 1-5; 1 = død, 2 = passiv, ikke på treet, 3 = aktivt svømming eller slag mot pleopoder, ikke på treet, 4 = krypende på overflaten av treet, 5 = burrowed inn i treet. - Behandling av bilder
- Bruk en fin pensel for å skille eventuelle klumper slik at individuelle pellets er synlige og børste pellets bort fra selve kantene på brønnen. Ta et detaljert bilde under et stereomikroskop, ved forstørrelse x4 og last opp til en datamaskin (figur 7).
MERK: Sørg for at pelletsene er i fokus og bakgrunnen er jevn, uten skygger eller lysrefleksjoner på overflaten av vannet.
- Bruk en fin pensel for å skille eventuelle klumper slik at individuelle pellets er synlige og børste pellets bort fra selve kantene på brønnen. Ta et detaljert bilde under et stereomikroskop, ved forstørrelse x4 og last opp til en datamaskin (figur 7).
Figur 7: Bilde av gribble fekale pellets. L. quadripunctata fekal pellets (små, sylindriske, brune pellets) fra fôring på Radiata furu tre i en brønn av en multi-brønn plate. Tatt ved x4-forstørrelse. Bilder før manipulering for bildeanalyse (se figur 7). A) Eksempel på et passende bilde som skal brukes til automatisert telling i ImageJ. Pellets er tilstrekkelig spredt ut og bort fra kantene på brønnen. Brønnen er sentrert og det er ingen hindringer eller refleksjoner. B) Et eksempel på et bilde som ikke er egnet for bildeanalyse. Brønnen er utenfor sentrum, og skjærer av den nederste halvdelen. Blå (prikket) sirkel viser lysrefleksjon fra overflaten av vannet. Oransje (solid) sirkel viser pellets som er klumpet for tett sammen og for nær kanten av brønnen. Rød (stiplet) sirkel viser en flis som ikke ble fjernet. Skalastang 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Prosess for å generere fekal pelletsantall ved hjelp av ImageJ.
- Last ned ImageJ (siste versjon per 03/08/21, 1.8.0_172) fra https://imagej.nih.gov/ij/download.html eller kjøres fra datamaskinens nettleser.
- Last opp en bunke med bilder ved å dra og slippe, eller ved å velge Fil | Importere | Bildesekvens | Bla gjennom. Ikke endre noen parametere, og velg deretter OK.
- Deretter bruker du sirkelverktøyet til å velge den nederste delen av brønnen som inneholder fekalpellets. Fjern brønnkantene, velg Rediger | Rydd utenfor. Gjør bildet binært, velg Behandle | Gjør binær.
- Kalibrere ved å velge Analyser | Angi skala og velg antall piksler per millimeter for bildet (for eksempel 10 bildepunkter = 1 mm). Tell pelletsene, velg Analyser | Analyser partikler.
- I boksen ved siden av Størrelse (enhet2) velger du en lavere terskel som er den samme som den minste pelletsen, ved hjelp av enhetsskalasettet tidligere (for eksempel hvis 10 piksler = 1 mm og den minste pelletsen er 0,5 mm, velg 5-uendelig).
- Velg Disposisjoner i rullegardinlisten Vis, og merk deretter av for Oppsummer og trykk OK (figur 8).
MERK: Du finner mer informasjon på https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html
Figur 8: Et flytskjema over prosessen som brukes i ImageJ til å telle fekalpellets. A) Importere en bildesekvens i Fil-fanen i ImageJ. B) Bla gjennom-knappen i dialogboksen Importer bildesekvens for å importere en sekvens med bilder fra en lokal enhet. C) Bruke sirkelverktøyet til å velge område som inneholder fekale pellets D) Fjern den utvendige knappen i redigeringsfaneområdet for å fjerne utenfor det valgte området. E) Lag binær knapp i prosessfanen. F) Still inn skalaknappen i kategorien Analyse. Avstand i piksler tilsvarer antall piksler som én målenhet (mm). G) Analyse av partikler-knappen i Analyse-fanen. Størrelse (enhet^2) satt til den nedre terskelen for fekal pelletsstørrelse, i piksler, til uendelig. Vis disposisjoner, og sammendrag er valgt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
-
Dataanalyse
- Konverter pelletstall til pellets per dag, noe som gir og indirekte mål på fôringshastighet. Kast data fra eventuelle moulting individer på dager som moulting skjedde (Figur 9).
MERK: Moulting skjer over 1-3 dager og kan identifiseres når en full moult av eksoskjelettet kan sees.
- Konverter pelletstall til pellets per dag, noe som gir og indirekte mål på fôringshastighet. Kast data fra eventuelle moulting individer på dager som moulting skjedde (Figur 9).
Figur 9: Eksempel på en gribble moult. Gribble (L. quadripunctata) moulting, på en Radiata furu tre testpinne størrelse 20 mm x 4 mm x 2 mm. Moults er indikert av røde sirkler. Skalastang 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et fôringseksperiment av L. quadripunctata ble utført over 20 dager, ved hjelp av fem forskjellige tretyper (Scots pine (Pinus sylvestris L) sapwood, og halstre av bøk (Fagus sylvatica L), ekki (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), søt kastanje (Castanea sativa Mil), og terpentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (Se Tabell over materialer), i november 2020. Åtte replikeringspinner ble brukt per treslag, og ett eksemplar av Limnoria quadripunctata ble matet per pinne. All gribble ble kjøpt fra aksjer som vedlikeholdes i akvarier ved Institute of Marine Sciences, University of Portsmouth, UK. Aksjer er regelmessig supplert med ville samlinger fra sørkysten av England. Dyr er godt akklimatisert til de stabile og konsistente kulturforholdene før eksperimentet. Trepinner (20 mm x 4 mm x 2 mm) ble utvasket i sjøvann i to uker før fôringsprøven. En gribble, en testpinne og 5 ml sjøvann ble plassert per brønn i en 12 multi-brønnplate og holdt i en inkubator ved stabile forhold på 20 °C (± 0,2 °C) og under konstant mørke forhold. Fekalpellets ble telt og samlet hver 2 til 5 dager, med fulle vannforandringer ved hver samling. Åtte replikeringer av hver treart ble brukt, noe som gir totalt førti pinner med en individuell gribble hver. Sjøvann som brukes til utvasking av tre og brukt gjennom hele eksperimentet ble hentet direkte fra akvariet som brukes til å bake prøver. Sjøvannsforholdene er stabile i akvariet og stabile i inkubatoren. Fordampning fra det lille volumet av vann som brukes per brønn minimeres av lokkdesignet på brønnplatene og fulle vannforandringer som skjer hver 2-5 dager.
Pellets ble telt automatisk ved hjelp av Bilde J (versjon 1.8.0_112).
Gribble fôring på scots furu sapwood tre som en kontroll, produserte de mest fekale pellets per dag konsekvent, bortsett fra på dag 20 hvor pelletsproduksjonen ble overtatt av bøk. Ekki produserte de laveste fekalpellets per dag av alle treslagene som ble testet. Den nest høyeste fekal pelletsproduksjonen ble sett på bøk, etterfulgt av søt kastanje og terpentin. Det var en økning i fekal pelletsproduksjon i alle arter fra dag 5 til dag 7. Pelletsproduksjonen falt i alle arter, annet enn ekki, mellom dag 7 og dag 12, muligens på grunn av økt tid mellom vannforandringer. Etter dette forble fekal pelletsproduksjon ganske konsistent blant hver av treslagene. Fra dag 14 gikk skotsk furu ned i daglig fekal pelletsproduksjon, mens bøke økte (figur 10).
Figur 10: Antall fekale pellets per dag (n=40) (gjennomsnittlig ± SE) produsert av L. quadripunctata ved hjelp av ulike treslag, over 20 dager. Terpentin, søt kastanje, bøk og ekki heartwood testet, med scots furu sapwood brukt som kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den høyeste vitaliteten av score (5) ble sett hos de fleste individer som fôret på skotsk furuskog, annet enn den ene døde personen. 5 indikerer dyr som har gravd inn i treet, og dette ble bare sett på skotsk furu sapwood og bøk. Ved dag 12 for skottene furu og dag 20 for bøk, hadde alle levende individer gravd inn i treet. Søt kastanje hadde høyest prosent dødelighet, men økte ikke over tid. Resten av levende individer bodde på en vitalitet på 4 (krypende på treoverflaten), bortsett fra på dag 14 hvor to personer var utenfor treet (vitalitet på 3). Ekki og terpentin hadde også flertallet av individer med en vitalitet på 4 i løpet av eksperimentets varighet, bortsett fra på dag 14 og dag 5 for terpentin. Dødeligheten viste ikke en økning over tid på tvers av noen av treartene. Bare graving ble sett for å øke på skotsk furu og bøk, mens de tre andre treslagene for det meste forble på en vitalitet på 4 (figur 11).
Figur 11: Vitalitet av individer over tid, som en prosentandel av replikerer, fôring på forskjellige treslag. Terpentin, søt kastanje, bøk og ekki heartwood testet, med scots furu sapwood brukt som kontroll. Av åtte replikeringer per treslag ble andelen ved ulike vitaliteter plottet inn i løpet av den 20-dagers eksperimentelle perioden. Mørk blå representerer en vitalitet på 5 (burrowing), lyseblå en vitalitet på 4 (på tre), grå en vitalitet på 3 (av tre, men aktiv), lilla en vitalitet på 2 (av tre og passiv) og svart viser en vitalitet på 1 eller døde individer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Resultater fra denne testmetoden kan brukes til å identifisere tretyper eller behandlinger som har økt motstand mot marine treborerskader. Deretter kan marine feltforsøk, som beskrevet i den europeiske standarden EN 275, gjennomføres og holdbarhet kan graderes (0 = 'ingen angrep', 1 = 'lite angrep', 2 = 'moderat angrep', 3 = 'alvorlig angrep', 4 = 'feil'20) i tillegg til sammenlignet med ikke-holdbart kontrolltre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Før du velger gribbleprøver som skal brukes i fôringseksperimentet, bør enkeltpersoner screenes for å vurdere deres egnethet. Det kan være en viss variasjon i fôringshastigheten mellom individer på grunn av forskjeller i størrelse, så bare fullvoksne voksne prøver bør velges. Det ble ikke påvist noen signifikant forskjell mellom fôringshastigheten til individer mellom 1,5 mm og 3 mm lengde av Borges et al., 200917. Kvinne Limnoria brød eggene sine, i løpet av hvilken tid har redusert fôringshastighet. Derfor bør eventuelle brooding kvinner kontrolleres og kastes mens du velger prøver. På samme måte vil moulting individer også ha en redusert fôringshastighet21. Derfor teller fekal pellet på dager når enkeltpersoner moulting bør kastes17. Når moulting oppstår i mer enn en dag, telles moults når en full eksoskjelettmoult kan ses på pelletssamlingsdager. Limnoria, når de lager sine burrows, har økt fekal pelletsproduksjon og vil også produsere mer frass (fint treavfall som ikke er innlemmet i avføringspellets). De høye nivåene av frass kan forstyrre identifisering av avføringspellets, men kan forsiktig fjernes under stereomikroskopobservasjon, ved hjelp av en pipette eller fin pensel, før bildeopptak for automatisk telling. Alternativt kan pellets telles manuelt.
Programvaren ImageJ krever kvalitet, in-focus bilder for bildebehandling. For dette formål bør bilder fanges der avføringspellets ikke er blokkert av brønnveggene, og en pensel skal brukes til å skille individuelle avføringspellets. Bakgrunnen i bildet må være ensartet uten områder med lys eller skygge, noe som vil forstyrre når bildet transformeres til binært for behandling i ImageJ. Det er ikke nødvendig å justere kontrast eller lys før bildebehandling. Når du importerer en stabel med bilder, må alle fotografier tas i samme plan, slik at det ikke oppstår feil under behandlingen.
Vakuumimpregnering av tre med sjøvann får treet til å synke og bli lett tilgjengelig for gribble. Utvasking av tre før det utsettes for gribbles vil fjerne eventuelle vannløselige ekstraktiver som kan påvirke fôringshastigheten eller forårsake dødelighet12. Dødelighet på grunn av utvinningsmidler i vannet er ikke representativ for dødelighet som forventes i sjøen, hvor ekstraktiver vil bli raskt fortynnet. Brønnplater bør holdes ved en konstant temperatur som er optimal for gribble-artene som testes. Den vanlige sørlige britiske arten, L. quadripunctata, mater godt mellom 15 og 25 °C og har en optimal fôringshastighet ved 20 °C17 , slik at brønnplater enkelt kan oppbevares i en inkubator ved en konstant 20 °C ± 0,5 °C.
Vurdering av vitaliteten til fôringsgribble oppdager sublethal eller pre-dødelige effekter av trebehandlinger eller naturlig holdbare tømmer. En høy vitalitet på 5 indikerer at gribble demonstrerer naturlig oppførsel ved å grave seg inn i treet og lider ingen negativ effekt av kontakt med det. En vitalitet på 4 viser at selv om du ikke har gravd inn i treet, er gribble fortsatt behagelig å krype langs overflaten. En poengsum på 3 er gitt til gribble som ikke er på treet, men i stedet svømmer aktivt i vannet eller står stille, men med raskt slående ben og pleopods. En lav vitalitet på 2 betyr at gribble er utsatt og / eller har liten energi. Dette kan komme fra en lengre periode med lav fôringshastighet eller fra ekstraktiver som enten lekker ut i vannet eller blir tilgjengelige under fôring. Hvis høy dødelighet ses etter 7-8 uker, kan dette skyldes sult, da sultne gribbles (holdt i brønner med bare 5 ml sjøvann og ikke noe tre) kan overleve så lenge (personlig observasjon).
Fordelene ved å bruke en kortsiktig laboratorieanalyse i motsetning til langsiktige marine feltforsøk, er at nye behandlinger og treprodukter raskt kan testes for å identifisere deres potensial til å bli brukt kommersielt. Videre kan slike analyser legge til rette for rask optimalisering av behandlingsprosesser. Hvis en betydelig lavere fekal pelletsproduksjon ses sammenlignet med et kontrolltre, kan testing suppleres med marine studier. Slevin et al., 201523 og Westin et al., 201624 viser en god sammenheng mellom laboratorie- og feltvurderinger gjennom testing av samme tre i to forskjellige settinger, noe som indikerer en dyktig prediktiv evne til førstnevnte. En kortsiktig analyse kan kjøres i flere uker. Sultne gribbles kan overleve i 7-8 uker når de holdes i godt vannet uten tre (personlig observasjon) som kan gi ytterligere sammenligning hvis du undersøker dødelighetens respons på forskjellige typer skoger. Men gjennom nylige, upubliserte observasjoner er det ingen signifikante svingninger i fekal pelletsproduksjon over en tidsperiode som er lengre enn 20 dager, annet enn når dødeligheten begynner å oppstå. I tillegg kjører tidligere metoder, som det som brukes av Borges et al., 2008 og 2009, i 15 dager. Derfor er 20 dager en tilstrekkelig tid for en rask laboratoriebasert test for å gi indikasjon på tre holdbarhet.
Selv om denne metoden er egnet for kortsiktige studier, bør funnene suppleres med langsiktige marine felteksperimenter. Laboratorieforhold kan ikke gjenskape mangfoldet av biotiske og abiotiske faktorer som kan påvirke tre i det marine miljøet. Biofouling organismer, sammen med andre arter av marine treborere (som skipsorm) kan fortsatt være til stede og forårsake skade på treet25,26. I tillegg kan slitasje fra bølgekastet helvetesild eller sand slites tre ned, noe som deretter kan bli tilgjengelig for gribbles27. En standard laboratoriemetode kan imidlertid gi en innledende screening av nye produkter som viser løfte om marine applikasjoner. Ved å vurdere fekal pelletsproduksjon og vitalitet, kan tresorter som er bedre til å redusere gribble fôringshastighet identifiseres.
På grunn av regelverket og restriksjonene til trebeskyttelsesmidler, som CCA og kreosot, er det viktig å finne nye produkter for å erstatte disse behandlingene. Tømmer er utsatt for høye nivåer av biologisk nedbrytning i det marine miljøet, men er fortsatt et av de mest fornybare byggematerialene som er tilgjengelige og beholder sin styrke og struktur godt i sjøvann27,28. Ikke bare vil tømmer som er motstandsdyktig mot biologisk nedbrytning redusere kostnadene, men vil også være mer miljøvennlig enn å bruke alternative materialer som betong eller stål, som krever høy energiinngang under produksjon29,30, eller bredspektret biocid konserveringsmidler som kan lekke ut og påvirke det omkringliggende økosystemet31,32,33,34,35,36, 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter knyttet til denne studien.
Acknowledgments
Takk til Norges forskningsråd (Oslo regionale fond, Alcofur rffofjor 269707) og University of Portsmouth (Det vitenskapelige fakultets ph.d.-forskning) for å finansiere studiene av Lucy Martin. Også til Gervais S. Sawyer som ga treet som brukes til å generere de representative resultatene. Terpentin ble levert av prof. Philip Evans ved University of British Columbia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 150200 | |
| 50ml Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Adjustable volume pipette | Fisher Scientific | FBE10000 | 1-10 ml |
| Beech | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Fagus sylvatica | Taxonomic authority: L |
| Ekki | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Lophira alata | Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn. |
| Forceps | Fisher Scientific | 10098140 | |
| Incubator | LMS LTD | INC5009 | |
| Microporous specimen capsules | Electron Microscopy Sciences | 70187-20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Scots Pine | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Pinus sylvestris | Taxonomic authority: L. |
| Size 00000 paintbrush | Hobby Craft | 5674331001 | Size 000 or 0000 also acceptable |
| Sweet Chestnut | G. Sawyer (consultant in timber technology) | Castanea sativa | Taxonomic authority: Mill |
| Turpentine | P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia) | Syncarpia glomulifera | Taxonomic authority: (Sm.) Nied. |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific | 15544635 |
References
- Morrell, J. J. Protection of wood-based materials. Handbook of environmental degradation of materials, 3rd ed. Kutz, M. , Elsevier Science and Technology Books. Oxford. 343-368 (2018).
- Distel, D. L. The biology of marine wood boring bivalves and their bacterial endosymbionts. Wood deterioration and preservation. Goodell, B., Nicholas, D., Schultz, T. , American Chemical Society. Washington, D.C. 253-271 (2003).
- Buslov, V., Scola, P. Inspection and structural evaluation of timber pier: case study. Journal of Structural Engineering. 117 (9), 2725-2741 (1991).
- US EPA. Registration Eligibility Decision for Chromated Arsenicals. List A, Case No. 0132. US EPA - Office of prevention, pesticides and toxic substances. , Available from: https://swap.stanford.edu/20110202084/http://www.epa.gov/oppsrrd1/reregistration/REDs/cca_red.pdf 800-807 (2008).
- Arsenic timber treatments (CCA and arsenic trioxide) review scope document, Review series 03.1. ISSN number 1443. Australian pesticides and veterinary medicines authority. , Available from: https://apvma.gov.au/sites/default/files/publication/14296-arsenic-timber-review-scope.pdf (2003).
- Commission directive 2003/2/EC of 6 January 2003 relating to restrictions on the marketing and use of arsenic (tenth adaptation to technical progress to Council Deretive 76/769/EEC). Official Journal of the European Communities. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/eudr/2003/2/adopted (2003).
- The Hazardous Waste (England and Wales) Regulations 2005 No.894. Environmental Protection England and Wales. , Available from: https://www.legislation.gov.uk/uksi/2005/894/contents/made (2005).
- Palanti, S., Cragg, S. M., Plarre, R. Resistance against marine borers: About the revision of EN 275 and the attempt for a new laboratory standard for Limnoria. International Research Group on Wood Preservation, Document No. IRG/WP 20-20669. , (2020).
- The European Commission for Standardization. EN 275:1992. Wood preservatives- Determination of the protective effectiveness against marine wood borers. The European Commission for Standardization (CEN). , (1992).
- European Commission. Directive 98/8/EC concerning the placing of biocidal products on the market. Communication and Information Resource Centre for Administrations, Businesses and Citizens. , (2010).
- Mantanis, G. I. Chemical modification of wood by acetylation or furfurylation: A review of the present scaled-up technologies. BioResources. 12 (2), 4478-4489 (2017).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Bergot, J., Williams, J. R., Shayler, B., Sawyer, G. S. Laboratory screening of tropical hardwoods for natural resistance to the marine borer Limnoria quadripunctata: The role of leachable and non-leachable factors. Holzforschung. 62 (1), 99-111 (2008).
- Cragg, S. M., Pitman, A., Henderson, S. Developments in the understanding of the biology of marine wood boring crustaceans and in methods of controlling them. International Biodeterioration & Biodegradation. 43 (4), 197-205 (1999).
- Cookson, L. J., Vic, M. D. C.
- Cookson, L. Australasian species of Limnoriidae (Crustacea: Isopoda). Memoirs of the Museum of Victoria. 52 (2), 137 (1991).
- Jones, L. T. The geographical and vertical distribution of British Limnoria [Crustacea: Isopoda]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 43 (3), 589-603 (1963).
- Borges, L. M. S., Cragg, S. M., Busch, S. A laboratory assay for measuring feeding and mortality of the marine wood borer Limnoria under forced feeding conditions: A basis for a standard test method. International Biodeterioration & Biodegradation. 63 (3), 289-296 (2009).
- BSI Standards Publication. BS EN 350:2016. Durability of wood and wood-based products - Testing and classification of the durability to biological agents of wood and wood-based materials. BSI Standards Publication. , (2016).
- Menzies, R. The phylogeny, systematics, distribution, and natural history of limnoria. , University of Southern California. Dosctoal dissertation 196-208 (1951).
- Palanti, S., Feci, E., Anichini, M. Comparison between four tropical wood species for their resistance to marine borers (Teredo spp and Limnoria spp) in the Strait of Messina. International Biodeterioration & Biodegradation. 104, 472-476 (2015).
- Delgery, C. C., Cragg, S. M., Busch, S., Morgan, E. Effects of the epibiotic heterotrich ciliate Mirofolliculina limnoriae and moulting on the faecal pellet production by the wood-boring isopods Limnoria tripunctata and Limnoria quadripunctata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 334 (2), 165-173 (2006).
- Morrell, J. J., Helsing, G. G., Graham, R. D. Marine wood maintenance manual: a guide for proper use of Douglas-fir in marine exposures. Forest Research Laboratory. , Oregon State University. Corvallis. Research Bulletin 48 (1984).
- Slevin, C. R., Westin, M., Lande, S., Cragg, S. Laboratory and marine trials of resistance of furfurylated wood to marine borers. Eighth European Conference on Wood Modification. , Aalto University. 464-471 (2015).
- Westin, M., et al. Marine borer resistance of acetylated and furfurylated wood - results from up to 16 years of field exposure. International Research Group on Wood Preservation. , Document No. IRG/WP 16-40756 (2016).
- Westin, M., Rapp, A., Field Nilsson, T. Field test of resistance of modified wood to marine borers. Wood Material Science and Engineering. 1 (1), 34-38 (2006).
- Borges, L. M. S. Biodegradation of wood exposed in the marine environment: Evaluation of the hazard posed by marine wood-borers in fifteen European sites. International Biodeterioration & Biodegradation. 96 (1), 97-104 (2014).
- Treu, A., et al. Durability and protection of timber structures in marine environments in Europe: An overview. BioResources. 14 (4), 10161-10184 (2019).
- Williams, J. R., Sawyer, G. S., Cragg, S. M., Simm, J. A questionnaire survey to establish the perceptions of UK specifiers concerning the key material attributes of timber for use in marine and freshwater engineering. Journal of the Institute of Wood Science. 17 (1), 41-50 (2005).
- Purnell, P. The carbon footprint of reinforced concrete. Advances in Cement Research. 25 (6), 362-368 (2013).
- Hill, C. A. S. The environmental consequences concerning the use of timber in the built environment. Frontiers in Built Environment. 5, 129 (2019).
- Mercer, T. G., Frostick, L. E. Leaching characteristics of CCA-treated wood waste: a UK study. Science of the Total Environment. 427, 165-174 (2012).
- Brown, C. J., Eaton, R. A., Thorp, C. H. Effects of chromated copper arsenate (CCA) wood preservative on early fouling community formation. Marine Pollution Bulletin. 42 (11), 1103-1113 (2001).
- Brown, C. J., Eaton, R. A. Toxicity of chromated copper arsenate (CCA)-treated wood to non-target marine fouling communities in Langstone Harbour, Portsmouth, UK. Marine Pollution Bulletin. 42 (4), 310-318 (2001).
- Brown, C. J., Albuquerque, R. M., Cragg, S. M., Eaton, R. A. Effects of CCA (copper-chrome-arsenic) preservative treatment of wood on the settlement and recruitment of wood of barnacles and tube building polychaete worms. Biofouling. 15 (1-3), 151-164 (2000).
- Lebow, S. T., Foster, D. O., Lebow, P. K. Release of copper, chromium and arsenic from treated southern pine exposed in seawater and freshwater. Forest Products Journal. 49 (7), 80-89 (1999).
- Smith, P. T. Risk to human health and estuarine posed by pulling out creosote-treated timber on oyster farms. Aquatic Toxicology. 86 (2), 287-298 (2008).
- Brown, C. J., et al. Assessment of Effects of Chromated Copper Arsenate (CCA)-Treated Timber on Nontarget Epibiota by Investigation of Fouling Community Development at Seven European Sites. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45 (1), 0037-0047 (2003).
