Schnelle Prüfung der Beständigkeit von Holz gegen den biologischen Abbau durch marine holzbohrende Krebstiere

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Bewertung der Fütterungsrate des holzbohrenden Krebstiers Limnoria durch Messung der Fäkalpelletproduktion dar. Diese Methode ist für den Einsatz in nicht spezialisierten Labors konzipiert und bietet das Potenzial, in Standardprüfprotokolle integriert zu werden, um eine verbesserte Holzhaltbarkeit unter Marinebedingungen zu bewerten.

Abstract

Holzbohrende Wirbellose zerstören schnell Meereshölzer und hölzerne Küsteninfrastruktur und verursachen jedes Jahr Schäden in Milliardenhöhe auf der ganzen Welt. Da die Behandlung von Holz mit Breitbandbioziden wie Kreosot und chromatiertem Kupferarsenat (CCA) in der marinen Verwendung durch die Gesetzgebung eingeschränkt ist, sind natürlich haltbare Holzarten und neuartige Konservierungsmethoden für Holz erforderlich. Diese Methoden werden getestet, um regulatorische Normen wie die europäische Norm zur Prüfung von Holzschutzmitteln gegen Meeresbohrer, EN 275, zu erfüllen. Die Erstuntersuchung langlebiger Hölzerarten oder Holzschutzbehandlungen kann schnell und kostengünstig durch Labortests erreicht werden, was viele Vorteile gegenüber marinen Feldversuchen bietet, die typischerweise kostspielige, langfristige Bemühungen sind. Viele Arten von Limnoria (Gribble) sind marine holzbohrende Krebstiere. Limnoria ist ideal für den Einsatz in Labortests des biologischen Abbaus von Holz durch Marine-Holzbohrer, aufgrund der Praktikabilität der Aufzucht in Aquarien und der Leichtigkeit, ihre Fütterungsraten auf Holz zu messen. Hierin beschreiben wir einen standardisierbaren Labortest zur Beurteilung des biologischen Abbaus von Holz mit Gribble.

Introduction

Holzbohrer können umfangreiche Schäden an marinen Holzkonstruktionen wie Seeverteidigungen, Piers und Aquakulturstrukturen verursachen. deren Ersatz oder Wiederherstellung weltweit Milliarden von Dollar pro Jahr ^kostet1,2,3. Um diese Strukturen zu schützen, wird Holz oft behandelt, um den biologischen Abbau zu reduzieren. Aufgrund der Beschränkung der Verwendung von Breitbandbioziden in Australien, der EU, dem Vereinigten Königreich und den USA in der Meeresumwelt werden jedoch neue Modifikationstechniken und Holzarten, die für Bohrer von Natur aus haltbar sind^, gesucht4,5,6,7. Neuartige Techniken zur Erhaltung von Holz in der Meeresumwelt erfordern gründliche Tests, um die gesetzlichen Standards zu erfüllen und die Umweltauswirkungen von Gefahren wie dem Auslaugen chemischer Konservierungsmittel zu begrenzen. Beispielsweise wird die europäische Norm EN 275, die aktuelle europäische Norm von 1992, verwendet, um Holzschutzbehandlungen gegen Marine-Holzbohrerschäden zu ^bewerten8,9. Diese Norm erfordert zusammen mit anderen Rechtsvorschriften gegen die Verwendung von Biozidverbindungen wie CCA4,5,6,7 und Kreosot10 nachhaltige, ungiftige Methoden des Holzschutzes und die Verwendung von natürlich haltbaren Holzarten als Ersatz für Biozidbehandlungen11,12 . Marine Versuche, wie sie in EN 275 spezifiziert sind, erfordern lange Expositionszeiten und sind daher teuer und langsam, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. Laborversuche bieten jedoch eine viel schnellere Alternative zu Testmethoden zur Konservierung von Holzprodukten gegen den Angriff von Holzbohrern im Meer, was eine schnelle Bewertung von Anpassungen der Behandlungspläne ^{ermöglicht13}. Die Ergebnisse dieses schnellen Laborexperiments sollen neuartige Modifikationsprozesse von Holz informieren und Holzarten mit natürlicher Haltbarkeit für Bohrerschäden identifizieren. Eine niedrige Fütterungsrate und Vitalität kann auf eine erhöhte Resistenz in potenziellen Produkten hinweisen, und diese Informationen können dann an Industriepartner zurückgegeben werden, damit sie designs verbessern können. Unsere Methode ermöglicht eine flinke und schnelle Reaktion, die in der Industrie wünschenswert ist, und sobald vielversprechende Produkte identifiziert wurden, können die Ergebnisse mit denen aus marinen Studien ergänzt werden.

Gribbles (Limnoria) ist eine Gattung von Krebstieren aus der Familie der Limnoriidae. Es gibt über 60 Arten von Limnoria weltweit13,14,15, mit drei häufigen Arten in Großbritannien, Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata und Limnoria quadripunctata16. Sie bohren Tunnel auf der Oberfläche von Holz, das in Meerwasser eingetaucht ist, und verursachen oft wirtschaftlich erhebliche Schäden. Gribbles sind in britischen Küstengewässern sehr häufig und unter Laborbedingungen leicht zu pflegen, was sie zu idealen Organismen für die Untersuchung des biologischen Abbaus von Holz durch marine holzbohrende Wirbellose macht. Die Bewertung der Fütterungsraten und der Vitalität von Körnern an verschiedenen Holzarten und Holzschutzmethoden kann die Wirksamkeit ihrer Beständigkeit gegen biologischen Abbau bestimmen. Das folgende Protokoll legt eine Standardmethode zur Messung der Gribble-Vorschubgeschwindigkeit fest, die aus der von Borges und Kollegen beschriebenen Methode entwickelt ^wurde12,17, und rationalisiert die Einführung der Bildanalyse, um den Prozess in nicht spezialisierten Labors bedienbar zu machen. Die Bildanalyse wird auch verwendet, um die praktischen Einschränkungen beim manuellen Zählen einer großen Anzahl von Proben zu reduzieren. Die Haltbarkeit bei Langzeit-Marinetests gemäß der britischen Norm EN350-1:1994 wird in Bezug auf Pinus sylvestris-Splintholz18 eingestuft. In den hier vorgestellten Kurzzeit-Labortests verwenden wir Splintholz der Waldkiefer (Pinus sylvestris L) als Kontrolle zur Prüfung von Kernholz der Arten Ekki (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), Buche (Fagus sylvatica L), Edelkastanie (Castanea sativa Mill) und Terpentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied). Die durchschnittliche Fäkalpelletproduktion und Vitalität von acht Replikaten pro Holzart wurde als Indikator für die Haltbarkeit verwendet. Wir liefern anschauliche Daten, die aus einer typischen Bewertung unter Verwendung der Gribble-Art Limnoria quadripunctata und einer Reihe von natürlich haltbaren Holzarten gesammelt wurden. Limnoria quadripunctata, identifiziert durch die von Menzies (1951) zur Verfügung gestellten Schlüssel, wurde als die optimale Art für biologische Abbauversuche ausgewählt, da sie das am besten untersuchte Mitglied der Familie ist und sich als Modellspezies für den Einsatz in biologischen Abbauversuchen etabliert hat. Dieses Protokoll gilt auch für die Untersuchung von Hölzern unterschiedlicher Behandlungen, obwohl die verwendete Kontrolle unbehandelte Replikationen derselben Art sein sollte.

Protocol

1. Vorbereiten von Teststäbchen

1. Nachdem alle Behandlungsprozesse abgeschlossen sind, schneiden Sie trockenes Holz in Teststäbe mit der Größe 2 mm x 4 mm x 20 mm (Abbildung 1). Lufttrocken haftet unter Laborbedingungen bei einem konstanten Gewicht. Verwenden Sie mindestens 5 Replikate jedes getesteten Holzes.

Abbildung 1: Teststäbchen, die in kurzfristigen Labortests verwendet werden, um die Gribble-Fütterungsraten zu bewerten.  Testen Sie Holzstöcke mit den Abmessungen 2 mm x 4 mm x 20 mm. Von links nach rechts: Ekki, Terpentin, Edelkastanien- und Buchenkernholz und Edelkiefern-Splintholz. Maßstabsleiste 4 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Vakuumimprägnierung
   1. Legen Sie nach der Holzvorbereitung (d. h. schneiden und behandeln Sie die Stöcke unter einem Netz in einem lebensmittelechten Kunststoffbehälter in den Vakuum-Exsikkator und ersetzen Sie den Deckel, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten, die durch eine Beschichtung aus Vakuumfett erleichtert wird (Abbildung 2).
   2. Befestigen Sie ein Drei-Wege-Ventil zwischen dem Schlauch, der den Exsikkator und die Pumpe verbindet, wobei ein drittes Rohr ins Freie führt (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass das Drei-Wege-Ventil für die Luft geschlossen ist und lassen Sie die Pumpe laufen, um ein Vakuum zwischen -0,75 und -1,0 bar innerhalb des Vakuum-Exsikkators zu erreichen und halten Sie dieses Vakuum für 45 Minuten - 1 Stunde.
   3. Tauchen Sie das offene Ende der dritten Röhre in einen Behälter mit Meerwasser. Schalten Sie die Pumpe aus und schließen Sie das Ventil, das zur Pumpe führt, und öffnen Sie dann langsam das Ventil, bis Meerwasser vom Vakuum in den Exsikkator gesaugt wird. Lassen Sie das Wasser fließen, bis es den Kunststoffbehälter über dem Niveau des Netzes füllt.
   4. Ziehen Sie dann das Rohr aus dem Meerwasser in den Behälter, so dass Luft eindringen kann, bis der Exsikkator auf atmosphärischen Druck zurückkehrt. Halten Sie die Sticks unter dem Netz, bis sie auf den Boden des Plastikbehälters sinken.

Abbildung 2: Geräte zum Vakuumieren von Holzstäbchen mit Meerwasser in Vorbereitung auf die Fütterung von Gribbles während eines Laborfütterungsassays.  A) Vakuum-Exsikkator; B) Pumpe; C) Manometer für den Vakuum-Exsikkator; D) Das Drei-Wege-Ventil, das zum Vakuum-Exsikkator, zur Pumpe und zum Freien oder Meerwasser führt (orangefarbenes Rohr). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Auslaugung von Holz
   1. Mit Meerwasser gesättigte Teststäbchen in Meerwasser tauchen, das in 50-ml-Röhrchen enthalten ist (Abbildung 3). Ersetzen Sie regelmäßig Wasser für einen Zeitraum von 20 Tagen.
      HINWEIS: Das Auslaugungsverfahren gilt für jedes zu prüfende Versuchsholz, einschließlich behandelter oder natürlicher Hölzer.

Abbildung 3: Sickerwasser aus Holzstäbchen zur Vorbereitung für die Fütterung an Gribbles während eines Laborfütterungsassays.  Holz, das vollständig in Meerwasser eingetaucht war, das in einem 50 ml Falcon-Röhrchen enthalten war, mit regelmäßigem Wasserwechsel (1-3 Tage), produzierte deutlich gefärbtes Sickerwasser. Von links nach rechts Sickerwasser aus Kernholz von; Edelkastanie, Terpentin, Ekki und Buche und Waldkiefer Splintholz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Extraktion von Gribble

1. Extrahieren Sie einzelne Proben von Gribble aus einem befallenen Holzblock. Verwenden Sie eine feine Pinzette und einen dünnen Pinsel (Größe 000/0,4 mm oder kleiner). Ziehen Sie vorsichtig jedes Holz, das den Gribble-Bau bedeckt, mit der Pinzette zurück
   HINWEIS: Höhlen befinden sich auf der Oberfläche von Holz und können durch kleine Löcher identifiziert werden (Abbildung 4).
2. Sobald gribble freigelegt wurde, verwenden Sie einen Pinsel, um vorsichtig Personen von unten aufzunehmen und in einer mit Meerwasser gefüllten Petrischale abzulegen. Überprüfen Sie Gribble unter einem Mikroskop, um Arten zu identifizieren und sicherzustellen, dass während der Extraktion keine Schäden verursacht wurden.
   HINWEIS: Pleopoden schlagen sind ein Zeichen von Vitalität.
   1. Entsorgen Sie alle Weibchen, die Eier brüten, da gravide Weibchen eine reduzierte Fütterungskapazität haben.

Abbildung 4: Bild eines Gribble-Baus mit zwei typischen Belüftungslöchern. Hrsg. quadripunctata graben auf einem Stock aus Radiata Kiefernholz, Größe 2 mm x 4 mm x 20 mm. Zwei kleinere Lüftungslöcher sind neben dem Baueingang zu sehen. Maßstabsleiste 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.  

3. Identifizierung von Limnoria quadripunctata
   1. Identifizieren Sie Limnoria quadripunctata unter einem Stereomikroskop durch die vier verschiedenen Tuberkel, die in einem quadratischen Muster angeordnet sind, auf dem Pleotelson des Tieres zusätzlich zu einer X-förmigen Carina auf dem fünften Pleonit19 (Abbildung 5).

Abbildung 5: Limnoria quadripunctata Identifizierende Merkmale.  Bild der dorsalen Oberfläche Limnoria quadripunctata, aufgenommen auf einem Stereomikroskop mit x20-Vergrößerung. Erkennungsmerkmale, die durch roten Pfeil angezeigt werden - zeigt die X-förmige Carina und den blauen Pfeil an - zeigen vier Tuberkel auf Pleotelson an. Maßstabsleiste 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Brunnenplatten vorbereiten

1. In Multi-Well-Platten mit Vertiefungen mit einem Durchmesser von 20 mm wird ein Prüfstab und 5 ml ungefiltertes Meerwasser zwischen 32 und 35 Netzteil pro Vertiefung platziert (Abbildung 6).
2. Platzieren Sie Behandlungen / Holzarten systematisch in der gesamten Brunnenplatte, so dass jede Holzart mindestens einmal pro Platte vertreten ist. Fügen Sie einen Gribble pro Vertiefung hinzu.
   ANMERKUNG: Die Temperatur sollte in einem Inkubator bei 20 °C ± 2 °C für die Spezies L stabil gehalten werden. quadripunctata, andere Arten von Limnoria können mit Anpassungen der Temperatur verwendet werden, um der spezifischen Art zu entsprechen.
3. Halten Sie die Platten unter konstanten dunklen Bedingungen, da die Photoperiode keinen Einfluss auf die Mahlgeschwindigkeit ^hat15.

Abbildung 6: Versuchsaufbau für den Gribble Feeding Assay.  Ein Beispiel für eine 12-Multi-Well-Platte, die bei der Laboruntersuchung der Gribble-Fütterungsrate verwendet wird. Jede Vertiefung enthält 5 ml Meerwasser und einen Prüfstab (20 mm x 4 mm x 2 mm) verschiedener Holzarten; Waldkiefer Splintholz und Ekki, Buche, Edelkastanie und TerpentinKernholz. Maßstabsleiste 20 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Fäkalpellets sammeln und zählen und Vitalität beurteilen.

1. Zweimal pro Woche den Teststäbchen und jeden Gribble (einen pro Vertiefung) von der Bohrlochplatte entfernen und in eine frisch vorbereitete Brunnenplatte (mit 5 ml Meerwasser pro Vertiefung [32-35 PSU, 18-22 °C]) geben.
2. Verwenden Sie einen Pinsel, um Fäkalienpellets vor dem Übertragen vorsichtig vom Stick abzubürsten, und bewahren Sie die Fäkalpellets im ursprünglichen Brunnen auf.
   HINWEIS: Vor der Übertragung des Gribbles auf einen frischen Brunnenteller kann die Vitalität auf einer Skala von 1-5 beurteilt werden. 1= tot, 2 = passiv, nicht auf dem Holz, 3 = aktiv schwimmende oder schlagende Pleopoden, nicht auf dem Holz, 4 = Kriechen auf der Holzoberfläche, 5 = in den Wald eingegraben.
3. Bildverarbeitung
   1. Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um Klumpen zu trennen, so dass einzelne Pellets sichtbar sind, und bürsten Sie Pellets von den Rändern des Brunnens weg. Machen Sie ein detailliertes Foto unter einem Stereomikroskop, bei vergrößerung x4 und laden Sie es auf einen Computer hoch (Abbildung 7).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Pellets scharf sind und der Hintergrund gleichmäßig ist, ohne Schatten oder Lichtreflexionen auf der Wasseroberfläche.

Abbildung 7: Bild von Fäkalienpellets. Hrsg. quadripunctata fäkale Pellets (kleine, zylindrische, braune Pellets) aus der Fütterung von Radiata-Kiefernholz in einem Brunnen einer Multi-Well-Platte. Aufgenommen bei x4 Vergrößerung. Bilder vor der Manipulation für die Bildanalyse (siehe Abbildung 7). A) Beispiel für ein geeignetes Bild, das für die automatisierte Zählung in ImageJ verwendet werden soll. Pellets sind ausreichend verteilt und von den Rändern des Brunnens entfernt. Der Brunnen ist zentriert und es gibt keine Hindernisse oder Reflexionen. B) Ein Beispiel für ein Bild, das für die Bildanalyse ungeeignet ist. Der Brunnen ist außerhalb der Mitte und schneidet die untere Hälfte ab. Blauer (gepunkteter) Kreis zeigt Lichtreflexion von der Wasseroberfläche. Der orangefarbene (feste) Kreis zeigt Pellets, die zu dicht beieinander und zu nahe am Rand des Brunnens verklumpt sind. Roter (gestrichelter) Kreis zeigt einen Holzspäne, der nicht entfernt wurde. Maßstabsleiste 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.  

Abbildung 8: Ein Flussdiagramm des Prozesses, der in ImageJ zum Zählen von Fäkalpellets verwendet wird.  A) Importieren einer Bildsequenz in die Registerkarte Datei von ImageJ. B) Die Schaltfläche "Durchsuchen" im Dialogfeld "Bildsequenz importieren", um eine Sequenz von Bildern von einem lokalen Gerät zu importieren. C) Verwenden des Kreiswerkzeugs zum Auswählen eines Bereichs mit Kotpellets D) Schaltfläche "Außen löschen" im Bereich "Bearbeiten" zum Entfernen außerhalb des ausgewählten Bereichs. E) Schaltfläche Binär in der Registerkarte Prozess erstellen. F) Schaltfläche Skalierung in der Registerkarte Analysieren festlegen. Der Abstand in Pixeln entspricht der Anzahl der Pixel zu einer Maßeinheit (mm). G) Schaltfläche Partikel analysieren auf der Registerkarte Analysieren. Größe (Einheit ^ 2) auf die untere Schwelle der Kotpelletgröße in Pixeln bis unendlich festgelegt. Show 'Outlines' und 'Summarise' sind ausgewählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Datenanalyse
   1. Konvertieren Sie die Anzahl der Pellets in Pellets pro Tag, was ein indirektes Maß für die Fütterungsrate ergibt. Verwerfen Sie Daten von mausernden Individuen an Tagen, an denen die Mauser stattgefunden hat (Abbildung 9).
      HINWEIS: Die Mauser erfolgt über 1-3 Tage und kann identifiziert werden, wenn eine vollständige Häutung des Exoskeletts zu sehen ist.

Abbildung 9: Beispiel für eine Körnerhäutung.  Gribble (L. quadripunctata) Mauser, auf einem Radiata Kiefernholz Teststab Größe 20 mm x 4 mm x 2 mm. Häutungen werden durch rote Kreise angezeigt. Maßstabsleiste 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Representative Results

Ein Fütterungsexperiment von L. Quadripunctata wurde über 20 Tage unter Verwendung von fünf verschiedenen Holzarten (Waldkiefer (Pinus sylvestris L) Splintholz und Kernholz von Buche (Fagus sylvatica L), Ekki (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), Edelkastanie (Castanea sativa Mil) und Terpentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (siehe Materialtabelle) im November 2020 durchgeführt. Pro Holzart wurden acht Replikatstöcke verwendet und pro Stock wurde ein Exemplar von Limnoria quadripunctata gefüttert. Alle Gribble wurden aus Beständen erworben, die in Aquarien am Institute of Marine Sciences, University of Portsmouth, UK, aufbewahrt werden. Die Bestände werden regelmäßig mit Wildsammlungen von der Südküste Englands ergänzt. Die Tiere sind vor dem Experiment gut an die stabilen und konsistenten Kulturbedingungen gewöhnt. Holzstöcke (20 mm x 4 mm x 2 mm) wurden vor dem Fütterungsversuch zwei Wochen lang im Meerwasser ausgelaugt. Ein Gribble, ein Teststab und 5 ml Meerwasser wurden pro Bohrung in eine 12 Multi-Well-Platte gegeben und in einem Inkubator bei stabilen Bedingungen von 20 °C (± 0,2 °C) und bei konstanter Dunkelheit aufbewahrt. Fäkalpellets wurden gezählt und alle 2 bis 5 Tage gesammelt, mit vollem Wasserwechsel bei jeder Sammlung. Von jeder Holzart wurden acht Replikate verwendet, so dass insgesamt vierzig Stöcke mit je einem einzelnen Gribble vorhanden waren. Meerwasser, das zum Auslaugen von Holz verwendet und während des gesamten Experiments verwendet wurde, wurde direkt aus dem Aquarium gewonnen, das zur Aufzucht von Exemplaren verwendet wurde. Die Meerwasserbedingungen sind im Aquarium stabil und im Inkubator stabil. Die Verdunstung aus dem geringen Wasservolumen, das pro Brunnen verbraucht wird, wird durch das Deckeldesign der Brunnenplatten und den vollständigen Wasserwechsel alle 2-5 Tage minimiert.

Die Pellets wurden automatisch mit Bild J (Version 1.8.0_112) gezählt.

Gribble, das sich mit Waldkiefern-Splintholz als Kontrolle ernährte, produzierte konstant die meisten Fäkalpellets pro Tag, abgesehen von Tag 20, an dem die Pelletproduktion von der Buche überholt wurde. Ekki produzierte von allen getesteten Holzarten die geringsten Fäkalpellets pro Tag. Die zweithöchste Fäkalpelletproduktion wurde auf Buche beobachtet, gefolgt von Edelkastanie und Terpentin. Es gab einen Anstieg der Fäkalpelletproduktion bei allen Arten von Tag 5 bis Tag 7. Die Pelletproduktion sank bei allen Arten außer Ekki zwischen Tag 7 und Tag 12, möglicherweise aufgrund der erhöhten Zeit zwischen den Wasserwechseln. Danach blieb die Fäkalpelletproduktion bei jeder der Holzarten ziemlich konstant. Ab Tag 14 nahm die Föhre in der täglichen Fäkalpelletproduktion ab, während die Buche zunahm (Abbildung 10).

Abbildung 10: Anzahl der Fäkalpellets pro Tag (n=40) (mittlere ± SE), die von L. quadripunctata unter Verwendung verschiedener Holzarten über 20 Tage produziert werden. Terpentin- und Edelkastanien-, Buchen- und Ekki-Kernholz getestet, wobei Waldkiefern-Splintholz als Kontrolle verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die höchste Vitalität der Punktzahl (5) wurde bei den meisten Individuen beobachtet, die sich von Waldkiefernholz ernährten, mit Ausnahme des einen toten Individuums. 5 zeigt Tiere an, die sich in das Holz eingegraben haben und dies war nur auf Waldkiefernsprengholz und Buchenkernholz zu sehen. Bis Tag 12 für Waldkiefer und Tag 20 für Buche hatten sich alle lebenden Individuen in den Wald eingegraben. Edelkastanie hatte die höchste prozentuale Sterblichkeit, nahm aber im Laufe der Zeit nicht zu. Der Rest der lebenden Individuen blieb bei einer Vitalität von 4 (Krabbeln auf der Holzoberfläche), abgesehen von Tag 14, wo zwei Individuen vom Wald waren (Vitalität von 3). Ekki und Terpentin hatten auch die Mehrheit der Individuen bei einer Vitalität von 4 über die Dauer des Experiments, abgesehen von Tag 14 und Tag 5 für Terpentin. Die Mortalität zeigte im Laufe der Zeit keine Zunahme über eine der Holzarten hinweg. Nur bei Waldkiefer und Buche wurde beobachtet, dass das Graben zunahm, während die anderen drei Holzarten meist bei einer Vitalität von 4 blieben (Abbildung 11).

Abbildung 11: Vitalität von Individuen im Laufe der Zeit, in Prozent der Replikate, die sich von verschiedenen Holzarten ernähren.  Terpentin- und Edelkastanien-, Buchen- und Ekki-Kernholz getestet, wobei Waldkiefern-Splintholz als Kontrolle verwendet wird. Von acht Replikaten pro Holzart wurde der Prozentsatz bei unterschiedlichen Vitalitäten über den 20-tägigen Versuchszeitraum aufgetragen. Dunkelblau steht für eine Vitalität von 5 (Graben), Hellblau für eine Vitalität von 4 (auf Holz), Grau für eine Vitalität von 3 (außerhalb von Holz, aber aktiv), Lila für eine Vitalität von 2 (außerhalb von Holz und passiv) und Schwarz zeigt eine Vitalität von 1 oder toten Individuen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Ergebnisse dieser Testmethode können verwendet werden, um Holzarten oder Behandlungen zu identifizieren, die eine erhöhte Beständigkeit gegen marine Holzbohrerschäden aufweisen. Anschließend können Marinefeldversuche, wie in der Europäischen Norm EN 275 beschrieben, durchgeführt und die Haltbarkeit zusätzlich zum Vergleich mit nicht haltbarem Kontrollholz bewertet werden (0= 'kein Angriff', 1= 'leichter Angriff', 2= 'mäßiger Angriff', 3= 'schwerer Angriff', 4='^Versagen'20).

Discussion

Vor der Auswahl von Gribble-Proben, die im Fütterungsexperiment verwendet werden sollen, sollten Die Individuen gescreent werden, um ihre Eignung zu beurteilen. Es kann aufgrund von Größenunterschieden zu Unterschieden in der Fütterungsrate zwischen den Individuen kommen, daher sollten nur ausgewachsene erwachsene Exemplare ausgewählt werden. Borges et al., 200917, fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen der Fütterungsrate von Individuen zwischen ^1,5 mm und 3 mm Länge. Weibliche Limnoria brüten ihre Eier, während dieser Zeit haben sie eine reduzierte Fütterungsrate. Daher sollten brütende Weibchen bei der Auswahl der Exemplare kontrolliert und verworfen werden. In ähnlicher Weise haben mausernde Individuen auch eine reduzierte ^{Fütterungsrate21}. Daher sollten Fäkalienpellets an Tagen, an denen sich Personen mausern, verworfen ^werden17. Da die Häutung länger als einen Tag erfolgt, werden Häutungen gezählt, wenn an Pelletsammeltagen eine vollständige Exoskelett-Häutung zu sehen ist. Limnoria hat bei der Herstellung ihrer Höhlen eine erhöhte Fäkalpelletproduktion und produziert auch mehr Frass (feiner Holzabfall, der nicht in die Kotpellets eingearbeitet wird). Der hohe Frassgehalt kann die Identifizierung von Kotpellets beeinträchtigen, kann aber vor der Bildaufnahme für die automatische Zählung vorsichtig unter stereomikroskopischer Beobachtung mit einer Pipette oder einem feinen Pinsel entfernt werden. Alternativ können Pellets manuell gezählt werden.

Die Software ImageJ benötigt qualitativ hochwertige, fokussierte Bilder für die Bildverarbeitung. Dazu sollten Bilder aufgenommen werden, in denen Fäkalpellets nicht durch die Brunnenwände behindert werden und mit einem Pinsel einzelne Kotpellets getrennt werden. Der Hintergrund des Bildes muss einheitlich sein und keine Licht- oder Schattenbereiche enthalten, die stören würden, wenn das Bild für die Verarbeitung in ImageJ in binär umgewandelt wird. Es ist nicht notwendig, Kontrast oder Licht vor der Bildverarbeitung anzupassen. Beim Importieren eines Stapels von Bildern müssen alle Fotos in derselben Ebene aufgenommen werden, damit während der Verarbeitung keine Fehler auftreten.

Die Vakuumimprägnierung von Holz mit Meerwasser bewirkt, dass das Holz sinkt und für den Gribble leicht zugänglich wird. Wenn Holz ausgelaugt wird, bevor es Grieben ausgesetzt wird, werden alle wasserlöslichen Extrakte entfernt, die sich auf ihre Fütterungsrate auswirken oder die Mortalität verursachen ^können12. Die Mortalität aufgrund von Extrakten im Wasser ist nicht repräsentativ für die zu erwartende Mortalität im Meer, wo die Extrakte schnell verdünnt werden. Well-Platten sollten auf einer konstanten Temperatur gehalten werden, die für die zu testende Gribble-Spezies optimal ist. Die häufigste südbritische Art, L. quadripunctata, ernährt sich gut zwischen 15 und 25 °C und hat eine optimale Fütterungsrate bei 20 °^C17 , so dass die Platten bequem in einem Inkubator bei konstanten 20 °C ± 0,5 °C aufbewahrt werden können.

Die Beurteilung der Vitalität der Futterkrone erkennt subletale oder präletale Auswirkungen von Holzbehandlungen oder natürlich haltbaren Hölzern. Eine hohe Vitalität von 5 zeigt an, dass der Gribble ein natürliches Verhalten zeigt, indem er sich in das Holz eingräbt und durch den Kontakt mit ihm keine nachteiligen Auswirkungen erleidet. Eine Vitalität von 4 zeigt, dass der Gribble zwar nicht in das Holz eingegraben ist, aber dennoch bequem an seiner Oberfläche entlang kriechen kann. Eine Punktzahl von 3 wird für Gribble vergeben, die nicht auf dem Holz sind, sondern aktiv im Wasser schwimmen oder stationär sind, aber mit schnell schlagenden Beinen und Pleopoden. Eine geringe Vitalität von 2 bedeutet, dass der Gribble freiliegt und / oder wenig Energie hat. Dies kann auf eine längere Zeit niedriger Fütterungsrate oder auf Extraktive zurückzuführen sein, die entweder in das Wasser gelangen oder während der Fütterung zugänglich werden. Wenn nach 7-8 Wochen eine hohe Mortalität beobachtet wird, kann dies auf Hunger zurückzuführen sein, da verhungerte Gribbles (in Brunnen mit nur 5 ml Meerwasser und ohne Holz gehalten) so lange überleben können (persönliche Beobachtung).

Der Vorteil der Verwendung eines kurzfristigen Labortests im Gegensatz zu längerfristigen marinen Feldversuchen besteht darin, dass neuartige Behandlungen und Holzprodukte schnell getestet werden können, um ihr Potenzial für den kommerziellen Einsatz zu identifizieren. Darüber hinaus können solche Assays eine schnelle Optimierung von Behandlungsprozessen ermöglichen. Wenn im Vergleich zu einem Kontrollholz eine deutlich geringere Fäkalpelletproduktion beobachtet wird, können die Tests durch marine Versuche ergänzt werden. Slevin et al., 201523 und Westin et al., 201624 zeigen eine gute Korrelation zwischen Labor- und Feldbewertungen, indem sie das gleiche Holz in zwei verschiedenen Umgebungen testen, was auf eine leistungsfähige Vorhersagefähigkeit des ersteren hinweist. Ein Kurzzeitassay kann mehrere Wochen lang durchgeführt werden. Ausgehungerte Gribbles können 7-8 Wochen überleben, wenn sie in gut belüftetem Wasser ohne Holz (persönliche Beobachtung) gehalten werden, was bei der Untersuchung der Mortalitätsreaktion auf verschiedene Holzarten einen zusätzlichen Vergleich liefern kann. Aufgrund neuerer, unveröffentlichter Beobachtungen gibt es jedoch keine signifikanten Schwankungen in der Fäkalpelletproduktion über einen Zeitraum von mehr als 20 Tagen, außer wenn die Mortalität beginnt. Darüber hinaus laufen frühere Methoden, wie die von Borges et al., 2008 und 2009, 15 Tage lang. Daher sind 20 Tage eine ausreichende Zeit für einen laborbasierten Schnelltest, um hinweise auf die Haltbarkeit von Holz zu geben.

Während sich diese Methode für Kurzzeitversuche eignet, sollten die Erkenntnisse durch langfristige marine Feldexperimente ergänzt werden. Laborbedingungen können die Vielfalt der biotischen und abiotischen Faktoren, die Holz in der Meeresumwelt beeinflussen können, nicht replizieren. Biofouling-Organismen können zusammen mit anderen Arten von marinen Holzbohrern (wie Schiffswürmern) noch vorhanden sein und schädigen das ^Holz25,26. Darüber hinaus kann abriebender Abrieb von wellengeworfenen Schindeln oder Sand Holz abnutzen, das dann für Gribbles zugänglich werden ^kann27. Eine Standard-Labormethode kann jedoch ein erstes Screening neuer Produkte ermöglichen, die für marine Anwendungen vielversprechend sind. Durch die Bewertung der Fäkalpelletproduktion und -vitalität können Hölzer identifiziert werden, die die Fütterungsrate besser reduzieren können.

Aufgrund der Vorschriften und Einschränkungen von Holzschutzmitteln wie CCA und Kreosot ist es wichtig, neuartige Produkte zu finden, um diese Behandlungen zu ersetzen. Holz unterliegt in der Meeresumwelt einem hohen Grad an biologischem Abbau, ist aber immer noch eines der erneuerbarsten verfügbaren Baumaterialien und behält seine Festigkeit und Struktur gut im ^{Meerwasser27,28}. Holz, das gegen biologischen Abbau resistent ist, wird nicht nur die Kosten senken, sondern auch umweltfreundlicher sein als die Verwendung alternativer Materialien wie Beton oder Stahl, die während der Herstellung einen hohen Energieeinsatz ^{erfordern29,30}, oder Breitband-Biozid-Konservierungsstoffe, die auslaugen und das umgebende Ökosystem beeinträchtigen ^{können31,32,33,34,35,36, 37. Auflage}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well cell culture plates	ThermoFisher Scientific	150200
50ml Falcon tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Adjustable volume pipette	Fisher Scientific	FBE10000	1-10 ml
Beech	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Fagus sylvatica	Taxonomic authority: L
Ekki	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Lophira alata	Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn.
Forceps	Fisher Scientific	10098140
Incubator	LMS LTD	INC5009
Microporous specimen capsules	Electron Microscopy Sciences	70187-20
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
Scots Pine	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Pinus sylvestris	Taxonomic authority: L.
Size 00000 paintbrush	Hobby Craft	5674331001	Size 000 or 0000 also acceptable
Sweet Chestnut	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Castanea sativa	Taxonomic authority: Mill
Turpentine	P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia)	Syncarpia glomulifera	Taxonomic authority: (Sm.) Nied.
Vacuum desiccator	Fisher Scientific	15544635