Summary
Este protocolo describe los pasos para inducir la uveítis micobacteriana preparada (PMU) en ratones. Este método describe los pasos para ayudar a producir una inflamación ocular confiable y robusta en el sistema modelo de ratón. Usando este protocolo, generamos ojos uveíticos y ojos compañeros no inflamados de animales individuales para su posterior evaluación con ensayos inmunológicos, transcriptómicos y proteómicos.
Abstract
El término "uveítis" describe un conjunto heterogéneo de afecciones que presentan inflamación intraocular. En términos generales, la uveítis se define por la etiología: infección o autoinmunidad. La uveítis infecciosa requiere tratamiento con los agentes antimicrobianos apropiados, mientras que la uveítis autoinmune requiere tratamiento con corticosteroides u otros agentes inmunosupresores. La uveítis postinfecciosa es una forma de uveítis crónica que requiere corticosteroides para controlar la secuela inmune después de la infección inicial. La uveítis asociada con la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es una forma bien reconocida de uveítis postinfecciosa, pero los mecanismos de la enfermedad no se comprenden completamente. Para comprender el papel que desempeñan los antígenos micobacterianos y los ligandos innatos en la estimulación de la inflamación ocular crónica después de la infección por mTB, se desarrolló el modelo de uveítis micobacteriana (PMU) para su uso en ratones. Este manuscrito describe los métodos para generar PMU y monitorear el curso clínico de la inflamación utilizando imágenes de fondo de ojo en color y tomografía de coherencia óptica (OCT). La PMU es inducida por la inmunización con extracto micobacteriano muerto por calor seguido de la inyección intravítrea del mismo extracto en un ojo siete días después. La inflamación ocular se monitorea longitudinalmente utilizando imágenes in vivo y seguida de la recolección de muestras para una amplia gama de ensayos, que incluyen histología, citometría de flujo, análisis de citoquinas, qPCR o secuenciación de ARNm. El modelo de ratón de PMU es una nueva herramienta útil para estudiar las respuestas oculares a la mTB, el mecanismo de la uveítis crónica, y para las pruebas de eficacia preclínica de nuevas terapias antiinflamatorias.
Introduction
El término "uveítis" describe un conjunto heterogéneo de condiciones que presentan inflamación intraocular1. Los modelos animales de uveítis son importantes para comprender los mecanismos de la enfermedad y para las pruebas preclínicas de nuevas terapias. Se han establecido varios modelos animales de uveítis2. Los dos que se han estudiado más extensamente son la uveítis autoinmune experimental (o uveoretinitis; EAU) y uveítis inducida por endotoxinas (EIU). La EAU se genera típicamente por inmunización con antígenos oculares o puede ocurrir espontáneamente cuando la tolerancia central se interrumpe en ausencia del gen AIRE 3,4. Desde entonces, se han desarrollado otras variantes del modelo 5,6,7 para incluir diferentes péptidos uveitogénicos; Estos han sido revisados extensamente 8,9,10. EAU es el modelo primario para las formas de uveítis autoinmune dependiente de células T, como la enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada y la coriorretinitis en humanos. La EIU se genera por inyección sistémica o local de lipopolisacárido bacteriano (LPS)10,11. La EIU ha sido utilizada como modelo de uveítis aguda generada por la activación de vías de señalización inmune innata12. Ambos modelos han sido fundamentales para la comprensión actual de la inmunología ocular, pero ninguno es un modelo efectivo para la uveítis crónica postinfecciosa. Recientemente establecido en ratones, el modelo de uveítis micobacteriana (PMU) preparada ahora proporciona un enfoque para interrogar y evaluar los aspectos clínicos y celulares de esta forma de uveítis13.
Existe una alta prevalencia de infección micobacteriana en todo el mundo, con más de 10 millones de nuevos casos y más de 1,4 millones de muertes reportadas por la Organización Mundial de la Salud en 201914. La manifestación extrapulmonar de la infección activa de tuberculosis (TB) incluye uveítis y es una causa bien reconocida de uveítis infecciosa15,16. Las manifestaciones de la uveítis asociada a TB son proteicas, lo que probablemente refleja múltiples mecanismos distintos de la enfermedad para incluir infección ocular directa, así como inflamación inmunomediada menos conocida17,18,19. Los mecanismos propuestos para estas secuelas postinfecciosas incluyen una respuesta inflamatoria crónica estimulada por la persistencia de una infección pauci-bacilar en el epitelio pigmentario de la retina (EPR), una respuesta inflamatoria crónica estimulada por la presencia de patrones moleculares residuales asociados a patógenos (PAMP) de una infección ocular eliminada con éxito, y la activación inadecuada de la respuesta inmune adaptativa contra antígenos oculares a través de un proceso de mimetismo molecular o antígeno. diseminación causada por infección sistémicade TB 20,21,22,23.
Con el fin de obtener una mejor comprensión mecanicista de la uveítis postinfecciosa crónica y estudiar el papel de los antígenos micobacterianos en el inicio de la enfermedad, se desarrolló el modelo PMU para su uso en ratones13,24. En consecuencia, para provocar inflamación, el ratón primero recibe una inyección subcutánea de antígeno de la cepa H37Ra de Mycobacterium tuberculosis muerta por calor para imitar la infección sistémica, seguida siete días después por la inyección intravítrea del mismo antígeno administrado al ojo izquierdo o derecho para imitar la infección ocular local. La intensidad y la duración de la uveítis resultante se monitorizan mediante tomografía de coherencia óptica (OCT) longitudinal in vivo e imágenes del ojo25. La PMU se caracteriza por una panuveítis aguda mieloide dominante que se convierte en una uveítis posterior crónica dominante de células T con vitritis, inflamación retiniana perivascular y áreas focales de daño retiniano externo26. La presencia de inflamación granulomatosa en el segmento posterior del ojo sugiere que el modelo PMU puede ser utilizado para estudiar algunas formas de uveítis anterior (granulomatosa y no granulomatosa) e intermedia, observada en pacientes con evidencia inmunológica de infección por Mtb pasada27. Además, se ha sugerido que los componentes de la Mtb muerta por calor utilizados en el modelo PMU desencadenan respuestas inmunes subyacentes a los aspectos de la uveítis recurrente en pacientes con tuberculosis ocular que responden a la terapia antituberculosa (ATT)28. Debido a las diferencias en el inicio de la enfermedad y el curso inflamatorio en comparación con EAU y EIU, PMU representa un nuevo modelo animal de uveítis que no depende de la inmunización con antígenos oculares y puede ayudar a dilucidar los mecanismos de la enfermedad en pacientes con uveítis crónica. Este protocolo describe los métodos para generar PMU, monitorear el curso clínico de la inflamación y recolectar muestras oculares para el análisis post mortem con citometría de flujo.
Protocol
Todos los procedimientos realizados fueron aprobados localmente por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington (protocolo de estudio de animales # 4481-02) o en concordancia con la licencia del Ministerio del Interior del Reino Unido (PPL 30/3281) y el Grupo de Revisión Ética de la Universidad de Bristol. Los experimentos realizados en ambas instituciones concordaron con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y Visual. La PMU se generó en ratones C57BL / 6J de 6-10 semanas de edad; todos los ratones pesaban al menos 18 g en el momento de la inducción de la uveítis y fueron confirmados negativos para la mutación rd8 del gen Crb129. Los ratones se mantuvieron con comida estándar y agua medicada (paracetamol 200-300 mg / kg / día) ad libitum en condiciones específicas libres de patógenos. La eutanasia animal se realizó utilizando un método estándar de inhalación de dióxido de carbono30.
1. Preparación del antígeno para inyección subcutánea
- Realice todos los procedimientos de esta sección dentro de una campana extractora de humos químicos para evitar la inhalación o el contacto de la piel con el polvo Mtb H37Ra. Maneje de acuerdo con sus políticas institucionales para el Adyuvante de Freund Completo (típicamente BSL-1). Esto incluye el uso de guantes resistentes a productos químicos, gafas de seguridad y ropa de trabajo protectora (bata de laboratorio).
- Utilice una buena técnica estéril para evitar la contaminación de los reactivos que se introducirán en animales de experimentación.
- Haga la suspensión de Mtb en PBS mezclando 5 mg de polvo liofilizado de M. tuberculosis H37Ra con 2.5 ml de PBS frío en un tubo de microcentrífuga de 5 ml. Vórtice una vez durante 30 s y luego colóquelo en hielo.
- Para generar una suspensión fina del H37Ra en PBS, sonicar la suspensión en hielo durante 5 min.
- Dessujete el cuerpo de la unidad convertidora y limpie la sonda con un hisopo con alcohol al 70% (v/v).
- Encienda el sonicador, ajuste la configuración de energía a 4 girando la perilla de control de potencia y sumerja la punta de la sonda en el polvo micobacteriano que contiene PBS. Asegúrese de que la punta de la sonda esté sumergida al menos a la mitad de la profundidad de la muestra y de que la punta de la sonda no toque la pared del tubo de microcentrífuga.
- Sonicar la mezcla en hielo durante 30 s, hacer una pausa de 30 s y repetir durante un total de 5 minutos para dispersar completamente el polvo en una suspensión uniforme sin calentar el líquido.
- Agregue 2.5 ml de adyuvante incompleto de Freund a la mezcla y repita el proceso de sonicación en hielo hasta que la emulsión forme una consistencia similar a la pasta de dientes.
- Ajuste la alimentación a 0 usando la perilla de control y apague la unidad para finalizar la sonicación. Retire la punta de la suspensión y limpie la sonda con un hisopo con alcohol.
- Conservar la emulsión de antígeno a 4 °C. Hacer lotes de la emulsión ayudará a garantizar la consistencia entre los experimentos. La emulsión puede conservarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
2. Inyección subcutánea
- Realice la inyección subcutánea una semana antes de la inyección intravítrea (designada como día -7).
- Cargue una jeringa de 1 ml (sin aguja conectada) con la emulsión micobacteriana. Debido a la viscosidad y opacidad de la emulsión, las burbujas de aire difíciles de ver pueden llenar la jeringa.
- Para evitar burbujas de aire en la jeringa, después de cargar 0.2-0.3 ml de emulsión, invierta la jeringa (punta hacia arriba) y golpee suavemente la jeringa repetidamente en el borde de un mostrador para llevar las burbujas a la superficie.
- Expulse el aire de la jeringa y continúe llenando la jeringa. Invertir y golpear intermitentemente hasta que se llene.
- Coloque una aguja de 25 G en la jeringa y avance la emulsión para llenar la aguja. Guarde la jeringa en hielo hasta que la use.
- Para realizar la inyección subcutánea de forma segura, anestesiar al ratón o utilizar métodos de sujeción humanitarios que permitan un fácil acceso a los cuartos traseros del animal31.
- Para anestesiar para inyección subcutánea, coloque al animal en una cámara de inducción de isoflurano (3% -4% para inducción y 1% -3% para mantenimiento). Una vez anestesiado, asegúrese de que el ratón tenga una frecuencia respiratoria lenta y no muestre signos de dificultad respiratoria.
- Coloque las inyecciones subcutáneas en la superficie dorsal de las caderas o en la superficie ventral de las piernas proximal a la región de los ganglios linfáticos inguinales.
- Inserte cuidadosamente la aguja para evitar inyectarla en el músculo. Inyecte 0,05 ml de la emulsión Mtb en el espacio subcutáneo. No retire la aguja inmediatamente para permitir que la emulsión espesa se inyecte completamente.
- Repita la inyección en ambos lados izquierdo y derecho para un total de 0,1 ml por animal.
- Si está anestesiado, coloque el mouse en una almohadilla térmica tibia hasta que se recupere por completo. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
- Devuelva el ratón a su jaula después de la recuperación completa y etiquete la tarjeta de la jaula con la fecha de la inyección subcutánea.
- Proporcionar analgesia con paracetamol oral (200 mg / kg / día), pero no con AINE, ya que los agentes antiinflamatorios pueden afectar la inducción de la uveítis.
3. Preparación del material de antígenos para inyección intravítrea
- Realizar todos los procedimientos de esta sección en condiciones estériles adecuadas para evitar la contaminación de la suspensión intravítrea de Mtb.
- Hacer las suspensiones intravítreas.
- Para la inducción de panuveítis leve a moderada, hacer la suspensión intravítrea a una concentración de 5 mg/ml agregando 5 mg del extracto de micobacterias a 1 ml de 1x PBS.
- Para la inducción de panuveítis moderada a grave, hacer la suspensión intravítrea a una concentración de 10 mg/ml agregando 10 mg del extracto de micobacterias a 1 ml de 1x PBS.
- Vórtice una vez durante 30 s y luego colóquelo en hielo.
- Para generar una suspensión fina del H37Ra en PBS, sonicar la suspensión en hielo durante 10 minutos como se describe en el paso 1.4. Alícuota esta solución madre en volúmenes de 100 μL y almacenar a -20 °C.
- Antes de usar, descongele a temperatura ambiente y haga el vórtice a temperatura alta durante 1 minuto. Mantenga las alícuotas en hielo mientras se transportan a la instalación para animales.
4. Procedimiento de inyección intravítrea el día 0
- Preparación animal
- Use guantes de examen ajustados, coloque el mouse en una balanza de pesaje para obtener su peso en gramos.
- Administrar una inyección intraperitoneal de 0,02 mL/g de peso vivo de una solución que contiene 100 mg/ml de ketamina y 20 mg/ml de xilazina mezclada con agua estéril para anestesiar al animal. Un enfoque alternativo incluye la inducción usando ~1.5% de isoflurano (inhalado).
- Espere aproximadamente 2 minutos para que el ratón se duerma, y luego coloque el ratón en una caja de calentamiento y cubra la tapa. Realizar pruebas de reflejos del dolor como pellizco de oreja, dedo del pie y cola para evaluar la profundidad de la anestesia para el procedimiento32.
- Una vez dormido, anestesiar la córnea con 1 gota de 0,5% (v/v) de tetracaína. Evite que la tetracaína se acerque a la nariz o la boca del ratón. Después de 10 s, aplique el exceso de líquido.
NOTA: Se ha observado que la dilatación del iris y la visualización de la cámara anterior (CA) mejoran cuando se administra anestesia tópica, posiblemente debido a la mejora de la supresión del reflejo corneal con la anestesia sistémica y tópica combinada. Sin embargo, este paso podría omitirse si se desea. - Dilatar la pupila con 1 gota de fenilefrina al 2,5% (v/v). Tenga cuidado para evitar cualquier exceso de gotitas que puedan entrar en la nariz o la boca. Después de 2-3 minutos, elimine el exceso de líquido.
- Para disminuir el riesgo de endoftalmitis, agregue 1 gota de betadina al 5% a la superficie del ojo y al cabello circundante. Dejar en el ojo durante 2-3 min.
NOTA: Realice todos los procedimientos de esta sección en condiciones estériles apropiadas para prevenir la endoftalmitis. - Retire la betadina y cubra el ojo con hipromelosa (0,3%) o gel ocular carbómero al 0,2% p/p) para evitar la sequedad bajo anestesia. Esto también ayudará a prevenir la formación de cataratas.
- Configuración del sistema de microinyección
- Realice la inyección intravítrea utilizando una microbomba conectada a un controlador de bomba de microjeringa y una jeringa de inyección (Figura 1A-C). Alternativamente, inyecte con una aguja de 33 G conectada a una jeringa de Hamilton como se describe en la subsección 4.4.
- Conecte una aguja de 34 G al soporte para inyección para montar el inyector. Afloje la tapa de rosca plateada en el extremo frontal del soporte para inyección y deslice la aguja en el cuerpo del soporte aproximadamente hasta la mitad. Apriete el dedo de la tapa de rosca plateada.
- Conecte el tubo al soporte para inyección como se menciona en los pasos 4.2.4-4.2.5.
- Para insertar el tubo en el soporte de inyección, afloje el tornillo de plástico en el extremo posterior del soporte, deslice el tubo a través de la junta en el interior y apriete el tornillo.
- Mantenga un ligero espacio con el extremo del tubo para evitar daños en el tubo durante la inyección. Consulte la figura 1C.
- Descongelar una alícuota de 100 μL de la suspensión madre de micobacterias.
- Agregue 3 μL de una solución de fluoresceína sódica al 1% (AK-Fluor) y vórtice bien.
- Cargue una jeringa de 10 μL con la mezcla de antígeno y fluoresceína sin incluir burbujas de aire.
- Retire la aguja de carga de la jeringa y deslice el tubo a través de la junta de tapón de rosca plateado hasta que la punta alcance la marca cero en el cuerpo de la jeringa.
- Una vez que la punta del tubo esté correctamente alineada con la posición deseada, apriete el dedo del tapón de rosca.
- Enjuague la solución en la jeringa a través del tubo de inyección para cargar completamente el sistema. A continuación, repita los pasos 4.2.8-4.2.11 para volver a cargar la jeringa inyectable.
- Para instalar la jeringa cargada en la microbomba, presione el botón de liberación de la abrazadera en el extremo de la microbomba para abrir las abrazaderas de la jeringa.
- Coloque la tapa del émbolo en el soporte de la tapa del émbolo en el extremo posterior de la microbomba.
- A continuación, deslice el collar de la jeringa sobre el tope del collar y el cuerpo de la jeringa en la abrazadera de la jeringa.
- Suelte el botón de la abrazadera y apriete el tornillo de retención del émbolo. Consulte la figura 1D.
- Deslice el soporte para inyección y la aguja a través de la abrazadera tórica del aparato de inyección estereotáctica. Esta es una plataforma personalizada; Alternativamente, la jeringa se puede sostener y colocar manualmente.
- Ajuste el volumen de infusión y la velocidad del volumen de infusión en el controlador de la bomba de microjeringa para inyectar 500 nL por ciclo a una velocidad de 40 nL/s, respectivamente.
NOTA: Se pueden usar tasas de inyección más rápidas, sin embargo, se puede experimentar más reflujo antes de que se pueda lograr el reposicionamiento de la aguja. - Pruebe el sistema para garantizar el correcto funcionamiento antes de realizar una inyección intravítrea.
NOTA: Cuando el sistema de inyección funciona correctamente, la activación de un ciclo de inyección con el pedal o el panel de control producirá un movimiento visible del soporte de la tapa del émbolo y se verá una pequeña gota de líquido verdoso en la punta de la aguja. En el caso de que no se produzca líquido, active ciclos adicionales o enjuague y vuelva a cargar la jeringa. - Antes de inyectar el ojo, limpie suavemente la aguja con una almohadilla de etanol al 95%.
- Procedimiento de inyección intravítrea
- El ratón se coloca en un aparato estereotáxico para realizar el procedimiento de inyección.
- Mantenga caliente el escenario/plataforma en la que descansa el ratón colocando 2-3 toallas de papel en su superficie.
- Coloque el ratón en posición prona sobre la plataforma. Use las barras de la oreja derecha e izquierda para fijar suavemente la cabeza del animal. Consulte la figura 1E.
- Coloque el ratón y oriente debajo del endoscopio de modo que el aspecto nasal superior del ojo derecho sea visible.
- Use una aguja de 30 G para desplazar las pestañas y exponer la esclerótica. Visualice el limbo y el vaso sanguíneo radial.
- Use una aguja estéril de 30 G para hacer un orificio guía en la esclerótica de 1-2 mm posterior al limbo.
- Inserte la aguja de 34 G unida al soporte de inyección en el ojo a través del orificio guía en un ángulo que evite la lente, pero coloque la punta de la aguja en la cavidad vítrea.
- Usando el controlador de la bomba de microjeringa, inyecte cuidadosamente 1 μL del extracto de Mtb en la cavidad vítrea. En caso de reflujo constante, aumentar el volumen de inyección a 1,5 μL para asegurar la administración adecuada de la dosis.
NOTA: Para controles simulados, inyecte 1 μL de PBS en el ojo del animal. - Verifique la colocación intravítrea mediante la visualización de un reflejo verdoso en el ojo. Consulte la figura 1F.
- Después de 10 s, retire la aguja del ojo. Tenga en cuenta cualquier reflujo.
- Retire el ratón de la plataforma, coloque ungüento ocular con hipromelosa al 0,3% o al 0,2% p/p de carbómero en ambos ojos para la protección de la córnea y pase a la caja de calentamiento de recuperación.
- No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No regrese a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Cuando el ratón esté completamente despierto, regrese a la jaula y agregue una botella de agua medicada de paracetamol (200-300 mg / kg / día). Etiquete la tarjeta de la jaula con la fecha de la inyección de IVT.
- Las inyecciones intravítreas son generalmente bien toleradas. Los signos clínicos que pueden indicar dolor y la necesidad de retirarse del estudio incluyen alopecia periocular (indicativa de autotraumatismo), ulceración corneal, pérdida de peso y postura encorvada.
- Método alternativo para la inyección intravítrea
NOTA: Este procedimiento se realiza utilizando un microscopio quirúrgico y una aguja de 33 G en una jeringa.- Propólta el ojo y manténgalo en posición con un par de fórceps.
- A continuación, aplique gel ocular de carbómero al 0,2 % p/p o gel ocular de hipromelosa al 0,3 % y coloque un cubreobjetos circular (7 mm de diámetro) sobre el ojo.
- Monte una aguja hipodérmica de 33 G en una jeringa Hamilton de 5 μL e insértela aproximadamente 2 mm circunferencial al limbo corneal con un ángulo de inyección de ~45°.
- Guiar el bisel de la aguja hacia el vítreo, deteniéndose entre el cristalino y el disco óptico (desde el punto de vista relativo del cirujano, esto está por encima / cubriendo el disco óptico, aproximadamente a 1,5 mm del sitio de inserción), e inyecte 2 μL de Mtb (a 2,5 ug / μL en PBS) lentamente.
- Mantenga la aguja en su lugar brevemente (para reducir la cantidad de reflujo de la inyección) y luego retírela.
- Después de la inyección, deposite el globo liberando los fórceps. Se puede administrar una gota de 1% p/p de ungüento de cloranfenicol al ojo en este momento para proporcionar protección adicional contra la endoftalmitis posterior a la inyección.
- Después de la inyección, pasar a la caja de calentamiento de recuperación como se menciona en los pasos 4.3.11-4.3.13.
5. Imágenes de OCT para detectar y cuantificar la uveítis
- Preparación animal
- Anestesiar al ratón como se describe en los pasos 4.1.2-4.1.4
- Dilatar la pupila con 1 gota de fenilefrina al 2,5%. Tenga cuidado para evitar cualquier exceso de gotitas que puedan entrar en la nariz o la boca. Después de 2-3 minutos, elimine el exceso de líquido.
- Coloque 0.3% de hipromelosa o 0.2% p/p de gel de carbomero en el ojo para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia. Esto también ayudará a prevenir la formación de cataratas.
- Envuelva al ratón en una capa de gasa quirúrgica para mantener el calor corporal y colóquelo en el casete del animal. Coloque la cabeza con la barra de mordida.
- Adquirir las imágenes OCT de las cámaras anterior y posterior.
NOTA: Si obtiene imágenes de la cámara anterior y posterior, obtenga primero las imágenes de la cámara posterior (PC) para evitar la degradación de la imagen después de la formación de cataratas. La formación de cataratas se puede prevenir con lubricación frecuente y aplicando 0,3% de hipromelosa o 0,2% p/p de gel ocular de carbómero. Para imágenes extendidas (>10 min), mantener el mouse caliente (mediante el uso de una almohadilla térmica) también ayuda.- Después de encender el sistema de imágenes OCT, asegure la lente de imagen correcta y ajuste la posición del brazo de referencia según sea necesario.
- Abra el software de creación de imágenes, cree el ID de mouse único y comience a crear imágenes según el protocolo del fabricante de OCT.
- Usando la opción Free Run con el protocolo de escaneo rápido, coloque el ojo con el nervio óptico centrado en las imágenes de la cámara posterior o el ápice de la córnea en las imágenes de la cámara anterior.
NOTA: La Tabla 1 contiene parámetros de protocolo de imágenes para dos sistemas de imágenes de animales pequeños disponibles comercialmente. Consulte la Tabla de materiales para conocer las especificaciones del producto. - Para la toma de imágenes de la cámara posterior, acerque la OCT a la superficie del ojo. Tenga cuidado para evitar poner la superficie de la lente en contacto con el ojo.
- Una vez que el ojo esté correctamente posicionado, detenga el escaneo rápido y seleccione el protocolo de escaneo de volumen, y active el escaneo con la opción Apuntar .
- Para imágenes del segmento posterior, ajuste hasta que el nervio óptico esté centrado en la imagen de alineación horizontal de B-Scan y que la retina esté alineada con el eje de alineación vertical
- Para imágenes del segmento anterior, ajuste la posición para centrar el vértice de la córnea tanto en la imagen de alineación horizontal de B-Scan como en la imagen de alineación vertical de B-Scan. La presencia de un artefacto de reflexión en ambas imágenes confirmará la alineación adecuada. A continuación, desplace la imagen horizontal lo suficiente como para eliminar el artefacto de reflexión. Consulte la figura 2.
- Haga clic en Instantánea para capturar la imagen de escaneo de volumen y luego haga clic en Guardar.
- A continuación, obtenga el escaneo de línea central promediado. Abra el protocolo de escaneo y haga clic en Aim seguido de Snapshot. Haga clic derecho en el mismo panel y luego haga clic en Promedio.
- Repita los pasos 5.2.1-5.2.9 para cada ojo con ambas lentes.
- Después de recopilar todas las imágenes, retire el ratón del casete y proporcione protección corneal durante la recuperación, tal como se indica en los pasos 4.3.11-4.3.13.
6. Puntuación de la inflamación por OCT
- Califique las imágenes de OCT con la ayuda de los calificadores que están enmascarados a la condición de tratamiento.
NOTA: Para PMU en el modelo de ratón, se recomienda el sistema de puntuación proporcionado en la Tabla 2 . - Si se obtuvieron imágenes de cámara anterior (CA) y cámara posterior (PC), combine estas puntuaciones para obtener la puntuación final de cada ojo.
NOTA: La inflamación de la cámara anterior se resuelve antes que la inflamación de la cámara posterior.
7. Puntuación de la inflamación por histología post mortem
- Al final del experimento, recolecte ojos individuales por enucleación, fije formaldehído al 4% durante la noche y proceda a la incrustación de parafina, seccionamiento y tinción de H&E33.
NOTA: Se recomiendan múltiples secciones de 4-8 μm a lo largo del eje del nervio pupilar-óptico.
NOTA: Tres secciones por ojo son calificadas por un calificador enmascarado utilizando el sistema de puntuación proporcionado en la Tabla 3, y la puntuación promedio de las tres secciones se informa como la puntuación final de inflamación histológica.
Representative Results
Este protocolo demuestra la inducción de uveítis en ratones utilizando el modelo de uveítis micobacteriana (PMU) preparado. Garantizar la consistencia en la inyección subcutánea y la precisión de la inyección intravítrea son pasos clave en el desarrollo del modelo de uveítis micobacteriana (PMU) preparado. La figura 1 muestra el procedimiento de inyección intravítrea de ratón utilizando un aparato estereotáxico. Las barras para los oídos ayudan a colocar suavemente la cabeza en el mismo lugar bajo el microscopio (Figura 1E). También mantienen la cabeza estable durante el procedimiento de inyección intravítrea, lo que disminuye el riesgo de traumatismo por inyección. Después de una inyección exitosa, la fluoresceína en la solución inyectable produce un reflejo verdoso desde el interior del ojo que se puede ver bajo el microscopio o desde una vista lateral como se muestra en la Figura 1F.
Cuando se realiza como se describe, el protocolo genera uveítis aguda robusta que se puede detectar mediante OCT e imágenes de fondo de ojo tan pronto como 10 h después de la inyección intravítrea. La figura 2 muestra la alineación correcta del ojo para las imágenes de OCT. En la tabla 1A se enumeran los parámetros utilizados en el protocolo OCT. Un enfoque sistemático para obtener imágenes proporcionará imágenes de alta calidad que se pueden comparar con el tiempo. Las imágenes de la cámara anterior se centran en el ápice de la córnea utilizando la imagen SLO en cara (Figura 2A) con el iris alineado en paralelo a los planos horizontal y vertical (Figura 2B, C). Los escaneos de volumen y línea se capturan con una alineación vertical de tal manera que las regiones inferior y superior se pueden ver simultáneamente. Las imágenes del segmento posterior se centran en el nervio óptico utilizando la imagen SLO en cara (Figura 2D), y la banda brillante del EPR se utiliza para alinear la retina en paralelo a los planos horizontal y vertical (Figura 2E, F).
La Figura 3 muestra los hallazgos típicos de inflamación ocular de PMU utilizando imágenes de OCT. Veinticuatro horas después de la inyección intravítrea, se observan células inflamatorias en el acuoso y vítreo (Figura 3B). En presencia de inflamación moderada o severa, se verá un hipopión en el ángulo inferior en el aire acondicionado. El grado de inflamación ocular se puede puntuar en estas imágenes de OCT utilizando los criterios enumerados en la Tabla 2. En la Figura 4 se muestran ejemplos representativos de imágenes que demuestran las características inflamatorias típicas de cada puntuación. Las puntuaciones de cámara AC y PC se pueden sumar para generar la puntuación OCT combinada. Las puntuaciones combinadas >0 pero ≤2.5 representan inflamación leve. La inflamación moderada está determinada por puntuaciones >2,5 pero ≤4,5. Las puntuaciones >4.5 identifican inflamación severa. La inflamación típicamente alcanza su punto máximo 48 h después de la inyección intravítrea con puntuaciones de OCT en AC y PC entre 1 y 3 (puntuaciones combinadas entre 2 y 6). Las puntuaciones de AC y PC de 0.5 o 4 son menos comunes. En el caso de que las puntuaciones fuera del rango típico se encuentren con frecuencia, es posible que se requiera la solución de problemas para identificar los factores que contribuyen a las puntuaciones atípicas (consulte la sección de discusión). Las puntuaciones de inflamación en la cámara anterior tienden a volver a cero dentro de una semana después de la inyección intravítrea. Por el contrario, las puntuaciones posteriores no vuelven a cero; En cambio, la inflamación crónica de bajo nivel persiste en forma de vitritis, y los linfocitos perivasculares se infiltran en la retina durante 1-2 meses después de la inyección intravítrea.
La puntuación de inflamación en PMU también se puede determinar utilizando histología. La Figura 5 muestra secciones representativas de H&E para su uso en la puntuación de la gravedad de la PMU por histología. El número de células inflamatorias en el acuoso y vítreo se cuenta y se utiliza para determinar la gravedad utilizando los criterios de puntuación enumerados en la Tabla 3. La infiltración celular inflamatoria del cuerpo ciliar se observa comúnmente en un lado de la sección histológica (afectación unilateral) en la inflamación leve o moderada. Cuando la inflamación es grave, esto se refleja en la presencia de un infiltrado de células inflamatorias en el cuerpo ciliar en ambos lados del cristalino (denominado afectación bilateral). Durante los puntos de tiempo posteriores después de la inyección intravítrea, también se pueden identificar manifestaciones inflamatorias crónicas, incluida la presencia de leucocitos perivasculares e intrarretinianos y pliegues retinianos externos. La histología también puede ser útil para identificar los ojos afectados por técnicas de inyección deficientes. El traumatismo del cristalino durante la inyección intravítrea se puede identificar por la presencia de proteínas del cristalino teñidas con eosina amorfa (rosa) fuera de la cápsula del cristalino adyacente al área del traumatismo. El reflujo de la mTB intravítrea hacia el espacio subconjuntival generará inflamación fuera del ojo que puede identificarse mediante una revisión cuidadosa de las estructuras perioculares presentes en las secciones. Debido a la incapacidad de retener el extracto de mTB dentro de los ojos, estos ojos generalmente tendrán puntajes bajos de inflamación de OCT.
Las imágenes de fondo de ojo de campo claro también se pueden usar para identificar aspectos clínicamente relevantes de la PMU, incluido el desarrollo de un hipopión, vitritis e infiltración de células inflamatorias retinianas o perivasculares. La Figura 6 muestra dos ejemplos en los que la inflamación retiniana y perivascular se puede ver en las imágenes del fondo de ojo. Estos dos ojos también muestran el rango de inflamación que es común en el modelo PMU. La Tabla 1B enumera los parámetros utilizados en el sistema de imágenes de OCT de fondo de ojo/retina. Tenga en cuenta el impacto que la inflamación severa tiene en la calidad de la imagen (Figura 6, día 2, OCT e imágenes de fondo de ojo en la fila superior) y la extensión de la enfermedad presente en el día 21. El edema corneal también puede disminuir la calidad de la imagen durante la inflamación aguda; Sin embargo, es poco común que el edema corneal sea grave solo por la inflamación. Más comúnmente, la calidad de la imagen se degradará por el daño epitelial resultante de una protección superficial incompleta durante los eventos de imágenes y anestesia.
El modelo PMU se puede utilizar para inducir uveítis en cualquier raza de ratón o genotipo. En los ojos albinos, la OCT todavía se puede usar para calificar la inflamación, pero la ausencia de pigmento del fondo de ojo hace que la visualización de la inflamación sea difícil mediante imágenes de campo claro13,34. Los estudios post mortem se pueden realizar en tejidos oculares, ganglios linfáticos regionales o el bazo. Algunos ejemplos incluyen ensayos para la presencia de células inmunes como citometría de flujo e inmunohistoquímica y medición de citoquinas inflamatorias. En todos los puntos temporales probados después del inicio de la inflamación con PMU (día 1 a día 56), hay suficientes células inflamatorias CD45+ presentes en ojos individuales para detectar muchas poblaciones importantes de leucocitos en el ojo mediante análisis de flujo multiparamétrico12,35. Los humores acuosos (2-5 μL) y vítreos (5-10 μL) pueden ser recolectados de ojos inflamados para la determinación de la concentración de proteínas, estudios proteómicos o determinación de la concentración de citoquinas36.
Figura 1: Configuración de la inyección intravítrea en ratón. La inyección intravítrea se realiza en el ojo del ratón utilizando (A) un controlador de bomba de microjeringa conectado a la (B) Microbomba y (C) una jeringa de inyección. La jeringa se carga y se monta en la microbomba (D). La cabeza del ratón se coloca con barras auriculares (E) para garantizar la estabilidad y la consistencia durante el procedimiento de inyección intravítrea. (F) La fluoresceína en la solución inyectable produce un reflejo verdoso desde el interior del ojo después de un procedimiento exitoso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Alineación adecuada del ojo para la obtención de imágenes de OCT. (A) Usando la imagen del oftalmoscopio láser de escaneo (SLO) en la cara, el ojo se centra para las imágenes de la cámara anterior. La línea verde indica la posición del escaneo de línea horizontal que se muestra en el panel (B). Tenga en cuenta que la córnea central se evita para disminuir el artefacto de reflexión. (C) B-Scan vertical a través de la cámara anterior paracentral. Este escaneo se obtiene a 90° del escaneo horizontal. Tenga en cuenta que la alineación de las secciones del iris a cada lado de la lente está nivelada en el escaneo horizontal (panel B) y dispuesta una encima de la otra en el escaneo vertical (panel C). (D) Usando la imagen SLO, la imagen de la cámara posterior se centra en el nervio óptico. (e) alineación horizontal de b-scan, (f) alineación vertical de b-scan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La inducción de PMU genera panuveítis que puede ser monitoreada por imágenes longitudinales de OCT. La fila superior muestra la cámara anterior (CA); la fila inferior muestra imágenes de OCT de la cámara posterior (PC) para resaltar los cambios patológicos en el curso de la enfermedad. (A) Imagen de OCT basal de la CA (arriba) y PC (abajo) antes de la inducción de la uveítis, ambas puntúan 0. (B) Día 1 después de la inyección intravítrea que muestra la presencia de edema corneal (flecha negra), un hipopión (*) múltiples células inflamatorias flotantes en el CA (flechas blancas) y vitritis (puntas de flecha blancas) en el PC. (C) Día 7 después de la inyección intravítrea con pocas células AC en la cápsula anterior del cristalino (flecha blanca) y disminución de la vitritis (punta de flecha blanca). (D) Día 28 después de la inyección intravítrea cámara anterior con inflamación AC resuelta y vitritis leve. Abreviaturas: C- córnea, L - lente, I - iris, Aq - acuoso, V vítreo, RGC - células ganglionares de la retina, PR - fotorreceptores, Ch- coroides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplos de puntuación de OCT. Se asigna una puntuación OCT entre 0 y 4 a cada imagen de CA e imagen de PC utilizando el sistema categórico que se muestra en la Tabla 2. Las puntuaciones AC y PC se combinan para la puntuación OCT final para el ojo. (A, D) Ejemplos de una puntuación de cero. (B,E) Ejemplos de una puntuación de 0,5. (C,F) Ejemplos de una puntuación de 1. (G,J) Ejemplos de una puntuación de 2. (H,K) Ejemplos de una puntuación de 3. (I,L) Ejemplos de una puntuación de 4 se muestran en los paneles I y L. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de puntuación histológica. La puntuación histológica se determina en función de cinco características visibles en las secciones de H&E: densidad de proteínas de la cámara anterior, número de células de la cámara anterior, infiltración de células inmunes del cuerpo ciliar, densidad de células vítreas, inflamación vascular de la retina y cambios estructurales en la retina. Se asigna una puntuación de 0-2 para cada característica. La descripción de cada puntuación se encuentra en la Tabla 3. En esta figura se muestra un ejemplo representativo de 0-2 para cada característica. La columna de la izquierda muestra la puntuación de cero. La columna central muestra ejemplos de puntuación 1. La columna de la derecha muestra ejemplos de puntuación 2. Se asigna una puntuación de 2 para la puntuación del cuerpo ciliar si el cuerpo ciliar a cada lado del cristalino en la misma sección demuestra inflamación celular. La puntuación histológica final es la suma de la puntuación para cada uno de los cinco criterios (puntuación máxima 10). La flecha en el panel inferior derecho indica leucocitos perivasculares asociados con un vaso retiniano superficial. La barra de escala negra indica 500 μm. Las barras de escala ciliar indican 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Las imágenes longitudinales de fondo de ojo en PMU identificaron un rango de gravedad de la enfermedad. (A) Los ojos severamente inflamados demuestran múltiples infiltrados blancos en la retina y tortuosidad vascular en imágenes de fondo de ojo en color (fila superior), así como vitritis densa y edema retiniano en OCT (fila inferior) en el día 2. La progresión en el número de lesiones retinianas se puede ver con el tiempo mientras la vitritis mejora. La línea verde indica la posición de la imagen OCT. (B) Los ojos levemente inflamados muestran menos lesiones lineales y más discretas en el fondo de ojo y un número de células infiltrantes en el espacio vítreo. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Un | |||
| Cámara anterior del ratón | Análisis rápido | Análisis de volumen | Escaneo lineal |
| Largo x Ancho | 4,0 mm x 4,0 mm | 3,6 mm x 3,6 mm | 3,6 mm |
| Ángulo | 0 | 90 | 90 |
| A-scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-scans | 50 | 400 | 1 |
| Fotogramas/ B-scan | 1 | 3 | 20 |
| Cámara posterior del ratón | Análisis rápido | Análisis de volumen | Escaneo lineal |
| Largo x Ancho | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm |
| Ángulo | 0 | 0 | 0 |
| A-scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-scans | 50 | 200 | 1 |
| Fotogramas/ B-scan | 1 | 3 | 20 |
| B | |||
| Cámara posterior del ratón | Análisis de volumen | Escaneo lineal | |
| Largo x Ancho | 0,9 mm x 0,9 mm | 1,8 mm | |
| Ángulo | 0 | Cualquiera (típicamente 0 o 90) | |
| A-scan/B-Scan | 1024 | 1024 | |
| # B-scans | 512 | 1 | |
| Fotogramas/ B-scan | 1 | 30 |
Tabla 1: Parámetros de escaneo. (A) Parámetros de exploración de OCT. (B) Parámetros de la exploración del fondo de ojo/OCT retiniana
| Descripciones de la puntuación de OCT | ||||||
| Puntuación | Cámara anterior | Cámara posterior | ||||
| NA | No hay vista más allá de la córnea anterior | Sin vista del segmento posterior | ||||
| 0 | Sin inflamación | Sin inflamación | ||||
| 0.5 | 1–5 células en el acuoso | Pocas células ocupan menos del 10% del área vítrea | ||||
| O edema corneal | Sin infiltrados subretinianos o intrarretinianos ni alteración de la arquitectura retiniana | |||||
| 1 | 6–20 células en la acuosa | Células difusas (sin grupos densos) que ocupan entre el 10 y el 50% del área vítrea. | ||||
| O una sola capa de células en la cápsula anterior del cristalino | Sin infiltrados subretinianos o intrarretinianos ni alteración de la arquitectura retiniana | |||||
| 2 | 20–100 células en el acuoso | Células difusas (sin grupos densos) que ocupan > el 50% del área vítrea | ||||
| O menos de 20 células y un hipopión presente | Sin infiltrados subretinianos o intrarretinianos ni alteración de la arquitectura retiniana | |||||
| 3 | 20–100 células en el acuoso | Células difusas iguales a grado 2 y 1 | ||||
| Y un hipopión O una membrana pupilar | Y al menos una opacidad vítrea densa que ocupe entre el 10% y el 20% del área vítrea O la presencia de células vítreas iguales a grado 2 y opacidades subretinianas o ntraretinianas raras (≤ 2) | |||||
| 4 | Cualquier número de células acuosas | Opacidad vítrea densa que ocupa > el 20% del área vítrea. | ||||
| Y una gran hipopión y pérdida de membrana pupilar O estructura anterior debido a una inflamación severa | O células vítreas difusas con grandes opacidades subretinianas o intrarretinianas | |||||
Tabla 2: Criterios de puntuación de la PMI OCT: Las imágenes de OCT se puntúan de acuerdo con los criterios enumerados en la tabla. Las puntuaciones AC y PC se suman para obtener la puntuación final del ojo. En los casos en que no se adquirió una visión clara del ojo, se asignó una puntuación de NA a las imágenes, y éstas fueron excluidas del estudio.
| Descripción de la puntuación histológica | |||
| Característica | 0 | 1 | 2 |
| Proteína de la cámara anterior (AC) | Escasa tinción de partículas acelulares con eosina en la CA | Tinción de eosina extracelular moderada, pero no confluente, en cualquier parte del CA | Tinción de eosina extracelular confluente o casi confluente en todo el CA |
| Célula de la cámara anterior (CA) | Sin celdas | 1–100 celdas, pero sin agregaciones densas de células | >100 células, o agregaciones densas de células |
| Inflamación del cuerpo ciliar | Sin infiltración leucocitaria del cuerpo ciliar o del vítreo circundante | Presencia unilateral de leucocitos infiltrados en el cuerpo ciliar y/o en el vítreo circundante. | Presencia bilateral de leucocitos infiltrados en el cuerpo ciliar y/o en el vítreo circundante. |
| Inflamación vascular retiniana | Sin vasos retinianos con leucocitos perivasculares | Un vaso por sección con leucocitos perivasculares | >1 vaso por sección con leucocitos perivasculares |
| Pliegue o daño retiniano | Sin daño retiniano | 1–3 pliegues retinianos por sección | >3 pliegues retinianos por sección, o cualquier otra destrucción de la capa retiniana o hemorragia intrarretiniana |
Tabla 3: Criterios de puntuación histológica de la PMU: Las secciones H&E del ojo se calificaron según los criterios enumerados en la tabla. Se calificaron y promediaron tres secciones del mismo ojo para obtener la puntuación histológica final del ojo.
Discussion
Los modelos animales de uveítis han sido fundamentales para comprender los mecanismos de inflamación ocular y homeostasis, así como para permitir la evaluación preclínica de terapias médicas y quirúrgicas para pacientes con uveítis37. Tanto las variantes de conejo como de rata del modelo PMU han demostrado su valor en la terapia preclínica a través de estudios de prueba de concepto38,39,40. Debido a la disponibilidad de una amplia gama de cepas transgénicas en ratones, el establecimiento del sistema modelo PMU de ratón ahora permite estudios mecanicistas más detallados para identificar tipos específicos de células, vías y genes que contribuyen a la patología de esta enfermedad.
Los modelos animales de uveítis pueden demostrar variabilidad animal a animal en la incidencia e intensidad de la inflamación41. En la cepa de ratón C57BL/6, la PMU se genera de forma fiable utilizando el protocolo descrito aquí. Se han reportado variaciones específicas de la cepa en el curso y la intensidad de la uveítis tanto para EAU como para EIU42,43. Si bien los impactos específicos de la cepa sobre la gravedad y el curso de PMU no se han medido experimentalmente, este modelo se ha utilizado en C57BL / 6J de tipo salvaje, así como en ratones albinos (B6 (Cg)-Tyrc-2J / J) y produjo respuestas inflamatorias similares. Al generar el modelo PMU, controlar las consideraciones enumeradas a continuación puede ayudar a los nuevos investigadores a limitar la variabilidad y producir la uveítis más consistente y reproducible.
Asegurar la consistencia en las inyecciones subcutáneas:
Para proporcionar una inyección subcutánea consistente, asegúrese de que todas las burbujas de aire se eliminen de la emulsión. Las consideraciones incluyen una centrífuga corta (30 s a 400 x g) de la emulsión prefabricada antes de cargar la jeringa. Esto eliminará el aire atrapado en la emulsión. Además, al cargar la jeringa, invierta periódicamente (punta) y golpee la jeringa para eliminar cualquier burbuja de aire. Durante la inyección, no coloque la jeringa demasiado profundo para evitar la inyección intramuscular. Por el contrario, una inyección superficial (intradérmica) puede provocar la erosión de la emulsión a través de la piel. Recuerde hacer una breve pausa antes de retirar la jeringa del lugar de inyección para asegurar la inyección completa de la emulsión viscosa espesa y para evitar el reflujo de la piel.
Siete días después de colocar la inyección subcutánea, confirme la presencia de nódulos palpables a ambos lados de las patas traseras. Si no se pueden identificar nódulos, es posible que se haya inyectado aire en lugar de emulsión. En este caso, la inflamación aguda puede no ser tan robusta, y la inflamación crónica puede no desarrollarse.
Prevenir el desarrollo de endoftalmitis infecciosa:
La endoftalmitis bacteriana o fúngica generará una variable de confusión si no se previene44. Para prevenir la endoftalmitis bacteriana, siempre practique una buena técnica aséptica al hacer la suspensión intravítrea, manipule y limpie todas las herramientas reutilizables que entrarán en contacto con el ojo. Es importante usar artículos estériles de un solo uso, esterilizarlos en autoclave o limpiarlos con lavados o toallitas con alcohol al 95%. El uso apropiado de betadina aplicada a la superficie ocular, los párpados y el pelaje periocular también ayudará a prevenir la endoftalmitis45. Es sencillo reconocer un ojo con infección, ya que las estructuras oculares serán borradas por una inflamación extrema durante el curso posterior a la inyección. Esto no es típico de PMU. La presencia de sangrado intraocular también puede sugerir endoftalmitis o traumatismo por la inyección. En tales casos, excluir a estos animales del estudio.
Asegurar la consistencia en la inyección intravítrea:
La inyección intravítrea es un paso crítico en la inducción de inflamación confiable y reproducible en PMU. Proporcionar una cantidad constante de suspensión de Mtb con cada inyección, evitar traumatismos y prevenir el reflujo de la suspensión son factores que deben considerarse al realizar las inyecciones. Para garantizar una suspensión consistente, aplique un vórtice a fondo la suspensión de la culata al descongelarla y antes de cargarla en la jeringa. Dado que este extracto de Mtb utilizado no forma una solución, la suspensión puede sufrir sedimentación con el tiempo. Para asegurar una concentración uniforme del extracto de Mtb en cada inyección, use o expulse y vuelva a cargar la jeringa dentro de los 15 minutos posteriores a la carga. La fenilefrina se usa para la dilatación para proporcionar un campo de visión más amplio al ojo posterior y reducir el riesgo de traumatismo en el ojo durante la inyección. Esta caída genera una retracción natural del párpado y una ligera proptosis del globo, permitiendo una buena visualización del área 1-2 mm posterior al limbo sin necesidad de agarrar el ojo con fórceps. El uso de fórceps para restringir el ojo podría causar un trauma potencial y aumentar transitoriamente la presión intraocular y el riesgo de reflujo de la suspensión Mtb. El trauma también puede ser causado por intentar inyectar demasiado volumen en el ojo. El volumen de inyección se limita a 2 μL para evitar una elevación significativa y prolongada de la presión intraocular y un traumatismo en el ojo. Además, los animales más jóvenes tendrán ojos que son más pequeños que los ratones adultos. Normalmente, los ratones de 6-8 semanas (20-25 g) proporcionan un tamaño de ojo uniforme y aseguran una mayor consistencia en la inflamación después de la inyección de Mtb. Se observó una mayor frecuencia de reflujo posterior a la inyección de la suspensión micobacteriana en ratones más pequeños. Esto, a su vez, conduce a una inflamación aguda menos de lo esperado. Se utiliza una solución de fluoresceína diluida para proporcionar al inyector novato información visual sobre el éxito de su técnica de inyección. La dilatación en el momento de la inyección permitirá la visualización directa del material inyectado en la cavidad vítrea y la oportunidad de observar cualquier evidencia de traumatismo del cristalino. En el caso de un traumatismo del cristalino, puede causar un cambio en la claridad del cristalino que causará una catarata que se puede visualizar en la OCT. En el caso de traumatismo ocular, los ojos deben ser excluidos del estudio debido a la posibilidad de uveítis inducida por el cristalino46. Recomendamos hacer una pausa de 10 s antes de retirar la jeringa del ojo para permitir la dispersión de la suspensión Mtb dentro del ojo y disminuir el reflujo.
El modelo PMU se puede modificar para cambiar la intensidad de la inflamación aguda variando la concentración del Mtb en la inyección intravítrea. Diferentes dosis que van desde 2.5 μg / μL a 15 μg / μL se han probado previamente en nuestro laboratorio. Sin embargo, se encontró que dosis superiores a 10 μg / μL causan daño ocular severo, incluida la ruptura espontánea del cristalino, edema corneal severo y cicatrización, e hifema. Este grado de gravedad no es típico en pacientes humanos con uveítis postinfecciosa y, por lo tanto, no se recomiendan estas concentraciones. Se encontró que una dosis de 5 μg / μL produce de manera confiable inflamación aguda leve a moderada y uveítis crónica leve; la dosis de 10 μg/μL produce una enfermedad aguda fiable de moderada a grave y una enfermedad crónica más notable. Por lo tanto, variar la concentración intravítrea puede proporcionar gravedades alternativas de la enfermedad para su uso según sea necesario en función de la pregunta experimental. Los controles deben seleccionarse para garantizar que los resultados se deban a la respuesta a la tuberculosis magnética y no al trauma asociado con las inyecciones subcutáneas o intravítreas. En los controles de inyección simulada, PBS se puede utilizar en lugar del extracto de mTB. Para las comparaciones con animales no expuestos, se deben considerar las verdaderas muestras ingenuas, ya que los ojos compañeros no siempre son equivalentes.
Debido al pequeño tamaño del ojo del ratón, la OCT puede ser un ensayo más sensible para detectar inflamación en la cámara anterior que la visualización directa o la fotografía microscópica de campo brillante. El trabajo previo con PMU en ratas25 determinó que se pueden detectar más células por histología que por OCT, pero que existe una buena correlación entre las dos modalidades. La OCT tiene la ventaja añadida de que se puede utilizar para controlar la inflamación longitudinalmente en el mismo animal. Otros modelos importantes de uveítis en ratones, como EAU y EIU, también han empleado OCT para el análisis cuantitativo 12,47,48. En el modelo PMU de ratones, las células de la cámara anterior solo son visibles en OCT y no se pueden ver en exámenes clínicos a menos que haya un gran hipopión. La inflamación vítrea (vitritis) se puede observar con imágenes de fondo de ojo en color, pero la detección de cambios cuantitativos solo es posible con imágenes de OCT. Otros aspectos del modelo, como la inflamación vascular retiniana y el daño retiniano, se pueden identificar fácilmente con OCT y fotografía microscópica de fondo de ojo de campo claro.
Cuando se usa OCT, es importante considerar cómo las imágenes localizadas pueden verse afectadas por las diferencias regionales en el grado de inflamación. Informes anteriores han identificado una distribución desigual de células en la cámara anterior de los seres humanos, con más células localizadas inferiormente49. En ratones, una predisposición similar es común. Por lo tanto, las exploraciones verticales o radiales a través del aire acondicionado ayudarán a garantizar imágenes que capturen el rango de inflamación. Además, la realización de imágenes en el mismo lugar también proporcionará consistencia a las imágenes recogidas en el mismo ojo longitudinalmente. Para obtener imágenes en la misma parte del ojo, utilice puntos de referencia estables y un enfoque sistemático. Para las imágenes de la cámara anterior, la imagen se centra inmediatamente adyacente al ápice de la córnea y se orienta verticalmente para que se pueda detectar la presencia de un hipopión en el ángulo inferior. Para las imágenes del segmento posterior, la imagen se centra en el nervio óptico. Se recomienda considerar el uso de al menos 3 escaneos de línea para la puntuación para garantizar que se capture la variabilidad regional. En los casos en que la inflamación se limita a ubicaciones periféricas, la adquisición de exploraciones de volumen puede ser útil. La recopilación de escaneos de volumen también puede ayudar a capturar variaciones regionales, pero aumentará los requisitos de almacenamiento de datos.
Otros ensayos in vivo que se pueden utilizar para caracterizar la inflamación en el modelo de ratón PMU incluyen imágenes de bioluminiscencia13,35. Se pueden realizar ensayos post mortem, como el análisis citométrico de flujo multiparamétrico, para identificar y cuantificar poblaciones infiltrantes de tipo de células inmunes en la cámara acuosa y posterior del ojo12,26. En el modelo PMU, la inflamación aguda se caracteriza por una respuesta innata con un infiltrado de neutrófilos predominante, seguido de una respuesta adaptativa crónica y persistente dominante de células T que persiste durante más de un mes35. Otros ensayos de la función inmune que se pueden realizar en tejidos post-mortem incluyen el análisis de citoquinas del líquido ocular. Además, otros ensayos posteriores, como la secuenciación del ARNm y las imágenes de inmunofluorescencia, se pueden utilizar para evaluar los patrones de expresión de genes y proteínas de las poblaciones de células inmunes de la retina en la uveítis50,51.
El modelo PMU se puede replicar en otros sistemas de roedores utilizando adaptaciones apropiadas para las diferentes especies. El modelo PMU ha sido utilizado previamente en ratas y conejos38,39,40. En ratas, la panuveítis aguda se desarrolla después de la inyección intravítrea que se resuelve espontáneamente durante 14 días sin desarrollar signos de inflamación crónica por histología24. En conejos, la inducción de la uveítis utiliza dos rondas de inyección subcutánea antes de la inyección intravítrea, pero también genera una panuveítis robusta. Una de las ventajas de usar el modelo de ratón es la disponibilidad inmediata de numerosas cepas transgénicas y knockout que pueden ayudar a comprender el mecanismo básico de la uveítis52. Todos los modelos de roedores se pueden usar para pruebas de terapia preclínica si el agente se administra sistémicamente o como una gota tópica. Sin embargo, debido a su mayor tamaño, los ojos de rata y conejo son mejores modelos para su uso en estudios preclínicos de opciones de tratamiento de inyección implantable o local para la uveítis.
En resumen, este protocolo proporciona a los investigadores interesados en estudiar los mecanismos de la inflamación ocular crónica una nueva herramienta que no depende de la inmunización previa con antígenos oculares.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos financieros que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo está respaldado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, Estados Unidos (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, subvención central de investigación de visión de la UW (NEI P30EY01730), donaciones del Mark Daily, MD Research Fund y el fondo de investigación Christopher y Alida Latham, una subvención departamental sin restricciones de Research to Prevent Blindness y un premio de desarrollo profesional de Research to Prevent Blindness (KP). El trabajo realizado en Bristol fue apoyado por fondos adicionales de Sight Research UK y The Underwood Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial | |
| AnaSed | Akorn Animal Health, IL, USA | NDC 59399-110-20 | Xylazine 20 mg/mL |
| Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution | Alcon, TX, USA | 8007-1 | |
| B-D Precision Glide Needles -25 G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305122 | |
| B-D Precision Glide needle -30-G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305106 | |
| Bond MAX, Bond Rx | Leica Biosystems, IL,USA | Automated IHC staining system | |
| Chloramphenicol ointment | Martindale Pharma, Romford, UK | 1% w/w Chloramphenicol | |
| EG1150H | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Embedding | |
| Envisu R2300 | Bioptigen/Leica | OCT Machine | |
| Freund's Incomplete Adjuvant | BD Difco, NJ, USA | 263910 | |
| GenTeal lubricant eye ointment | Alcon, TX, USA | --- | |
| GenTeal lubricant eye gel | Alcon, TX, USA | --- | |
| H37Ra lyophilized Mycobacteria extract | BD Difco, NJ, USA | 231141 | |
| Hamilton RN Needle (33/12/2)S | Hamilton, Reno, NV | 7803-05(33/12/2) | 33 G |
| Hamilton syringe | Hamilton, Reno, NV | CAL7633-01 | 5 µL |
| Insulin needle | Exel International, USA | 26029 | 1 mL |
| Isoflurane | |||
| Ketaset | Zoetis, USA | 377341 | Ketamine HCL 100 mg/mL |
| Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller | World Precision Instruments, FL, USA | UMP3 | |
| Micron IV | Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA | Alternative Imaging/OCT Machine | |
| Nanofil 10 µL syringe | World Precision Instruments, FL, USA | NANOFIL | |
| Nanofil Intraocular Injection Kit | World Precision Instruments, FL, USA | IO-KIT | |
| Olympus SZX10 | Olympus | Dissection scope | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 17478020115 | |
| RM2255 | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Sectioning | |
| TB Syringe | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 309602 | 1 mL |
| Tetracaine 0.5% | Alcon, TX, USA | 1041544 | |
| Tissue Tek VIP series | Sakura Finetek USA, Inc.,CA. | Histology Tissue Processing | |
| Tropicamide 1% | Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK | Minims | |
| Tylenol | Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA | NDC 50580-614-01 | Acetaminophen |
| Viscotears | Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK | Carbomer eye gel 0.2% w/w |
References
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