Summary
Este protocolo descreve as etapas para a indução da Uveíte Micobacteriana Primed (PMU) em camundongos. Este método descreve as etapas para ajudar a produzir inflamação ocular confiável e robusta no sistema modelo de rato. Usando este protocolo, geramos olhos uveíticos e outros olhos não inflamados de animais individuais para avaliação adicional com ensaios imunológicos, transcriptômicos e proteômicos.
Abstract
O termo "uveíte" descreve um conjunto heterogêneo de condições que apresentam inflamação intraocular. Em termos gerais, a uveíte é definida pela etiologia: infecção ou autoimunidade. A uveíte infecciosa requer tratamento com os agentes antimicrobianos apropriados, enquanto a uveíte autoimune requer tratamento com corticosteroides ou outros agentes imunossupressores. A uveíte pós-infecciosa é uma forma de uveíte crônica que requer corticosteroides para controlar as sequelas imunes após a infecção inicial. A uveíte associada à infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é uma forma bem reconhecida de uveíte pós-infecciosa, mas os mecanismos da doença não são totalmente compreendidos. Para entender o papel que os antígenos micobacterianos e os ligantes inatos desempenham na estimulação da inflamação ocular crônica após a infecção por mTB, o modelo de Uveíte Micobacteriana Preparada (UPM) foi desenvolvido para uso em camundongos. Este manuscrito descreve os métodos para gerar PMU e monitorar o curso clínico da inflamação usando a imagem de fundo de cor e tomografia de coerência óptica (OCT). A PMU é induzida pela imunização com extrato micobacteriano morto pelo calor, seguido de injeção intravítrea do mesmo extrato em um olho sete dias depois. A inflamação ocular é monitorada longitudinalmente usando imagens in vivo e seguida pela coleta de amostras para uma ampla gama de ensaios, incluindo histologia, citometria de fluxo, análise de citocinas, qPCR ou sequenciamento de mRNA. O modelo de camundongo da PMU é uma nova ferramenta útil para estudar as respostas oculares à TBm, o mecanismo da uveíte crônica e para testes de eficácia pré-clínica de novas terapias anti-inflamatórias.
Introduction
O termo 'uveíte' descreve um conjunto heterogêneo de condições que apresentam inflamação intraocular1. Modelos animais de uveíte são importantes para a compreensão dos mecanismos da doença e para testes pré-clínicos de novas terapias. Vários modelos animais de uveíte foram estabelecidos2. Os dois que foram estudados mais extensivamente são uveíte autoimune experimental (ou uveorretinite; EAU) e uveíte induzida por endotoxinas (EIU). A UA é tipicamente gerada pela imunização com antígenos oculares ou pode ocorrer espontaneamente quando a tolerância central é interrompida na ausência do gene AIRE 3,4. Outras variantes do modelo já foram desenvolvidas 5,6,7 para incluir diferentes peptídeos uveitogênicos; estes foram revisados extensivamente 8,9,10. A EAU é o modelo primário para formas de uveíte autoimune dependente de células T, como a doença de Vogt-Koyanagi-Harada e a coriorretinite em humanos. A EIU é gerada por injeção sistêmica ou local de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS)10,11. A EIU tem sido utilizada como modelo de uveíte aguda gerada pela ativação de vias de sinalização imune inata12. Ambos os modelos têm sido fundamentais para a compreensão atual da imunologia ocular, mas nenhum deles são modelos eficazes para uveíte crônica pós-infecciosa. Recentemente estabelecido em camundongos, o modelo de Uveíte Micobacteriana Primed (UPM) agora fornece uma abordagem para interrogar e avaliar aspectos clínicos e celulares dessa forma de uveíte13.
Há uma alta prevalência de infecção micobacteriana em todo o mundo, com mais de 10 milhões de novos casos e mais de 1,4 milhão de mortes relatadas pela Organização Mundial da Saúde em 201914. A manifestação extrapulmonar da infecção ativa por tuberculose (TB) inclui uveíte e é uma causa bem reconhecida de uveíte infecciosa15,16. As manifestações da uveíte associada à TB são proteanas, o que provavelmente reflete múltiplos mecanismos distintos da doença para incluir infecção ocular direta, bem como inflamação imunomediada menos bem compreendida17,18,19. Os mecanismos propostos para essas sequelas pós-infecciosas incluem uma resposta inflamatória crônica estimulada pela persistência de uma infecção pauci-bacilar no epitélio pigmentar da retina (EPR), uma resposta inflamatória crônica estimulada pela presença de padrões moleculares residuais associados a patógenos (PAMPs) de uma infecção ocular eliminada com sucesso e ativação inadequada da resposta imune adaptativa contra antígenos oculares através de um processo de mimetismo molecular ou antígeno disseminação causada pela infecção sistêmica por TB20,21,22,23.
Com o objetivo de obter uma melhor compreensão mecanicista da uveíte crônica pós-infecciosa e estudar o papel dos antígenos micobacterianos no início da doença, o modelo de PMU foi desenvolvido para uso em camundongos13,24. Assim, para provocar inflamação, o camundongo primeiro recebe uma injeção subcutânea de antígeno da cepa H37Ra do Mycobacterium tuberculosis morta pelo calor para imitar a infecção sistêmica, seguida sete dias depois pela injeção intravítrea do mesmo antígeno administrado ao olho esquerdo ou direito para imitar a infecção ocular local. A intensidade e a duração da uveíte resultante são monitoradas por tomografia longitudinal in vivo de coerência óptica (OCT) e imagem fundal do olho25. A PMU é caracterizada por uma panuveíte aguda, mielóide-dominante que se desenvolve em uma uveíte posterior crônica dominante nas células T com vitrite, inflamação perivascular da retina e áreas focais de dano externo da retina26. A presença de inflamação granulomatosa no segmento posterior do olho sugere que o modelo de PMU pode ser utilizado para estudar algumas formas de uveíte anterior (granulomatosa e não granulomatosa) e intermediária, observadas em pacientes com evidência imunológica de infecção prévia por Mtb27. Além disso, os componentes do Mtb morto pelo calor utilizados no modelo de PMU têm sido sugeridos para desencadear respostas imunes subjacentes aos aspectos da uveíte recorrente em pacientes com tuberculose ocular que respondem à terapia antitubercular (ATT)28. Devido às diferenças no início da doença e no curso inflamatório quando comparado à UDE e à EIU, a UPM representa um novo modelo animal de uveíte que não é dependente da imunização com antígenos oculares e pode ajudar a elucidar mecanismos da doença em pacientes com uveíte crônica. Este protocolo descreve os métodos para gerar UPM, monitorar o curso clínico da inflamação e coletar amostras oculares para análise post-mortem com citometria de fluxo.
Protocol
Todos os procedimentos realizados foram aprovados localmente pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington (protocolo de estudo em animais # 4481-02) ou em concordância com a licença do Home Office do Reino Unido (PPL 30/3281) e o Grupo de Revisão Ética da Universidade de Bristol. Os experimentos realizados em ambas as instituições foram concordantes com a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual. A PMU foi gerada em camundongos C57BL/6J de 6-10 semanas de idade; todos os camundongos pesavam pelo menos 18 g no momento da indução da uveíte e foram confirmados negativos para a mutação rd8 do gene Crb129. Os camundongos foram mantidos com ração padrão e água medicamentosa (paracetamol 200-300 mg/kg/dia) ad libitum sob condições específicas livres de patógenos. A eutanásia animal foi realizada utilizando-se o método padrão de inalação de dióxido de carbono30.
1. Preparação antigénica para injeção subcutânea
- Execute todos os procedimentos nesta seção dentro de um exaustor químico para evitar a inalação ou o contato da pele com o pó Mtb H37Ra. Manuseie de acordo com suas políticas institucionais para o Adjuvante do Complete Freund (normalmente BSL-1). Isso inclui o uso de luvas resistentes a produtos químicos, óculos de segurança e roupas de trabalho de proteção (jaleco).
- Use uma boa técnica estéril para evitar a contaminação de reagentes que serão introduzidos em animais experimentais.
- Faça a suspensão de Mtb em PBS misturando 5 mg de pó de M. tuberculosis H37Ra liofilizado e morto pelo calor com 2,5 mL de PBS frio em um tubo de microcentrífuga de 5 mL. Vórtice uma vez por 30 s e depois coloque no gelo.
- Para gerar uma suspensão fina do H37Ra em PBS, sonicate a suspensão no gelo por 5 min.
- Desaperte o corpo da unidade conversora e limpe a sonda com um cotonete com álcool a 70% (v/v).
- Ligue o sonicator, ajuste a configuração de energia para 4 girando o botão de controle de energia e mergulhe a ponta da sonda no pó micobacteriano contendo PBS. Certifique-se de que a ponta da sonda esteja imersa a pelo menos metade da profundidade da amostra e que a ponta da sonda não esteja tocando a parede do tubo de microcentrífuga.
- Sonicate a mistura no gelo por 30 s, pause 30 s e repita por um total de 5 min para dispersar totalmente o pó em uma suspensão uniforme sem aquecer o líquido.
- Adicione 2,5 mL de Adjuvante Incompleto de Freund à mistura e repita o processo de sonicação no gelo até que a emulsão forme uma consistência semelhante à pasta de dente.
- Defina a alimentação como 0 usando o botão de controle e desligue a unidade para terminar a sonicação. Retire a ponta da suspensão e limpe a sonda com um cotonete com álcool.
- Conservar a emulsão antigénica a 4 °C. Fazer lotes da emulsão ajudará a garantir a consistência entre os experimentos. A emulsão pode ser armazenada a 4 °C por até 3 meses.
2. Injeção subcutânea
- Realizar injeção subcutânea uma semana antes da injeção intravítrea (designada como dia -7).
- Carregue uma seringa de 1 ml (sem agulha ligada) com a emulsão micobacteriana. Devido à viscosidade e opacidade da emulsão, bolhas de ar difíceis de ver podem encher a seringa.
- Para evitar bolhas de ar na seringa, depois de carregar 0,2-0,3 mL de emulsão, inverta a seringa (ponta voltada para cima) e bata suavemente na seringa repetidamente na borda de um contador para trazer as bolhas à superfície.
- Expulse o ar da seringa e continue a encher a seringa. Inverta e toque intermitentemente até ficar cheio.
- Coloque uma agulha de 25 G na seringa e avance a emulsão para encher a agulha. Conservar a seringa no gelo até ser utilizada.
- Para realizar a injeção subcutânea com segurança, anestesiar o camundongo ou utilizar métodos de contenção humana que permitam fácil acesso aos quartos traseiros do animal31.
- Para anestesiar para injeção subcutânea, coloque o animal em uma câmara de indução de isoflurano (3%-4% para indução e 1%-3% para manutenção). Uma vez anestesiado, certifique-se de que o rato tem uma frequência respiratória lenta e não apresenta sinais de desconforto respiratório.
- Coloque as injeções subcutâneas na superfície dorsal dos quadris ou na superfície ventral das pernas proximal à região dos gânglios linfáticos inguinais.
- Insira cuidadosamente a agulha para evitar a injeção no músculo. Injete 0,05 mL da emulsão de Mtb no espaço subcutâneo. Não remova a agulha imediatamente para permitir que a emulsão espessa seja totalmente injetada.
- Repetir a injeção nos lados esquerdo e direito para um total de 0,1 ml por animal.
- Se anestesiado, coloque o rato numa almofada de aquecimento quente até à recuperação completa. Não deixe o rato sozinho até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
- Devolver o rato à sua gaiola após a recuperação completa e rotular o cartão da gaiola com a data da injeção subcutânea.
- Fornecer analgesia com paracetamol oral (200 mg/kg/dia), mas não AINEs, pois os agentes anti-inflamatórios podem afetar a indução da uveíte.
3. Preparação do reservatório de antigénios para injecção intravítrea
- Execute todos os procedimentos nesta seção sob condições estéreis apropriadas para evitar a contaminação da suspensão Mtb intravítrea.
- Faça as suspensões intravítreas.
- Para a indução de panuveíte leve a moderada, faça a suspensão intravítrea a uma concentração de 5 mg/mL adicionando 5 mg do extrato de micobactérias a 1 mL de 1x PBS.
- Para a indução de panuveíte moderada a grave, fazer a suspensão intravítrea a uma concentração de 10 mg/mL adicionando 10 mg do extrato de micobactérias a 1 mL de 1x PBS.
- Vórtice uma vez por 30 s e depois coloque no gelo.
- Para gerar uma suspensão fina do H37Ra em PBS, sonicate a suspensão no gelo por 10 minutos, conforme descrito na etapa 1.4. Aliquotar esta solução-mãe em volumes de 100 μL e armazenar a -20 °C.
- Antes do uso, descongele à temperatura ambiente e faça vórtice no alto por 1 min. Mantenha as alíquotas no gelo durante o transporte para a instalação de animais.
4. Procedimento de injeção intravítrea no dia 0
- Preparação animal
- Use luvas de exame ajustadas, coloque o rato numa balança de pesagem para obter o seu peso em gramas.
- Administrar uma injeção intraperitoneal de 0,02 ml/g de peso corporal de uma solução contendo 100 mg/ml de cetamina e 20 mg/ml de xilazina misturada com água estéril para anestesiar o animal. Uma abordagem alternativa inclui a indução usando ~1,5% de isoflurano (inalado).
- Aguarde aproximadamente 2 minutos para que o rato adormeça e, em seguida, coloque-o numa caixa de aquecimento e cubra a tampa. Realizar testes de reflexo de dor como orelha, dedo do pé e pinça de cauda para avaliar a profundidade da anestesia para o procedimento32.
- Uma vez adormecido, anestesiar a córnea com 1 gota de tetracaína a 0,5% (v/v). Evite obter tetracaína perto do nariz ou boca do rato. Após 10 s, retire o excesso de líquido.
NOTA: Observou-se que a dilatação da íris e a visualização da câmara anterior (CA) são melhoradas quando a anestesia tópica é administrada, possivelmente devido à melhora da supressão do reflexo corneano com a anestesia sistêmica e tópica combinada. No entanto, essa etapa pode ser omitida, se desejado. - Dilate a pupila com 1 gota de fenilefrina a 2,5% (v/v). Tenha cuidado para evitar qualquer excesso de gotículas que possam entrar no nariz ou na boca. Após 2-3 min, tire o excesso de líquido.
- Para diminuir o risco de endoftalmite, adicione 1 gota de betadine a 5% à superfície do olho e ao cabelo circundante. Deixe no olho por 2-3 min.
NOTA: Execute todos os procedimentos nesta seção sob condições estéreis apropriadas para prevenir a endoftalmite. - Remova a betadina e cubra o olho com hipromelose (0,3%) ou gel ocular carbômero 0,2% p/p) para evitar a secura sob anestesia. Isso também ajudará a prevenir a formação de catarata.
- Configuração do sistema de microinjeção
- Realizar a injeção intravítrea utilizando uma microbomba ligada a um controlador de bomba de microseringa e a uma seringa de injeção (Figura 1A-C). Em alternativa, injetar com uma agulha 33 G ligada a uma seringa Hamilton, conforme descrito na subsecção 4.4.
- Ligue uma agulha de 34 G ao suporte da injeção para montar o injetor. Solte a tampa de rosca prateada na extremidade frontal do suporte de injeção e deslize a agulha para o corpo do suporte na metade do caminho. Aperte o dedo da tampa de rosca prateada com força.
- Ligue o tubo ao suporte de injecção, conforme mencionado nos passos 4.2.4-4.2.5.
- Para inserir a tubulação no suporte de injeção, solte o parafuso de plástico na extremidade traseira do suporte, deslize a tubulação através da junta interna e aperte o parafuso.
- Mantenha um ligeiro espaço com a extremidade da tubulação para evitar danos à tubulação durante a injeção. Consulte a Figura 1C.
- Descongelar uma alíquota de 100 μL da suspensão da reserva de micobactérias.
- Adicione 3 μL de uma solução de fluoresceína sódica a 1% (AK-Fluor) e forme bem o vórtice.
- Carregue uma seringa de 10 μL com a mistura de antigénio e fluoresceína sem incluir bolhas de ar.
- Remova a agulha de carga da seringa e deslize a tubulação através da junta da tampa de rosca prateada até que a ponta atinja a marca zero no corpo da seringa.
- Uma vez que a ponta da tubulação esteja corretamente alinhada à posição desejada, aperte o dedo da tampa de rosca com força.
- Lave a solução na seringa através da tubulação de injeção para carregar totalmente o sistema. Em seguida, repita os passos 4.2.8-4.2.11 para recarregar a seringa para injeção.
- Para instalar a seringa carregada na microbomba, prima o botão de libertação da braçadeira no final da microbomba para abrir as braçadeiras da seringa.
- Posicione a tampa do êmbolo no suporte da tampa do êmbolo na extremidade traseira da microbomba.
- Em seguida, deslize o colar da seringa para a paragem do colar e o corpo da seringa para a braçadeira da seringa.
- Solte o botão de braçadeira e aperte o parafuso de retenção do êmbolo. Consulte a Figura 1D.
- Deslize o suporte para injeção e a agulha através da braçadeira do aparelho de injeção estereotáxico. Esta é uma plataforma personalizada; alternativamente, a seringa pode ser segurada e posicionada manualmente.
- Ajuste o volume de perfusão e a taxa de volume de perfusão no controlador da bomba de microseringa para injetar 500 nL por ciclo a uma taxa de 40 nL/s, respetivamente.
NOTA: Taxas de injeção mais rápidas podem ser usadas, no entanto, mais refluxo pode ser experimentado antes que o reposicionamento da agulha possa ser alcançado. - Teste o sistema para garantir o funcionamento correto antes de realizar uma injeção intravítrea.
NOTA: Quando o sistema de injeção está funcionando corretamente, a ativação de um ciclo de injeção usando o pedal do pé ou a almofada de controle produzirá movimento visível do suporte da tampa do êmbolo e uma pequena gota de líquido esverdeado será vista na ponta da agulha. No caso de não ser produzido nenhum líquido, ative ciclos adicionais ou lave e recarregue a seringa. - Antes de injetar o olho, limpe suavemente a agulha com uma almofada de etanol a 95%.
- Procedimento de injeção intravítrea
- O rato é colocado num aparelho estereotáxico para realizar o procedimento de injecção.
- Mantenha o palco/plataforma sobre o qual o rato repousa aquecido, prendendo 2-3 toalhas de papel na sua superfície.
- Coloque o mouse em uma posição prona na plataforma. Use as barras auriculares direita e esquerda para fixar suavemente a cabeça do animal. Consulte a Figura 1E.
- Posicione o rato e oriente sob o escopo para que o aspecto nasal superior do olho direito seja visível.
- Use uma agulha 30 G para deslocar os cílios e expor a esclera. Visualize o limbo e o vaso sanguíneo radial.
- Use uma agulha estéril de 30 G para fazer um orifício guia na esclera 1-2 mm posterior ao limbo.
- Insira a agulha 34 G presa ao suporte de injeção no olho através do orifício guia em um ângulo que evite a lente, mas coloque a ponta da agulha na cavidade vítrea.
- Usando o controlador da bomba de microseringa, injete cuidadosamente 1 μL do extrato de Mtb na cavidade vítrea. Em caso de refluxo consistente, aumente o volume de injeção para 1,5 μL para garantir a administração adequada da dose.
NOTA: Para controlos simulados, injectar 1 μL de PBS no olho do animal. - Verifique a colocação intravítrea pela visualização de um reflexo esverdeado no olho. Consulte a Figura 1F.
- Após 10 s, retire a agulha do olho. Observe qualquer refluxo.
- Remova o mouse da plataforma, coloque 0,3% de hipromelose ou 0,2% p/m de pomada ocular em ambos os olhos para proteção da córnea e vá para a caixa de aquecimento de recuperação.
- Não deixe o rato sozinho até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não retorne à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Quando o rato estiver totalmente acordado, regresse à gaiola e adicione paracetamol (200-300 mg/kg/dia) garrafa de água medicamentosa. Rotule o cartão da gaiola com a data da injeção de TVI.
- As injeções intravítreas são geralmente bem toleradas. Os sinais clínicos que podem indicar dor e necessidade de remoção do estudo incluem alopecia periocular (indicativa de autotrauma), ulceração da córnea, perda de peso e postura curvada.
- Método alternativo para injeção intravítrea
NOTA: Este procedimento é realizado usando um microscópio cirúrgico e uma agulha 33 G em uma microseringa.- Proponça o olho e mantenha-o na posição com um par de fórceps.
- Em seguida, aplique o gel de olho carbômero a 0,2% p/p ou o gel de olho de hipromelose a 0,3% e coloque uma tampa circular (7 mm de diâmetro) sobre o olho.
- Monte uma agulha hipodérmica de 33 G numa seringa Hamilton de 5 μL e insira-a aproximadamente 2 mm circunferencial ao limbo corneano com um ângulo de injeção de ~45°.
- Guie o bisel da agulha para o vítreo, parando entre a lente e o disco óptico (do ponto de vista relativo do cirurgião, este está acima/cobrindo o disco óptico - aproximadamente 1,5 mm do local de inserção) e injete 2 μL de Mtb (a 2,5 ug/μL em PBS) lentamente.
- Segure a agulha no lugar brevemente (para reduzir a quantidade de refluxo de injetar) e, em seguida, remova-a.
- Após a injeção, reposite o globo liberando a pinça. Uma gota de 1% p/p de pomada de cloranfenicol pode ser administrada ao olho neste momento para fornecer proteção adicional contra endoftalmite pós-injeção.
- Após a injeção, mova para a caixa de aquecimento de recuperação, conforme mencionado nas etapas 4.3.11-4.3.13.
5. Imagem OCT para detectar e quantificar uveíte
- Preparação animal
- Anestesiar o mouse conforme descrito nas etapas 4.1.2-4.1.4
- Dilate a pupila com 1 gota de fenilefrina a 2,5%. Tenha cuidado para evitar qualquer excesso de gotículas que possam entrar no nariz ou na boca. Após 2-3 minutos, tire o excesso de líquido.
- Coloque 0,3% de hipromelose ou 0,2% p/p de gel de carbômero no olho para evitar a secura durante a anestesia. Isso também ajudará a prevenir a formação de catarata.
- Envolva o rato numa camada de gaze cirúrgica para manter o calor do corpo e coloque-o na do animal. Posicione a cabeça com a barra de mordida.
- Adquira as imagens OCT das câmaras anterior e posterior.
NOTA: Se obtiver imagens da câmara anterior e posterior, obtenha as imagens da câmara posterior (CP) primeiro para evitar a degradação da imagem após a formação da catarata. A formação de catarata pode ser prevenida com lubrificação frequente e aplicação de 0,3% de hipromelose ou 0,2% p/p de gel ocular carbômero. Para imagens prolongadas (>10 min), manter o mouse aquecido (através do uso de uma almofada de calor) também ajuda.- Depois de ligar o sistema de imagem OCT, prenda a lente de imagem correta e ajuste a posição do braço de referência conforme necessário.
- Abra o software de geração de imagens, crie o ID exclusivo do mouse e comece a criar imagens de acordo com o protocolo do fabricante da OCT.
- Usando a opção Free Run com o protocolo de varredura rápida, posicione o olho com o nervo óptico centrado nas imagens da câmara posterior ou o ápice da córnea nas imagens da câmara anterior.
NOTA: A Tabela 1 contém parâmetros de protocolo de imagem para dois sistemas de imagem de pequenos animais comercialmente disponíveis. Consulte a Tabela de Materiais para obter as especificações do produto. - Para imagens da câmara posterior, aproxime a OCT da superfície do olho. Tenha cuidado para evitar colocar a superfície da lente em contato com o olho.
- Quando o olho estiver posicionado corretamente, pare a varredura rápida e selecione o protocolo de varredura por volume e ative a varredura com a opção Apontar .
- Para imagens de segmento posterior, ajuste até que o nervo óptico esteja centralizado na imagem Alinhamento horizontal de varredura B e que a retina esteja alinhada com o eixo de alinhamento vertical
- Para imagens de segmento anterior, ajuste a posição para centralizar o ápice da córnea na imagem Alinhamento horizontal B-Scan e na imagem Alinhamento vertical B-Scan Alignment. A presença de um artefato de reflexão em ambas as imagens confirmará o alinhamento adequado. Em seguida, desloque a imagem horizontal o suficiente para remover o artefato de reflexão. Consulte a Figura 2.
- Clique em Instantâneo para capturar a imagem de digitalização de volume e, em seguida, clique em Salvar.
- Em seguida, obtenha a varredura média da linha central. Abra o protocolo de digitalização e clique em Apontar seguido de Instantâneo. Clique com o botão direito do mouse no mesmo painel e, em seguida, clique em Média.
- Repita os passos 5.2.1-5.2.9 para cada olho com ambas as lentes.
- Depois que todas as imagens forem coletadas, remova o mouse do e forneça proteção da córnea durante a recuperação, conforme listado nas etapas 4.3.11-4.3.13.
6. Pontuação inflamação por OCT
- Marque as imagens da OCT com a ajuda de alunos que estão mascarados para a condição de tratamento.
NOTA: Para PMU no modelo de mouse, recomenda-se o sistema de pontuação fornecido na Tabela 2 . - Se as imagens de câmara anterior (CA) e de câmara posterior (CP) foram obtidas, combine esses escores para obter o escore final para cada olho.
NOTA: A inflamação da câmara anterior se resolve antes da inflamação da câmara posterior.
7. Pontuação da inflamação pela histologia post-mortem
- Ao final do experimento, coletar olhos individuais por enucleação, fixar em formaldeído a 4% durante a noite e proceder à incorporação de parafina, seccionamento e coloração H&E33.
NOTA: Múltiplas seções de 4-8 μm ao longo do eixo do nervo pupilar-óptico são recomendadas.
NOTA: Três seções por olho são pontuadas por um avaliador mascarado usando o sistema de pontuação fornecido na Tabela 3, e a pontuação média das três seções é relatada como o escore final de inflamação histológica.
Representative Results
Este protocolo demonstra a indução de uveíte em camundongos utilizando o modelo de uveíte micobacteriana primed (PMU). Garantir a consistência na injeção subcutânea e a precisão da injeção intravítrea são etapas fundamentais no desenvolvimento do modelo de uveíte micobacteriana preparada (UPM). A Figura 1 demonstra o procedimento de injeção intravítrea em camundongo utilizando um aparelho estereotáxico. As barras auriculares ajudam a posicionar suavemente a cabeça no mesmo local sob o microscópio (Figura 1E). Eles também mantêm a cabeça estável durante o procedimento de injeção intravítrea, o que diminui o risco de trauma de injeção. Após uma injeção bem-sucedida, a fluoresceína na solução injetável produz um reflexo esverdeado de dentro do olho que pode ser visto ao microscópio ou de uma visão lateral, conforme ilustrado na Figura 1F.
Quando realizado conforme delineado, o protocolo gera uveíte aguda robusta que pode ser detectada usando OCT e imagem de fundo de olho já 10 h após a injeção intravítrea. A Figura 2 demonstra o alinhamento correto do olho para a imagem OCT. A Tabela 1A lista os parâmetros usados no protocolo OCT. Uma abordagem sistemática para a obtenção de imagens fornecerá imagens de alta qualidade que podem ser comparadas ao longo do tempo. As imagens da câmara anterior são centradas no ápice da córnea utilizando a imagem SLO en face (Figura 2A) com a íris alinhada em paralelo aos planos horizontal e vertical (Figura 2B,C). As varreduras de volume e linha são capturadas com um alinhamento vertical de modo que as regiões inferiores e superiores possam ser visualizadas simultaneamente. As imagens do segmento posterior são centradas no nervo óptico usando a imagem do SLO en face (Figura 2D), e a faixa brilhante do PSE é usada para alinhar a retina em paralelo aos planos horizontal e vertical (Figura 2E,F).
A Figura 3 mostra os achados típicos de inflamação ocular da PMU por meio de imagens OCT. Vinte e quatro horas após a injeção intravítrea, as células inflamatórias são observadas no aquoso e vítreo (Figura 3B). Na presença de inflamação moderada ou grave, um hipópio será visto no ângulo inferior da CA. O grau de inflamação ocular pode ser pontuado nessas imagens OCT usando os critérios listados na Tabela 2. Exemplos representativos de imagens que demonstram as características inflamatórias típicas de cada escore são mostrados na Figura 4. Os escores da câmara AC e PC podem ser somados para gerar o escore combinado da OCT. Os escores combinados >0, mas ≤2,5 representam inflamação leve. A inflamação moderada é determinada por pontuações >2,5 mas ≤4,5. Pontuações >4,5 identificam inflamação grave. A inflamação geralmente atinge o pico 48 h após a injeção intravítrea com escores de OCT na CA e PC entre 1 e 3 (escores combinados entre 2 e 6). Os escores de CA e PC de 0,5 ou 4 são menos comuns. No caso de pontuações fora do intervalo típico serem encontradas com frequência, a solução de problemas pode ser necessária para identificar os fatores que contribuem para pontuações atípicas (consulte a seção de discussão). Os escores de inflamação na câmara anterior tendem a retornar a zero dentro de uma semana após a injeção intravítrea. Em contraste, os escores posteriores não retornam a zero; em vez disso, a inflamação crônica de baixo nível persiste na forma de vitrite e os linfócitos perivasculares se infiltram na retina por 1-2 meses após a injeção intravítrea.
O escore de inflamação na PMU também pode ser determinado usando histologia. A Figura 5 mostra cortes representativos de H&E para uso na pontuação da gravidade da PMU por histologia. O número de células inflamatórias no aquoso e vítreo é contado e utilizado para determinar a gravidade utilizando os critérios de pontuação listados na Tabela 3. A infiltração de células inflamatórias do corpo ciliar é comumente observada em um lado da seção de histologia (envolvimento unilateral) em inflamação leve ou moderada. Quando a inflamação é grave, isso é refletido pela presença de um infiltrado de células inflamatórias no corpo ciliar em ambos os lados do cristalino (denominado envolvimento bilateral). Durante os períodos posteriores após a injeção intravítrea, as manifestações inflamatórias crônicas, incluindo a presença de leucócitos perivasculares e intrarretinianos e dobras externas da retina, também podem ser identificadas. A histologia também pode ser útil na identificação de olhos afetados por técnicas de injeção deficientes. O trauma no cristalino durante a injeção intravítrea pode ser identificado pela presença de proteínas do cristalino coradas com eosina amorfa (rosa) fora da cápsula do cristalino adjacente à área do trauma. O refluxo da TBm intravítrea para o espaço subconjuntival gerará inflamação fora do olho que pode ser identificada por uma revisão cuidadosa das estruturas perioculares presentes nas seções. Devido à falha em reter o extrato de mTB dentro dos olhos, esses olhos normalmente terão baixos escores de inflamação da OCT.
A imagem do fundo de olho de Brightfield também pode ser usada para identificar aspectos clinicamente relevantes da UPM, incluindo o desenvolvimento de um hipópio, vitrite e infiltração de células inflamatórias retinianas ou perivasculares. A Figura 6 mostra dois exemplos em que a inflamação retiniana e perivascular pode ser vista em imagens de fundo de olho. Esses dois olhos também mostram a gama de inflamação que é comum no modelo PMU. A Tabela 1B lista os parâmetros utilizados no sistema de imagem OCT de fundo/retina. Observe o impacto que a inflamação grave tem na qualidade da imagem (Figura 6, dia 2, OCT e imagens de fundo na linha superior) e a extensão da doença presente no dia 21. O edema da córnea também pode diminuir a qualidade da imagem durante a inflamação aguda; no entanto, é incomum que o edema da córnea seja grave apenas por inflamação. Mais comumente, a qualidade da imagem será degradada por danos epiteliais resultantes da proteção incompleta da superfície durante eventos de imagem e anestesia.
O modelo PMU pode ser usado para induzir uveíte em qualquer raça ou genótipo de camundongo. Em olhos albinos, a OCT ainda pode ser usada para marcar a inflamação, mas a ausência de pigmento de fundo de olho torna a visualização da inflamação desafiadora por imagens de campo brilhante13,34. Estudos post mortem podem ser realizados em tecidos oculares, linfonodos regionais ou baço. Alguns exemplos incluem ensaios para a presença de células imunes, como citometria de fluxo e imuno-histoquímica e medição de citocinas inflamatórias. Em todos os momentos testados após o início da inflamação com PMU (dia 1 a dia 56), há células inflamatórias CD45+ suficientes presentes em olhos individuais para detectar muitas populações leucocitárias importantes no olho por análise de fluxo multiparâmetro12,35. Humores aquosos (2-5 μL) e vítreos (5-10 μL) podem ser coletados de olhos inflamados para determinação da concentração de proteínas, estudos proteômicos ou determinação da concentração de citocinas36.
Figura 1: Configuração da injeção intravítrea do rato. A injeção intravítrea é realizada no olho do rato utilizando (A) um controlador de bomba de microseringa ligado à (B) Microbomba e (C) uma seringa de injeção. A seringa é carregada e montada na Microbomba (D). A cabeça do rato é posicionada usando barras auriculares (E) para garantir estabilidade e consistência durante o procedimento de injeção intravítrea. (F) A fluoresceína na solução injetável produz um reflexo esverdeado de dentro do olho após um procedimento bem-sucedido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alinhamento adequado do olho para imagens OCT. (A) Usando a imagem de oftalmoscópio a laser de varredura (SLO) en-face, o olho é centrado para imagens da câmara anterior. A linha verde indica a posição da varredura de linha horizontal mostrada no painel (B). Observe que a córnea central é evitada para diminuir o artefato de reflexão. (C) B-Scan vertical através da câmara anterior paracentral. Esta varredura é obtida a 90° a partir da varredura horizontal. Observe que o alinhamento das seções da íris em cada lado da lente é nivelado na varredura horizontal (painel B) e disposto um acima do outro na varredura vertical (painel C). (D) Usando a imagem SLO, a imagem da câmara posterior é centrada no nervo óptico. (E) Alinhamento horizontal B-Scan, (F) Alinhamento vertical B-Scan. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A indução da PMU gera panuveíte que pode ser monitorada por imagens longitudinais da OCT. A linha superior mostra a câmara anterior (CA); a linha inferior mostra imagens OCT da câmara posterior (PC) para destacar alterações patológicas no curso da doença. (A) Imagem OCT basal da CA (superior) e PC (inferior) antes da indução da uveíte, ambos escore 0. (B) Dia 1 após injeção intravítrea mostrando a presença de edema de córnea (seta preta), um hipópio (*) múltiplas células inflamatórias flutuantes na CA (setas brancas) e vitrite (pontas de seta branca) no PC. (C) Dia 7 após injeção intravítrea com poucas células CA na cápsula anterior do cristalino (seta branca) e vitrite diminuída (ponta de seta branca). (D) Dia 28 após injeção intravítrea câmara anterior com inflamação CA resolvida e vitrite leve. Abreviaturas: C- córnea, L - lente, I - íris, Aq - aquoso, V vítreo, RGC - células ganglionares da retina, PR - fotorreceptores, Ch- coroide. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplos de pontuação OCT. Uma pontuação OCT entre 0 e 4 é atribuída a cada imagem AC e imagem PC usando o sistema categórico mostrado na Tabela 2. Os escores AC e PC são combinados para a pontuação final da OCT para o olho. (A,D) Exemplos de uma pontuação de zero. (B,E) Exemplos de uma pontuação de 0,5. (C,F) Exemplos de uma pontuação de 1. (G,J) Exemplos de uma pontuação de 2. (H,K) Exemplos de uma pontuação de 3. (I,L) Exemplos de uma pontuação de 4 são mostrados nos painéis I e L. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplos de escore histológico. O escore histológico é determinado com base em cinco características visíveis em cortes de H & E: densidade proteica da câmara anterior, número de células da câmara anterior, infiltração de células imunes do corpo ciliar, densidade de células vítreas, inflamação vascular da retina e alterações estruturais da retina. Uma pontuação de 0-2 é atribuída para cada característica. A descrição de cada escore encontra-se na Tabela 3. Uma pontuação de exemplo representativa de 0-2 para cada característica é mostrada nesta figura. A coluna da esquerda demonstra a pontuação de zero. A coluna central mostra exemplos de pontuação 1. A coluna da direita mostra exemplos de pontuação 2. Uma pontuação de 2 para a pontuação do corpo ciliar é atribuída se o corpo ciliar em ambos os lados da lente na mesma seção demonstrar inflamação celular. O escore histológico final é a soma do escore para cada um dos cinco critérios (escore máximo 10). A seta no painel inferior direito indica leucócitos perivasculares associados a um vaso superficial da retina. A barra de escala preta indica 500 μm. Barras de escala ciliar indicam 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A imagem longitudinal do fundo de olho na PMU identificou uma variedade de gravidade da doença. (A) Olhos gravemente inflamados demonstram múltiplos infiltrados brancos na retina e tortuosidade vascular na imagem do fundo de olho colorido (linha superior), bem como vitrite densa e edema de retina na OCT (linha inferior) no dia 2. A progressão no número de lesões da retina pode ser observada ao longo do tempo enquanto a vitrite melhora. A linha verde indica a posição da imagem da OCT. (B) Olhos levemente inflamados demonstram menos e mais discretas lesões lineares no fundo de olho e várias células infiltrantes no espaço vítreo. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Um | |||
| Câmara Anterior do Rato | Varredura rápida | Varredura de volume | Varredura linear |
| Comprimento X Largura | 4,0 mm x 4,0 mm | 3,6 mm x 3,6 mm | 3,6 milímetros |
| Ângulo | 0 | 90 | 90 |
| A-scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-scans | 50 | 400 | 1 |
| Quadros/ B-scan | 1 | 3 | 20 |
| Câmara Posterior do Rato | Varredura rápida | Varredura de volume | Varredura linear |
| Comprimento X Largura | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 milímetros |
| Ângulo | 0 | 0 | 0 |
| A-scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-scans | 50 | 200 | 1 |
| Quadros/ B-scan | 1 | 3 | 20 |
| B | |||
| Câmara Posterior do Rato | Varredura de volume | Varredura linear | |
| Comprimento X Largura | 0,9 mm x 0,9 mm | 1,8 milímetros | |
| Ângulo | 0 | Qualquer (normalmente 0 ou 90) | |
| A-scan/B-Scan | 1024 | 1024 | |
| # B-scans | 512 | 1 | |
| Quadros/ B-scan | 1 | 30 |
Tabela 1: Parâmetros de varredura. (A) Parâmetros de varredura OCT. (B) Parâmetros de varredura de OCT de fundo/retina
| Descrições da Pontuação OCT | ||||||
| Pontuação | Câmara Anterior | Câmara Posterior | ||||
| NA | Nenhuma vista além da córnea anterior | Sem visão do segmento posterior | ||||
| 0 | Sem inflamação | Sem inflamação | ||||
| 0.5 | 1–5 células no aquoso | Poucas células ocupando menos de 10% da área vítrea | ||||
| OU edema de córnea | Sem infiltrados sub-retinianos ou intrarretinianos ou interrupção da arquitetura da retina | |||||
| 1 | 6–20 células no aquoso | Células difusas (sem aglomerados densos) ocupando entre 10 e 50% da área vítrea. | ||||
| OU uma única camada de células na cápsula do cristalino anterior | Sem infiltrados sub-retinianos ou intrarretinianos ou interrupção da arquitetura da retina | |||||
| 2 | 20–100 células no aquoso | Células difusas (sem aglomerados densos) ocupando > 50% da área vítrea | ||||
| OU menos de 20 células e um hipópio presente | Sem infiltrados sub-retinianos ou intrarretinianos ou interrupção da arquitetura da retina | |||||
| 3 | 20–100 células no aquoso | Células difusas iguais aos graus 2 e 1 | ||||
| E um hipópio OU uma membrana pupilar | E pelo menos uma opacidade vítrea densa ocupando 10% a 20% da área vítrea OU a presença de células vítreas iguais ao grau 2 e raras (≤ 2) opacidades sub-retinianas ou ntrarretinianas | |||||
| 4 | Qualquer número de células aquosas | Opacidade vítrea densa ocupando > 20% da área vítrea. | ||||
| E um grande hipópio e membrana pupilar OU perda de estrutura anterior devido a inflamação grave | OU células vítreas difusas com grandes opacidades sub-retinianas ou intrarretinianas | |||||
Tabela 2: Critérios de pontuação da PMU OCT: As imagens OCT são pontuadas de acordo com os critérios listados na tabela. Os escores AC e PC são adicionados para obter o escore final do olho. Nos casos em que uma visão clara do olho não foi adquirida, um escore de NA foi atribuído às imagens, e estas foram excluídas do estudo.
| Descrição do escore histológico | |||
| Característica | 0 | 1 | 2 |
| Proteína da Câmara Anterior (CA) | Partículas acelulares escassas corando com eosina na CA | Coloração de eosina extracelular moderada, mas não confluente, em qualquer parte da CA | Coloração de eosina extracelular confluente ou quase confluente em toda a CA |
| Célula da Câmara Anterior (CA) | Sem células | 1–100 células, mas sem agregações densas de células | >100 células, ou agregações densas de células |
| Inflamação do Corpo Ciliar | Nenhuma infiltração leucocitária do corpo ciliar ou do vítreo circundante | Presença unilateral de leucócitos infiltrados no corpo ciliar e/ou no vítreo circundante. | Presença bilateral de leucócitos infiltrados no corpo ciliar e/ou no vítreo circundante. |
| Inflamação Vascular da Retina | Sem vasos da retina com leucócitos perivasculares | Um vaso por secção com leucócitos perivasculares | >1 vaso por secção com leucócitos perivasculares |
| Dobra ou dano retiniano | Sem danos na retina | 1–3 dobras retinianas por seção | >3 dobras retinianas por seção, ou qualquer outra destruição da camada retiniana ou hemorragia intrarretiniana |
Tabela 3: Critérios de pontuação histológica da PMU: As seções de H&E do olho foram pontuadas com base nos critérios listados na tabela. Três cortes do mesmo olho foram pontuadas e calculadas em média para obter o escore histológico final do olho.
Discussion
Modelos animais de uveíte têm sido fundamentais para a compreensão dos mecanismos de inflamação ocular e homeostase, bem como para permitir a avaliação pré-clínica de terapias médicas e cirúrgicas para pacientes com uveíte37. Ambas as variantes de coelho e rato do modelo de PMU demonstraram seu valor na terapia pré-clínica por meio de estudos de prova de conceito38,39,40. Devido à disponibilidade de uma gama diversificada de cepas transgênicas em camundongos, o estabelecimento do sistema de modelo PMU de camundongos agora permite estudos mecanicistas mais detalhados para identificar tipos específicos de células, vias e genes que contribuem para a patologia desta doença.
Modelos animais de uveíte podem demonstrar variabilidade animal a animal na incidência e intensidade da inflamação41. Na cepa de mouse C57BL/6, a PMU é gerada de forma confiável usando o protocolo descrito aqui. Variações específicas de cepa no curso e intensidade da uveíte foram relatadas tanto para a UDE quanto para a EIU42,43. Embora os impactos específicos da cepa na gravidade e no curso da PMU não tenham sido medidos experimentalmente, esse modelo tem sido usado em C57BL/6J do tipo selvagem, bem como em camundongos albinos (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) e produziu respostas inflamatórias semelhantes. Ao gerar o modelo PMU, controlar as considerações listadas abaixo pode ajudar novos pesquisadores a limitar a variabilidade e produzir a uveíte mais consistente e reprodutível.
Garantir a consistência nas injeções subcutâneas:
Para fornecer uma injeção subcutânea consistente, certifique-se de que todas as bolhas de ar sejam removidas da emulsão. As considerações incluem uma centrífuga curta (30 s a 400 x g) da emulsão pré-fabricada antes de carregar a seringa. Isso removerá o ar preso na emulsão. Além disso, ao carregar a seringa, inverta periodicamente (incline-se) e toque na seringa para remover quaisquer bolhas de ar. Durante a injeção, não coloque a seringa muito profunda para evitar a injeção intramuscular. Por outro lado, uma injeção superficial (intradérmica) pode resultar em erosão da emulsão através da pele. Lembre-se de fazer uma breve pausa antes de remover a seringa do local de injeção para garantir a injeção completa da emulsão espessa viscosa e evitar o refluxo da pele.
Sete dias após a colocação da injeção subcutânea, confirme a presença de nódulos palpáveis em ambos os lados das patas traseiras. Se nenhum nódulo puder ser identificado, é possível que o ar tenha sido injetado em vez de emulsão. Neste caso, a inflamação aguda pode não ser tão robusta e a inflamação crônica pode não se desenvolver.
Prevenir o desenvolvimento de endoftalmite infecciosa:
A endoftalmite bacteriana ou fúngica gerará uma variável de confusão se não forprevenida 44. Para prevenir a endoftalmite bacteriana, pratique sempre uma boa técnica asséptica ao fazer a suspensão intravítrea, manusear e limpar todas as ferramentas reutilizáveis que entrarão em contato com o olho. Usar itens estéreis de uso único, autoclave ou limpeza com 95% de álcool lavagens ou lenços umedecidos é importante. O uso adequado de betadina aplicada na superfície ocular, pálpebras e pelo periocular também ajudará a prevenir a endoftalmite45. É simples reconhecer um olho com infecção, pois as estruturas oculares serão obliteradas por inflamação extrema durante o curso pós-injeção. Isso não é típico da PMU. A presença de sangramento intraocular também pode sugerir endoftalmite ou trauma da injeção. Nesses casos, exclua esses animais do estudo.
Garantir a consistência na injeção intravítrea:
A injeção intravítrea é um passo crítico na indução de inflamação confiável e reprodutível na UPM. Fornecer uma quantidade consistente de suspensão de Mtb a cada injeção, evitar traumas e prevenir o refluxo da suspensão são fatores que devem ser considerados ao realizar as injeções. Para garantir uma suspensão consistente, vortex a suspensão de estoque completamente após o descongelamento e antes de carregá-la na seringa. Uma vez que este extrato de Mtb utilizado não forma uma solução, a suspensão pode sofrer sedimentação ao longo do tempo. Para garantir uma concentração uniforme do extracto de Mtb em cada injecção, utilize ou expulse e recarregue a seringa no prazo de 15 minutos após o carregamento. A fenilefrina é usada para dilatação para fornecer um campo de visão maior para o olho posterior e reduzir o risco de trauma no olho durante a injeção. Essa queda gera retração pálpebra natural e leve proptose do globo, permitindo uma boa visualização da área 1-2 mm posterior ao limbo sem a necessidade de agarrar o olho com fórceps. O uso de fórceps para conter o olho pode causar trauma potencial e aumentar transitoriamente a pressão intraocular e o risco de refluxo da suspensão de Mtb. O trauma também pode ser causado pela tentativa de injetar muito volume no olho. O volume de injeção é limitado a 2 μL para evitar a elevação significativa e prolongada da pressão intraocular e trauma ocular. Além disso, os animais mais jovens terão olhos menores do que os ratos adultos. Normalmente, ratos de 6-8 semanas (20-25 g) fornecem um tamanho de olho uniforme e garantem maior consistência na inflamação após a injeção de Mtb. Uma maior frequência de refluxo pós-injeção da suspensão micobacteriana foi observada em camundongos menores. Isso, por sua vez, leva a uma inflamação aguda menor do que o esperado. Uma solução diluída de fluoresceína é usada para fornecer ao injetor novato feedback visual sobre o sucesso de sua técnica de injeção. A dilatação no momento da injeção permitirá a visualização direta do material injetado na cavidade vítrea e a oportunidade de observar qualquer evidência de trauma do cristalino. No caso de trauma da lente, pode causar uma alteração na clareza da lente que causará uma catarata que pode ser visualizada na OCT. No caso de trauma ocular, os olhos precisam ser excluídos do estudo devido à possibilidade de uveíte induzida pelo cristalino46. Recomendamos uma pausa de 10 s antes de remover a seringa do olho para permitir a dispersão da suspensão de Mtb dentro do olho e diminuir o refluxo.
O modelo de PMU pode ser modificado para alterar a intensidade da inflamação aguda, variando a concentração do Mtb na injeção intravítrea. Diferentes dosagens variando de 2,5 μg/μL a 15 μg/μL foram testadas anteriormente em nosso laboratório. No entanto, doses superiores a 10 μg/μL causaram danos oculares graves, incluindo ruptura espontânea do cristalino, edema e cicatrizes graves da córnea e hifema. Esse grau de gravidade não é típico em pacientes humanos com uveíte pós-infecciosa e, portanto, essas concentrações não são recomendadas. Verificou-se que uma dose de 5 μg/μL produz de forma confiável inflamação aguda leve a moderada e uveíte crônica leve; a dose de 10 μg/μL produz uma doença aguda moderada a grave e uma doença crónica mais notável. Assim, variar a concentração intravítrea pode fornecer severidades alternativas da doença para uso conforme necessário com base na questão experimental. Os controles devem ser selecionados para garantir que os resultados sejam devidos à resposta à mTB e não ao trauma associado às injeções subcutâneas ou intravítreas. Nos controles de injeção simulada, o PBS pode ser usado no lugar do extrato de mTB. Para comparações com animais não expostos, amostras verdadeiramente ingênuas devem ser consideradas, pois nem sempre são equivalentes.
Devido ao pequeno tamanho do olho do rato, a OCT pode ser um ensaio mais sensível para detectar inflamação na câmara anterior do que a visualização direta ou a fotografia microscópica de campo brilhante. Trabalhos anteriores com PMU em ratos25 determinaram que mais células podem ser detectadas pela histologia do que pela OCT, mas que há uma boa correlação entre as duas modalidades. OCT tem a vantagem adicional de que ele pode ser usado para monitorar a inflamação longitudinalmente no mesmo animal. Outros grandes modelos de uveíte em camundongos, como EAU e EIU, também empregaram OCT para análise quantitativa 12,47,48. No modelo de PMU de camundongos, as células da câmara anterior só são visíveis na OCT e não podem ser vistas em exames clínicos, a menos que um grande hipópio esteja presente. A inflamação vítrea (vitrite) pode ser observada com imagens de fundo de olho, mas a detecção de alterações quantitativas só é possível com imagens OCT. Outros aspectos do modelo, como inflamação vascular da retina e danos na retina, podem ser facilmente identificados com OCT e fotografia microscópica de fundo de campo brilhante.
Ao usar a OCT, é importante considerar como a imagem localizada pode ser afetada por diferenças regionais no grau de inflamação. Relatos anteriores identificaram uma distribuição desigual de células na câmara anterior dos seres humanos, com mais células localizadas inferiormente49. Em camundongos, uma predisposição semelhante é comum. Assim, varreduras verticais ou radiais através do CA ajudarão a garantir imagens que capturem a faixa de inflamação. Além disso, a realização de imagens no mesmo local também fornecerá consistência às imagens coletadas no mesmo olho longitudinalmente. Para obter imagens na mesma parte do olho, use marcos estáveis e uma abordagem sistemática. Para as imagens da câmara anterior, a imagem é centrada imediatamente adjacente ao ápice da córnea e orientada verticalmente para que a presença de um hipópio possa ser detectada no ângulo inferior. Para imagens de segmento posterior, a imagem é centrada no nervo óptico. Recomenda-se considerar o uso de pelo menos 3 varreduras de linha para pontuação para garantir que a variabilidade regional seja capturada. Nos casos em que a inflamação é restrita a locais periféricos, a aquisição de exames de volume pode ser útil. A coleta de varreduras de volume também pode ajudar a capturar variações regionais, mas aumentará os requisitos de armazenamento de dados.
Outros ensaios in vivo que podem ser utilizados para caracterizar a inflamação no modelo de camundongo PMU incluem imagens de bioluminescência13,35. Ensaios post-mortem, como análise citométrica de fluxo multiparâmetro, podem ser realizados para identificar e quantificar populações infiltrantes do tipo de células imunes na câmara aquosa e posterior do olho 12,26. No modelo de PMU, a inflamação aguda é caracterizada por uma resposta inata com um infiltrado neutrófilo predominante, seguida por uma resposta dominante adaptativa crônica e persistente de células T que persiste por mais de um mês35. Outros ensaios de função imunológica que podem ser realizados em tecidos post-mortem incluem análise de citocinas do fluido ocular. Além disso, outros ensaios a jusante, como sequenciamento de mRNA e imagens de imunofluorescência, podem ser usados para avaliar padrões de expressão gênica e proteica de populações de células imunes da retina na uveíte50,51.
O modelo PMU pode ser replicado em outros sistemas de roedores usando adaptações apropriadas para as diferentes espécies. O modelo de PMU já foi utilizado anteriormente em ratos e coelhos38,39,40. Em ratos, a panuveíte aguda se desenvolve após injeção intravítrea que se resolve espontaneamente ao longo de 14 dias sem desenvolver sinais de inflamação crônica por histologia24. Em coelhos, a indução da uveíte utiliza duas rodadas de injeção subcutânea antes da injeção intravítrea, mas também gera uma panuveíte robusta. Uma das vantagens do uso do modelo de camundongo é a pronta disponibilidade de inúmeras cepas transgênicas e knockout que podem ajudar a entender o mecanismo básico da uveíte52. Todos os modelos de roedores podem ser usados para testes de terapia pré-clínica se o agente for administrado sistemicamente ou como uma gota tópica. No entanto, devido ao seu tamanho maior, os olhos de rato e coelho são melhores modelos para uso em estudos pré-clínicos de opções de tratamento por injeção implantável ou local para uveíte.
Em resumo, este protocolo fornece aos pesquisadores interessados em estudar os mecanismos de inflamação ocular crônica uma nova ferramenta que não depende da imunização prévia com antígenos oculares.
Disclosures
Os autores não têm conflitos financeiros a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Maryland, Estados Unidos (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), doações do Mark Daily, MD Research Fund e do Christopher and Alida Latham Research Fund, uma bolsa departamental irrestrita da Research to Prevent Blindness e prêmio de desenvolvimento de carreira da Research to Prevent Blindness (KP). O trabalho realizado em Bristol foi apoiado por financiamento adicional da Sight Research UK e do The Underwood Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial | |
| AnaSed | Akorn Animal Health, IL, USA | NDC 59399-110-20 | Xylazine 20 mg/mL |
| Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution | Alcon, TX, USA | 8007-1 | |
| B-D Precision Glide Needles -25 G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305122 | |
| B-D Precision Glide needle -30-G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305106 | |
| Bond MAX, Bond Rx | Leica Biosystems, IL,USA | Automated IHC staining system | |
| Chloramphenicol ointment | Martindale Pharma, Romford, UK | 1% w/w Chloramphenicol | |
| EG1150H | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Embedding | |
| Envisu R2300 | Bioptigen/Leica | OCT Machine | |
| Freund's Incomplete Adjuvant | BD Difco, NJ, USA | 263910 | |
| GenTeal lubricant eye ointment | Alcon, TX, USA | --- | |
| GenTeal lubricant eye gel | Alcon, TX, USA | --- | |
| H37Ra lyophilized Mycobacteria extract | BD Difco, NJ, USA | 231141 | |
| Hamilton RN Needle (33/12/2)S | Hamilton, Reno, NV | 7803-05(33/12/2) | 33 G |
| Hamilton syringe | Hamilton, Reno, NV | CAL7633-01 | 5 µL |
| Insulin needle | Exel International, USA | 26029 | 1 mL |
| Isoflurane | |||
| Ketaset | Zoetis, USA | 377341 | Ketamine HCL 100 mg/mL |
| Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller | World Precision Instruments, FL, USA | UMP3 | |
| Micron IV | Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA | Alternative Imaging/OCT Machine | |
| Nanofil 10 µL syringe | World Precision Instruments, FL, USA | NANOFIL | |
| Nanofil Intraocular Injection Kit | World Precision Instruments, FL, USA | IO-KIT | |
| Olympus SZX10 | Olympus | Dissection scope | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 17478020115 | |
| RM2255 | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Sectioning | |
| TB Syringe | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 309602 | 1 mL |
| Tetracaine 0.5% | Alcon, TX, USA | 1041544 | |
| Tissue Tek VIP series | Sakura Finetek USA, Inc.,CA. | Histology Tissue Processing | |
| Tropicamide 1% | Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK | Minims | |
| Tylenol | Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA | NDC 50580-614-01 | Acetaminophen |
| Viscotears | Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK | Carbomer eye gel 0.2% w/w |
References
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