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Biochemistry

Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

Techniken zur Messung der Aktivität von Schlüsselenzymen des Glykogenstoffwechsels werden vorgestellt, wobei ein einfaches Spektralphotometer verwendet wird, das im sichtbaren Bereich arbeitet.

Abstract

Glykogen wird als Speicherform von Glukose von einer Vielzahl von Organismen synthetisiert, die von Bakterien bis hin zu Tieren reichen. Das Molekül besteht aus linearen Ketten von α1,4-verknüpften Glucoseresten, deren Verzweigungen durch Zugabe von α1,6-Bindungen eingebracht werden. Um zu verstehen, wie die Synthese und der Abbau von Glykogen reguliert werden und wie Glykogen seine charakteristische verzweigte Struktur erreicht, müssen die Enzyme der Glykogenspeicherung untersucht werden. Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Untersuchung dieser Enzymaktivitäten verwenden jedoch typischerweise Reagenzien oder Techniken, die nicht allen Forschern zur Verfügung stehen. Hier diskutieren wir eine Reihe von Verfahren, die technisch einfach, kostengünstig und dennoch in der Lage sind, wertvolle Einblicke in die Steuerung der Glykogenspeicherung zu liefern. Die Techniken erfordern den Zugang zu einem Spektralphotometer, das im Bereich von 330 bis 800 nm arbeitet, und werden unter der Annahme beschrieben, dass die Benutzer Einweg-Kunststoffküvetten verwenden. Die Verfahren sind jedoch leicht skalierbar und können für den Einsatz in einem Mikrotiterplatten-Reader modifiziert werden, was eine hochgradig parallele Analyse ermöglicht.

Introduction

Glykogen ist in der Natur weit verbreitet, wobei die Verbindung in Bakterien, vielen Protisten, Pilzen und Tieren gefunden wird. In Mikroorganismen ist Glykogen wichtig für das Überleben der Zellen, wenn Nährstoffe begrenzt sind, und in höheren Organismen wie Säugetieren dienen Synthese und Abbau von Glykogen dazu, den Blutzuckerspiegel zu puffern 1,2,3. Die Untersuchung des Glykogenstoffwechsels ist daher für so unterschiedliche Bereiche wie die Mikrobiologie und die Säugetierphysiologie von Bedeutung. Um den Glykogenstoffwechsel zu verstehen, müssen die Schlüsselenzyme der Glykogensynthese (Glykogensynthase und das verzweigte Enzym) und des Glykogenabbaus (Glykogenphosphorylase und Debranching-Enzym) untersucht werden. Die Goldstandard-Assays von Glykogensynthase, Phosphorylase, Verzweigung und Entzweigung von Enzymaktivitäten verwenden radioaktive Isotope. Zum Beispiel wird die Glykogensynthase im Allgemeinen in einem gestoppten radiochemischen Assay gemessen, indem Glukose aus UDP-[14 C]glucose (im Fall von tierischen und Pilzenzymen) oder ADP-[14C]glucose (im Fall von bakteriellen Enzymen) in Glykogen 4,5 eingebaut wird. In ähnlicher Weise wird die Glykogenphosphorylase in Richtung der Glykogensynthese gemessen, nachdem Glukose aus [14C]glucose-1-phosphat in Glykogen6 eingebaut wurde. Das verzweigte Enzym wird durch Messung der Fähigkeit dieses Enzyms untersucht, den Einbau von [14 C]glucose aus Glucose-1-phosphat in α1,4-verknüpfte Ketten durch Glykogenphosphorylase7 zu stimulieren, und die Entzweigungsenzymaktivität wird bestimmt, indem die Fähigkeit des Enzyms verfolgt wird, [14C]glucose in Glykogen einzubauen8 . Obwohl sie sehr empfindlich sind und ihre Verwendung in Rohzellextrakten mit geringer Enzymaktivität ermöglichen, sind die radioaktiven Substrate teuer und unterliegen den regulatorischen Anforderungen, die mit der Verwendung von Radioisotopen verbunden sind. Diese Barrieren machen die Verwendung bestimmter Assays für viele Arbeiter unerreichbar. Im Laufe vieler Jahre wurde jedoch eine beeindruckende Vielfalt spektrophotometrischer Ansätze zur Messung dieser Enzyme beschrieben. Im Allgemeinen beruhen diese Ansätze letztendlich auf der Messung der Produktion oder des Verbrauchs von NADH / NADPH oder der Erzeugung von Farbkomplexen zwischen Glykogen und Jod. Daher sind sie unkompliziert und können mit einfachen Spektralphotometern durchgeführt werden, die nur mit Wolfram- oder Xenon-Blitzlampen ausgestattet sind.

Spektrophotometrische Assays der Glykogensynthase beruhen auf der Messung des Nukleosiddiphosphats, das vom Zuckernukleotiddonor freigesetzt wird, wenn Glukose zur wachsenden Glykogenkette 9,10 hinzugefügt wird. Das in Abschnitt 1 des Protokolls beschriebene Verfahren zur Messung der Glykogensynthaseaktivität ist eine Modifikation des von Wayllace et al.11 beschriebenen Verfahrens, und das Kopplungsschema ist unten dargestellt:

(Glukose) n + UPD-Glukose → (Glukose)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + Phosphoenolpyruvat → Pyruvat + ATP

Pyruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+

Glykogensynthase fügt Glukose aus UDP-Glucose zu Glykogen hinzu. Das dabei erzeugte UDP wird durch Nukleosiddiphosphatkinase (NDP-Kinase) in eine Reaktion umgewandelt, die ADP erzeugt. Das ADP wiederum dient dann als Substrat für die Pyruvatkinase, die das ADP mit Phosphoenolpyruvat als Phosphatdonor phosphoryliert. Das entstehende Pyruvat wird durch das Enzym Laktatdehydrogenase in einer Reaktion, die NADH verbraucht, in Laktat umgewandelt. Der Assay kann daher kontinuierlich durchgeführt werden, wobei die Abnahme der Absorption bei 340 nm überwacht wird, wenn NADH verbraucht wird. Es ist leicht für die Verwendung mit Enzymen geeignet, die ADP-Glukose als Glukosespender benötigen. Hier sind die Kopplungsschritte einfacher, da das ADP, das durch die Wirkung der Glykogensynthase freigesetzt wird, direkt von der Pyruvatkinase beeinflusst wird.

Es gibt eine Vielzahl von spektrophotometrischen Assays zur Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität. In der klassischen Version wird das Enzym rückwärts in Richtung der Glykogensynthese getrieben, wie unten gezeigt:

(Glukose) n + Glucose-1-phosphat → (Glucose)n+1 + Pi

In zeitlichen Abständen werden Aliquots des Reaktionsgemisches entfernt und die freigesetzte Phosphatmenge mit12,13 quantifiziert. In unseren Händen war dieser Assay aufgrund des Vorhandenseins von leicht messbarem freiem Phosphat in vielen kommerziellen Zubereitungen von Glucose-1-phosphat, kombiniert mit den hohen Konzentrationen von Glucose-1-phosphat, die für die Phosphorylase-Wirkung erforderlich sind, von begrenztem Nutzen. Vielmehr haben wir routinemäßig einen alternativen Assay verwendet, der das Glucose-1-phosphat misst, das freigesetzt wird, wenn Glykogen durch Phosphorylase13 abgebaut wird. Es wird ein gekoppeltes Reaktionsschema verwendet, das unten dargestellt ist.

(Glukose) n + Pi → (Glucose)n-1 + Glucose-1-phosphat

Glucose-1-phosphat → Glucose-6-phosphat

Glucose-6-phosphat + NADP+ → 6-Phosphogluconolacton + NADPH + H+

Das Glucose-1-phosphat wird durch Phosphoglucomutase in Glucose-6-phosphat umgewandelt, und das Glucose-6-phosphat wird dann zu 6-Phosphogluconolacton oxidiert, mit der gleichzeitigen Reduktion von NADP+ zu NADPH. Das in Abschnitt 2 des Protokolls beschriebene Verfahren leitet sich von den von Mendicino et al.14 und Schreiber & Bowling 15 beschriebenen Methoden ab. Der Assay kann problemlos kontinuierlich durchgeführt werden, wobei die Absorption bei 340 nm im Laufe der Zeit zunimmt, was die Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit ermöglicht.

Die spektrophotometrische Bestimmung der Debranching-Enzymaktivität beruht auf der Messung der Glukose, die durch die Wirkung des Enzyms auf Phosphorylase-Grenzdextrin16 freigesetzt wird. Diese Verbindung wird durch erschöpfende Behandlung von Glykogen mit Glykogenphosphorylase hergestellt. Da die Glykogenphosphorylase-Wirkung 4 Glucosereste von einem α1,6-Zweigpunkt entfernt stoppt, enthält das Grenzdextrin Glykogen, dessen äußere Ketten auf ~4 Glucosereste verkürzt wurden. Die Herstellung von Phosphorylase-Grenzdextrin wird hier unter Verwendung eines Verfahrens beschrieben, das von den von Taylor et al.17 und Makino & Omichi 18 entwickelten Verfahren abgeleitet ist.

Die Entzweigung ist ein zweistufiger Prozess. Die 4-α-Glucanotransferase-Aktivität des bifunktionellen Entzweigungsenzyms überträgt zunächst drei Glucosereste vom Zweigpunkt zum nicht-reduzierenden Ende einer nahe gelegenen α1,4-verknüpften Glucosekette. Der einzelne, α1,6-verknüpfte Glucoserest, der am Zweigpunkt verbleibt, wird dann durch die α1,6-Glucosidase-Aktivität19 hydrolysiert. Der Assay wird typischerweise in einer gestoppten Weise durchgeführt, wobei die nach einer bestimmten Zeit (oder einer Reihe von Malen) freigesetzte Glukose in einem gekoppelten Enzymassay gemessen wird, wie unten gezeigt:

(Glukose) n → (Glukose)n-1 + Glukose

Glucose + ATP → Glucose-6-phosphat + ADP

Glucose-6-phosphat + NADP+ → 6-Phosphogluconolacton + NADPH + H+

Die Bestimmung der produzierten NADPH gibt ein Maß für die Glukoseproduktion. Das in Abschnitt 3 des Protokolls beschriebene Verfahren basiert auf einem von Nelson et al.16 beschriebenen Verfahren. Wie die anderen Methoden, die auf dem Verbrauch oder der Erzeugung von NADH / NADPH beruhen, ist der Assay sehr empfindlich. Das Vorhandensein von Amylasen oder anderen Glucosidasen, die auch freie Glukose aus Phosphorylase-Grenzdextrin freisetzen können, führt jedoch zu erheblichen Störungen (siehe Diskussion).

Die kolorimetrische Bestimmung der verzweigten Enzymaktivität beruht auf der Tatsache, dass α1,4-verknüpfte Glukoseketten helikale Strukturen annehmen, die an Jod binden und farbige Komplexe bilden20. Die Farbe des gebildeten Komplexes hängt von der Länge der α1,4-verknüpften Ketten ab. So bildet Amylose, die aus langen, weitgehend unverzweigten Ketten von α1,4-verknüpfter Glucose besteht, mit Jod einen tiefblauen Komplex. Im Gegensatz dazu bilden Glykogene, deren äußere Ketten in der Regel nur 6 bis 8 Glukosereste lang sind, orangerote Komplexe. Wenn eine Lösung von Amylose mit verzweigtem Enzym inkubiert wird, führt die Einführung von Zweigen in die Amylose zur Bildung kürzerer α1,4-verknüpfter Glucoseketten. Somit verschiebt sich das Absorptionsmaximum der Amylose/Jod-Komplexe in Richtung kürzerer Wellenlängen. Das hier diskutierte Verfahren leitet sich von dem von Boyer & Preiss21 beschriebenen ab, und die Verzweigungsenzymaktivität wird als Verringerung der Absorption des Amylose/Iod-Komplexes bei 660 nm im Laufe der Zeit quantifiziert.

Wie aus der obigen Diskussion leicht ersichtlich sein sollte, bedeutet die Tatsache, dass die Farben der zwischen Jod und α1,4-Glucoseketten gebildeten Komplexe mit der Kettenlänge variieren, dass die Absorptionsspektren von Glykogen/Jod-Komplexen mit dem Grad der Glykogenverzweigung variieren sollten. Dies ist in der Tat der Fall, und weniger verzweigte Glykogene / Glykogene mit längeren äußeren Ketten absorbieren Licht bei einer längeren Wellenlänge als Glykogene, die stärker verzweigt sind / kürzere äußere Ketten haben. Die Jodfärbungsreaktion kann daher genutzt werden, um schnelle, qualitative Daten über den Grad der Glykogenverzweigung zu gewinnen22. Die orange-braune Farbe bildet sich, wenn Glykogenkomplexe mit Jod nicht besonders intensiv sind. Die Farbentwicklung kann jedoch durch die Aufnahme von gesättigter Calciumchloridlösung22 verbessert werden. Dies erhöht die Empfindlichkeit der Methode um das 10-fache und ermöglicht eine fertige Analyse von Mikrogrammmengen an Glykogen. Der in Abschnitt 4 des Protokolls beschriebene Assay zur Bestimmung der Verzweigung basiert auf einem von Krisman22 entwickelten Verfahren. Es wird einfach durchgeführt, indem die Glykogenprobe mit Jodlösung und Calciumchlorid in einer Küvette kombiniert und das Absorptionsspektrum von 330 nm bis 800 nm gesammelt wird. Das Absorptionsmaximum verschiebt sich in Richtung längerer Wellenlängen, wenn der Verzweigungsgrad abnimmt.

Insgesamt bieten die hier beschriebenen Methoden einfache, zuverlässige Mittel, um die Aktivitäten der Schlüsselenzyme des Glykogenstoffwechsels zu bewerten und qualitative Daten über das Ausmaß der Glykogenverzweigung zu erhalten.

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Protocol

1. Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität

  1. Bereiten Sie die Stammlösungen der erforderlichen Reagenzien gemäß Tabelle 1 (vor dem Versuchstag) vor.
Bestandteil Wegbeschreibungen
50 mM Tris pH 8,0 Lösen Sie 0,61 g Tris-Base in ~ 80 ml Wasser auf.  Auf 4 °C abkühlen.   Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 8,0 ein und erhöhen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 ml.
20 mM HEPES-Puffer 0,477 g HEPES in ~ 80 mL Wasser auflösen.  Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,0 ein und füllen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 ml aus.
132 mM Tris/32 mM KCl Puffer pH 7,8 Lösen Sie 1,94 g Tris-Base und 0,239 g KCl in ~90 ml Wasser auf.  Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,8 ein und füllen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 ml aus.
0,8% w/v Austernglykogen Wiegen Sie 80 mg Austernglykogen aus und geben Sie es zu Wasser.  Machen Sie das endgültige Volumen mit Wasser auf 10 ml und erwärmen Sie es vorsichtig / mischen, um Glykogen vollständig aufzulösen.
100 mM UDP-Glukose 0,31 g UDP-Glucose werden in Wasser gelöst und das Endvolumen auf 1 ml erhöht.  In Aliquots lagern, bei -20 °C eingefroren.   Stabil für mehrere Monate.
50 mM ATP Lösen Sie 0,414 g ATP in ~ 13 mL Wasser.  Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,5 ein und füllen Sie das Volumen mit Wasser auf 15 ml aus.  In aliquoten bei -20 °C gefrorenen aliquots lagern.   Stabil für mehrere Monate.
100 mM Glucose-6-phosphat pH 7,8 0,282 g Glucose-6-phosphat werden in ~ 7 bis 8 ml Wasser gelöst.  Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,8 ein.  Machen Sie das Volumen mit Wasser auf 10 ml.  Tiefgefroren in Aliquots bei -20 °C lagern.   Stabil für mindestens sechs Monate.
40 mM Phosphoenolpyruvat 4 mg Phosphoenolpyruvat werden in 0,5 ml 20 mM HEPES-Puffer pH 7,0 gelöst.  Bei -20 °C lagern.   Stabil für mindestens 1 Woche.
0,5 M MnCl2 9,90 g MnCl2 werden in einem Endvolumen von 100 mL Wasser gelöst.
NDP-Kinase Rekonstituieren Sie lyophilisiertes Pulver mit ausreichend Wasser, um 1 U / μl Lösung zu erhalten.  Aliquots vorbereiten, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.   Stabil für mindestens 1 Jahr.

Tabelle 1: Stammlösungen, die für die Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität erforderlich sind.

  1. Am Tag des Assays wird eine frische Arbeitslösung von 4 mM NADH hergestellt, indem 4,5 mg NADH in 1,5 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 gelöst werden. Auf Eis lagern, vor Licht geschützt.
  2. Auftauen von Stammlösungen von UDP-Glucose, ATP, Phosphoenolpyruvat und NDP-Kinase auf Eis.
  3. Ein Wasserbad auf 30 °C vorheizen.
  4. Richten Sie jeden Glykogensynthase-Assay in einem 1,5-ml-Röhrchen ein, indem Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Reaktionsgemischreagenzien hinzufügen.
Bestandteil Volumen (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl Puffer pH 7,8 250
Wasser 179
100 mM Glucose-6-phosphat, pH 7,8 58
0,8 % w/v Austernglykogen 67
50 mM ATP 80
4 mM NADH 80
100 mM UDP-Glukose 28
40 mM Phosphoenolpyruvat 20
0,5 M MnCl2 8
Letzter Band 770

Tabelle 2: Zusammensetzungsreaktionsgemisch zur Bestimmung der Glykogensynthaseaktivität.

HINWEIS: Um den Aufbau zu erleichtern, kann ein Master-Mix hergestellt werden, der genügend von jedem der oben aufgeführten Reagenzien enthält, um die Anzahl der geplanten Assays zu vervollständigen.

  1. Bereiten Sie eine Blindreaktion vor, bei der das NADH in der obigen Mischung durch Wasser ersetzt wird. In eine Einweg-Methacrylatküvette überführen und damit den Nullpunkt auf dem Spektralphotometer auf 340 nm setzen.
  2. Man nimmt einen 770 μL des aliquoten Reaktionsgemisches in ein 1,5 ml Röhrchen. 2 μL NDP-Kinase und 2 μL Pyruvatkinase/Laktat-Dehydrogenase-Gemisch zugeben, vorsichtig mischen und bei 30 °C 3 min inkubieren, um das Reaktionsgemisch vorzuwärmen.
  3. 30 μL der Glykogensynthase enthaltenden Probe in 20 mM Tris-Puffer, pH 7,8 geben; Mischen und das Reaktionsgemisch in eine Einweg-Methacrylatküvette überführen.
  4. Legen Sie die Küvette in das Spektralphotometer und zeichnen Sie die Absorption bei 340 nm in Zeitintervallen für 10 bis 20 min auf. Zeichnen Sie die erhaltenen Absorptionswerte gegen die Zeit auf.
    HINWEIS: Eine Reaktion, bei der die Glykogensynthase-Probe durch einen 20 mM Tris-Puffer ersetzt wird, sollte durchgeführt werden, um die nicht-enzymatische Oxidation von NADH zu kontrollieren. Abhängig von der Reinheit der Probe können andere Kontrollreaktionen erforderlich sein. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion.
  5. Bestimmen Sie die Reaktionsgeschwindigkeit (siehe Ergebnisse für Details).

2. Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität

  1. Bereiten Sie Stammlösungen wie in Tabelle 3 angegeben vor (vor dem Versuchstag) vor.
Bestandteil Wegbeschreibungen
125 mM ROHRE pH 6,8 3,78 g PIPES werden in Wasser gelöst.  Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 6,8 ein und füllen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 ml aus.
8% w/v Austernglykogen 0,8 g Austernglykogen wiegen und zu Wasser geben.  Machen Sie das endgültige Volumen mit Wasser auf 10 ml und erwärmen Sie es vorsichtig / mischen Sie, um Glykogen aufzulösen.  Tiefgefroren bei -20 °C lagern.
200 mM Na Phosphat pH 6,8 2,63 g Na2HPO4,7H2O und 1,41gNaH2PO4 werden gelöst. H2O in Wasser.  Bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 ml.
1 mM Glucose-1,6-bisphosphat 2 mg Glucose-1,6-bisphosphat werden in 4 ml Wasser gelöst.  Aliquot und gefroren bei -20 °C lagern.   Stabil für mindestens mehrere Monate.
10 mM NADP Lösen Sie 23 mg NADP in 3 ml Wasser auf.  Aliquot und gefroren bei -20 °C lagern.   Stabil für mindestens mehrere Monate.

Tabelle 3: Für die Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität erforderliche Stammlösungen.

  1. Ein Wasserbad auf 30 °C vorheizen
  2. Richten Sie jeden Glykogenphosphorylase-Assay in einem 1,5-ml-Röhrchen ein, indem Sie die unten aufgeführten Reaktionsgemischreagenzien hinzufügen (Tabelle 4).
Bestandteil Volumen (μl)
125 mM PIPES Puffer pH 6,8 160
Wasser 70
8% w/v Austernglykogen 100
200 mM Na Phosphat 6,8 400
1 mM Glucose-1,6-bisphosphat 20
10 mM NADP 20
Letzter Band 770

Tabelle 4: Zusammensetzungsreaktionsgemisch zur Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität.

HINWEIS: Um den Aufbau zu erleichtern, kann ein Master-Mix hergestellt werden, der genügend von jedem der oben aufgeführten Reagenzien enthält, um die Anzahl der geplanten Assays zu vervollständigen.

  1. Es wird eine Blindreaktion vorbereitet, die die in Tabelle 4 aufgeführten Komponenten enthält, jedoch zusätzliche 30 μL 25 mM PIPES-Puffer, pH 6,8 (hergestellt durch Verdünnen von 125 mM PIPES-Puffer 1/5 mit Wasser) hinzugefügt. In eine Einweg-Methacrylatküvette überführen und den Nullpunkt auf dem Spektralphotometer auf 340 nm setzen.
  2. Nehmen Sie ein 770 μL aliquotes Reaktionsgemisch in ein 1,5 ml Röhrchen. 1 μL Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 1 μL Phosphoglucomutase zugeben, vorsichtig mischen und 3 min bei 30 °C inkubieren, um das Reaktionsgemisch vorzuwärmen.
  3. Fügen Sie 30 μL der Probe mit Glykogenphosphorylase in 25 mM PIPES-Puffer mit pH 6,8 hinzu. Das Reaktionsgemisch mischen und in eine Einweg-Methacrylatküvette überführen.
  4. Legen Sie die Küvette in das Spektralphotometer und zeichnen Sie die Absorption bei 340 nm in Zeitintervallen für 10 bis 20 min auf. Zeichnen Sie die erhaltenen Absorptionswerte gegen die Zeit auf.
    HINWEIS: Eine Reaktion, bei der die Glykogenphosphorylase durch 25 mM PIPES-Puffer ersetzt wird, sollte enthalten sein. Abhängig von der Reinheit der Glykogenphosphorylase-Probe können auch andere Kontrollen erforderlich sein (siehe Diskussion für Details).
  5. Bestimmen Sie die Reaktionsgeschwindigkeit (siehe Repräsentative Ergebnisse für Details).

3. Bestimmung der Glykogen-Entzweigungsenzymaktivität

  1. Bereiten Sie die Stammlösungen gemäß Tabelle 5 (vor dem Versuchstag) vor.
Bestandteil Wegbeschreibungen
100 mM Maleat-Puffer Lösen Sie 1,61 g Maleinsäure in ~ 80 ml Wasser.  Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 6,6 ein und machen Sie das Endvolumen mit Wasser auf 100 ml.
300 mM Triethanolaminhydrochlorid/ 3 mMMgSO4 pH 7,5 27,85 g Triethanolaminhydrochlorid und 0,370 gMgSO4 werden gelöst. 7H2O in ~ 400 mL Wasser.  Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,5 ein und füllen Sie mit Wasser ein Endvolumen von 500 ml auf.
150 mM ATP/12 mM NADP Lösen Sie 1,24 g ATP in ~ 10 mL Wasser.  Überwachen Sie den pH-Wert und fügen Sie NaOH hinzu, um einen pH-Wert von ~ 7,5 aufrechtzuerhalten, wenn sich das ATP auflöst.  Fügen Sie 0,138 g NADP hinzu.  Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf ~ 7,5 ein und füllen Sie mit Wasser ein Endvolumen von 15 ml. In Aliquots bei – 20 °C lagern. Stabil für mehrere Monate.
50 mM Na Phosphatpuffer pH 6,8 32,81 g Na2HPO4,7H2O und 17,61 gNaH2PO4 werden gelöst. H2O in Wasser.  Bringen Sie das Volumen mit Wasser auf ein Endvolumen von 5 L.

Tabelle 5: Stammlösungen, die für die Bestimmung der Glykogen-Entzweigungsenzymaktivität erforderlich sind.

  1. Phosphorylase-Grenzdextrin vorbereiten
    1. 0,3 g Austernglykogen werden in 10 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8 gelöst.
    2. Ausreichend lyophilisiertes Phosphorylase-A-Pulver wird gelöst, um 60 E Aktivität in 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, zu erhalten.
      HINWEIS: Abhängig von der gekauften Charge der Phosphorylase A variiert die benötigte Masse, liegt aber im Allgemeinen zwischen 5 und 10 mg Pulver.
  2. 60 E Phosphorylase A in die Glykogenlösung geben und in einen Dialysebeutel geben. Dialysieren bei Raumtemperatur gegen 1 L 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8 für 8 h. Wechseln Sie in den frischen Dialysepuffer und setzen Sie die Inkubation über Nacht fort.
  3. Fügen Sie weitere 10 E Phosphorylase A hinzu und wechseln Sie zu einem frischen Dialysepuffer. Nach 8 h wieder in frischen Dialysepuffer wechseln und die Inkubation über Nacht fortsetzen.
  4. Den Inhalt des Dialysebeutels in ein Zentrifugenröhrchen geben und 10 min kochen lassen. Auf Eis kühlen und dann 15 min bei 10.000 x g zentrifugieren.
  5. Der Überstand wird in einen Dialysebeutel überführt und für 8 h gegen drei Wechsel von 2 L destilliertem Wasser dialysiert.
  6. Den Inhalt des Dialysebeutels in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Messen Sie das Volumen und fügen Sie zwei Volumina eiskaltes absolutes Ethanol hinzu, um das Grenzdextrin auszufällen. Lassen Sie die Röhre 30 min auf Eis stehen.
    HINWEIS: Ein weißer Niederschlag sollte sich sofort nach der Zugabe von Ethanol bilden, aber wenn dies nicht der Fall ist, fügen Sie einen Tropfen 3 M NaCl hinzu.
  7. Bei 15.000 x g 15 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Spülen Sie das weiße Pellet von Limit-Dextrin zweimal mit 66% v / v Ethanol ab, wobei Sie ~ 30 ml für jede Spülung verwenden.
  8. Das Grenzdextrin in einen Mörser geben und vollständig an der Luft trocknen lassen. Wenn das Grenzdextrin trocken ist, mit einem Stößel zu einem Pulver mahlen und zur Lagerung in ein geeignetes Gefäß geben; trocken bei 4 °C.
  9. Zur Verwendung als verzweigendes Enzymsubstrat wird eine 1% w/v-Lösung in Wasser hergestellt.
  10. Ein Wasserbad auf 30 °C vorheizen.
  11. Heizblock oder Wasserbad auf 95 °C vorheizen.
  12. Bereiten Sie vier 1,5-ml-Röhrchen vor, die jeweils 100 μL Maleatpuffer, 80 μl Phosphorylase-Grenzdextrin und 10 μl Wasser enthalten. Diese Röhrchen werden verwendet, um den Debranching-Enzym-Assay durchzuführen. Beschriften Sie zwei der Röhrchen Reaktion und die anderen beiden Röhrchen Kontrolle.
  13. In zeitgesteuerten Intervallen werden 10 μL der Entzweigungsenzymprobe in die Reaktionsröhrchen und 10 μL Puffer, der zur Vorbereitung der verzweigten Enzymprobe zu den Kontrollröhrchen verwendet wurde, gegeben. Bei 30 °C inkubieren.
  14. Zu definierten Zeitpunkten (z. B. 5-, 10- und 20-minütige Inkubation) 50 μL aus jedem Reaktions- und Kontrollröhrchen entnehmen und sofort bei 95 °C in den Heizblock oder das Wasserbad geben. 3 min erhitzen.
  15. Bei 15.000 x g für 2 min zentrifugieren, um ausgefälltes Protein zu entfernen.
    HINWEIS: An dieser Stelle kann der Vorgang bei Bedarf angehalten werden. Die erhitzten Proben können gefroren bei -20 °C gelagert werden, bis mit der Messung der freigesetzten Glukose fortgefahren wird (Schritt 17, unten).
  16. Messung der freigesetzten Glukose
    1. 40 μL des Überstands aus den erhitzten Proben in Einweg-Methacrylatküvetten überführen und 833 μL Triethanolaminhydrochlorid/Magnesiumsulfat-Puffer, 67 μL NADP/ATP-Gemisch und 60 μL Wasser hinzufügen. Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, und achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.
      HINWEIS: Um den Aufbau zu erleichtern, kann ein Master-Mix hergestellt werden, der genügend von jedem der oben aufgeführten Reagenzien enthält, um die Anzahl der geplanten Assays zu vervollständigen.
    2. Bereiten Sie eine Blindreaktion vor, indem Sie 100 μL Maleatpuffer, 80 μL Phosphorylase-Grenzdextrin und 20 μL Wasser kombinieren. Gut mischen und 40 μL in eine Einweg-Methacrylat-Küvette geben. Fügen Sie 833 μL Triethanolaminhydrochlorid/Magnesiumsulfat usw. hinzu, wie in Schritt 3.17.1 beschrieben.
    3. Stellen Sie den Nullpunkt auf dem Spektralphotometer mit der Blindreaktion auf 340 nm ein.
    4. Fügen Sie 0,5 μL Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zu jeder Küvette hinzu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie langsam auf und ab pipettieren. Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren und dann die Absorption bei 340 nm aufzeichnen.
      HINWEIS: Die Absorptionswerte sollten niedrig sein, was eine geringe Kontamination der Proben mit Glucose-6-phosphat bedeutet.
    5. Fügen Sie 0,5 μL Hexokinase zu jeder Küvette hinzu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie langsam auf und ab pipettieren. Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren und dann die Absorption bei 340 nm aufzeichnen.
    6. Setzen Sie die Inkubation bei Raumtemperatur für weitere 5 Minuten fort. Zeichnen Sie die Absorption bei 340 nm erneut auf. Wenn die Absorption gegenüber der nach 15 Minuten aufgezeichneten erhöht ist, setzen Sie die Inkubation für weitere 5 Minuten fort und überprüfen Sie erneut die Absorption. Die endgültige Absorption wird bei 340 nm aufgezeichnet.
    7. Subtrahieren Sie für jede Probe die nach Zugabe der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aufgezeichnete Absorption bei 340 nm von der endgültigen Extinktion, die nach Zugabe von Hexokinase erhalten wird. Die erhaltenen Werte werden gegen die Zeitdauer aufgetragen, in der die entsprechende Probe mit dem Entzweigungsenzym inkubiert wurde.

4. Bestimmung der Glykogenverzweigungsenzymaktivität

  1. Bereiten Sie vor dem Versuchstag Jod / KI-Lösung vor, indem Sie zuerst 2,6 g KI in 10 ml Wasser auflösen. In einem Abzug 0,26 g Jod abwiegen und zur KI-Lösung geben.
    ACHTUNG: Jod ist schädlich, wenn es mit der Haut in Berührung kommt oder eingeatmet wird. Das Jod auflösen und lichtgeschützt bei 4 °C lagern. Bereiten Sie auch 125 mM PIPES-Puffer vor, pH 6,8 (siehe Tabelle 3).
  2. Wenn Sie mit Experimenten beginnen, machen Sie einen Arbeitsvorrat an angesäuertem Jodreagenz.
    1. Nehmen Sie 45,7 ml Wasser in ein 50 ml Röhrchen und fügen Sie 150 μL Jod/KI-Lösung gefolgt von 150 μL 1 M HCl hinzu.
    2. Gut mischen und lichtgeschützt bei 4 °C lagern. Die Lösung ist unter diesen Bedingungen mindestens 3 Tage stabil.
  3. Machen Sie am Tag des Experiments eine frische 10 mg / ml Lösung von Amylose.
    1. Wiegen Sie 50 mg Amylose ab und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen.
    2. Fügen Sie 200 μL absolutes Ethanol hinzu und schütteln Sie vorsichtig.
    3. 500 μL 2 M KOH zugeben und vorsichtig schütteln.
      ACHTUNG: KOH verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
    4. Fügen Sie 0,5 ml Wasser hinzu, während Sie leicht schütteln. Wenn sich die Amylose nicht vollständig auflöst, fügen Sie zusätzlich 0,5 ml Wasser hinzu.
    5. Stellen Sie den pH-Wert auf ~6,5 bis 7,0 mit 1 M HCl ein.
      ACHTUNG: HCl kann Augen-, Haut- und Atemwegsreizungen verursachen. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
    6. Fügen Sie Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 5 ml zu erreichen.
    7. Durch Durchgang durch einen 0,2 μm Spritzenendfilter sterilisieren und bei Raumtemperatur lagern. Nicht kühlen oder einfrieren.
  4. Ein Wasserbad auf 30 °C vorheizen.
  5. Bereiten Sie zwölf 1,5-ml-Röhrchen vor, die jeweils 1 ml angesäuertes Jodreagenz enthalten. Auf der Bank beiseite stellen. Diese werden verwendet, um die verzweigte Enzymreaktion zu stoppen.
  6. Bereiten Sie vier 1,5-ml-Röhrchen vor, die jeweils 150 μL Amylose, 150 μL PIPES-Puffer und 45 μL Wasser enthalten. Diese Röhrchen werden verwendet, um den Verzweigungsenzym-Assay durchzuführen. Beschriften Sie zwei der Röhrchen Reaktion und die anderen beiden Röhrchen Kontrolle.
  7. In zeitgesteuerten Intervallen werden 5 μL verzweigte Enzymprobe zu den Reaktionsröhrchen und 5 μL Puffer, der zur Vorbereitung der verzweigten Enzymprobe zu den Kontrollröhrchen verwendet wurde, hinzugefügt. Bei 30 °C inkubieren.
  8. Zu definierten Zeitpunkten (z. B. 5, 10 und 15 Minuten Inkubation) 10 μL aus jedem Reaktions- und Kontrollröhrchen entnehmen und zu den 1,5 ml Röhrchen, die 1 ml angesäuertes Jodreagenz enthalten, hinzufügen. Fügen Sie weitere 140 μL Wasser hinzu und mischen Sie gut. Transfer zu Einwegküvetten.
    HINWEIS: Die Proben sollten blau gefärbt sein und die Lösung sollte frei von Niederschlägen sein. Die gebildete Farbe ist mindestens 2 h bei Raumtemperatur stabil.
  9. Bereiten Sie eine Probe vor, die 1 ml angesäuertes Jodreagenz und 150 μL Wasser enthält. Gut mischen und in eine Küvette geben. Verwenden Sie diese Küvette, um den Nullpunkt auf dem Spektralphotometer auf 660 nm einzustellen.
  10. Lesen Sie die Absorption jeder der zwölf Proben bei 660 nm ab. Bestimmen Sie die Geschwindigkeit der Verzweigungsenzymreaktion, indem Sie die in Gegenwart eines verzweigten Enzyms (Reaktion) erhaltene Absorption von der Absorption subtrahieren, wenn zu jedem Zeitpunkt kein verzweigtes Enzym vorhanden ist (Kontrolle). Weitere Informationen finden Sie unter Repräsentative Ergebnisse.

5. Qualitative Bewertung der Glykogenverzweigung

  1. Bereiten Sie gesättigte Calciumchloridlösung vor, indem Sie 74,5 g wasserfreies Calciumchlorid zu ~ 40 ml Wasser geben und umrühren. Fügen Sie etwas mehr Wasser hinzu und rühren Sie weiter. Machen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 mL und rühren Sie weiter, bis sich das CaCl2 vollständig aufgelöst hat.
  2. Bereiten Sie einen Arbeitsvorrat an Jod/CaCl 2-Farbreagenz vor, indem Sie 50 μl KI/Iod-Stammlösung (siehe Schritt 4.1 oben) mit 13 ml gesättigter CaCl2-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen mischen. Gut mischen und lichtgeschützt bei 4 °C lagern. Die Lösung ist unter diesen Bedingungen mindestens 1 Woche stabil.
  3. Bestimmung der Verzweigung
    1. In einem 1,5-ml-Röhrchen 650 μL Jod/CaCl 2-Farbreagenzien mit 100 μL Wasser kombinieren und gründlich mischen. Die Lösung in eine Einweg-Methacrylatküvette geben.
      HINWEIS: Die Lösung in der Küvette sollte klar und hellgelb sein.
    2. Setzen Sie es in das Spektralphotometer ein und erfassen Sie im Wellenlängenscanning-Modus ein Hintergrundspektrum von 330 nm bis 800 nm.
    3. In einem 1,5-ml-Röhrchen 650 μL Jod / CaCl 2-Farbreagenz mit 50 μg Austernglykogen kombinieren. Das Endvolumen mit Wasser auf 750 μL bringen und gründlich mischen. Die Lösung in eine Einweg-Methacrylatküvette geben.
      HINWEIS: Die Lösung in der Küvette sollte klar und eine tiefe orange / braune Farbe haben.
    4. In das Spektralphotometer geben und ein Absorptionsspektrum von 330 nm bis 800 nm sammeln.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.3 bis 4.4.4 mit 50 μg Amylopektin und 30 μg Amylose.
      HINWEIS: Die Amylopektinprobe sollte gelb/grün und die Amyloseprobe grün/blau sein. Beide Proben sollten klar sein. Die gebildeten farbigen Komplexe sind stabil, ohne Veränderung des Absorptionsspektrums, für mindestens 1 h bei Raumtemperatur.
    6. Um einen Hinweis auf die verzweigte Struktur einer nicht charakterisierten Glykogenprobe zu erhalten, kombinieren Sie 25 μg bis 50 μg Glykogen mit 650 μL Arbeitsjod / CaCl 2-Farbreagenz. Gehen Sie wie oben vor, bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 750 μL, mischen Sie gründlich und übertragen Sie es in eine Methacrylatküvette.
      HINWEIS: Die Glykogenprobe sollte eine gelbe / orange bis orange / braune Farbe ergeben, abhängig vom Grad der Verzweigung (Länge der äußeren Ketten) des vorhandenen Glykogens. Auch hier sollte die Probe klar sein. Weitere Informationen finden Sie unter Repräsentative Ergebnisse .
    7. Sammeln Sie das Absorptionsspektrum.

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Representative Results

Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität
Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse von Glykogensynthase-Assays unter Verwendung gereinigter Enzyme. In Panel A kam es nach einer leichten Verzögerung zu einer linearen Abnahme der Absorption bei 340 nm über einen Zeitraum von etwa 12 min. Die Änderungsrate der Absorption in Abbildung 1A betrug ~0,12 Absorptionseinheiten/min. Eine Änderungsrate der Absorption zwischen ~0,010 und ~0,20 Absorptionseinheiten/min ist optimal und die Menge der hinzugefügten Glykogensynthase sollte an die Ausbeuteraten innerhalb dieses Bereichs angepasst werden. In Panel B wird das Ergebnis der Zugabe von zu viel Glykogensynthase zum Assay gezeigt. Hier war die Reaktion innerhalb der ersten 2 min abgeschlossen. Die Kontrollreaktion, die in diesen Fällen keine Glykogensynthase enthielt, zeigte keine messbare Abnahme der Absorption im Laufe der Zeit. Wie in der Diskussion ausgeführt, ist die Verwendung von Gewebehomogenaten in diesem Assay durchaus möglich, obwohl zusätzliche Kontrollreaktionen erforderlich sind.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet Austernglykogen als Substrat, das gut mit Glykogensynthasen vieler verschiedener Spezies funktioniert. Es sollte jedoch beachtet werden, dass Glykogensynthasen je nach Art des verwendeten Glykogens eine sehr unterschiedliche Aktivität aufweisen können. Daher ist es ratsam, eine Vielzahl von Formen von Glykogen vor Beginn einer detaillierten Studie zu untersuchen.

Das angegebene Protokoll enthält Glucose-6-phoposphat in der Reaktionsmischung, da viele Glykogensynthasen durch diese Verbindung 9,23,24,25,26 allosterisch aktiviert werden. Die Durchführung von Assays in Gegenwart und Abwesenheit von Glucose-6-phosphat (das das Reaktionsvolumen mit Wasser bildet) ermöglicht die Berechnung des -/+ Glucose-6-phosphat-Aktivitätsverhältnisses, was ein nützlicher Hinweis auf den Phosphorylierungszustand von Säugetier- und Pilzglykogensynthasen 1,27 ist.

Die Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität aus der Änderung der Absorption ist ziemlich einfach. Der Extinktionskoeffizient von NADH wird mit 6220 M-1 cm-1 angenommen, was die Berechnung der Änderungsrate der NADH-Konzentration aus der Änderungsrate der Absorptionsrate wie folgt ermöglicht:

Eine Änderungsrate der Absorption von 0,12 Einheiten/min entspricht 0,12/6220 = 1,93 x 10-5 mol/L/min Änderung der NADH-Konzentration. Das Volumen in der Küvette betrug 0,8 ml, was bedeutet, dass die Änderung der Menge an NADH betrug: 1,93 x 10-5 x 0,8 x 10-3 = 3,46 x 10-8 mol / min. Das Volumen des hinzugefügten Enzyms betrug 60 μL, 3,46 x 10-8 x (1000 / 60) = 5,76 x 10-7 mol NADH verbrauchtes / min / ml Enzym.

Da es eine Eins-zu-Eins-Beziehung zwischen dem verbrauchten NADH und der in Glykogen eingebauten Glukose gibt, kann die Reaktionsgeschwindigkeit als 5,76 x 10-7 mol eingebaute Glukose / min / ml ausgedrückt werden.

Wenn der Proteingehalt der Enzymprobe bekannt ist, kann die spezifische Enzymaktivität als μmol glucose incorporated/min/mg protein oder nmol glucose incorporated/min/mg protein ausgedrückt werden.

Wie in der Einleitung erwähnt, kann das Protokoll leicht angepasst werden, um die Aktivität von Glykogensynthasen zu messen, die ADP-Glukose als Glukosespender verwenden. Dies wird durch die einfache Substitution von UDP-Glucose durch ADP-Glucose im Reaktionsgemisch erreicht. Darüber hinaus werden sowohl NDP-Kinase als auch ATP aus dem Reaktionsgemisch weggelassen, da das ADP, das während der Glykogensynthase-Wirkung freigesetzt wird, ein direktes Substrat für die Pyruvatkinase ist.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse aus Assays der Glykogensynthase-Aktivität. Das Spektralphotometer wurde so eingestellt, dass es eine Messung pro Minute für eine Gesamtzeit von 20 Minuten durchführt. Panel A zeigt die erwartete kurze Verzögerungsphase, gefolgt von einer linearen Abnahme der Absorption mit der Zeit (experimentell). Es gab keine Abnahme der Resorption, die in der Kontrollreaktion festgestellt wurde. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird aus der Steigung der Absorptionsänderung in der linearen Phase (von 5 bis 16 min) berechnet. Panel B zeigt das Ergebnis der Zugabe von zu viel Enzym. Hier ist der NADH innerhalb von 2 min erschöpft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität
Abbildung 2 zeigt repräsentative Daten aus einem Glykogenphosphorylase-Assay unter Verwendung eines gereinigten Enzyms. Mit dem hier verwendeten Präparat war der Assay über ca. 3 min linear. Der Einschub zeigt eine Regressionslinie, die von Zeit 0 bis 2,5 min durch die Punkte gezogen wird. Die Steigung dieser Linie zeigt die Absorptionsänderungsrate von 0,022 Absorptionseinheiten/min. Eine Absorptionsrate von etwa 0,01 bis 0,04 ist optimal, da der Assay ziemlich schnell von der Linearität abweicht, wenn zu viel Enzym vorhanden ist. Die Rate der NADPH-Bildung wird aus dem Extinktionskoeffizienten berechnet, der wie der von NADH 6220 M-1 cm-1 beträgt. Für jeweils 1 mol gebildetes NADPH wurde ein Mol Glucose-1-phosphat durch die Wirkung der Glykogenphosphorylase produziert. Die Enzymaktivität kann daher nach einer ähnlichen Berechnung wie oben beschrieben als die Menge an Glucose-1-phosphat ausgedrückt werden, die pro Zeiteinheit aus Glykogen freigesetzt wird.

Die Reaktionsbedingungen sind für jene Phosphorylasen, die empfindlich auf allosterische Modulation reagieren, leicht anpassbar. Die erforderlichen Effektoren werden einfach in den Reaktionsmastermix aufgenommen und ersetzen einen Teil des Wassers. Ein wichtiger Vorbehalt ist, dass gezeigt werden muss, dass der Effektor selbst die Aktivität der Kopplungsenzyme, Phosphoglucomutase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, nicht beeinflusst.

Schließlich, wie bei der oben beschriebenen Glykogensynthase, kann die Art des Glykogens, das als Substrat verwendet wird, die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen. Während Austernglykogen gut mit Phosphorylasen vieler Arten funktioniert, ist es möglicherweise nicht immer die optimale Wahl.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse aus Assays der Glykogenphosphorylase-Aktivität. Das Spektralphotometer wurde so eingestellt, dass es alle 30 s eine Messung für eine Gesamtzeit von 10 Minuten durchführt. Es wurde ein stetiger Anstieg der Absorption in Gegenwart von Glykogenphosphorylase (experimentell) aufgezeichnet, während die Reaktion ohne Zusatz von Phosphorylase zu Studienbeginn blieb (Kontrolle). Der Einschub zeigt eine Verlängerung der anfänglichen Reaktionszeit und zeigt die Linearität der Produktbildung in Bezug auf die Zeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Bestimmung der Glykogen-Entzweigungsenzymaktivität
Die in Abbildung 3 gezeigten Daten sind repräsentativ für einen Glykogen-Entzweigungsenzym-Assay unter Verwendung eines gereinigten Entastungsenzyms. Zu jedem Zeitpunkt wurde die Änderung der Resorption, die in Abwesenheit eines hinzugefügten Verzweigungsenzyms (Control) auftrat, von der Änderung der Absorption subtrahiert, die in Gegenwart eines verzweigten Enzyms (Reaktion) auftrat. Die resultierenden Absorptionswerte wurden dann aufgetragen. Wie oben wird eine Änderungsrate der NADPH-Konzentration aus der anfänglichen Steigung der Kurve durch Regressionsanalyse berechnet. In diesem Beispiel war der Anstieg des NADPH pro Zeiteinheit 10 min linear mit einer Steigung von 0,0079 Absorptionseinheiten/min. Während diese Daten perfekt verwendbar sind, hätte die Zugabe von etwas weniger Enzym eine flachere Steigung ergeben und eine längere lineare Phase ermöglicht. Alternativ könnten zusätzliche Messungen vorgenommen werden, indem Aliquots für die Messung bei 2 min und 7 min Inkubation entfernt werden. Die Bestimmung der Entzweigungsenzymaktivität ist sehr einfach, da 1 mol NADPH für jeweils 1 mol Glukose gebildet wird, die durch die α1,6-Glucosidase-Aktivität des entzweigenden Enzyms freigesetzt wird. Daher kann die Reaktionsgeschwindigkeit als Menge an Glukose ausgedrückt werden, die aus Phosphorylase-Grenzdextrin pro Zeiteinheit freigesetzt wird, nach der gleichen Art von Berechnung, die für die obigen Glykogensynthase- und Phosphorylasen-Assays verwendet wurde.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse aus Assays der Glykogen-Debranching-Enzymaktivität. Proben von Phosphorylase-Limit-Dextrin wurden mit einem Entzweigungsenzym für 5, 10, 20 oder 40 min behandelt. Die Erhöhung der Absorption bei 340 nm, die erzeugt wurde, als NADP in einem gekoppelten Enzymassay zu NADPH reduziert wurde, wurde in Proben gemessen, die zu jedem dieser Zeitpunkte entnommen wurden. Die Reaktion zeigte eine lineare Phase, die mindestens 10 min anhielt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Bestimmung der Glykogenverzweigungsenzymaktivität
Abbildung 4 zeigt Daten aus Glykogenverzweigungsenzym-Assays. Zu jedem der angegebenen Zeitpunkte wurde die Absorption der Kontroll- und Reaktionsproben gemessen. Die Absorption der Reaktionsprobe bei 660 nm wurde von der der entsprechenden Kontrollprobe subtrahiert, und die Absorptionsdifferenz wurde gegen die Zeit aufgetragen. Anschließend wurde eine Regressionslinie durch die Punkte gezogen (Panel A). Die Reaktionsgeschwindigkeit kann einfach als Absorptionsänderung bei 660 nm pro Zeiteinheit ausgedrückt werden. Die maximale Absorptionsänderung, die in diesem Assay auftreten kann, beträgt nur ~0,4 Absorptionseinheiten, was eine maximale Verzweigung der hinzugefügten Amylose durch das verzweigende Enzym darstellt (Panel B). Wenn die Absorption der Reaktionsröhrchen um mehr als ~0,2 Absorptionseinheiten unter die des Kontrollgeräts fällt, liegt der Assay nicht mehr im linearen Bereich und es kann keine Abschätzung der Reaktionsgeschwindigkeit vorgenommen werden (Panel B).

Die Amylose, die bei diesem Verfahren als Substrat verwendet wird, beginnt ziemlich leicht die Lösung zu verlassen, wenn sie gekühlt oder gefroren und dann aufgetaut wird. Daher ist es wichtig, die Amylose-Substratlösung frisch zu machen und sicherzustellen, dass sich vor der Verwendung kein Niederschlag gebildet hat.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse aus Assays der Glykogenverzweigungsenzymaktivität. Proben von Amylose wurden mit verzweigtem Enzym behandelt. Aliquots wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entfernt und einem angesäuerten Jodreagenz zugesetzt. Die Absorption des gebildeten Amylose/Jod-Komplexes wurde dann bei 660 nm gemessen. Die gezeigten Daten repräsentieren den Unterschied in der Absorption zwischen Kontrollinkubationen ohne verzweigtes Enzym und Reaktionen, die verzweigtes Enzym enthielten. Panel A zeigt eine Abnahme der Absorption bei 660 nm aufgrund der Entzweigung der Enzymaktivität, die für ~20 min linear war. Abbildung B veranschaulicht den engen Dynamikbereich des Assays, wobei die maximale Absorptionsänderung, die erzeugt werden kann, ~0,4 Absorptionseinheiten beträgt und die Linearität verloren geht, wenn die Änderung der Absorption ~0,2 Absorptionseinheiten beträgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Qualitative Beurteilung des Ausmaßes der Glykogenverzweigung
Amylose, Amylopektin, Phosphorylase-Limitdextrin, aus Hefe isoliertes Glykogen wurden mit Jod/gesättigter Calciumchloridlösung kombiniert und die Absorptionsspektren der resultierenden Komplexe gesammelt (Abbildung 5). Unter Verwendung der Massen von Glykogen, Amylopektin und Amylose, die in dem oben beschriebenen Protokoll angegeben sind, sollte der maximale Extinktionswert etwa 0,7 bis 0,8 betragen, wie hier gezeigt (Panels A und B). Die Extinktionsmaxima für Amylose und Amylopektin liegen bei etwa 660 nm bzw. 500 nm bzw. 385 nm. Phosphorylase-Grenzdextrin wurde hier eingeschlossen, da die Erfassung des Absorptionsspektrums von Phosphorylase-Grenzdextrin/Jod-Komplexen eine schnelle Überprüfung des Ausmaßes der Phosphorylase-Verdauung ermöglicht, die während der Herstellung dieses entzweigenden Enzymsubstrats erreicht wird. Glykogen aus den meisten Quellen erzeugt zwei Peaks, einen bei etwa 400 nm und einen zweiten Peak bei 460 nm (Abbildung 5B). Linksverschiebungen in den Absorptionsspektren von Glykogen deuten auf eine erhöhte Verzweigung/verminderte äußere Kettenlänge hin. Umgekehrt deuten Rechtsverschiebungen auf eine verminderte Verzweigung/erhöhte äußere Kettenlänge hin.

Die gesättigte Calciumchloridlösung ist dicht und die hinzugefügten Glykogenproben bilden eine Schicht über der Oberseite, wenn sie hinzugefügt werden. Daher ist eine sorgfältige Mischung erforderlich, um eine homogene Lösung zu erhalten. Wenn die verwendeten Kohlenhydratproben vor dem Mischen mit der Calciumchloridlösung nicht vollständig aufgelöst sind, bilden sich in der Küvette dunkel färbende Aggregate. Diese Aggregate behindern offensichtlich die Erfassung eines Absorptionsspektrums, und es ist wichtig sicherzustellen, dass die Lösung in der Küvette klar ist, bevor Sie mit den Messungen fortfahren.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse aus der qualitativen Bewertung der Glykogenverzweigung. Proben von gereinigtem Phosphorylase-Grenzdextrin, Amylopektin, Amylose (Panel A) oder Glykogen (Panel B) wurden mit Jod/gesättigter Calciumchloridlösung kombiniert, und die Absorptionsspektren der resultierenden Komplexe wurden von 330 nm bis 800 nm gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Im Allgemeinen sind die Hauptvorteile aller vorgestellten Methoden ihre niedrigen Kosten, Einfachheit, Geschwindigkeit und fehlende Abhängigkeit von Spezialgeräten. Der größte Nachteil, den sie alle teilen, ist die Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen verfügbaren Methoden. Die Sensitivität der Verfahren, die die Produktion oder den Verbrauch von NADH / NADPH beinhalten, ist leicht abzuschätzen. Da der Extinktionskoeffizient von NADH/NADPH 6,22 M-1 cm-1 beträgt, zeigt einfache Arithmetik, dass ~10-20 μM Konzentrationsänderungen leicht nachgewiesen werden können. Mit den im vorliegenden Artikel beschriebenen Assayvolumina entspricht dies der Fähigkeit, Größen im Bereich von ~10-20 nmol zu messen. Das ist wohl ziemlich sensibel. Es ist jedoch möglich, die spezifische Aktivität von radioaktiv markierten Substraten so einzustellen, dass die Empfindlichkeit über die Grenze der spektrophotometrischen Assays hinaus leicht erhöht werden kann. Obwohl sowohl der Verzweigungsenzymassay als auch die qualitative Bewertung der Glykogenverzweigung auf der Bildung von Komplexen zwischen Jod und α1,4-verknüpften Glucosepolymeren beruhen, ist die Ausgabe jedes Assays unterschiedlich und ihre Empfindlichkeiten sind ebenfalls unterschiedlich. Spezifische Überlegungen für jeden der beschriebenen Assays werden im Folgenden erörtert.

Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität
Der hier beschriebene gekoppelte Enzymassay ermöglicht eine kontinuierliche Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität, was bei der Bestimmung kinetischer Parameter nützlich ist. Es ist auch leicht skalierbar und ein sehr ähnliches Verfahren wurde für die Verwendung in Mikrotiterplatten beschrieben, wodurch hochparallele Messungen der Enzymaktivität durchgeführt werden können28. Wir verwenden diesen Assay routinemäßig mit gereinigten, rekombinanten Glykogensynthasen29. Die beschriebenen Verfahren wurden jedoch ursprünglich für den Einsatz in Gewebehomogenaten entwickelt (siehe z.B. Danforth10 und Leloir et al.9). Ein Vorbehalt hierbei ist, dass das Gewebehomogenat vor der Verwendung angemessen verdünnt werden muss. Die Verdünnung ist notwendig, um die Trübung des Homogenats und die Interferenz durch konkurrierende Enzyme/Substrate im Homogenat zu reduzieren. Um den NADH-Verbrauch zu berücksichtigen, der nicht von der Glykogensynthase-Aktivität abhängig ist, sollten Blindreaktionen, die alle Reaktionskomponenten außer UDP-Glucose enthalten, einbezogen werden. Die Glykogensynthase-Aktivität wird dann bestimmt, indem die Änderungsrate der NADH-Absorption in Abwesenheit von UDP-Glucose von der in Gegenwart dieser Verbindung erhaltenen Rate subtrahiert wird.

Bestimmung der Glykogenphosphorylase-Aktivität
Wie der Glykogensynthase-Assay kann die spektrophotometrische Messung der Phosphorylaseaktivität kontinuierlich durchgeführt werden, während andere Phosphorylasen-Assays gestoppte Assays13 sind. Es ist auch leicht anpassbar für den Einsatz in Mikrotiterplatten oder anderen Hochdurchsatzanwendungen15. Auch hier erfordert die Verwendung mit Gewebehomogenaten eine angemessene Verdünnung, um Trübung / Störreaktionen zu reduzieren. Zum Beispiel ist Glucose-6-phosphat ein ziemlich häufiger Metabolit, und seine Anwesenheit in einem Gewebehomogenat führt zu einer NADPH-Produktion über das Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Kopplungsenzym unabhängig von der Phosphorylase-Aktivität. Bei der Arbeit mit Gewebehomogenaten sollten Kontrollreaktionen, die entsprechend verdünntes Gewebehomogenat enthalten, und alle anderen Assay-Komponenten außer Phosphat und Glykogen einbezogen werden. Die Phosphorylaseaktivität wird dann berechnet, indem die NADPH-Produktion in Abwesenheit von Glykogen / Phosphat von der in Gegenwart dieser Verbindungen auftretenden subtrahiert wird. Spezifische Empfehlungen zum angemessenen Verdünnungsgrad verschiedener Arten von Säugetiergewebeextrakten finden sich in Mezl et al.13.

Bestimmung der Glykogen-Entzweigungsenzymaktivität
Obwohl hier als gestoppter Assay beschrieben, kann dieses Verfahren leicht angepasst und kontinuierlich durchgeführt werden16. Da der Assay auf der Produktion von Glucose beruht, muss seine Verwendung in rohen Gewebeextrakten die Freisetzung von Glucose aus Phosphorylase-Limitdextrin durch andere Enzyme als das Debranching-Enzym und die Erzeugung von Glucose durch die Wirkung solcher Enzyme auf endogenes Glykogen im Gewebeextrakt berücksichtigen. Die Frage des endogenen Glykogens kann leicht mit einer Kontrollreaktion gelöst werden, zu der kein Phosphorylase-Grenzdextrin hinzugefügt wird. Das Vorhandensein anderer α-Glucosidase-Aktivitäten kann in parallelen Reaktionen abgeschätzt werden, bei denen Maltose anstelle von Phosphorylase-Limitdextrin als Substrat vorliegt.

Bestimmung der Glykogenverzweigungsenzymaktivität
Von den verschiedenen diskutierten quantitativen Assays ist der kolorimetrische Verzweigungsenzym-Assay bei weitem der am wenigsten empfindliche. Tatsächlich wurde geschätzt, dass die Empfindlichkeit etwa 50-100 mal geringer ist als bei der radiochemischen Methode, bei der die Stimulation der Glykogenphosphorylase-Reaktion durch Zugabe von verzweigtem Enzym gemessen wird21. Ähnlich wie der Debranching-Enzym-Assay ist der Verzweigungsenzym-Assay auch empfindlich gegenüber dem Vorhandensein kontaminierender Glucosidase-Aktivitäten, da die Verdauung der Amylose die Jodbindung beeinflusst. Es wurden einige Problemumgehungen vorgeschlagen, um die Verwendung von Assays ähnlich dem hier beschriebenen in Gegenwart von kontaminierenden Glucosidase-Aktivitäten30 zu ermöglichen. Unserer Ansicht nach eignet sich dieser Assay jedoch am besten für die Untersuchung von gereinigten oder teilweise gereinigten Glykogenverzweigungsenzymen, bei denen solche störenden Aktivitäten minimal sind oder fehlen.

Qualitative Beurteilung des Ausmaßes der Glykogenverzweigung
Die detaillierte Analyse der Glykogenverzweigung ist ziemlich mühsam und beinhaltet typischerweise eine Kombination aus enzymatischem Aufschluss, chemischer Modifikation und einer Vielzahl von Trenntechniken, um die erzeugten Produkte zu analysieren31. Während der hier beschriebene kolorimetrische Assay eindeutig keine vergleichbaren Informationen über die Feinstruktur von Glykogen liefern kann, liefert er ein einfaches und schnelles Maß für mehr oder weniger Verzweigung. Darüber hinaus enthalten die erhaltenen Spektren einige zusätzliche Informationen. Zum Beispiel, wie unter Repräsentative Ergebnisse diskutiert, sind Proben von Glykogen typischerweise mit Absorptionsspitzen bei ~ 400 nm und ~ 460 nm vorhanden. Der Peak bei ~400 nm stellt offenbar kurze äußere Ketten in Glykogenpartikeln dar, da er in Glykogen verstärkt ist, das aus Hefemutanten ohne verzweigtes Enzym im Vergleich zur Wildtyp-Hefe isoliert wurde32.

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Disclosures

Es sind keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit bekannt, und es gab keine finanzielle Unterstützung für diese Arbeit, die ihr Ergebnis hätte beeinflussen können.

Acknowledgments

Der Autor dankt Karoline Dittmer und Andrew Brittingham für ihre Einblicke und viele hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IÖR 03-17-05 und 03-20-04) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

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References

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Biochemie Ausgabe 174
Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels
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Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

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