Summary
Nous décrivons la transplantation intraparenchymateuse de cellules progénitrices neurales humaines transduites avec un double vecteur rapporteur exprimant la protéine fluorescente vert luciférase (GFP) dans le cerveau de la souris. Après la transplantation, le signal de la luciférase est mesuré à plusieurs reprises à l’aide de la bioluminescence in vivo et de cellules greffées exprimant la GFP identifiées dans des sections du cerveau à l’aide de la microscopie à fluorescence.
Abstract
La thérapie cellulaire est depuis longtemps un paradigme de traitement émergent en neurobiologie expérimentale. Cependant, les études de transplantation cellulaire reposent souvent sur des mesures finales et ne peuvent donc évaluer que les changements longitudinaux de la migration et de la survie cellulaires dans une mesure limitée. Cet article fournit un protocole fiable et peu invasif pour transplanter et suivre longitudinalement les cellules progénitrices neurales (NPC) dans le cerveau de la souris adulte. Avant la transplantation, les cellules sont transduites avec un vecteur lentiviral comprenant un rapporteur bioluminescent (luciole-luciférase) et fluorescent (protéine fluorescente verte [GFP]). Les PNJ sont transplantés dans l’hémisphère cortical droit à l’aide d’injections stéréotaxiques dans le cortex sensorimoteur. Après la transplantation, des cellules greffées ont été détectées à travers le crâne intact pendant cinq semaines (aux jours 0, 3, 14, 21, 35) avec une limite de résolution de 6 000 cellules en utilisant l’imagerie par bioluminescence in vivo . Par la suite, les cellules transplantées sont identifiées dans des sections histologiques du cerveau et caractérisées par immunofluorescence. Ainsi, ce protocole fournit un outil précieux pour transplanter, suivre, quantifier et caractériser les cellules du cerveau de la souris.
Introduction
Le cerveau des mammifères a des capacités de régénération limitées à la suite d’une blessure ou d’une maladie, ce qui nécessite des stratégies innovantes pour favoriser la réparation tissulaire et fonctionnelle. Les stratégies précliniques se concentrent sur différents aspects de la régénération du cerveau, y compris la neuroprotection, la neurogenèse, l’angiogenèse 1,2, la réparation de la barrière hémato-encéphalique 3,4 ou la thérapie cellulaire 5,6. La thérapie cellulaire a l’avantage de pouvoir promouvoir simultanément bon nombre de ces processus pro-réparation. Dans les expériences de transplantation de cellules, la réparation tissulaire s’est produite par (1) le remplacement cellulaire direct et (2) la production de cytokines conduisant à l’angiogenèse et à la neurogenèse7. Les progrès récents de la technologie des cellules souches ont facilité davantage le développement de sources de cellules neurales évolutives et bien caractérisées qui sont maintenant en cours d’essais cliniques (examinés dans 7,8,9). Bien que les thérapies cellulaires aient atteint le stade clinique pour quelques maladies neurologiques (p. ex., la maladie de Parkinson10, l’AVC11 et les lésions de la moelle épinière12), leur efficacité a été variable et des recherches précliniques supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les mécanismes des interactions greffe-hôte.
Une limitation majeure de nombreuses études précliniques est le suivi continu des cellules transplantées à l’intérieur de l’hôte. Souvent, seules des mesures de point final sont effectuées, en omettant les processus dynamiques de migration et de survie chez l’hôte 6,13. Ces limitations entraînent une mauvaise caractérisation des cellules greffées et nécessitent un nombre élevé d’animaux pour comprendre les changements longitudinaux. Pour surmonter ces limites, dans cette étude, nous transduisons des cellules progénitrices neurales induites dérivées de cellules souches pluripotentes (iPSC) avec un vecteur lentiviral double rapporteur disponible dans le commerce composé de luciole rouge luciférase et de protéine fluorescente verte améliorée (rFluc-eGFP). Ces cellules sont transplantées par injection intraparenchymateuse stéréotaxique dans le cerveau de la souris et font l’objet d’un suivi longitudinal à l’aide de l’imagerie par bioluminescence in vivo sur une période de 5 semaines. Après la collecte de tissus cérébraux, les cellules greffées exprimant la GFP sont identifiées et caractérisées dans des sections histologiques du cerveau. Cette méthode peut être adaptée en douceur à d’autres sources cellulaires transductibles et voies de transplantation pour des applications in vivo dans le cerveau des rongeurs. Dans l’ensemble, la procédure est précieuse pour obtenir des informations longitudinales sur la survie et la migration du greffon dans le cerveau de la souris et facilite la caractérisation histologique ultérieure.
Protocol
NOTE: Toutes les expériences impliquant des souris ont été menées conformément aux directives gouvernementales, institutionnelles et ARRIVE et ont été approuvées par l’Office vétérinaire cantonal de Zurich. Des souris SCID gamma (NSG) diabétiques adultes mâles et femelles non obèses (10-14 semaines, 25-35 g) ont été utilisées. Les souris ont été logées dans des cages régulières de type II/III en groupes d’au moins deux animaux par cage dans une pièce à humidité et température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité constant de 12/12 h. .).
1. Culture cellulaire et transduction virale
- Différencier les cellules progénitrices neurales (NPC) des IPC à l’aide d’inhibiteurs de petites molécules comme décrit précédemment14.
- Culture de PNJ15 à partir du passage 2 dans un milieu de maintenance des cellules souches neurales (NSMM; Tableau 1) complété par de petites molécules (tableau 1) dans des plaques de 6 puits (2 mL de milieu par puits) recouvertes de poly-ornithine/laminine521 (pLO/L521). Changez le support tous les jours.
REMARQUE : Pour passer les PNJ, ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire par puits (voir le Tableau des matériaux) et incuber à 37 °C pendant 1 min jusqu’à ce que la plupart des cellules se détachent.- Pour le revêtement, incuber 150 μL de pLO dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 0,1 M par puits pendant 2 h à température ambiante (RT). Après trois lavages avec du PBS, incuber 10 μg de L521 dans 1 mL de PBS par puits pendant 2 h à RT.
- Pour la transduction virale, plaquez 50 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits recouverte de pLO/L521 et ajoutez des vecteurs viraux préemballés (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) à chaque puits.
NOTE: Les unités infectieuses totales (UFI) fournies sont >2 × 106 UFI et sont suffisantes pour infecter 100 000 cellules à une multiplicité d’infection (MOI) de 20. Le comptage des cellules a été effectué à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. L’efficacité de la transduction dépend fortement de la lignée cellulaire utilisée. Le travail avec le lentivirus nécessite la conformité aux directives locales pour les produits de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). - Incuber les cellules à 37 °C pendant 72 h, tout en continuant les changements quotidiens du milieu.
- Confirmez la réussite de la transduction en vérifiant l’expression des GFP dans les cellules dans un microscope à fluorescence. Réglez le grossissement du microscope sur 10x ou 20x et utilisez l’excitation appropriée (460-480 nm) et la plage d’émission (490-520 nm) pour détecter les cellules transduites exprimant GFP.
- Quantifier le rapport entre les cellules transduites par GFP et les cellules totales afin d’estimer l’efficacité générale de la transduction.
REMARQUE : Des taux de transduction de 65 à 95 % ont été atteints grâce à ce protocole. Une efficacité de transduction de >50% est recommandée comme critère go/no-go avant la transplantation. Si une efficacité de transduction de 50% ne peut être atteinte, effectuez une sélection de puromycine ou triez les cellules à l’aide de la cytométrie en flux pour augmenter le rendement des cellules transduites. - Facultatif : Congélation des cellules
- Faites tourner les cellules vers le bas (300 × g, 5 min) et jetez le surnageant. Remettre la pastille dans 1 mL de milieu de congélation (voir la table des matières) et transférer la suspension dans des flacons pour obtenir 106 cellules/flacon. Transférer les cellules dans des boîtes de congélation pendant 24 h à -80 °C, puis à -150 °C pour un stockage à long terme.
2. Préparation cellulaire pour la transplantation
- Prélever un flacon de cellules à -150 °C et le transférer au laboratoire. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
REMARQUE: Le flacon contient 1,5-2 × 106 cellules. - Transférer rapidement le flacon dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il ne reste plus de cristaux de glace (2-3 min).
REMARQUE: Il est important de décongeler rapidement pour minimiser les dommages aux membranes cellulaires. Ne plongez pas complètement le flacon dans le bain-marie car cela peut augmenter le risque de contamination. - Transférer le flacon dans l’armoire de biosécurité et pipeter tout le contenu (~1 mL) dans un tube conique stérile de 15 mL.
REMARQUE: Le travail avec des cellules transduites lentiviralement nécessite BSL-2. Cependant, les cellules de lavage et de passage éliminent les particules virales du milieu. Les informations sur le moment où un transfert de BSL-2 à BSL-1 est autorisé doivent être obtenues auprès des autorités locales. - Ajouter 9 mL de PBS stérile 1x et centrifuger pendant 5 min à 300 × g, RT.
- Retirer le surnageant par aspiration à l’aide d’une pipette (1-10 mL); inclinez doucement la suspension vers l’extrémité de la pipette et commencez à aspirer. Veillez à ne pas déranger la pastille.
- Lavez les cellules en les réutilisant dans 10 mL de PBS stérile 1x.
REMARQUE: Serrez doucement le tube pour remettre en suspension les cellules dans le volume résiduel. Triturez lentement la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de 1 mL jusqu’à ce qu’elle ne contienne pas d’amas ou d’agrégats. - Comptez les cellules avant le spin final à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
- Centrifuger pendant 5 min à 300 × g, RT.
- Retirez le surnageant (étape 2.5) et remettez en suspension la pastille cellulaire dans le volume requis de PBS stérile à une concentration de 8 × 104 cellules/μL. Placez les cellules sur de la glace et utilisez-les pour la transplantation dans les 5 heures suivantes.
REMARQUE : Un volume de 1,6 × 105 cellules/2 μL de PBS a été utilisé dans ce protocole.
3. Procédure de transplantation
- Préparation à la chirurgie
- Nettoyez et stérilisez l’équipement chirurgical.
- Préparez le dispositif stéréotaxique et le système de pompe à micro-injection.
REMARQUE: Il est essentiel de tester la seringue Hamilton et l’aiguille de 30 G et 2 pouces avant de commencer. Insérez l’aiguille dans un tube contenant du NaCl stérile à 0,9% et aspirez lentement la solution à l’intérieur et à l’extérieur. - Installez l’appareil d’anesthésie. Testez la machine avant d’impliquer des animaux. Nettoyez la chambre d’induction avec 70% d’éthanol.
- Préparation des animaux
- Gardez les souris pendant au moins 7 jours avant les expériences dans des conditions standard pour les acclimater.
REMARQUE: Les animaux suivants ont été utilisés pour ce protocole: femelle NOD / SCID / IL2rγnull (30-35 g, également connu sous le nom de NSG) et femelle C57BL / 6J (20-25 g, également connu sous le nom de B6). La procédure peut également être effectuée avec des souris mâles. - Mesurez le poids corporel de la souris et ajustez la dose de l’analgésique à injecter. Administrer du carprofène (5 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale pour réduire la douleur et/ou prévenir une réponse inflammatoire.
- Anesthésier les animaux à l’aide d’isoflurane (3% en phase d’induction et 1,5-2% en phase d’entretien pendant la chirurgie) vaporisé en oxygène.
REMARQUE: L’anesthésie gazeuse est préférée en raison d’un réveil rapide après l’intervention chirurgicale et parce que les niveaux de gaz anesthésique peuvent être facilement ajustés. - Utilisez des réflexes nociceptifs pour vous assurer que l’animal est profondément anesthésié (p. ex., pincements d’orteils). Lorsque l’anesthésie profonde est atteinte, transportez l’animal de la chambre d’induction au cadre stéréotaxique. Maintenez l’anesthésie à l’aide d’un masque facial.
REMARQUE: Le rythme respiratoire doit être surveillé visuellement tout au long de la procédure (40 à 60 respirations par minute). Utilisez un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie pendant la procédure. - Appliquez un lubrifiant ophtalmique pour empêcher les yeux de se dessécher.
- Rasez le cuir chevelu de la souris avec un rasoir électrique et désinfectez la peau avec une solution de bétadine à 5% à l’aide de cotons-tiges.
- Fixez la tête de la souris et insérez les barres d’oreille dans le méat externe.
REMARQUE: Veillez à ne pas endommager les tympans. Appliquez la pommade à la lidocaïne sur les deux conduits auditifs avant d’insérer les barres auriculaires. Pour vérifier si la tête de l’animal est dans une position stable, appuyez soigneusement sur la tête pour voir s’il y a du mouvement. Si un mouvement est noté, la barre d’oreille, le placement du protège-nez ou les deux sont incorrects et doivent être réajustés.
- Gardez les souris pendant au moins 7 jours avant les expériences dans des conditions standard pour les acclimater.
- Craniotomie
- Utilisez une lame chirurgicale pour faire une coupe le long de la ligne médiane assez grande pour révéler les repères lambda et bregma.
REMARQUE: Des rétracteurs cutanés peuvent être appliqués pour garder le crâne exposé. - Rétractez le périoste et le fascia avec un scalpel et utilisez des cotons-tiges stériles pour sécher la surface du crâne.
- Ajustez les barres d’oreille et de bouche pour normaliser la position de la tête.
REMARQUE: Les coordonnées verticales pour bregma et lambda doivent être identiques pour le positionnement antéropostérieur. - Placez l’aiguille au niveau du bregma et calculez les coordonnées des points d’injection souhaités (les coordonnées d’intérêt choisies pour ce protocole : antérieure-postérieure (AP) : + 0,5 mm, médiale-latérale (ML) : + 1,5 mm). Déplacez l’aiguille jusqu’à ce point et marquez-la avec de l’encre.
REMARQUE: Les coordonnées ont été choisies en fonction de l’Atlas du cerveau de souris Franklin et Paxinos 16. Les distances sont mm de la bregma. - Appliquez du NaCl stérile à 0,9% sur le crâne et percez un trou d’un diamètre de 2-3 mm à travers le crâne avec une perceuse dentaire chirurgicale.
- Déplacez l’aiguille à la surface de la dure-mère et calculez les coordonnées de profondeur.
- Utilisez une lame chirurgicale pour faire une coupe le long de la ligne médiane assez grande pour révéler les repères lambda et bregma.
- Procédure de transplantation
- Remettre en suspension les cellules dans le tube (étape 2.9) et aspirer 2 μL de suspension cellulaire dans une seringue (5 μL ou 10 μL).
REMARQUE: Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans la suspension cellulaire. La seringue doit être maintenue en position horizontale jusqu’à ce qu’elle soit montée dans le dispositif stéréotaxique pour éviter la sédimentation cellulaire. - Placez la seringue au-dessus du site cible (coordonnées calculées: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) et déplacez lentement l’aiguille à la surface de la dure-mère.
REMARQUE: Si vous n’êtes pas sûr des coordonnées correctes, effectuez des injections avec un colorant et une évaluation histologique du site d’injection avant de transplanter des cellules (pour plus de détails, voir 17). - Guidez l’aiguille à une vitesse de 0,02 mm/s dans le cerveau jusqu’à la bonne profondeur (la coordonnée choisie pour ce protocole est dorsale-ventrale (DV) - 0,8 mm). Dépassez la profondeur de 0,1 mm et retirez l’aiguille sur la même distance pour créer une poche pour les cellules injectées.
- Appliquez de l’adhésif tissulaire autour de l’aiguille à l’aide d’une pince pour éviter les fuites de cellules.
- Injecter 2 μL de la suspension cellulaire préparée à un taux constant de 3-5 nL/s.
REMARQUE: La procédure d’injection durera entre 7 et 12 minutes. - Après l’injection, laissez l’aiguille en place pendant au moins 5 minutes avant de la retirer lentement. Appliquez de l’adhésif tissulaire pour sceller le trou dans le crâne et attendez encore 2 minutes.
- Remettre en suspension les cellules dans le tube (étape 2.9) et aspirer 2 μL de suspension cellulaire dans une seringue (5 μL ou 10 μL).
- Sutures et post-soins
- Appliquer une solution stérile de NaCl à 0,9% sur le crâne exposé pour éviter la déshydratation.
- Fermez la plaie avec un fil de suture de soie 5/0.
- Hydrater l’animal avec 0,5 mL de solution de lactate de sonnerie injectée par voie sous-cutanée dans le bas du dos.
- Interrompez l’administration de l’anesthésie et retirez soigneusement la souris de l’appareil stéréotaxique et replacez-la dans une cage maintenue sur un coussin chauffant.
- Surveillez les animaux pendant la phase aiguë après la blessure. Vérifiez la suture, le poids de l’animal et la santé globale au moins deux fois par jour.
4. Imagerie in vivo
- Préparation de la luciférine
- Décongeler le sel de potassium D-luciférine à RT et préparer une solution mère fraîche de D-luciférine à 30 mg/mL dans du PBS.
- Stériliser la solution mère à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm.
REMARQUE: L’utilisation immédiate de la solution de travail est recommandée. Si nécessaire, la luciférine dissoute peut être conservée à -20 °C. Cependant, un stockage prolongé peut entraîner la dégradation du signal. La luciférine est un réactif sensible à la lumière; gardez-le hors de la lumière directe autant que possible. D’autres substrats peuvent également être envisagés, par exemple le cycluc, pour améliorer la limite de résolution18.
- Imagerie
- Configuration initiale
REMARQUE: L’imagerie par bioluminescence a été réalisée à l’aide d’un système d’imagerie in vivo (voir le tableau des matériaux) composé d’une chambre sombre et d’une caméra CCD (Cooled Charge-Coupled Device).- Double-cliquez sur l’icône du logiciel Living Image et sélectionnez un ID utilisateur dans la liste déroulante.
- Cliquez sur Initialiser dans le panneau de configuration qui s’affiche. Une fois le processus d’initialisation terminé, la boîte de température dans le panneau de commande devient verte.
- Dans le panneau de commande, cochez les cases Luminescent et Photographie et sélectionnez Exposition automatique (~60 s). Sélectionnez un champ de vision (D/12,5 cm a été choisi pour ce protocole). Entrez la hauteur du sujet (1,5 cm) et sélectionnez l’option Utiliser la mise au point de la hauteur du sujet . Réglez manuellement les paramètres suivants : grand binning, f/2, filtre d’excitation bloqué et filtre d’émission ouvert.
- Déterminer la quantité injectée de D-luciférine à 300 mg/kg de poids corporel. REMARQUE: La dose standard recommandée est de 150 mg / kg de D-luciférine. Cette procédure a été ajustée selon un protocole signalant une sensibilité plus élevée en utilisant 300 mg / kg18.
- Injecter la luciférine par voie intrapéritonéale (i.p.).
REMARQUE: Si l’animal doit être sous sédation avant l’injection, sachez que cela peut prolonger le temps d’expression de la luciférase maximale. - Attendez 5 min, puis anesthésiez les animaux avec un apport continu d’isoflurane (4,5% en phase d’induction et 1,5-2% en phase d’entretien pendant la procédure d’imagerie).
- Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux, puis rasez les animaux sous sédation sur la région de la tête à l’aide d’un rasoir à cheveux conventionnel. Placez les animaux dans la chambre d’imagerie et commencez l’imagerie 15 minutes après l’injection de luciférine en cliquant sur Acquérir dans le panneau de commande .
- Configuration initiale
5. Perfusion
- Anesthésier les animaux par injection i.p. de pentobarbital de sodium (150 mg/kg de poids corporel). Attendez que la souris ne réponde plus aux stimuli douloureux, tels que les pincements d’orteils.
- Posez la souris sur le dos et utilisez une pince à épiler et des ciseaux pour ouvrir la cavité thoracique.
- Utilisez des ciseaux standard pour ouvrir le diaphragme.
- Exposez le cœur et insérez une aiguille (du tube avec une sonnerie / solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4%) dans l’apex du ventricule gauche.
REMARQUE: Veillez à garder le bout de l’aiguille dans la lumière du ventricule. - Coupez le ventricule droit à l’aide de ciseaux.
- Perfuser avec une solution de sonnerie (peut être maintenue à RT) pendant 3-4 min (débit: 17 mL / min). Continuez jusqu’à ce que le cœur soit propre.
- Changez le robinet d’arrêt pour permettre l’écoulement du PFA (conserver à 4 °C; garder sur la glace pendant la procédure) et perfuser pendant encore 5 min (~ 100 mL).
- Arrêtez la pompe et retirez l’aiguille du ventricule gauche.
REMARQUE: La perfusion avec PFA préserve uniformément l’intégrité des tissus. Il facilite également la préservation du signal GFP dans les greffes qui, autrement, pourrait être perdu en raison de la diffusion.
6. Traitement
- Prélèvement de tissus
- Retirez la tête à l’aide de ciseaux standard et faites une incision médiane dans la peau.
- Retournez la peau sur les yeux pour exposer le crâne.
- Commencez par la partie caudale au point de l’os pariétal et faites une petite incision à l’aide de ciseaux à ressort. Avancez les ciseaux rostralement le long de la suture mi-sainte jusqu’à un point entre les yeux. Recommencez à partir de la partie caudale et faites deux coupes parallèles et espacées d’environ 4 mm dans le plan sagittal.
REMARQUE: Veillez à ne pas endommager le cerveau en appuyant sur les ciseaux contre la surface interne du crâne. - Utilisez une pince pour incliner soigneusement un côté de l’os pariétal et le casser. Faites de même avec l’autre côté.
REMARQUE: Utilisez un microspatule pour libérer l’os des méninges; sinon, ils peuvent endommager le cerveau tout en cassant le crâne. S’il reste des parties de l’os frontal, faites une petite coupure pour incliner et casser la plaque osseuse. - Pour libérer le cerveau, faites glisser soigneusement le microspatule sous le cerveau (bulbes olfactifs) et inclinez-le doucement vers le haut.
- Après la collecte, conserver le cerveau dans une solution de PFA à 4% pendant 4-6 h à 4 °C. Transférez-le ensuite sur 1x PBS stérile.
- Immunohistochimie
- Transférer le cerveau dans une solution de saccharose à 30% pendant au moins 48 h à 4 °C pour éviter la formation de cristaux pendant la congélation.
- Utilisez un microtome coulissant pour couper des sections coronales d’une épaisseur de 40 μm. Recueillir et stocker les sections sous forme de sections flottantes (dans une plaque de 24 puits) dans une solution cryoprotectrice (tableau 1) à -20 °C jusqu’à un traitement ultérieur.
- Rincez les sections avec 450 μL de 1x PBS pour chaque puits (3 fois, 5 min chacune, RT).
- Bloquer les sites non spécifiques avec 450 μL de solution bloquante pour chaque puits (tableau 1) pendant 1 h à TA.
- Incuber chaque puits avec 450 μL d’anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit. Diluer les anticorps à 1:200 dans du sérum d’âne à 3%; 0,1% Triton-X-100 dans PBS. Pour identifier le matériel donneur dans l’environnement hôte, utilisez un anticorps dirigé contre des noyaux spécifiques à l’homme (anticorps anti-noyaux humains, clone 235-1).
- Lavez les sections avec 450 μL de 1x PBS pour chaque puits (3 fois, 5 min chacune, RT).
- Incuber chaque puits avec 450 μL d’anticorps secondaires fluorescents correspondants pendant 2-3 h (RT). Diluer les anticorps dans 3% de sérum d’âne; 0,1% Triton-X-100 en 1x PBS.
- Lavez les sections avec 450 μL de 1x PBS pour chaque puits (3 fois, 5 min chacune, RT).
- Colorez les noyaux avec 450 μL de 0,1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
Representative Results
Nous visons à suivre longitudinalement les cellules progénitrices neurales transplantées dans le cerveau de la souris à l’aide de l’imagerie par bioluminescence in vivo et à identifier les cellules transplantées dans une analyse histologique ultérieure (Figure 1A). Par conséquent, les cellules progénitrices neurales sont transduites avec un vecteur lentiviral constitué de EF1α-rFluc-eGFP. Avant la transplantation, les cellules ont été testées pour une transduction réussie par expression d’eGFP in vitro (Figure 1B). Les cellules transduites avec succès ont été transplantées stéréotapciquement dans le cerveau de la souris aux coordonnées souhaitées (par exemple, dans le cortex sensorimoteur). Après la transplantation, les souris ont été injectées systématiquement avec de la D-luciférine, le substrat de rFluc, et les intensités de signal des cellules transplantées ont été mesurées pour confirmer le succès de la transplantation (Figure 1C).
Pour évaluer la limite de détection de l’imagerie par bioluminescence in vivo, une plage de 6 000 à 180 000 cellules a été transplantée dans le cortex sensorimoteur droit de la souris (Figure 2A). Nous avons détecté < 6 000 cellules et un signal de bioluminescence proportionnel au nombre de cellules transplantées directement après la transplantation (Figure 2B). Comme les sources de cellules humaines sont immunogènes pour les souris immunocompétentes, des souris immunodéficientes NOD scid gamma (NSG) ont été utilisées pour observer la survie à long terme des greffes cellulaires. La survie à long terme et la détection d’un signal de bioluminescence jusqu’à 5 semaines ont été confirmées après une greffe de cellules (Figure 2C,D). Les cellules transplantées ont été détectées avec succès ex vivo lors d’une analyse histologique ultérieure grâce au rapporteur eGFP et à l’immunocoloration avec des noyaux anti-humains et des anticorps mitochondriaux anti-humains (Figure 2E).
Figure 1 : Transplantation de cellules progénitrices neurales. (A) Aperçu schématique de la génération et de la transplantation de PNJ rFluc-eGFP. (B) Image représentative d’immunofluorescence de PNJ transduqués (rapporteur GFP, vert) contre-coloré avec DAPI (bleu); barres d’échelle = 5 μm. (C) Détection in vivo du signal de bioluminescence dans les cellules transplantées; barre de couleur = bleu (0, min, pas de signal), rouge (4 flux, p/s × 105, signal max) Abréviations: PNJ = cellules progénitrices neurales; GFP = protéine fluorescente verte; rFluc-eGFP = luciole rouge luciférase et protéine fluorescente verte améliorée; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; p/s = photons/s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évolution dans le temps des cellules transplantées. (A) Vue schématique du nombre de cellules pour la transplantation. B) Limite de détection des cellules transplantées 1 h après la transplantation. (C, D) Durée de la transplantation (180 000 cellules) jusqu’à 35 jours chez les souris NSG ; barre de couleur = bleu (0, min, pas de signal), rouge (4 flux, p/s × 105, signal max) Les données sont moyennes ± SEM (n = 3). (E) Images de fluorescence représentatives de coupes histologiques et de cellules transplantées 5 semaines après la transplantation. Barre d’échelle = 10 μm. Abréviations: D = jour après la transplantation; NSG = immunodéficient NOD scid gamma; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; GFP = protéine fluorescente verte; HuNu = Anticorps anti-noyaux humains, clone 235-1; p/s = photons/s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
La régénération du cerveau blessé pour permettre la récupération fonctionnelle reste un défi non relevé. De nombreuses approches précliniques innovantes ont évolué en ciblant, par exemple, la modulation immunitaire19,20, l’angiogenèse 1,21,22,23, l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique 2,3,24,25 et le remplacement cellulaire 5,26 . Surtout ces dernières années, les thérapies cellulaires sont apparues comme une stratégie de traitement prometteuse pour le cerveau en raison des progrès majeurs de la technologie des cellules souches et des protocoles de différenciation efficaces15,28. Cet article fournit un protocole précieux pour la transplantation et le suivi des cellules neurales dans le cerveau de la souris. La méthode est applicable à toutes les lignées cellulaires transductibles pour des applications in vivo dans le cerveau de la souris.
La configuration présentée utilise des greffes d’origine humaine chez une souris. Ces greffes ne sont pas viables à long terme chez les souris de type sauvage immunocompétentes en raison de l’immunogénicité. Par conséquent, des souris NSG immunodéficientes ont été utilisées pour surmonter cette limitation. Alternativement, l’utilisation de greffes de souris peut être préférée pour surmonter les aspects immunogènes. Si la transplantation de cellules humaines est nécessaire, les modèles murins humanisés représentent une alternative émergente pour réduire la probabilité de rejet du greffon29.
Un vecteur viral commercial à double rapporteur composé de luciole luciférase et d’eGFP sous le promoteur EF1α a été utilisé pour visualiser les greffes. Ce promoteur a été sélectionné pour atteindre une intensité de signal élevéede 15. Cependant, en dehors des PNJ, il a été démontré que d’autres types de cellules favorisent la fonction cérébrale après une blessure, notamment les péricytes30 et les astrocytes31; par conséquent, selon la lignée cellulaire utilisée, d’autres promoteurs pourraient être plus appropriés pour atteindre des niveaux d’expression élevés. En outre, l’utilisation de promoteurs de transgènes, tels que le CMV, peut entraîner une régulation négative, en particulier dans les expériences à long terme32. L’efficacité de transduction du vecteur lentiviral dépend fortement de la lignée cellulaire utilisée et peut varier d’une expérience à l’autre. Par conséquent, l’efficacité de la transduction doit être évaluée avant de commencer les expériences in vivo et pour corriger les variations de l’efficacité de la transduction entre les expériences. La région cérébrale de la transplantation influence également la force du signal. Bien qu’une limite de détection de < 6 000 cellules ait été atteinte pour les transplantations corticales, il peut falloir plus de cellules pour détecter un signal dans des régions cérébrales plus profondes, par exemple le striatum ou l’hippocampe.
Les volumes de transplantation dans le cerveau de la souris sont limités à 1-2 μL. Par conséquent, il est important d’identifier un numéro de cellule approprié pour les expériences. Il a déjà été observé que l’augmentation du nombre de cellules entraîne une diminution du taux de survie, probablement en raison de la disponibilité limitée des nutriments et de l’oxygène dans la région de la transplantation33. L’imagerie par bioluminescence in vivo offre une résolution spatiale relativement faible par rapport à d’autres méthodes d’imagerie in vivo telles que l’IRM ou la tomodensitométrie. Par conséquent, les chemins migratoires courts des cellules greffées ne peuvent être évalués de manière fiable que dans l’analyse post-hoc ultérieure.
La force absolue du signal de la bioluminescence est généralement proportionnelle au nombre de cellules transplantées. Cependant, la force du signal peut être réduite si les greffons sont transplantés dans des structures cérébrales plus profondes ou si la force du signal est en dehors du spectre de détection linéaire du système d’imagerie in vivo . Actuellement, de nouveaux substrats sont développés pour assurer une pénétration plus efficace à travers la barrière hémato-encéphalique que la D-luciférine, y compris le cycluc1. Ces substrats pourraient encore améliorer la limite de détection des cellules greffées à l’avenir18. Dans l’ensemble, ce protocole permet une procédure simple et peu invasive pour transplanter et observer les greffons dans le cerveau de la souris.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts potentiel à déclarer.
Acknowledgments
Les auteurs RR et CT reconnaissent le soutien de la Fondation Mäxi et du Centre de compétences 3R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral Transduction | |||
| pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
| Consumables | |||
| Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
| Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
| Microscope cover slips | Product of choice | ||
| Microscope slides | Product of choice | ||
| Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
| Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
| Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
| Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
| Equipment | |||
| Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Heating pad | Product of choice | ||
| High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
| In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
| Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
| Microtome | Leica | HM430 | |
| NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
| Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
| Pharmaceuticals and Reagents | |||
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
| Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
| B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
| Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
| CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
| Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
| DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
| Donkey serum | Product of choice | ||
| Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ethanol; 70% | Product of choice | ||
| FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
| hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
| Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
| Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
| N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
| Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
| Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
| Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
| SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
| Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |
References
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