Summary
Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.
Abstract
A terapia celular tem sido um paradigma de tratamento emergente na neurobiologia experimental. No entanto, os estudos de transplante celular muitas vezes dependem de medidas de ponto final e, portanto, só podem avaliar mudanças longitudinais de migração celular e sobrevivência em uma extensão limitada. Este artigo fornece um protocolo confiável e minimamente invasivo para transplantar e rastrear longitudinalmente células progenitoras neurais (NPCs) no cérebro de camundongos adultos. Antes do transplante, as células são transduzidas com um vetor lentiviral composto por um repórter bioluminescente (vagalumly-luciferase) e fluorescente (proteína fluorescente verde [GFP]). Os NPCs são transplantados no hemisfério cortical direito usando injeções estereoxilicas no córtex sensorial. Após o transplante, as células enxertadas foram detectadas através do crânio intacto por até cinco semanas (nos dias 0, 3, 14, 21, 35) com um limite de resolução de 6.000 células usando imagens de bioluminescência viva . Posteriormente, as células transplantadas são identificadas em seções cerebrais histológicas e ainda caracterizadas com imunofluorescência. Assim, este protocolo fornece uma ferramenta valiosa para transplantar, rastrear, quantificar e caracterizar células no cérebro do camundongo.
Introduction
O cérebro mamífero tem capacidades regenerativas limitadas após lesões ou doenças, exigindo estratégias inovadoras para promover o tecido e a reparação funcional. As estratégias pré-clínicas se concentram em diferentes aspectos da regeneração cerebral, incluindo neuroproteção, neurogênese, angiogênese 1,2, reparação da barreira hemencefálica 3,4 ou terapia celular 5,6. A terapia celular tem a vantagem de poder promover muitos desses processos pró-reparação simultaneamente. Em experimentos com transplante de células, a reparação tecidual ocorreu através de (1) substituição celular direta e (2) produção de citocinas que levam à angiogênese e neurogênese7. Os recentes avanços na tecnologia de células-tronco facilitaram ainda mais o desenvolvimento de fontes de células neurais escaláveis e bem caracterizadas que agora estão no pipeline para ensaios clínicos (revisados em 7,8,9). Embora as terapias celulares tenham atingido o estágio clínico de algumas doenças neurológicas (por exemplo, doença de Parkinson10, derrame11 e lesão medular12), sua eficácia tem sido variável, e mais pesquisas pré-clínicas são necessárias para entender os mecanismos das interações enxerto-hospedeiro.
Uma das principais limitações de muitos estudos pré-clínicos é o rastreamento contínuo das células transplantadas dentro do hospedeiro. Muitas vezes são realizadas apenas medições de ponto final, omitindo os processos dinâmicos migratórios e de sobrevivência no hospedeiro 6,13. Essas limitações resultam na má caracterização das células enxertadas e requerem altos números de animais para compreender mudanças longitudinais. Para superar essas limitações, neste estudo, transduzimos células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) com um vetor lentiviral de dois repórteres comercialmente disponível, composto por luciferase de vagalume vermelha e proteína fluorescente verde aprimorada (rFluc-eGFP). Essas células são transplantadas através de injeção intraparenquimal estereotaxa no cérebro do camundongo e são rastreadas longitudinalmente usando imagens de bioluminescência in vivo ao longo de 5 semanas. Após a coleta de tecido cerebral, as células enxertadas que expressam GFP são identificadas e ainda caracterizadas em seções cerebrais histológicas. Este método pode ser adaptado suavemente a fontes celulares transdutíveis alternativas e rotas de transplante para aplicações in vivo no cérebro de roedores. No geral, o procedimento é valioso para obter informações longitudinais de sobrevivência e migração do enxerto no cérebro do camundongo e facilita a caracterização histológica subsequente.
Protocol
NOTA: Todos os experimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes governamentais, institucionais e de ARRIVE e foram aprovados pelo Escritório Veterinário Cantonal de Zurique. Foram utilizados camundongos adultos machos e femininos não obesos de SCID gama (NSG) (10-14 semanas, 25-35 g) foram utilizados. Os camundongos foram alojados em gaiolas regulares tipo II/III em grupos de pelo menos dois animais por gaiola em uma sala controlada por umidade e temperatura com um ciclo constante de 12/12 horas de luz/escuridão. .).
1. Cultura celular e transdução viral
- Diferencie as células progenitoras neurais (NPCs) dos iPSCs usando inibidores de pequenas moléculas como descrito anteriormente14.
- Cultura NPCs15 a partir da passagem 2 em diante no Meio de Manutenção de Células-Tronco Neurais (NSMM; Tabela 1) complementado com moléculas pequenas (Tabela 1) em placas de 6 poços (2 mL de médio por poço) revestidos com poli-ornithine/laminin521 (pLO/L521). Mude o meio diariamente.
NOTA: Para passar NPCs, adicione 1 mL de reagente de dissociação celular por poço (veja a Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C por 1 min até que a maioria das células se desprendem.- Para revestimento, incubar 150 μL de pLO em 1 mL de salina tamponada com fosfato (PBS) por poço por 2h em temperatura ambiente (RT). Depois de três lavagens com PBS, incubar 10 μg de L521 em 1 mL de PBS por poço por 2 h na RT.
- Para transdução viral, placa de 50.000 células por poço em uma placa de 24 poços revestida com pLO/L521 e adicionar vetores virais pré-embalados (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) a cada poço.
NOTA: As unidades infecciosas totais (IFU) fornecidas são >2 × 106 IFU e são suficientes para infectar 100.000 células em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20. A contagem de células foi realizada com um contador automático de células. A eficiência da transdução depende fortemente da linha celular usada. O trabalho com lentivírus requer o cumprimento das diretrizes locais para produtos de nível 2 de biossegurança 2 (BSL-2). - Incubar as células a 37 °C por 72 h, enquanto continua as alterações diárias do meio.
- Confirme a transdução bem sucedida verificando as células para expressão GFP em um microscópio de fluorescência. Defina a ampliação do microscópio em 10x ou 20x e use a excitação apropriada (460-480 nm) e a faixa de emissão (490-520 nm) para detectar células transduzidas de GFP.
- Quantifique a razão de células transduzidas por GFP para células totais para estimar a eficácia geral da transdução.
NOTA: As taxas de transdução de 65-95% foram alcançadas com este protocolo. Recomenda-se uma eficácia de transdução de >50% como critério de go/no-go antes do transplante. Se 50% de eficácia de transdução não puder ser alcançada, realize a seleção de puramicina ou classifique as células usando citometria de fluxo para aumentar o rendimento de células transduzidas. - Opcional: Congelamento de células
- Gire as células para baixo (300 × g, 5 min) e descarte o supernascedor. Resuspense a pelota em 1 mL de meio de congelamento (ver a Tabela de Materiais) e transfira a suspensão em frascos para obter 106 células/frasco. Transfira as células para caixas de congelamento por 24 h a -80 °C e depois para -150 °C para armazenamento a longo prazo.
2. Preparação celular para transplante
- Colete um frasco de células a partir de -150 °C de armazenamento e transfira-o para o laboratório. Conte as células usando um contador automático de células.
NOTA: O frasco contém 1,5-2 × 106 células. - Transfira rapidamente o frasco para um banho de água de 37 °C até que não permaneçam cristais de gelo (2-3 min).
NOTA: É importante descongelar rapidamente para minimizar qualquer dano às membranas celulares. Não mergulhe completamente o frasco no banho de água, pois pode aumentar o risco de contaminação. - Transfira o frasco para o armário de biossegurança e pipeta todo o conteúdo (~1 mL) para um tubo cônico estéril de 15 mL.
NOTA: O trabalho com células lentivirally transduzidas requer BSL-2. No entanto, as células de lavagem e passagem removem partículas virais do meio. Informações sobre quando uma transferência de BSL-2 para BSL-1 é permitida devem ser obtidas das autoridades locais. - Adicione 9 mL de PBS estéril de 1x e centrífuga por 5 min a 300 × g, RT.
- Remova o supernatante por aspiração usando uma pipeta (1-10 mL); incline suavemente a suspensão em direção à ponta pipeta e comece a aspirar. Tenha cuidado para não perturbar a pelota.
- Lave as células reutilizando em 10 mL de PBS 1x estéril.
NOTA: Tabe suavemente o tubo para resuspend células no volume residual. Triturar lentamente a suspensão celular usando uma pipeta de 1 mL até que não contenha aglomerados ou agregados. - Conte as células antes do giro final usando um contador automático de células.
- Centrifugar por 5 min a 300 × g, RT.
- Remova o supernasce (passo 2.5) e resuspenque a pelota celular no volume necessário de PBS estéril a uma concentração de 8 × 104 células/μL. Coloque as células no gelo e use-as para transplante nas próximas 5h.
NOTA: Foi utilizado neste protocolo um volume de 1,6 × 105 células/2 μL de PBS.
3. Procedimento de transplante
- Preparação para cirurgia
- Limpe e esterilize o equipamento cirúrgico.
- Prepare o dispositivo estereotaxista e o sistema de bomba de microinjeção.
NOTA: É fundamental testar a seringa Hamilton e a agulha de 30 G, 2 polegadas antes de começar. Insira a agulha em um tubo contendo NaCl 0,9% e puxe lentamente a solução para dentro e para fora. - Configure a máquina de anestesia. Teste a máquina antes de envolver qualquer animal. Limpe a câmara de indução com 70% de etanol.
- Preparação de animais
- Mantenha os ratos por pelo menos 7 dias antes dos experimentos em condições padrão para aclimatar.
NOTA: Os seguintes animais foram utilizados para este protocolo: NOD/SCID/IL2rγnull feminino (30-35 g, também conhecido como NSG) e fêmea C57BL/6J (20-25 g, também conhecida como B6). O procedimento também pode ser realizado com camundongos machos. - Meça o peso corporal do rato e ajuste a dose do analgésico a ser injetado. Administrar carprofeno (5 mg/kg de peso corporal) intraperitoneally para reduzir a dor e/ou prevenir uma resposta inflamatória.
- Anestesiar os animais que utilizam isoflurane (3% na fase de indução e 1,5-2% na fase de manutenção durante a cirurgia) vaporizadas em oxigênio.
NOTA: A anestesia gasosa é preferida devido a um rápido despertar após o procedimento cirúrgico e porque os níveis de gás anestésico podem ser facilmente ajustados. - Use reflexos nociceptivos para garantir que o animal esteja profundamente anestesiado (por exemplo, pinças do dedo do dedo). Quando a anestesia profunda é alcançada, transporte o animal da câmara de indução para o quadro estereotaxico. Mantenha a anestesia usando uma máscara facial.
NOTA: A taxa de respiração precisa ser monitorada visualmente durante todo o procedimento (40-60 respirações por minuto). Use uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia durante o procedimento. - Aplique lubrificante oftálmico para evitar que os olhos sequem.
- Raspe o couro cabeludo do rato com uma navalha elétrica e desinfete a pele com 5% de solução betadina usando cotonetes de algodão.
- Fixar a cabeça do mouse e inserir as barras de ouvido no meatus externo.
NOTA: Tenha cuidado para não danificar os tímpanos. Aplique pomada lidocaína em ambos os canais auditivos antes de inserir as barras de ouvido. Para verificar se a cabeça do animal está em uma posição estável, empurre cuidadosamente a cabeça para ver se há movimento. Se for observado movimento, ou a barra de ouvido, a colocação do nariz ou ambos estão incorretos e precisam ser reajustados.
- Mantenha os ratos por pelo menos 7 dias antes dos experimentos em condições padrão para aclimatar.
- Craniotomia
- Use uma lâmina cirúrgica para fazer um corte ao longo da linha média grande o suficiente para revelar os marcos lambda e bregma.
NOTA: Os retres de pele podem ser aplicados para manter o crânio exposto. - Retraia o periosteum e a fáscia com um bisturi e use cotonetes estéreis para secar a superfície do crânio.
- Ajuste as barras da orelha e da boca para padronizar a posição da cabeça.
NOTA: As coordenadas verticais para bregma e lambda precisam ser idênticas para posicionamento anteroposterior. - Coloque a agulha no bregma e calcule as coordenadas dos pontos de injeção desejados (as coordenadas de interesse escolhidas para este protocolo: anterior-posterior (AP): + 0,5 mm, medial-lateral (ML): + 1,5 mm). Mova a agulha para aquele ponto e marque-a com tinta.
NOTA: As coordenadas foram escolhidas com base no Franklin e Paxinos Mouse Brain Atlas 16. As distâncias são mm do bregma. - Aplique 0,9% de NaCl estéril no crânio e faça um furo com diâmetro de 2-3 mm através do crânio com uma broca cirúrgica e dentária.
- Mova a agulha para a superfície da dura e calcule as coordenadas de profundidade.
- Use uma lâmina cirúrgica para fazer um corte ao longo da linha média grande o suficiente para revelar os marcos lambda e bregma.
- Procedimento de transplante
- Resuspenque as células do tubo (etapa 2.9) e desenhe 2 μL de suspensão celular em uma seringa (5 μL ou 10 μL).
NOTA: Certifique-se de que não há bolhas de ar presentes na suspensão da célula. A seringa precisa ser mantida em posição horizontal até ser montada no dispositivo estereotático para evitar a sedimentação celular. - Coloque a seringa acima do local alvo (coordenadas calculadas: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) e mova lentamente a agulha para a superfície da dura.
NOTA: Se não tiver certeza sobre as coordenadas corretas, realize injeções com um corante e avaliação histológica do local da injeção antes de transplantar células (para mais detalhes, consulte 17). - Guie a agulha a uma taxa de 0,02 mm/s no cérebro até a profundidade adequada (a coordenada escolhida para este protocolo é dorsal-ventral (DV) - 0,8 mm). Sobrevoe a profundidade em 0,1 mm e retire a agulha sobre a mesma distância para criar um bolso para as células injetadas.
- Aplique adesivo de tecido ao redor da agulha usando fórceps para evitar o vazamento de células.
- Injete 2 μL da suspensão celular preparada a uma taxa constante de 3-5 nL/s.
NOTA: O procedimento de injeção durará entre 7 e 12 min. - Após a injeção, deixe a agulha no lugar por pelo menos 5 minutos antes de retirá-la lentamente. Aplique adesivo de tecido para selar o orifício no crânio e esperar por mais 2 minutos.
- Resuspenque as células do tubo (etapa 2.9) e desenhe 2 μL de suspensão celular em uma seringa (5 μL ou 10 μL).
- Suturas e pós-cuidados
- Aplique solução estéril de 0,9% na LCa ao crânio exposto para evitar a desidratação.
- Feche a ferida com um fio de sutura de seda 5/0.
- Hidrate o animal com 0,5 mL de solução de lactato de ringer subcutâneamente injetada na parte inferior das costas.
- Interrompa a entrega da anestesia e remova cuidadosamente o mouse do aparelho estereotaxista e coloque-o de volta em uma gaiola mantida em uma almofada de aquecimento.
- Monitore os animais durante a fase aguda pós-lesão. Verifique a sutura, o peso animal e a saúde geral pelo menos duas vezes ao dia.
4. Imagem in vivo
- Preparação da luciferina
- Descongele o sal de potássio D-luciferina na RT e prepare uma solução fresca de estoque de D-luciferin a 30 mg/mL em PBS.
- Esterilize a solução de estoque através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
NOTA: Recomenda-se o uso imediato da solução de trabalho. Se necessário, a luciferina dissolvida pode ser armazenada a -20 °C. No entanto, o armazenamento prolongado pode resultar na degradação do sinal. A luciferina é um reagente sensível à luz; mantê-lo fora da luz direta sempre que possível. Substratos alternativos também podem ser considerados, por exemplo, cycluc, para melhorar o limite de resolução18.
- Imagiologia
- Configuração inicial
NOTA: A imagem de bioluminescência foi realizada utilizando-se um sistema de imagem in vivo (ver a Tabela de Materiais) composto por uma câmara escura e uma câmera ccd (dispositivo acoplado por carga" resfriada.- Clique duas vezes no ícone do software Living Image e selecione um ID do usuário na lista de retirada.
- Clique em Inicializar no painel de controle que aparece. Uma vez concluído o processo de inicialização, a caixa de temperatura no painel de controle ficará verde.
- No painel de controle, verifique as caixas Luminescent e Photograph e selecione exposição automática (~60 s). Selecione um campo de visão (D/12,5cm foi escolhido para este protocolo). Digite a altura do assunto (1,5 cm) e selecione a opção de foco de altura do sujeito de uso. Defina manualmente os seguintes parâmetros: binning grande, f/2, filtro de excitação bloqueado e filtro de emissão aberto.
- Determine a quantidade de injeção de D-luciferina a 300 mg/kg de peso corporal. NOTA: A dose padrão recomendada é de 150 mg/kg de D-luciferina. Este procedimento foi ajustado de acordo com um protocolo relatando maior sensibilidade utilizando 300 mg/kg18.
- Injete a luciferina intraperitoneally (i.p.).
NOTA: Se o animal precisar ser sedado antes da injeção, esteja ciente de que pode estender o tempo máximo de expressão da luciferase. - Aguarde 5 min, depois anestesia animais com um suprimento contínuo de isoflurano (4,5% na fase de indução e 1,5-2% na fase de manutenção durante o procedimento de imagem).
- Aplique lubrificante oftálmico nos olhos e, em seguida, raspe os animais sedados na região da cabeça usando um barbeador convencional de cabelo. Coloque os animais na câmara de imagem e comece a fotografar 15 minutos após a injeção de luciferina clicando em Adquirir no painel de controle .
- Configuração inicial
5. Perfusão
- Anestesiar os animais por uma injeção i.p. de pentobarbital de sódio (150 mg/kg de peso corporal). Espere até que o rato não responda mais a estímulos dolorosos, como beliscões nos dedo do dedo.
- Coloque o rato nas costas e use pinças e tesouras para abrir a cavidade torácica.
- Use uma tesoura padrão para abrir o diafragma.
- Exponha o coração e insira uma agulha (da tubulação com solução de paraformaldeído (PFA) no ápice do ventrículo esquerdo.
NOTA: Tenha cuidado para manter a ponta da agulha no lúmen do ventrículo. - Corte o ventrículo direito usando uma tesoura.
- Perfuse com solução de ringer (pode ser mantido em RT) por 3-4 min (vazão: 17 mL/min). Continue até que o coração esteja limpo.
- Troque a torneira para permitir o fluxo de PFA (armazenar a 4 °C; mantenha no gelo durante o procedimento) e peruse por mais 5 minutos (~100 mL).
- Pare a bomba e remova a agulha do ventrículo esquerdo.
NOTA: A perfusão com PFA preserva uniformemente a integridade do tecido. Também facilita a preservação do sinal de GFP nos transplantes que de outra forma podem ser perdidos devido à difusão.
6. Processamento
- Coleta de tecidos
- Remova a cabeça usando uma tesoura padrão e faça uma incisão midline na pele.
- Vire a pele sobre os olhos para expor o crânio.
- Comece pela parte caudal no ponto do osso parietal e faça uma pequena incisão usando uma tesoura de mola. Avance a tesoura rostrally ao longo da sutura midsagittal até um ponto entre os olhos. Comece novamente a partir da parte caudal e faça dois cortes paralelos e ~4 mm de distância no plano sagital.
NOTA: Tenha cuidado para não danificar o cérebro pressionando a tesoura contra a superfície interna do crânio. - Use fórceps para inclinar cuidadosamente um lado do osso parietal e quebrá-lo. Faça o mesmo com o outro lado.
NOTA: Use uma microspatula para libertar o osso das meninges; caso contrário, eles podem danificar o cérebro enquanto quebram o crânio. Se as partes do osso frontal permanecerem, faça um pequeno corte para inclinar e quebrar a placa óssea. - Para liberar o cérebro, deslize cuidadosamente a microspatula sob o cérebro (lâmpadas olfativas) e incline-a suavemente para cima.
- Após a coleta, mantenha o cérebro em solução PFA de 4% por 4-6 h a 4 °C. Transfira para 1x PBS estéril depois.
- Imunohistoquímica
- Transfira o cérebro para uma solução de 30% de sacarose por pelo menos 48 h a 4 °C para evitar a formação de cristais durante o congelamento.
- Use um microtome deslizante para cortar seções coronais com uma espessura de 40 μm. Colete e armazene as seções como seções flutuantes gratuitas (em uma placa de 24 poços) em uma solução crioprotetora (Tabela 1) a -20 °C até um processamento adicional.
- Enxágüe as seções com 450 μL de 1x PBS para cada poço (3 vezes, 5 min cada, RT).
- Bloqueie sites não específicos com 450 μL de solução de bloqueio para cada poço (Tabela 1) por 1 h no RT.
- Incubar cada poço com 450 μL de anticorpos primários a 4 °C durante a noite. Diluir os anticorpos 1:200 em 3% de soro de burro; 0,1% Triton-X-100 na PBS. Para identificar material doador no ambiente hospedeiro, use um anticorpo para núcleos específicos do homem (Anticorpo anti-humano nuclei, clone 235-1).
- Lave as seções com 450 μL de 1x PBS para cada poço (3 vezes, 5 min cada, RT).
- Incubar cada poço com 450 μL de anticorpos secundários fluorescentes correspondentes por 2-3 h (RT). Diluir os anticorpos em 3% de soro de burro; 0,1% Triton-X-100 em 1x PBS.
- Lave as seções com 450 μL de 1x PBS para cada poço (3 vezes, 5 min cada, RT).
- Manche os núcleos com 450 μL de 0,1 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilômicos (DAPI).
Representative Results
Nosso objetivo é rastrear longitudinalmente as células progenitoras neurais transplantadas no cérebro do camundongo usando imagens de bioluminescência in vivo e identificar as células transplantadas na análise histológica subsequente (Figura 1A). Portanto, as células progenitoras neurais são transduzidas com um vetor lentiviral constituído por EF1α-rFluc-eGFP. Antes do transplante, as células eram testadas para transdução bem sucedida por expressão de eGFP in vitro (Figura 1B). As células transduzidas com sucesso foram estereoticamente transplantadas no cérebro do camundongo nas coordenadas desejadas (por exemplo, no córtex sensorial). Após o transplante, os camundongos foram injetados sistematicamente com D-luciferina, o substrato para rFluc, e intensidades de sinal das células transplantadas foram medidas para confirmar o sucesso do transplante (Figura 1C).
Para avaliar o limite de detecção da imagem de bioluminescência in vivo, uma faixa de 6.000-180.000 células foi transplantada no córtex sensorimotor direito do mouse (Figura 2A). Detectamos <6.000 células e um sinal de bioluminescência proporcional à contagem de células transplantadas logo após o transplante (Figura 2B). Como as fontes de células humanas são imunogênicas para camundongos imunocompetentes, os camundongos imunodeficentes nod scid gamma (NSG) foram usados para observar a sobrevivência a longo prazo dos enxertos celulares. A sobrevivência a longo prazo e a detecção de um sinal de bioluminescência por até 5 semanas foram confirmadas após o transplante celular (Figura 2C,D). As células transplantadas foram detectadas com sucesso ex vivo em uma análise histológica subsequente através do repórter eGFP e imunostaining com núcleos anti-humanos e anticorpos mitocondriais anti-humanos (Figura 2E).
Figura 1: Transplante de células progenitoras neurais. (A) Visão geral esquemática da geração e transplante de NPCs de RFluc-eGFP. (B) Imagem representativa de imunofluorescência de NPCs transduzidas (repórter GFP, verde) contra-manchada com DAPI (azul); barras de escala = 5 μm. (C) Detecção in vivo de sinal de bioluminescência em células transplantadas; barra de cor = azul (0, min, sem sinal), vermelho (4 fluxos, p/s × 105, sinal máximo) Abreviaturas: NPCs = células progenitoras neurais; GFP = proteína fluorescente verde; rFluc-eGFP = luciferase de vagalume vermelha e proteína fluorescente verde aprimorada; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole; p/s = fótons/s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curso de tempo de células transplantadas. (A) Visão esquemática dos números de células para transplante. (B) Limite de detecção de células transplantadas 1h após o transplante. (C, D) Curso de tempo de transplante (180.000 células) por até 35 dias em camundongos NSG ; barra de cor = azul (0, min, sem sinal), vermelho (4 fluxos, p/s × 105, sinal máximo) Os dados são médios ± SEM (n = 3). (E) Imagens representativas da fluorescência de seções histológicas e células transplantadas 5 semanas após o transplante. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: D = dia após o transplante; NSG = NOD imunodeficante scid gama; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole; GFP = proteína fluorescente verde; HuNu = Anticorpo anti-humano dos núcleos, clone 235-1; p/s = fótons/s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Regenerar o cérebro ferido para permitir a recuperação funcional continua sendo um desafio não cumprido. Muitas abordagens pré-clínicos inovadoras evoluíram visando, por exemplo, modulação imunológica 19,20, angiogênese 1,21,22,23, integridade da barreira hemencefálica 2,3,24,25 e substituição celular 5,26 . Especialmente nos últimos anos, as terapias baseadas em células surgiram como uma estratégia promissora de tratamento para o cérebro devido a grandes avanços na tecnologia de células-tronco e protocolos eficientes de diferenciação15,28. Este artigo fornece um protocolo valioso para transplantar e rastrear células neurais no cérebro do camundongo. O método é aplicável para todas as linhas celulares transduutíveis para aplicações in vivo no cérebro do camundongo.
A configuração apresentada utiliza transplantes de origem humana em um rato. Esses transplantes não são viáveis a longo prazo em camundongos do tipo selvagem imunocompetente devido à imunogenicidade. Assim, camundongos insg deficientes foram utilizados para superar essa limitação. Alternativamente, o uso de transplantes de camundongos pode ser preferido para superar os aspectos imunogênicos. Se o transplante de células humanas for necessário, os modelos de camundongos humanizados representam uma alternativa emergente para reduzir a probabilidade de rejeição do enxerto29.
Um vetor viral de dois repórteres comerciais composto por luciferase de vagalume e eGFP sob o EF1α promotor foi usado para visualizar os transplantes. Este promotor foi selecionado para alcançar uma alta intensidade de sinal15. No entanto, além dos NPCs, outros tipos de células têm sido mostrados para promover a função cerebral após a lesão, incluindo pericítos30 e astrócitos31; portanto, dependendo da linha celular utilizada, outros promotores podem ser mais adequados para alcançar altos níveis de expressão. Além disso, o uso de promotores transgênicos, como o CMV, pode levar à queda da regulação, especialmente em experimentos de longo prazo32. A eficiência de transdução do vetor lentiviral depende fortemente da linha celular usada e pode variar entre experimentos únicos. Portanto, a eficiência da transdução deve ser avaliada antes de iniciar os experimentos in vivo e corrigir variações na eficácia da transdução entre os experimentos. A região cerebral do transplante também influencia a força do sinal. Embora um limite de detecção de <6.000 células tenha sido alcançado para transplantes corticais, pode exigir mais células para detectar um sinal em regiões cerebrais mais profundas, por exemplo, estriado ou hipocampo.
Os volumes de transplante no cérebro do camundongo são limitados a 1-2 μL. Por isso, é importante identificar um número celular adequado para os experimentos. Observou-se anteriormente que o aumento do número de células leva à diminuição da taxa de sobrevivência, provavelmente devido à disponibilidade limitada de nutrientes e oxigênio na região do transplante33. A imagem de bioluminescência in vivo fornece uma resolução espacial relativamente baixa em comparação com outros métodos de imagem in vivo , como ressonância magnética ou tomografia computadorizada. Portanto, caminhos migratórios curtos de células enxertadas só podem ser avaliados de forma confiável na análise pós-hoc subsequente.
A força absoluta do sinal da bioluminescência é geralmente proporcional ao número celular transplantado. No entanto, a força do sinal pode ser reduzida se os enxertos forem transplantados em estruturas cerebrais mais profundas ou se a força do sinal estiver fora do espectro de detecção linear do sistema de imagem in vivo . Atualmente, novos substratos são desenvolvidos para garantir uma penetração mais eficiente em toda a barreira hemencefálica do que a D-luciferina, incluindo o cicluc1. Esses substratos podem melhorar ainda mais o limite de detecção das células enxertadas no futuro18. No geral, este protocolo permite um procedimento simples e minimamente invasivo para transplantar e observar enxertos no cérebro do camundongo.
Disclosures
Os autores não têm potenciais conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Os autores RR e CT reconhecem o apoio da Fundação Mäxi e do Centro de Competência 3R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral Transduction | |||
| pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
| Consumables | |||
| Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
| Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
| Microscope cover slips | Product of choice | ||
| Microscope slides | Product of choice | ||
| Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
| Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
| Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
| Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
| Equipment | |||
| Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Heating pad | Product of choice | ||
| High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
| In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
| Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
| Microtome | Leica | HM430 | |
| NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
| Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
| Pharmaceuticals and Reagents | |||
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
| Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
| B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
| Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
| CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
| Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
| DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
| Donkey serum | Product of choice | ||
| Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ethanol; 70% | Product of choice | ||
| FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
| hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
| Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
| Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
| N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
| Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
| Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
| Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
| SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
| Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |
References
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