Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידת פוטופיזיולוגיה של השלב המצורף של קולאקיום sp. על ידי פלואורומטר קצב חזרה מהירה מסוג Cuvette

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

פלואורומטר קצב חזרה מהיר (FRRf) היא שיטה מועילה למדידת פוטו-פיזיולוגיה של פוטו-מערכת II ופרודוקטיביות ראשונית. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד פוטופיזיולוגיה PSII של אצה אפיזואית, Colacium sp. על מצע zooplankton באמצעות FRRf סוג cuvette.

Abstract

פלואורומטר קצב חזרה מהיר (FRRf) היא שיטה מועילה למדידת פוטו-מערכת II (PSII) פוטופיזיולוגיה ופרודוקטיביות ראשונית. למרות ש-FRRf יכול למדוד חתך רוחב של ספיגת PSII (σ PSII), יעילות פוטוכימית מרבית (Fv/Fm), יעילות פוטוכימית יעילה (Fq′/Fm′), ומרווה לא פוטוכימית (NPQNSV) עבור אצות אוקריוטיות שונות וציאנובקטריה, כמעט כל מחקרי FRRf עד כה התמקדו בפיטופלנקטון. כאן, הפרוטוקול מתאר כיצד למדוד פוטופיזיולוגיה PSII של אצה אפיזואית Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), בשלב המצורף שלה (מצורף זואופלנקטון), באמצעות FRRf מסוג cuvette. ראשית, הערכנו את ההשפעות של זואופלנקטון מצע (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) על פלואורסצנטיות בסיסית σ PSII, Fv / Fm, Fq ′/ Fm ′, ו- NPQNSV של קולקיום sp פלנקטוני. כדי לאמת מתודולוגיה זו, הקלטנו מדידות פוטופיזיולוגיות של קולאקיום sp. מצורף על S. mucronata והשווינו תוצאות אלה עם השלב הפלנקטוני שלה. תוצאות מייצגות הראו כיצד הפרוטוקול יכול לקבוע את ההשפעות של סידן (Ca) ומנגן (Mn) על Colacium sp. פוטופיזיולוגיה ולזהות את ההשפעות השונות של העשרת Mn בין שלבים מצורפים פלנקטוניים. לבסוף, אנו דנים בהסתגלות של פרוטוקול זה לאצות פריפיטיות אחרות.

Introduction

פלואורסצנטיות משתנה כלורופיל היא כלי שימושי למדידת פוטו-מערכת אצות II (PSII) פוטופיזיולוגיה. אצות מגיבות ללחצים סביבתיים שונים, כגון מחסור עודף באור וחומרים מזינים, על ידי שינוי הפוטופיזיולוגיה של PSII שלהן. פלואורומטר קצב חזרה מהיר (FRRf) היא שיטה נפוצה למדידת פוטופיזיולוגיה PSII1,2 והערכת הפרודוקטיביות הראשונית1,3,4, המאפשרת ניטור פיטופלנקטון PSII פוטופיזיולוגיה, כמו גם פרודוקטיביות ראשונית על פני סולמות מרחביים וטמפורליים רחבים5,6,7. FRRf יכול למדוד בו זמנית חתך ספיגה PSII (σ PSII), ריכוז מרכז התגובה ([RCII]), יעילות פוטוכימית מרבית (Fv/Fm), יעילות פוטוכימית יעילה (Fq′/Fm′) ומרווה לא פוטוכימית (NPQNSV) (טבלה 1). באופן כללי, Fv/ Fm ו- Fq′/Fm′ מוגדרים כפעילות PSII8, בעוד NPQNSV מוגדר כאנרגיה יחסית מפוזרת חום9.

חשוב לציין, הבזקי מחזור יחיד (ST) של FRRf מפחיתים באופן מלא את מקבל האלקטרונים העיקרי של קינון, QA, אך לא את בריכת הפלסטוקווינון. לעומת זאת, תחלופה מרובה (MT) הבזקים מאפנון משרעת דופק (PAM) פלואורומטר יכול להפחית את שניהם. לשיטת ST יש יתרון ברור על פני שיטת MT בעת זיהוי המקורות האפשריים של NPQNSV על ידי מדידת קינטיקה של התאוששות בו זמנית של Fv / Fm, Fq ′/ Fm′, NPQNSV ו- σ PSII10. עד כה, מספר סוגים של מכשירי FRRf, כגון סוג צוללת, סוג קובט וסוג זרימה, זמינים מסחרית. FRRf מסוג צוללת מאפשר מדידות מיקום באוקיינוסים ובאגמים, ואילו FRRf מסוג cuvette מתאים למדידת נפחי מדגם קטנים. סוג הזרימה משמש בדרך כלל כדי למדוד ברציפות את הפוטופיזיולוגיה של פיטופלנקטון במים על פני השטח.

בהתחשב בהתפתחות של פלואורומטרים PAM, כולל סוג הקובט, עבור מגוון רחב של נושאים11, פלואורומטרים PAM עדיין נפוצים יותר מאשר FRRfs במחקר פוטופיזיולוגיה אצות12. לדוגמה, למרות מבנה תא המדגם ואת קיבולת cuvette בין כלים אלה רק שונה במקצת, PAM מסוג cuvette הוחל על phytoplanktons13,14,15, מיקרו-אצות בנטיות16,17,18, אצות קרח19, ואצות אפיזואיות20, בעוד FRRf מסוג cuvette הוחל בעיקר על פיטופלנקטונים21,22,23 ומספר מוגבל של קהילות אצות קרח24,25. בהתחשב ביעילותו, FRRf מסוג cuvette ישים באותה מידה לאצות בנטיות ואפיזואיות. לכן, הרחבת היישום שלה תספק תובנה ניכרת לתוך פוטופיזיולוגיה PSII, במיוחד עבור פוטופיזיולוגיה אצות אצות פחות ידוע.

אצות אפיזואיות קיבלו תשומת לב מועטה, עם מחקרים מעטים שבוחנים את הפוטופיזיולוגיה PSII שלהם20,26, ככל הנראה בשל תפקידיהם המשניים ברשתות מזון ימי27,28. עם זאת, אפיביונטים, כולל אצות אפיזואיות, יכולים להשפיע באופן חיובי על הדינמיקה הקהילתית של זואופלנקטון, כגון הגדלת שיעורי הרבייה וההישרדות29,30, כמו גם תהליכי השפעה שלילית, כגון הגדלת שיעור הטביעה22,31 ופגיעות לטורפים חזותיים32,33,34,35,36 . לכן, חקר הגורמים הסביבתיים והביולוגיים השולטים בדינמיקת האפיביונט בקהילות זואופלנקטון הוא קריטי.

בין אצות אפיזואיות, קולאקיום ארנברג 1834 (Euglenophyta) הוא קבוצה נפוצה, מים מתוקים, אצות 32,37,38,39 עם שלבי חיים שונים, כולל מצורף (איור 1A-D), פלנקטוני לא רגשן (איור 1E, F) ושלבים פלנקטוניים מוטיבים40,41 . במהלך השלב הפלנקטוני הלא-מוטיב, תאים חיים כפלנקטונים חד-תאיים, מושבות מצטברות או מושבות גיליון בשכבה אחת, המכוסות על ידי ריריות42. בשלב המצורף, Colacium sp. משתמש ברירית המופרשת מהקצה הקדמי של התא37,39,41 כדי לצרף אורגניזמים מצע (basibionts), במיוחד microcrustaceans41,43. מחזור החיים שלהם כרוך גם בהתנתקות מהשלד החיצוני המותך או מהבסיס המת ובשחייה עם הפלאגלה שלהם כדי למצוא אורגניזם מצע אחר39. הן שלבים פלנקטוניים והן שלבים מצורפים יכולים להגדיל את גודל האוכלוסייה שלהם על ידי mitosis40. למרות שהשלב המצורף שלהם הוא ההשערה כתכונה אבולוציונית לאיסוף משאבים, כגון אור44 ואלמנטים קורט41,45,46, או כאסטרטגיית פיזור27, מעט ראיות ניסיוניות זמינות על היבטים אלה37,41,44 ומנגנוני ההתקשרות העיקריים אינם ידועים ברובם. לדוגמה, רוסובסקי וקוגרנס ציפו שקולכסיום יקבל מנגן (Mn) ממצע קופפודס41, המרוכז בשלד החיצוני47.

כאן, אנו מתארים כיצד למדוד פוטופיזיולוגיה PSII של אצות פלנקטוניות ואת שיטת היישום הקשורה למיקוד אצות מצורפות (צירוף לזואופלנקטון) עם תאי קולאציום sp. באמצעות FRRf מסוג cuvette. אנו משתמשים במערכת Act2 המצוידת בשלוש דיודות פולטות אור (נורות LED) המספקות אנרגיית עירור הבזק המרוכזת ב- 444 ננומטר, 512 ננומטר ו- 633 nm48. כאן, 444 ננומטר (כחול) מתאים לשיא הקליטה של chrophyll a (Chl-a), בעוד 512 ננומטר (ירוק) ו 633 ננומטר (כתום) תואמים את פסגות הקליטה של phycoerythrin ו phycocyanin, בהתאמה. שיא זיהוי האותות הפלואורסצנטיים הוא 682 ננומטר עם רוחב פס של 30 ננומטר. מאז קשה למצוא את השלב הפלנקטוני של Colacium sp. בסביבות טבעיות, השלב המצורף שלהם נאסף עבור הניסויים. בין האורגניזמים הרבים של המצע, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, דפניידה; איור 1A, B, G) הוא אחד הפשוטים ביותר לטיפול בשל מהירות השחייה האיטית שלהם, גודל הגוף הגדול שלהם (400-650 מיקרומטר) והתנהגות ייחודית (תלויה הפוך על פני המים). לכן, פרוטוקול זה משתמש Colacium sp. מצורף על S. mucronata כמקרה מבחן של מערכת קולציום-basibiont. כדי למנוע פלואורסצנטיות הנגזרת מתכולת המעיים, S. mucronata היה מורעב. כמו מחקר קודם דיווח כי אות פלואורסצנטיות מתכולת המעיים (אצות בלע) מציג ירידה של פי חמישה לאחר 40 דקות49, ציפינו כי 90 דקות רעב יהיה מספיק כדי למזער את האפשרות של פלואורסצנטיות תוכן המעי המשפיע על מדידת FRRf עם השפעות מינימליות של מתח ניסיוני Colacium sp., כגון מחסור בחומרים מזינים. יתר על כן, פרוטוקול זה יושם כדי להבהיר את מנגנון ההצמדה של Colacium sp. ולקבוע כיצד שתי מתכות, סידן (Ca) ומנגן (Mn) להשפיע על הפוטופיזיולוגיה של שני שלבים פלנקטוניים מצורפים. סידן ממלא תפקידי מפתח במסלולים הפוטוסינתטיים50 בדרכים מרובות, ושתי המתכות נדרשות כדי לבנות את הקומפלקסים המתפתחים בחמצן של PSII51. כמו סידן ומנגן מרוכזים מאוד carapace של zooplankton47 הסרטני, אנו משערים כי Colacium sp. פוטופיזיולוגיה עשוי להגיב באופן בולט יותר Ca ו Mn העשרה במהלך השלב הפלנקטוני אם שלב זה בחיים מקבל אלמנטים אלה מ S. mucronata במהלך השלב המצורף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. דגימה

  1. לאסוף מי אגם מפני השטח על ידי דלי. כדי למקד Colacium sp. מחובר S. mucronata (איור 1A-C) לסנן 0.5-10 L של מי אגם באמצעות רשת רשת ניילון 100 מיקרומטר net52.
    הערה: S. mmorronata לעתים קרובות לצבור בצפיפות במים רדודים, אוטרופיים, בוציים, כגון בין קני סוף (phragmites) אזורים.
  2. אחסן את הדגימות המרוכזות בבקבוקי פלסטיק 500 מ"ל עם 350 מ"ל של מי אגם. יש לשמור בתנאים חשוכים.
  3. במעבדה, לשפוך את המים מדגם לתוך 500 מל ולאפשר לו להסתפק במשך כמה דקות.
  4. לסנן את מי האגם באמצעות מסנן בגודל נקבוביות בגודל 0.2 מיקרומטר.
  5. תאסוף את ס. אנשים mucronata באמצעות פיפטה תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 100x. בצע זיהוי מינים על פי Błędzki ו Rybak53.
  6. מעבירים אותם לטיפה של מי אגם מסוננים של 0.2 מיקרומטר (FLW) הממוקמים על מגלשת זכוכית.
    הערה: ס. mucronata יכול לשחות אל פני השטח או לצרף לקיר הכוס.
  7. בדוק ס. mucronata תחת מיקרוסקופיה קלה.
  8. ווש ס. אנשי mucronata המשתמשים ב-FLW (3 טיפות או יותר) כדי למנוע זיהום מאורגניזמים אחרים (איור 2).
  9. שמור על ס. mucronata בטמפרטורה במקום בתא גדילה תחת 40 מיקרומול פוטון−2·s−1.

2. ההשפעות של S . mucronata על פלואורסצנטיות בסיסית

  1. ס. טיפוח mucronata
    1. לאסוף S . mucronata אנשים באמצעות פיפטה תחת מיקרוסקופ אופטי ב 100x הגדלה ולשטוף באמצעות FLW, כמו בשלב 1.8.
    2. Aerate מי ברז באמצעות משאבת אוויר חשמלית באמצעות אבן אוויר במשך שבוע אחד לפחות. יוצקים 300 מ"ל של מי ברז מאווררים לתוך צנצנת זכוכית 350 מ"ל.
    3. להאכיל כלורלה (1 מ"ג C·L−1) ולשמור על 20 °C (60 °F תחת 40 μmol פוטון−2·s−1 בתא גדילה.
    4. לאחר כ -14 ימים, לאסוף 5-30 אנשים באמצעות פיפטה תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 100x ולחסן אותם לתוך 300 מ"ל של מי ברז נקיים, מאווררים כדי לשמור על טרי בינוני.
  2. הגדרת FRRf
    1. הפעל את תוכנת Act2Run.
    2. לחץ על הכרטיסיה אפשרויות ובחר Act2 FLC (נורות LED לבנות) במצב פעולה כדי להגדיר את צבע נוריות האקטין.
    3. לחצו על הערך של Dark בשלב 1 של ההגדרות של עקומת האור הפלואורסצנטי בחלון הראשי, והקלד 30 כדי להגדיר את משך התקופה הכהה (איור 3A).
    4. לחצו על צירוף ה-LED B, C ו-D כדי לכבות את נוריות ה-LED הירוקות והכתומות (איור 3C).
    5. לחץ על הערך של Fets ו - Pitch תחת שבת, והקלד 100 ו- 2, בהתאמה, כדי להגדיר את המספר ואת גובה ההבזק בשלב הרוויה (איור 3D).
    6. לחץ על הערך של Fets ו - Pitch תחת Rel, והקלד 40 ו- 60, בהתאמה, כדי להגדיר את המספר ואת גובה ההבזק בשלב ההרפיה (איור 3E).
    7. הפעילו את משאבת מעיל המים על ידי לחיצה על במהלך FLC (איור 3F) כדי לשלוט בטמפרטורת הדגימה במהלך המדידה.
    8. הפעל על-ידי לחיצה על נורית אוטומטית ו-PMT אוטומטי (איור 3F).
    9. לחץ על סנכרן כדי לחבר את FRRf-Act2.
  3. מדידות FRRf
    1. כדי לבחון את ההשפעות של אנשים zooplankton על פלואורסצנטיות בסיסית, להכין מבוגר S. mucronata (גודל גוף 400-650 מיקרומטר) מהתרבות בשלבים 2.1.1-2.1.4 ללא כל אורגניזמים מחוברים.
    2. כדי למנוע פלואורסצנטיות מתכולת המעיים, להרעיב את האנשים ב FLW ב 20°C במשך 90 דקות לפחות.
    3. יוצקים 1.5 מ"ל של FLW לתוך קובט. הרם 0, 1, 5, ו 10 S. mucronata אנשים באמצעות פיפטה תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 100x.
    4. העברה S. אנשים mucronata לתוך cuvette ולהוסיף FLW כדי להביא את המדגם עד 2 מ"ל.
    5. התאקלם תחת אור נמוך (1-10 μmol photon·m−2·s−1) ב 20 °C (10 °F) ב 20 °C (15 דקות לפני מדידת FRRf.
    6. לחץ על Act2 הפעל כדי להתחיל את המדידה. חזור על המדידות >3 פעמים לכל דגימה.
    7. קראו את ערך Fo מתוך תרשים התוצאות (איור 4).

3. ההשפעות של אורגניזם מצע על Chl - פלואורסצנטיות

  1. קולאקיום sp. טיפוח
    1. הכן את ה- FLW ואת ה- AF-6 medium54 לטיפוח (טבלה 2).
    2. לאסוף Colacium sp. מצורף S. mucronata כמו בשלבים 1.1 ו 1.2 ו, לשמור בטמפרטורה במקום בתא צמיחה.
    3. הרימו את Colacium sp. עם קרפצ'ה מותכת (איור 1D) באמצעות פיפטה מתחת למיקרוסקופ אופטי בהגדלה של פי 100. לשטוף אותם עם FLW, כמו בשלב 1.8.
    4. לחסן באופן אספטי Colacium sp. ו AF-6 בינוני בצינור זכוכית 10 מ"ל על ספסל נקי.
    5. שמור על התרבות בטמפרטורה במקום תחת 200 μmol פוטונומטר −2·s−1 בחדר צמיחה. נענעו את צינור הזכוכית בעדינות ביד לפחות פעם ביום כדי למנוע הסדרת תאים.
      הערה: כדי לשמור על אפקט ההנחתה של מושבות מצטברות נמוך ככל האפשר, בדוק את המושבות תחת מיקרוסקופ לפני מדידת FRRf. צבירת תאים עלולה לגרום למושבות צפופות ולהשפיע על פוטופיזיולוגיה של אצות55.
  2. מדידות FRRf
    1. כדי לבחון את ההשפעות של אנשים zooplankton על Chl-a פלואורסצנטיות מ Colacium sp., להכין מבוגר S. mucronata (גודל גוף 400-650 מיקרומטר) ללא כל אורגניזמים מחוברים.
    2. כדי למנוע פלואורסצנטיות מתכולת המעיים, הרעיבו את האנשים ב- FLW למשך 90 דקות לפחות.
    3. הגדר פלואורומטר קצב חזרה מהירה מסוג קובט (FRRf).
    4. יוצקים 1.5 מ"ל subsample של קולאקיום sp. precultured לתוך cuvette. העבר 0, 5, 10 ו- 15 S. אנשים mucronata לתוך cuvettes אלה ולהוסיף 2 מיקרומטר של מדיום מסונן כדי להביא את המדגם עד 2 מ"ל.
    5. התאקלם תחת אור נמוך (1-10 μmol photon·m−2·s−1) ב 20 °C (10 °F) במשך 15 דקות לפני נטילת מדידת FRRf.
      הערה: שמור על הדגימות בטמפרטורת הדגירה במהלך מדידות
    6. לחץ על Act2 הפעל כדי להתחיל את המדידה. חזור על המדידות >3 פעמים לכל דגימה.
    7. קראו את ערכי FO ו-Fm מתווה התוצאה (איור 4).
      הערה: בדוק את הערך RσPSII (טבלה 1), המציג אם עוצמת ה- LED נמצאת בטווח האופטימלי כדי להעריך את הפרמטרים של PSII כראוי. כאשר נורית ה-LED האוטומטית מופעלת, מערכת Act2run שולטת בעוצמת ה-LED כדי להשיג טווח RσPSII אופטימלי (0.042-0.064). ערך החיתוך הניסיוני של RσPSII הוגדר ב- 0.03 ו- 0.08 במחקר קודם48.
    8. כדי לתקן את הפלואורסצנטיות הבסיסית22, סנן את מדיום התרבות באמצעות מסנן בגודל נקבוביות בגודל 0.2 מיקרומטר ומדוד את הפלואורסצנטיות. הפחת FO של הדגימה הבסיסית מ- FO ו- Fm של Colacium sp., או שנה את ערך התיקון ריק בהגדרות בכרטיסיה אפשרויות.

4. פוטופיזיולוגיה של קולציום sp. (שלב מצורף)

  1. לבודד S. mucronata אנשים עם Colacium sp. באמצעות פיפטה תחת מיקרוסקופ אופטי.
  2. ווש ס. mucronata באמצעות FLW, כמו בשלב 1.8.
  3. העברה S. mucronata לתוך 100 מ"ל של FLW. לרעב, לשמור בתנאים כהים בטמפרטורה במקום במשך 90 דקות.
  4. יוצקים 1.5 מ"ל של FLW לתוך קובט.
  5. העברה ~ 10 S. אנשים mucronata עם Colacium sp. לתוך cuvette. עבור מדידות, יותר מ 100 תאי קולציום לכל 2 מ"ל נדרשים. הוסף FLW כדי להביא את המדגם עד 2 מ"ל.
  6. התאקלם תחת אור נמוך (1-10 μmol photon·m−2·s−1) בטמפרטורת המקום במשך 15 דקות. למדוד Chl-a פלואורסצנטיות כמו בשלבים 3.2.6-3.2.8.
  7. כדי למנות את מספר התאים המצורפים, תקן את המדגם עם glutaraldehyde (2% נפח סופי) לאחר נטילת מדידת FRRf. צלם תמונות במספר עומקים ומיקומים מוקדיים של S. mucronata תחת מיקרוסקופ אור.

5. פוטופיזיולוגיה של קולאקיום sp. (שלב פלנקטוני)

  1. לטפח נדגם Colacium sp. ב AF-6 בינוני בטמפרטורת המיקום כמו בשלבים 3.1.1-3.1.5.
  2. עבור השלב הנייח, לקחת 2 מ"ל של sp קולאקיום מתורבת ולשפוך לתוך cuvette.
  3. התאקלם תחת אור נמוך (1-10 μmol photon·m−2·s−1) בטמפרטורת המקום במשך 15 דקות. למדוד Chl-a פלואורסצנטיות כמו בשלבים 3.2.6-3.2.8.

6. ההשפעות של Ca ו- Mn תוספת על פוטופיזיולוגיה של Colacium sp.

  1. אפקטים על השלב המצורף
    1. לבודד S. mucronata אנשים עם Colacium sp. באמצעות פיפטה תחת מיקרוסקופ אופטי. לשטוף באמצעות FLW, כמו בשלב 1.8.
    2. העבר שישה אנשים כל אחד לתוך 12 כוסות זכוכית עם 30 מ"ל של FLW. ודא שכל מכילה >100 תאי קולסיום sp.
    3. הוסף 200 מיקרומול· L−1 CaCl2· H2O (טיפול Ca), 40 מיקרומול· L−1 MnCl4 (טיפול Mn), או מים אולטרה-פור (בקרה) לכל. דגירה את הדגימות מתחת 200 μmol photon·m−2 ·s−1 בטמפרטורת במקום בחדר צמיחה.
    4. ב 3 שעות ו 21 שעות, להעביר את כל האנשים ואת העורות מותכים לתוך cuvette עם 2 מ"ל של המדיום.
    5. כדי לבחון את התגובה המהירה להגדלת האור, לחץ על למעלה מתקופות של 8 שלבי אור אקטיניים והקלד 20 (איור 3A) כדי להגדיר את משך הזמן של כל שלב ב-20 שניות. כדי להגדיר את האור האקאטיני צעדי כ- 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 ו- 200 מיקרומול פוטון−2·s−1, לחץ על High E ו - Step Up ושנה את הערכים ל- 200 ו- 34, בהתאמה (איור 3B).
    6. לאחר 15 דקות של התאקלמות כהה, למדוד Chl-a פלואורסצנטיות של כל מדגם דומה לשלבים 3.2.6-3.2.8.
      הערה: ודא שערכי RσPSII ו- RσPSII נמצאים בטווח האופטימלי (0.03-0.08)48.
  2. השפעות על שלב הפלנקטוני
    1. לטפח נדגם Colacium sp. ב AF-6 בינוני בטמפרטורת המיקום כמו בשלבים 3.1.1-3.1.5.
    2. העבר את Colacium sp. מתורבת לתוך FLW ולהתאקלם בטמפרטורה במקום פחות מ 200 מיקרומול פוטונמול −2·s−1 במשך 3 ימים.
    3. העבר 1 מ"ל של דגימות התאקלמות לשלושה בקבוקוני זכוכית עם 10 מ"ל של FLW.
    4. הוסף 200 מיקרומול· L−1 CaCl2· H2O (טיפול Ca), 40 מיקרומול· L−1 MnCl3 (טיפול Mn), או מים אולטרה-פור (בקרה) לבקבוקונים. לדגור על הדגימות תחת 200 μmol פוטון−2·s−1 בטמפרטורת במקום בתא צמיחה.
    5. ב 3 שעות ו 21 שעות, למדוד Chl-a פלואורסצנטיות של כל מדגם כמו בשלבים 3.2.6-3.2.8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לא הייתה השפעה משמעותית של פלואורסצנטיות בסיסית (איור 5) או פלואורסצנטיות Chl-a (איור 6) על ידי S. mucronata עד 5 אנשים (inds.) mL−1. עם זאת, Fv / Fm ו- NPQNSV הושפעו באופן משמעותי כאשר S. mucronata היה 7.5 inds·mL−1. לכן, למדידת הפוטופיזיולוגיה של Colacium sp. במהלך השלב המצורף, בחרנו S. mucronata עם הנטל הגבוה יותר של Colacium sp. על מנת להגיע מספיק קולציום sp. שפע (>50 תאים−1) ומספר נמוך של S. mucronata (≤5 inds·mL−1) בקובט.

טבלה 3 מציגה וריאציה עונתית בפוטופיזיולוגיה של קולאקיום sp. במהלך השלב המצורף. למרות שטמפרטורת הדגימה השתנתה, הפוטופיזיולוגיה שלהם נשארה קבועה יחסית. σ PSII השתנה מ- 3.42 nm2 ל- 3.76 nm2 (ממוצע 3.60 ננומטר2), Fv / Fm השתנה מ- 0.52 ל- 0.60 (ממוצע 0.55) ו- NPQNSV השתנה מ- 0.66 ל- 0.85 (ממוצע 0.82). כדי לאמת תוצאות אלה, חקרנו עוד יותר וריאציות בקולציום sp. פוטופיזיולוגיה במהלך השלב הפלנקטוני עבור השלב הנייח במדיום AF-6 (טבלה 4). ממוצע Fv / Fm ו- NPQNSV עבור השלב המצורף היו דומים לאלה של השלב הפלנקטוני כאשר דגירה במדיום AF-6.

כדי לקבוע את ההשפעה של Ca ו- Mn על קולציום sp. פוטופיזיולוגיה הן בשלבים המצורפים והן בשלבים הפלנקטוניים, ביצענו ניסויי העשרה Ca ו- Mn. דגימות נלקחו מאזור קני הסוף של אגם ביווה ב-7 במאי 2021. עבור השלב המצורף של Colacium sp. בתנאים כהים, לא היה הבדל משמעותי בפרמטרים פוטופיזיולוגיים בין טיפולים, למעט NPQNSV בין טיפולים Mn ו Ca ב 3 שעות, שבו Ca < Mn (איור 7A, C,E). יתר על כן, σ PSII′, Fq′/Fm′, ותגובות NPQNSV להגברת האור בשלב המצורף לא הראו הבדלים ברורים בין הטיפולים (איור 8A, C,E ואיור 9A, C,E). עם זאת, NPQNSV נוטה להיות נמוך יותר בטיפול Ca מאשר הפקד בעוצמה נמוכה אור ב 21 שעות (11 ו 25 μmol פוטון−2·s−1, איור 9E). בשלב הפלנקטוני, σ PSII היה נמוך משמעותית בטיפול Mn מאשר Ca ב 3 שעות (איור 7B). Fq′/Fm′ היה גבוה משמעותית, אבל NPQNSV היה נמוך יותר בטיפול Mn מאשר שליטה ב 21 שעות (איור 7D,F). תחת אור הולך וגובר, Mn נטה להקטין σ PSII ולהגדיל Fq′/Fm′ במהלך השלב הפלנקטוני, בהשוואה לבקרה ב 3 שעות (איור 8D). באופן דומה, Mn הפחיתה באופן משמעותי את NPQNSV במהלך השלב הפלנקטוני בהשוואה לבקרה במהירות של 21 שעות (איור 9F). בדומה לשלב המצורף, סידן שיפר מעט את NPQNSV לשלב הפלנקטוני תחת אור הולך וגובר (איור 9F). עם זאת, Ca ירד Fq′/Fm′ והגדיל את NPQNSV לשלב הפלנקטוני בהשוואה לטיפול Mn תחת 44-200 מיקרומול פוטון−2·s−1 ב 3 שעות (איור 8D,F).

Figure 1
איור 1: קולציום sp. ואורגניזם החומר Scapholeberis mucronata. (א) S. mucronata נגוע. (B) S. mucronata נגוע קבוע עם glutaraldehyde. (ג) תאי קולציום מחוברים על S. mucronata חי. (D) תאי קולציום מחוברים על המעטפת המותכת. (ה, ו) קולאקיום sp. של שלב פלנקטוני (פלמלה). (ז) S. mucronata שאינו נגוע. החצים מצביעים על תאי קולאקיום. סרגלי קנה מידה: 200 מיקרומטר (A, B ו- G), 10 מיקרומטר (C, E ו- F) ו- 100 מיקרומטר (D). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שטיפת זואופלנקטון על ידי צנרת מתחת למי אגם מסוננים (FLW). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ממשק משתמש של תוכנת Act2Run. (א) זמן חשיפה לכל שלב אור אקטואני; (ב) מספר השלבים ושטף הפוטונים של אור אקטיני; (ג) שילוב של אורך גל עירור; (ד) רצף הבזקי רוויה ורגיעה; (ה) תדרים ועוצמות של ז'קט המים ומשאבות ערבוב מדגם; (F) שטף פוטון של פלאש עירור ב 444 (מסומן כ 450 כאן), 512 (530) ו 633 ננומטר (624), מתח צינור פוטומוליפלייר (PMT) ושכפולים ומרווח של רצף. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קריאת פלואורסצנטיות של מדגם האצות בתוכנת Act2Run. הקווים האדומים והכחולים מצביעים על אות פלואורסצנטי גולמי על ידי רצף של פלאשלט ועקומה המתאימים הן בשלבי הרוויה והן בשלבי הרפיה, בהתאמה. לפרטים נוספים ראו קולבר ואח' 2 . לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ההשפעה של צפיפות S. mucronata על פלואורסצנטיות בסיסית. הנקודות הקטנות מייצגות שכפולים (n = 3). תוצאות בדיקת ANOVA מוצגות גם כן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ההשפעות של צפיפות S. mucronata על (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm ו- (D) NPQNSV עבור קולציום sp. במהלך השלב הפלנקטוני. הנקודות הקטנות מייצגות שכפולים (n = 3). קולאקיום sp. היה תרבותי במדיום AF-6. התוצאות של ANOVA ו Tukey פוסט הוק הבדיקה מוצגים גם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תגובות של (A,B) חתך ספיגה, (C,D) פוטוכימיה PSII, ו -(E,F) מרווה לא פוטוכימית של (A,C,E) שלב מצורף (B,D,F) שלב פלנקטוני של קולציום sp. ב 3 שעות ו 21 שעות לאחר תוספת Ca ו- Mn. הנקודות הקטנות מייצגות שכפולים (n = 4). התוצאות של ANOVA ו Tukey פוסט הוק הבדיקה מוצגים גם. * p < 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תגובות אור מהיר של (A, B) חתך ספיגה, (C,D) פוטוכימיה PSII, ו -(E,F) מרווה לא פוטוכימי של Colacium sp. בשלבים מצורפים ופלנקטוניים לפרוטוקול אור צעדים ב 3 שעות לאחר תוספת Ca ו- Mn. C, שליטה; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 מיקרומטר Mn. הבדלים משמעותיים בין (א) C ו- Ca, (ב) C ו- Mn, ו- (ג) Ca ו- Mn בכל שטף PAR, עם רמת משמעות של p < 0.05 המוצגת בכל חלונית. קו שגיאה, ממוצע SD (n = 4). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: תגובות אור מהירות של (A,B) חתך קליטה, (C,D) פוטוכימיה PSII, ו -(E,F) מרווה לא פוטוכימי של Colacium sp. בשלבים מצורפים ופלנקטוניים לפרוטוקול אור צעדים במהירות של 21 שעות לאחר הוספת Ca ו- Mn. C, שליטה; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 מיקרומטר Mn. הבדלים משמעותיים בין (א) C ו- Ca, (ב) C ו- Mn, ו- (ג) Ca ו- Mn בכל שטף PAR, עם רמת משמעות של p < 0.05 המוצגת בכל חלונית. קו שגיאה, ממוצע SD (n = 4). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מונח הגדרה יחידות
פלואורסצנטיות בסיסית ערך Fo ללא פלואורסצנטיות Chl-a
F' פלואורסצנטיות בהבזק אפסי של מדידת מחזור בודדת כאשר C>0
Fo (ʹ) תפוקת פלואורסצנטיות מינימלית של PSII (תחת אור רקע) בהבזק אפסי
Fv (ʹ) Fm(ʹ) − Fo(ʹ)
Fm (ʹ) תפוקת פלואורסצנטיות מקסימלית של PSII (תחת אור רקע)
Fv/Fm יעילות פוטוכימית מרבית של PSII תחת רדת החשיכה
Fqʹ/Fmʹ יעילות פוטוכימית מרבית של PSII תחת אור רקע ,(Fmʹ− F)/(Fmʹ)
NPQNSV מרווה מנורמלת של שטרן-וולמר, FOʹ/(Fmʹ − FOʹ)
[RCII] ריכוז מרכז התגובה
RσPSII (ʹ) ההסתברות לסגירת RCII במהלך ההבזק הראשון של שלב רוויית מחזור יחיד (תחת אור רקע)
σ PSII (ʹ) חתך ספיגה פונקציונלי של PSII עבור הבזקי עירור (תחת אור רקע) nm2

טבלה 1: מונחים המשמשים בפרוטוקול זה.

רכיב כמות
NaNO3 140 מ"ג· L−1
NH4NO3 22 מ"ג· L−1
MgSO4·7H2O 30 מ"ג· L−1
KH2PO4 10 מ"ג· L−1
K2HPO4 5 מ"ג· L−1
CaCl2·2H2O 10 מ"ג· L−1
CaCO3 10 מ"ג· L−1
Fe-citrate* 2 מ"ג· L−1
חומצת לימון* 2 מ"ג· L−1
ביוטין 0.002 מ"ג· L−1
ויט.B 1 0.01 מ"ג· L−1
ויט.B 6 0.001 מ"ג· L−1
ויט.B 12 0.001 מ"ג· L−1
עקבות מתכות 1 מ"ל−1
(FeCl3·6H2O) (1.0 מ"ג−1)
(MnCl3·4H2O) (0.4 מ"ג−1)
(ZnSO4·7H2O) (0.005 מ"ג−1)
(CoCl2·6H2O) (0.002 מ"ג−1)
(Na2Moo4) (0.004 מ"ג−1)
(Na2-EDTA) (7.5 מ"ג−1)

טבלה 2: מתכון לבינוני AF-6. כוונן את רמת החומציות ל-6.6. ממיסים Fe-ציטראט וחומצת לימון בחום H2O בנפרד ומוסיפים HCl (1 מ"ל−1) לאחר ערבוב שני הריאגנטים. התוכן של מתכות קורט מוצגים בסוגריים.

תאריך דגימה מדגם מס' 1. טמפרטורת מים.
(°C) 		S. צפיפות mucronata
(inds.· mL−1)		 קולציום sp. צפיפות תאים
(inds.· mL−1)		 σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
27/04/2020 מס' 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
לצפות 0.22 0.01 0.04
21 במאי 2020 מס' 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
לצפות 0.16 0.02 0.06
מס' 3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
לצפות 0.09 0.01 0.02
מס' 4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
לצפות 0.12 0.00 0.02
18/06 ביוני 2020 מס' 5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
לצפות 0.16 0.02 0.06
מס' 6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
לצפות 0.09 0.01 0.02
מס' 7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
לצפות 0.12 0.00 0.02
20/06 ביולי 2020 מס' 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
לצפות 0.10 0.00 0.00
התכוון 3.60 0.55 0.82
ס.ד. 0.120349 0.03 0.10

טבלה 3: פוטופיזיולוגיה של קולציום sp. מצורף על S. mucronata.

תאריך דגימה מדגם מס' 1. בינוני טמפרטורת גדילה (°C) σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
21 במאי 2020 מס' 1 AF-6 19.4 2.72 0.65 0.53
לצפות 0.03 0.00 0.01
18/06 ביוני 2020 מס' 2 AF-6 22.4 3.07 0.55 0.84
לצפות 0.08 0.02 0.07
20/06 ביולי 2020 מס' 3 AF-6 27.5 2.90 0.58 0.73
לצפות 0.06 0.01 0.02
התכוון 2.90 0.59 0.70
ס.ד. 0.18 0.05 0.16

טבלה 4: פוטופיזיולוגיה של שלב קולאקיום sp. פלנקטוני. כל דגימה נמדדה במהלך השלב הנייח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה הדגים בפעם הראשונה כי פוטופיזיולוגיה של Colacium sp. במהלך השלב המצורף בסביבה טבעית דומה לשלב הפלנקטוני שלה במדיום AF-6. בנוסף, תכולת המעיים של S. mucronata מורעב לא השפיעה על קו הבסיס ועל פלואורסצנטיות Chl-a כאשר הצפיפות הייתה ≤5 inds·mL−1 (איור 5 ואיור 6). תוצאות אלה מצביעות על פרוטוקול זה יכול למדוד פוטופיזיולוגיה של Colacium sp. במהלך השלב המצורף ללא תיקון תחת שפע אורגניזם מצע נמוך. עם זאת, תוצאות השלבים 3.2.1-3.2.8 הראו כי שפע ה-S. mucronata הגבוה ביותר השפיע באופן משמעותי על Fv/Fm ועל NPQNSV באופן משמעותי, אך לא על FO ועל σ PSII (איור 4). כאן, זה אפשרי צפיפות אורגניזם גבוהה יותר החמירה את הלחץ הפיזי על Colacium sp. אנשים ולאחר מכן ירידה בפעילות הפוטוסינתטית. עבור מדידות תחת שפע גבוה של אורגניזמים מצע או מינים אחרים, ההשפעות של צפיפות אורגניזם מצע על הבסיס ו Chl-a פלואורסצנטיות דורש תשומת לב נוספת.

FRRfs שימשו כדי לבחון את ההשפעה של מניפולציה תזונתיים על זרימת האלקטרונים הליניארית ומרווה לא פוטוכימית של פיטופלנקטון22,56,57. התוצאות הראשוניות מראות שההעשרה של Ca ו-Mn הייתה שונה באופן משמעותי בין שלבי החיים של קולאקיום sp. (איור 7, איור 8 ואיור 9). באופן ספציפי, המנגן שיפר בבירור את התפוקה הפוטוכימית (המקסימלית) של PSII (Fv/Fm ו-Fq′/Fm′) והפחית את פיזור החום (NPQNSV)50 של שלבי הפלנקטוניים תחת רדת החשיכה (איור 7D,FM) ותנאי אור (איור 8D, F ואיור 9D,F). תוצאות אלה יכולות לנבוע מגודל אנטנה מופחת ב-PSII, σ PSII ו-σ PSII′ (איור 7B ואיור 8B), מה שמפחית את ספיגת האור העודפת58,59. מדידת גודל האנטנה בנוסף לזרימת האנרגיה בין מתחמי PSII תאפשר מדידות מדויקות יותר של תגובת האצות10. פרוטוקול זה מאפשר גם בחינה של מגבלות פוטוסינתזה על ידי משאבים אחרים. לדוגמה, מגבלות חנקן וזרחן נבדקו בקהילות פיטופלנקטון שונות, אך לא באצות אפיזואיות, למרות ההשפעות החזויות על Colacium41 ועל הצורניות האפיזואיות הימיות60,61. בנוסף לחומרים מזינים, סביבת האור יכולה להשפיע עוד יותר על התפלגות אצות אפיזואיות44.

כפי שניתן לראות באיור 7, איור 8 ואיור 9, FRRf מסוג קובט מאפשר לנו לבחון בו-זמנית השפעות תזונתיות ואור ללא זמני דגירה ארוכים ומאמץ מדידה. פרוטוקול אור צעדי זה (שלב 6.1.5) יכול גם לצייר עקומות אור מהיר של קצבי הובלת אלקטרונים יחסיים (rETR = Fq′/Fm′/Fm′× אור) לעומת אור כאנלוגי לייצור לעומת עקומות אור62. עם זאת, למרות זרימת אלקטרונים ליניאריים ב- PSII ניתן להעריך מתוך פרמטרים פוטופיזיולוגיים על ידי FRRf, זה לא בהכרח מקביל לשיעור קיבוע פחמן63,64. להערכת ייצור ראשוני מבוסס פחמן, יש לבחון את דרישת האלקטרונים לקיבוע CO2 (Фe, C), שיכולה להשתנות זמנית ומרחבית5,48, בעת הערכת קהילות הנושאים.

אם רשת הפלנקטון סתומה על ידי פסולת, מסך מראש על ידי רשת גדולה יותר, כגון רשת 5 מ"מ רשת, או לקטוף zooplanktons ישירות ממי האגם באמצעות פיפטה ללא סינון. יש לציין כי נזק מסוים עלול להתרחש לאצות המצורפות גם כאשר הסינון מתבצע בעדינות באמצעות גודל רשת גדול יחסית (200 מיקרומטר). למרות שהתוצאות מראות כי סטיית התקן של הפרמטרים PSII הייתה קטנה (טבלה 3), והערכים הממוצעים של הפרמטרים היו דומים מאוד לאלה של שלב הפלנקטוני התרבותי (טבלה 4), דגימה ללא סינון עשויה להיות אידיאלית.

מגבלה נוספת של מחקר זה הייתה נגזרת σ PSII. אור אקטיני והחלשת פלואורסצנטיות Chl-a יכול להפעיל השפעה גדולה / עיוות על FRRfs, אשר מסתמך על דגימות דקות אופטית עבור σ PII נחישות מדויקת65. למרות שהראנו כי S. mucronata לא השפיע על σ PSII של תאי קולציום פלנקטוניים, כי יש לבדוק הקשורים σ PSII של תאי הקולציום המצורפים. יתר על כן, גורם תיקון ספקטרלי (SCF) יהיה צורך עבור σ PSII בהערכת situ66 כמו אורך גל עירור של מערכת ACT2 (444 nm) שונה מההתפלגות הספקטרלית של הסביבה האור במקום. באופן כללי, טכניקת כרית המסנן משמשת למדידת ספקטרום הספיגה Chl-a ספציפי לחישוב ה- SCF. הליך זה נחוץ כדי להעריך את הפרודוקטיביות העיקרית של האצות על ידי FRRfs. מכיוון שלא יכולנו לקצור מספיק תאי קולציום מחוברים במהלך תקופת המחקר, יש לבחון את ספקטרום הקליטה הספציפי Chl-a במחקרים עתידיים.

יישום FRRf מסוג cuvette צריך להיות תלוי בגודל המצע כמו אצות periphytic דורש קובץ מצורף מצע. לדוגמה, מחקרים של אצות על חומרים בלתי ניתנים להריסה, כגון סלעים67, אורגניזמים גדולים יותר26,68, או אצות סימביוטיות, כולל סימביודיניום הקשור לאלמוגים קשים10,69,70, עשויים לדרוש את FRRf69 מסוג צוללת. לעומת זאת, אם הבזיליקום קטן מספיק כדי להשעות את עצמו בקובט, FRRf מסוג cuvette עשוי להספיק בנוסף ל- PAM מסוג קובט, כגון אצות בנטיות16,17,18. ואכן, מחקרים אחרונים בחנו FRRf מסוג קובט למדידת הפוטופיזיולוגיה של אצות קרח24,25. יתר על כן, הפעלת פלאש עירור ב 512 ו 633 ננומטר מאפשר היישום ציאנובקטריה עם פיגמנטים שונים אנטנת PSII, phycoerythrins ו phycocyanins, ובכך פסגות ספיגה שונות עם Chl-a71. כמו מודלים FRRf הנוכחי המשלבים אורכי גל עירור מרובים הם כלים שימושיים לבדיקת ציאנובקטריה פוטופיזיולוגיה ופרודוקטיביות7,66,72, אלה צריכים להיות שיטות שימושיות להערכת ציאנובקטריה בנטית, אם ההשפעות של עובי מדגם על פרמטרים פוטופיזיולוגיים ישתפרו65 . במחקרים עתידיים, FRRfs צריך להיות מכוון למגוון רחב יותר של אורגניזמים נושא לשפוך תובנה נוספת על המנגנונים המורכבים של פוטופיזיולוגיה אצות על פני בתי גידול שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין גילויים להצהיר.

Acknowledgments

העבודה נתמכה על ידי קרן המחקר השיתופית ממחוז שיגה תחת הכותרת "מחקר על איכות המים וסביבת קרקעית האגם להגנה על יציבות סביבת המים" במסגרת המענק היפני להתחדשות אזורית והקרן למחקר סביבתי ופיתוח טכנולוגיה (מס '5-1607) של המשרד לאיכות הסביבה, יפן. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. המחברים רוצים להודות לאנגו (www.enago.jp) על סקירת השפה האנגלית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolber, Z., Falkowski, P. G. Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1646-1665 (1993).
  2. Kolber, Z. S., Prášil, O., Falkowski, P. G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1367 (1), 88-106 (1998).
  3. Oxborough, K., Moore, C. M., Suggett, D. J., Lawson, T., Chan, H. G., Geider, R. J. Direct estimation of functional PSII reaction center concentration and PSII electron flux on a volume basis: a new approach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry (FRRf) data. Limnology and Oceanography: Methods. 10 (3), 142-154 (2012).
  4. Smyth, T. J., Pemberton, K. L., Aiken, J., Geider, R. J. A methodology to determine primary production and phytoplankton photosynthetic parameters from fast repetition rate fluorometry. Journal of Plankton Research. 26 (11), 1337-1350 (2004).
  5. Lawrenz, E., et al. Predicting the electron requirement for carbon fixation in seas and oceans. PLoS ONE. 8 (3), 58137 (2013).
  6. Zhu, Y., et al. Relationship between light, community composition and the electron requirement for carbon fixation in natural phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 580, 83-100 (2017).
  7. Schuback, N., Tortell, P. D. Diurnal regulation of photosynthetic light absorption, electron transport and carbon fixation in two contrasting oceanic environments. Biogeosciences. 16 (7), 1381-1399 (2019).
  8. Cosgrove, J., Borowitzka, M. A. Chlorophyll fluorescence terminology: an introduction. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 1-17 (2010).
  9. McKew, B. A., et al. The trade-off between the light-harvesting and photoprotective functions of fucoxanthin-chlorophyll proteins dominates light acclimation in Emiliania huxleyi (clone CCMP 1516). New Phytologist. 200 (1), 74-85 (2013).
  10. Warner, M. E., Lesser, M. P., Ralph, P. J. Chlorophyll fluorescence in reef building corals. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 209-222 (2010).
  11. Bhagooli, R., et al. Chlorophyll fluorescence - A tool to assess photosynthetic performance and stress photophysiology in symbiotic marine invertebrates and seaplants. Marine Pollution Bulletin. 165, 112059 (2021).
  12. Zavafer, A., Labeeuw, L., Mancilla, C. Global trends of usage of chlorophyll fluorescence and projections for the next decade. Plant Phenomics. 2020, 6293145 (2020).
  13. Goto, N., Tanaka, Y., Mitamura, O. Relationships between carbon flow through freshwater phytoplankton and environmental factors in Lake Biwa, Japan. Fundamental and Applied Limnology/Archiv für Hydrobiologie. 184 (4), 261-275 (2014).
  14. Napoléon, C., Raimbault, V., Claquin, P. Influence of nutrient stress on the relationships between PAM measurements and carbon incorporation in four phytoplankton species. PLOS ONE. 8 (6), 66423 (2013).
  15. Morris, E. P., Kromkamp, J. C. Influence of temperature on the relationship between oxygen- and fluorescence-based estimates of photosynthetic parameters in a marine benthic diatom (Cylindrotheca closterium). European Journal of Phycology. 38 (2), 133-142 (2003).
  16. Fraga, S., Rodríguez, F., Bravo, I., Zapata, M., Marañón, E. Review of the main ecological features affecting benthic dinoflagellate blooms. Cryptogamie, Algologie. 33 (2), 171-179 (2012).
  17. McMinn, A., et al. Quantum yield of the marine benthic microflora of near-shore coastal Penang, Malaysia. Marine and Freshwater Research. 56 (7), 1047-1053 (2005).
  18. Salleh, S., McMinn, A. The effects of temperature on the photosynthetic parameters and recovery of two temperate benthic microalgae, Amphora cf. coffeaeformis and Cocconeis cf. sublittoralis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 47 (6), 1413-1424 (2011).
  19. McMinn, A., Pankowskii, A., Ashworth, C., Bhagooli, R., Ralph, P., Ryan, K. In situ net primary productivity and photosynthesis of Antarctic sea ice algal, phytoplankton and benthic algal communities. Marine Biology. 157 (6), 1345-1356 (2010).
  20. Garbary, D. J., Bird, C. J., Kim, K. Y. Sporocladopsis jackii, sp. nov. (Chroolepidaceae, chlorophyta): a new species from eastern Canada and Maine symbiotic with the mud snail, Ilyanassa obsoleta (Gastropoda). Rhodora. 107 (929), 52-68 (2005).
  21. Suggett, D. J., Oxborough, K., Baker, N. R., MacIntyre, H. L., Kana, T. M., Geider, R. J. Fast repetition rate and pulse amplitude modulation chlorophyll a fluorescence measurements for assessment of photosynthetic electron transport in marine phytoplankton. European Journal of Phycology. 38 (4), 371-384 (2003).
  22. Hughes, D. J., et al. Impact of nitrogen availability upon the electron requirement for carbon fixation in Australian coastal phytoplankton communities. Limnology and Oceanography. 63 (5), 1891-1910 (2018).
  23. Melrose, D. C., Oviatt, C. A., O'Reilly, J. E., Berman, M. S. Comparisons of fast repetition rate fluorescence estimated primary production and 14C uptake by phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 311, 37-46 (2006).
  24. Yoshida, K., Seger, A., Kennedy, F., McMinn, A., Suzuki, K. Freezing, melting, and light stress on the photophysiology of ice algae: ex situ incubation of the ice algal diatom Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae) using an ice tank. Journal of Phycology. 56 (5), 1323-1338 (2020).
  25. Selz, V., et al. Ice algal communities in the Chukchi and Beaufort Seas in spring and early summer: composition, distribution, and coupling with phytoplankton assemblages. Limnology and Oceanography. 63 (3), 1109-1133 (2018).
  26. Falasco, E., Bo, T., Ghia, D., Gruppuso, L., Bona, F., Fenoglio, S. Diatoms prefer strangers: non-indigenous crayfish host completely different epizoic algal diatom communities from sympatric native species. Biological Invasions. 20 (10), 2767-2776 (2018).
  27. Møhlenberg, F., Kaas, H. Colacium vesiculosum Ehrenberg (Euglenophyceae), infestation of planktonic copepods in the Western Baltic. Ophelia. 31 (2), 125-132 (1990).
  28. Zalocar, Y., Frutos, S. M., Casco, S. L., Forastier, M. E., Vallejos, S. V. Prevalence of Colacium vesiculosum (Colaciales: Euglenophyceae) on planktonic crustaceans in a subtropical shallow lake of Argentina. Revista De Biologia Tropical. 59 (3), 1295-1306 (2011).
  29. Barea-Arco, J., Pérez-Martínez, C., Morales-Baquero, R. Evidence of a mutualistic relationship between an algal epibiont and its host, Daphnia pulicaria. Limnology and Oceanography. 46 (4), 871-881 (2001).
  30. Decaestecker, E., Declerck, S., De Meester, L., Ebert, D. Ecological implications of parasites in natural Daphnia populations. Oecologia. 144 (3), 382-390 (2005).
  31. Allen, Y. C., Stasio, B. T. D., Ramcharan, C. W. Individual and population level consequences of an algal epibiont on Daphnia. Limnology and Oceanography. 38 (3), 592-601 (1993).
  32. Willey, R. L., Cantrell, P. A., Threlkeld, S. T. Epibiotic euglenoid flagellates increase the susceptibility of some zooplankton to fish predation. Limnology and Oceanography. 35 (4), 952-959 (1990).
  33. Green, J. Parasites and epibionts of Cladocera. The Transactions of the Zoological Society of London. 32 (6), 417-515 (1974).
  34. Evans, M. S., Sicko-Goad, L. M., Omair, M. Seasonal occurrence of Tokophrya quadripartita (Suctoria) as epibionts on adult Limnocalanus macrurus (Copepoda: Calanoida) in southeastern Lake Michigan. Transactions of the American Microscopical Society. 98 (1), 102-109 (1979).
  35. Chiavelli, D. A., Mills, E. L., Threlkeld, S. T. Host preference, seasonality, and community interactions of zooplankton epibionts. Limnology and Oceanography. 38 (3), 574-583 (1993).
  36. Willey, R. L., Willey, R. B., Threlkeld, S. T. Planktivore effects on zooplankton epibiont communities: epibiont pigmentation effects. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1818-1822 (1993).
  37. Rosowski, J. R., Willey, R. L. Colacium libellae sp. nov. (euglenophyceae), a photosynthetic inhabitant of the larval damselfly rectum. Journal of Phycology. 11 (3), 310-315 (1975).
  38. Willey, R. L., Threlkeld, S. T. Organization of crustacean epizoan communities in a chain of subalpine ponds. Limnology and Oceanography. 38 (3), 623-627 (1993).
  39. Al-Dhaheri, R. S., Willey, R. L. Colonization and reproduction of the epibiotic flagellate Colacium vesiculosum (euglenophyceae) on Daphnia pulex. Journal of Phycology. 32 (5), 770-774 (1996).
  40. Rosowski, J. R. Photosynthetic euglenoids. Freshwater Algae of North America. , Elsevier Science. USA. 383-422 (2003).
  41. Rosowski, J. R., Kugrens, P. Observations on the euglenoid Colacium with special reference to the formation and morphology of attachment material. Journal of Phycology. 9 (4), 370-383 (1973).
  42. Salmaso, N., Tolotti, M. Other phytoflagellates and groups of lesser importance. Encyclopedia of Inland Waters. , Academic Press. 174-183 (2009).
  43. Threlkeld, S. T., Chiavelli, D. A., Willey, R. L. The organization of zooplankton epibiont communities. Trends in Ecology & Evolution. 8 (9), 317-321 (1993).
  44. Bertolo, A., Rodríguez, M. A., Lacroix, G. Control mechanisms of photosynthetic epibionts on zooplankton: an experimental approach. Ecosphere. 6 (11), (2015).
  45. Pringsheim, E. G. Notiz über Colacium (Euglenaceae). Österreichische Botanische Zeitschrift. 100 (3), 270-275 (1953).
  46. Wołowski, K., Duangjan, K., Peerapornpisal, Y. Colacium minimum (Euglenophyta), a new epiphytic species for Asia. Polish Botanical Journal. 60 (2), 179-185 (2015).
  47. Martin, J. H., Knauer, G. A. The elemental composition of plankton. Geochimica et Cosmochimica Acta. 37 (7), 1639-1653 (1973).
  48. Kazama, T., Hayakawa, K., Kuwahara, V. S., Shimotori, K., Imai, A., Komatsu, K. Development of photosynthetic carbon fixation model using multi-excitation wavelength fast repetition rate fluorometry in Lake Biwa. PLOS ONE. 16 (2), 0238013 (2021).
  49. Chesney, T., Sastri, A. R., Beisner, B. E., Nandini, S., Sarma, S. S. S., Juneau, P. Application of fluorometry (Phyto-PAM) for assessing food selection by cladocerans. Hydrobiologia. 829 (1), 133-142 (2019).
  50. Wang, Q., Yang, S., Wan, S., Li, X. The significance of calcium in photosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1353 (2019).
  51. Dau, H., Haumann, M. Eight steps preceding O-O bond formation in oxygenic photosynthesis-A basic reaction cycle of the photosystem II manganese complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767 (6), 472-483 (2007).
  52. Suthers, I., Bowling, L., Kobayashi, T., Rissik, D. Sampling methods for plankton. Plankton: A guide to their ecology and monitoring for water quality. , CSIRO Publishing. Melbourne. 63-90 (2019).
  53. Błędzki, L. A., Rybak, J. I. Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, with notes on ecology, distribution, methods and introduction to data analysis. , Springer. Switzerland. (2016).
  54. Kato, S. Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. (Euglenophyceae). Japanese Journal of Phycology (Sorui). 30, 63-67 (1982).
  55. Serôdio, J., Campbell, D. A. Photoinhibition in optically thick samples: Effects of light attenuation on chlorophyll fluorescence-based parameters. Journal of Theoretical Biology. 513, 110580 (2021).
  56. Sylvan, J. B., Quigg, A., Tozzi, S., Ammerman, J. W. Eutrophication-induced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: evidence from fast repetition rate fluorometry. Limnology and Oceanography. 52 (6), 2679-2685 (2007).
  57. Browning, T. J., et al. P. Nutrient regulation of late spring phytoplankton blooms in the midlatitude North Atlantic. Limnology and Oceanography. 65 (6), 1136-1148 (2020).
  58. Pausch, F., Bischof, K., Trimborn, S. Iron and manganese co-limit growth of the Southern Ocean diatom Chaetoceros debilis. PLOS ONE. 14 (9), 0221959 (2019).
  59. Ferroni, L., Baldisserotto, C., Fasulo, M. P., Pagnoni, A., Pancaldi, S. Adaptive modifications of the photosynthetic apparatus in Euglena gracilis Klebs exposed to manganese excess. Protoplasma. 224 (3), 167-177 (2004).
  60. Gaiser, E. E., Bachmann, R. W. Seasonality, substrate pereference and attachment sites of epizoic diatoms on cladoceran zooplankton. Journal of Plankton Research. 16 (1), 53-68 (1994).
  61. Totti, C., et al. The diversity of epizoic diatoms: relationships between diatoms and marine invertebrates. The Diversity of Epizoic Diatoms. 16, 323-343 (2011).
  62. Perkins, M., Effler, S. W., Strait, C. M. Phytoplankton absorption and the chlorophyll a-specific absorption coefficient in dynamic Onondaga Lake. Inland Waters. 4 (2), 133-146 (2014).
  63. Kromkamp, J., Capuzzo, E., Philippart, C. J. M. Measuring phytoplankton primary production: review of existing methodologies and suggestions for a common approach. EcApRHA Deliverable WP 3.2. 28, (2017).
  64. Hughes, D., et al. Roadmaps and detours: active chlorophyll-a assessments of primary productivity across marine and freshwater systems. Environmental Science & Technology. 52 (21), 12039-12054 (2018).
  65. Perkins, R. G., et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. 4, Springer. Dordrecht. 237-275 (2010).
  66. Schuback, N., Flecken, M., Maldonado, M. T., Tortell, P. D. Diurnal variation in the coupling of photosynthetic electron transport and carbon fixation in iron-limited phytoplankton in the NE subarctic Pacific. Biogeosciences. 13 (4), 1019-1035 (2016).
  67. Schreiber, U., Gademann, R., Ralph, P. J., Larkum, A. W. D. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements. Plant and Cell Physiology. 38 (8), 945-951 (1997).
  68. Garbary, D. J., Miller, A. G., Scrosati, R. A. Ascophyllum nodosum and its symbionts: XI. The epiphyte Vertebrata lanosa performs better photosynthetically when attached to Ascophyllum than when alone. Algae. 29 (4), 321-331 (2014).
  69. Gorbunov, M. Y., Kolber, Z. S., Lesser, M. P., Falkowski, P. G. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. Limnology and Oceanography. 46 (1), 75-85 (2001).
  70. Yellowlees, D., Warner, M. Photosynthesis in symbiotic algae. Photosynthesis in Algae. 14, Springer. Dordrecht. 437-455 (2003).
  71. Wojtasiewicz, B., Stoń-Egiert, J. Bio-optical characterization of selected cyanobacteria strains present in marine and freshwater ecosystems. Journal of Applied Phycology. 28 (4), 2299-2314 (2016).
  72. Aardema, H. M., Rijkeboer, M., Lefebvre, A., Veen, A., Kromkamp, J. C. High-resolution underway measurements of phytoplankton photosynthesis and abundance as an innovative addition to water quality monitoring programs. Ocean Science. 15 (5), 1267-1285 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 177 ספסל העליון FRRf קולציום sp. אפיביונט אצות אפיזואיות אגם ביווה פוטופיזיולוגיה
מדידת פוטופיזיולוגיה של השלב המצורף של <em>קולאקיום</em> sp. על ידי פלואורומטר קצב חזרה מהירה מסוג Cuvette
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter