Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение фотофизиологии прикрепленной стадии Colacium sp. с помощью флуорометра с быстрой частотой повторения типа кюветы

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

Флуорометр с высокой частотой повторения (FRRf) является полезным методом для измерения фотосистемы II фотофизиологии и первичной производительности. Здесь мы описываем протокол измерения PSII фотофизиологии эпизойных водорослей , Colacium sp. на субстратном зоопланктоне с использованием frRf кюветного типа.

Abstract

Флуорометр с высокой частотой повторения (FRRf) является полезным методом для измерения фотосистемы II (PSII) фотофизиологии и первичной производительности. Хотя FRRf может измерять поперечное сечение поглощения PSII (σ PSII), максимальную фотохимическую эффективность (Fv / Fm), эффективную фотохимическую эффективность (Fq'/Fm') и нефотохимическое гашение (NPQNSV) для различных эукариотических водорослей и цианобактерий, почти все исследования FRRf на сегодняшний день сосредоточены на фитопланктоне. Здесь протокол описывает, как измерить фотофизиологию PSII эпизойной водоросли Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), в своей присоединенной стадии (прикрепленной к зоопланктону), с использованием кюветного типа FRRf. Во-первых, мы оценили влияние субстратного зоопланктона (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) на базовую флуоресценцию и σ PSII, Fv/Fm, Fq'/Fm' и NPQNSV планктонного Colacium sp. Чтобы подтвердить эту методологию, мы записали фотофизиологические измерения прикрепленного Colacium sp. на S. mucronata и сравнили эти результаты с его планктонной стадией. Репрезентативные результаты показали, как протокол может определить влияние кальция (Ca) и марганца (Mn) на фотофизиологию Colacium sp. и идентифицировать различные эффекты обогащения Mn между прикрепленной и планктонной стадиями. Наконец, мы обсудим приспособляемость этого протокола к другим перифитным водорослям.

Introduction

Переменная флуоресценция хлорофилла является полезным инструментом для измерения фотофизиологии фотосистемы водорослей II (PSII). Водоросли реагируют на различные экологические стрессы, такие как избыток света и дефицит питательных веществ, изменяя свою фотофизиологию PSII. Флуорометр с быстрой частотой повторения (FRRf) является распространенным методом измерения фотофизиологии PSII1,2 и оценки первичной продуктивности1,3,4, что позволяет контролировать фотофизиологию фитопланктона PSII, а также первичную продуктивность в широких пространственных и временных масштабах5,6,7. FRRf может одновременно измерять поперечное сечение поглощения PSII (σ PSII), концентрацию реакционного центра ([RCII]), максимальную фотохимическую эффективность (Fv / Fm), эффективную фотохимическую эффективность (Fq'/Fm') и нефотохимическую закалку (NPQNSV) (таблица 1). В общем, Fv/Fm и Fq′/Fm′ определяются как активность PSII8, в то время как NPQNSV определяется как относительная теплоотдачаемая энергия9.

Важно отметить, что вспышки одиночного оборота (ST) FRRf полностью уменьшают первичный акцептор электронов хинона, QA, но не пул пластохинонов. И наоборот, вспышки с множественным оборотом (MT) от флуорометра с амплитудной модуляцией импульсов (PAM) могут уменьшить и то, и другое. Метод ST имеет явное преимущество перед методом MT при выявлении возможного происхождения NPQNSV путем одновременного измерения кинетики восстановления Fv/Fm, Fq'/Fm', NPQNSV и σ PSII10. На сегодняшний день коммерчески доступны несколько типов инструментов FRRf, таких как погружной тип, кюветный тип и проточный тип. Погружной тип FRRf позволяет проводить измерения in situ в океанах и озерах, в то время как FRRf кюветного типа подходит для измерения небольших объемов проб. Проточный тип обычно используется для непрерывного измерения фотофизиологии фитопланктона в поверхностных водах.

Учитывая развитие флуорометров PAM, в том числе кюветного типа, для широкого круга субъектов11, флуорометры PAM по-прежнему более распространены, чем FRRfs в исследованиях фотофизиологии водорослей12. Например, хотя структура камеры образца и емкость кюветы между этими инструментами отличаются незначительно, PAM кюветного типа был применен к фитопланктонам13,14,15, бентическим микроводорослям16,17,18, ледяным водорослям19 и эпизойным водорослям20, в то время как FRRf типа кюветы был применен в основном к фитопланктонам21,22,23 и ограниченное число сообществ ледяных водорослей24,25. Учитывая свою эффективность, frRf кюветного типа в равной степени применим к бентическим и эпизойным водорослям. Таким образом, расширение его применения даст значительное представление о фотофизиологии PSII, особенно для менее известной эпизойной фотофизиологии водорослей.

Эпизойные водоросли получили мало внимания, и лишь немногие исследования изучали их фотофизиологию PSII20,26, скорее всего, из-за их незначительной роли в водных пищевых сетях27,28. Однако эпибионты, включая эпизойные водоросли, могут положительно влиять на динамику сообщества зоопланктона, такую как увеличение показателей размножения и выживаемости29,30, а также негативно влиять на процессы, такие как увеличение скорости погружения29,31 и уязвимость к визуальным хищникам32,33,34,35,36 . Поэтому изучение экологических и биологических факторов, контролирующих динамику эпибионтов в сообществах зоопланктона, имеет решающее значение.

Среди эпизойных водорослей Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) представляет собой распространенную пресноводную группу водорослей32,37,38,39 с различными стадиями жизни, включая присоединенные (рисунок 1A-D), неподвижные планктонные (рисунок 1E,F) и подвижные планктонные стадии40,41 . Во время неподвижной планктонной стадии клетки живут как одноклеточные планктоны, агрегированные колонии или однослойные листовые колонии, покрытые слизью42. В присоединенной стадии Colacium sp. использует слизь, выведенную из переднего конца клетки37,39,41, для прикрепления к субстратным организмам (базибионтам), в частности микрокрустацианам41,43. Их жизненный цикл также включает в себя отделение от линького экзоскелета или мертвого базибоонта и плавание с их жгутиками, чтобы найти другой субстратный организм39. Как планктонные, так и прикрепленные стадии могут увеличить размер своей популяции с помощью mitosis40. Хотя предполагается, что их прикрепленная стадия является эволюционной чертой для сбора ресурсов, таких как свет44 и микроэлементы41,45,46, или в качестве стратегии дисперсии27, имеется мало экспериментальных данных об этих аспектах37,41,44, а ключевые механизмы прикрепления в значительной степени неизвестны. Например, Росовски и Кугренс ожидали, что Colacium получает марганец (Mn) из субстрата copepods41, сконцентрированного в экзоскелете47.

Здесь мы описываем, как измерить фотофизиологию PSII планктонных водорослей и связанный с этим метод применения для нацеливания на прикрепленные водоросли (присоединение к зоопланктону) с помощью клеток Colacium sp. с использованием FRRf типа кюветы. Мы используем систему Act2, оснащенную тремя светодиодами (СВЕТОДИОДАМИ), которые обеспечивают энергию возбуждения вспышки с центром в 444 нм, 512 нм и 633 нм48. Здесь 444 нм (синий) соответствует пику поглощения хрофилла a (Chl-a), в то время как 512 нм (зеленый) и 633 нм (оранжевый) соответствуют пикам поглощения фикоэритрина и фикоцианина соответственно. Пик обнаружения флуоресцентного сигнала составляет 682 нм с половинной полосой пропускания 30 нм. Поскольку трудно найти планктонную стадию Colacium sp. в естественных средах, их прикрепленная стадия была собрана для экспериментов. Среди многочисленных субстратных организмов, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Рисунок 1A, B, G) является одним из самых простых в обращении из-за их медленной скорости плавания, большого размера тела (400-650 мкм) и уникального поведения (висящего вниз головой на поверхности воды). Поэтому этот протокол использует Colacium sp., прикрепленный к S. mucronata, в качестве примера системы Colacium-basibiont. Чтобы избежать флуоресценции, полученной из содержимого кишечника, S. mucronata голодали. Поскольку в предыдущем исследовании сообщалось, что флуоресцентный сигнал от содержимого кишечника (проглоченных водорослей) показывает пятикратное снижение через 40 мин49, мы ожидали, что 90-минутного голодания будет достаточно, чтобы свести к минимуму возможность флуоресценции содержимого кишечника, влияющей на измерение FRRf с минимальными эффектами экспериментального стресса для Colacium sp., такими как дефицит питательных веществ. Кроме того, этот протокол был применен для уточнения механизма присоединения Colacium sp. и определения того, как два металла, кальций (Ca) и марганец (Mn), влияют на фотофизиологию как планктонной, так и прикрепленной стадий. Кальций играет ключевую роль в путях фотосинтеза50 несколькими способами, и оба металла необходимы для создания кислород-эволюционирующих комплексов PSII51. Поскольку кальций и марганец высоко сконцентрированы в панцире ракообразных zooplankton47, мы предполагаем, что фотофизиология Colacium sp. может более заметно реагировать на обогащение Ca и Mn во время планктонной стадии, если эта стадия жизни получает эти элементы от S. mucronata во время прикрепленной стадии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Отбор проб

  1. Соберите озерную воду с поверхности ведром. Для нацеливания Colacium sp. прикрепляют к S. mucronata (рисунок 1A-C) фильтруют 0,5-10 л озерной воды с использованием 100 мкм нейлоновой сетки 52.
    ПРИМЕЧАНИЕ: S. mucronata часто плотно накапливаются в мелкой, эвтрофной, мутной воде, например, среди тростниковых (фрагмитовых) областей.
  2. Храните концентрированные образцы в пластиковых бутылках по 500 мл с 350 мл озерной воды. Хранить в темных условиях.
  3. В лаборатории налейте образец воды в стакан объемом 500 мл и дайте ему отстояться в течение нескольких минут.
  4. Отфильтруйте воду озера через фильтр размером поры 0,2 мкм.
  5. Заберите S. Мукроната особей использует пипетку под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении. Выполнить идентификацию видов по Błędzki и Rybak53.
  6. Переложите их в каплю 0,2-мкм фильтрованной озерной воды (FLW), помещенную на стеклянную горку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С. Мукроната может выплывать на поверхность или прикрепляться к стенке стакана.
  7. Проверьте S. мукроната при световой микроскопии.
  8. Мойка С. Мукроната особей, использующих FLW (3 капли и более) для предотвращения загрязнения другими организмами (рисунок 2).
  9. Сохранить S. мукроната при температуре in situ в камере роста под 40 мкмоль фотон·м−2·с−1.

2. Эффекты S . мукроната на исходной флуоресценции

  1. С. выращивание мукроната
    1. Подберите S. mucronata особей с помощью пипетки под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении и промывайте с помощью FLW, как на шаге 1.8.
    2. Аэрируйте водопроводную воду с помощью электрического воздушного насоса через воздушный камень в течение не менее 1 недели. Налейте 300 мл газированной водопроводной воды в стеклянную банку объемом 350 мл.
    3. Кормят хлореллой (1 мг C·L−1) и поддерживают при 20 °C при фотоне 40 мкмоль·м−2·с−1 в камере роста.
    4. Примерно через 14 дней подберите 5-30 особей с помощью пипетки под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении и привите их в 300 мл чистой, газированной водопроводной воды, чтобы сохранить среду свежей.
  2. Настройка FRRf
    1. Запустите программное обеспечение Act2Run.
    2. Перейдите на вкладку «Параметры» и выберите Act2 FLC (белые светодиоды) в режиме работы , чтобы установить цвет актинических светодиодов.
    3. Нажмите на значение Dark на шаге 1 настроек кривой флуоресцентного света в главном окне и введите 30, чтобы установить продолжительность темного периода (рисунок 3A).
    4. Нажмите на комбинацию светодиодов B, C и D , чтобы выключить зеленый и оранжевый светодиоды (рисунок 3C).
    5. Нажмите на значение Fets и Pitch в sat и введите 100 и 2 соответственно, чтобы установить количество и шаг вспышки в фазе насыщения (рисунок 3D).
    6. Нажмите на значение Fets и Pitch в Rel и введите 40 и 60 соответственно, чтобы установить количество и шаг вспышки в фазе релаксации (рисунок 3E).
    7. Активируйте насос с водяной рубашкой, щелкнув Во время FLC (рисунок 3F), чтобы контролировать температуру образца во время измерения.
    8. Активируйте, щелкнув Auto-LED и Auto-PMT (рисунок 3F).
    9. Нажмите Синхронизировать , чтобы подключить FRRf-Act2.
  3. Измерения FRRf
    1. Чтобы изучить влияние особей зоопланктона на базовую флуоресценцию, подготовьте взрослого S. мукроната (размер тела 400-650 мкм) из культуры на этапах 2.1.1-2.1.4 без каких-либо прикрепленных организмов.
    2. Чтобы избежать флуоресценции содержимого кишечника, голодайте людей в FLW при 20 ° C в течение не менее 90 минут.
    3. Налейте 1,5 мл FLW в кювету. Подбирайте 0, 1, 5 и 10 S. mucronata особей с помощью пипетки под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении.
    4. Трансфер С. мукронат особей в кювету добавляют FLW, чтобы довести образец до 2 мл.
    5. Акклиматизируйте при слабом освещении (1-10 мкмоль фотон·м−2·с−1) при 20 °C в течение 15 мин до измерения FRRf.
    6. Нажмите на Act2 Run , чтобы начать измерение. Повторите измерения >3 раза на образец.
    7. Считывание значения Fo с результирующего графика (рисунок 4).

3. Влияние субстрата организма на флуоресценцию Chl-a

  1. Выращивание колациума sp.
    1. Подготовьте FLW и AF-6 medium54 для выращивания (таблица 2).
    2. Собирают Colacium sp., прикрепленный к S. mucronata , как на этапах 1.1 и 1.2, и хранят при температуре in situ в камере роста.
    3. Подберите Colacium sp. линяющим панцирем (рисунок 1D) с помощью пипетки под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении. Мойте их с помощью FLW, как на шаге 1.8.
    4. Асептически инокулируют Colacium sp. и среду AF-6 в стеклянной трубке объемом 10 мл на чистом стенде.
    5. Поддерживать культуру при температуре in situ ниже 200 мкмоль фотонов·м−2·с−1 в камере роста. Осторожно встряхните стеклянную трубку вручную, по крайней мере, один раз в день, чтобы предотвратить образование клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить эффект затухания агрегированных колоний как можно ниже, проверьте колонии под микроскопом перед измерением FRRf. Агрегация клеток может вызвать плотные колонии и повлиять на фотофизиологию водорослей55.
  2. Измерения FRRf
    1. Чтобы изучить влияние особей зоопланктона на флуоресценцию Chl-a от Colacium sp., подготовьте взрослую особь S. мукроната (размер тела 400-650 мкм) без каких-либо прикрепленных организмов.
    2. Чтобы избежать флуоресценции содержимого кишечника, голодайте людей в FLW в течение не менее 90 минут.
    3. Настройте флуорометр с быстрой частотой повторения (FRRf) типа кюветы.
    4. Налейте 1,5 мл субвыборки прекультурного Colacium sp. в кювету. Передача 0, 5, 10 и 15 S. mucronata особей в эти кюветы добавляют 2 мкм фильтрованной среды, чтобы довести образец до 2 мл.
    5. Акклиматизируйте при слабом освещении (1-10 мкмоль фотон·м−2·с−1) при 20 °C в течение 15 мин перед измерением FRRf.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание температуры инкубации образцов во время измерений
    6. Нажмите на Act2 Run , чтобы начать измерение. Повторите измерения >3 раза на образец.
    7. Считывание значений FO и Fm из результирующей диаграммы (рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте значение RσPSII (таблица 1), которое показывает, находится ли мощность светодиода в оптимальном диапазоне для правильной оценки параметров PSII. При активации auto-LED система Act2run управляет мощностью светодиода для достижения оптимального диапазона RσPSII (0,042-0,064). Экспериментальное пороговое значение RσPSII было определено на уровне 0,03 и 0,08 в предыдущем исследовании48.
    8. Чтобы исправить базовую флуоресценцию22, фильтруйте культуральную среду с помощью фильтра размером пор 0,2 мкм и измеряйте флуоресценцию. Вычтите FO базовой выборки из FO и Fm Colacium sp. или измените значение исправления Blank в параметрах на вкладке Параметры.

4. Фотофизиология Colacium sp. (присоединенная стадия)

  1. Изолируйте особей S. mucronata с Colacium sp. с помощью пипетки под оптическим микроскопом.
  2. Мойка С. мукроната с использованием FLW, как на шаге 1.8.
  3. Трансфер С. мукроната в 100 мл ФЛВ. Для голодания держите в темных условиях при температуре in situ в течение 90 мин.
  4. Налейте 1,5 мл FLW в кювету.
  5. Передача ~10 С. mucronata особей с Colacium sp. в кювету. Для измерений необходимо более 100 клеток колациума на 2 мл. Добавьте FLW, чтобы довести образец до 2 мл.
  6. Акклиматизируйте при слабом освещении (1-10 мкмоль фотонов·м−2·с−1) при температуре in situ в течение 15 мин. Измерьте флуоресценцию Chl-a , как на этапах 3.2.6-3.2.8.
  7. Чтобы перечислить количество прикрепленных клеток, зафиксируйте образец глутаровым альдегидом (2% конечного объема) после измерения FRRf. Делайте снимки на нескольких фокусных глубинах и положениях S. мукроната под световым микроскопом.

5. Фотофизиология Colacium sp. (планктонная стадия)

  1. Культивируйте отобранный образец Colacium sp. в среде AF-6 при температуре in situ , как на этапах 3.1.1-3.1.5.
  2. Для стационарной фазы возьмите 2 мл культивируемого Colacium sp. и перелейте в кювету.
  3. Акклиматизируйте при слабом освещении (1-10 мкмоль фотонов·м−2·с−1) при температуре in situ в течение 15 мин. Измерьте флуоресценцию Chl-a , как на этапах 3.2.6-3.2.8.

6. Влияние добавления Ca и Mn на фотофизиологию Colacium sp.

  1. Воздействие на прикрепленную сцену
    1. Изолируйте особей S. mucronata с Colacium sp. с помощью пипетки под оптическим микроскопом. Мойте с помощью FLW, как в шаге 1.8.
    2. Переведите по шесть особей в 12 стеклянных стаканов с 30 мл FLW. Убедитесь, что каждый стакан содержит >100 клеток Colacium sp.
    3. Добавить 200 мкмоль· L−1 CaCl2· H2O (обработка Ca), 40 мкмоль· L−1 MnCl4 (обработка Mn), или сверхчистая вода (контроль) на каждый стакан. Инкубируют образцы при фотоне 200 мкмоль·м−2 ·с−1 при температуре in situ в камере роста.
    4. Через 3 ч и 21 ч переведите всех особей и линьку кожи в кювету с 2 мл среды.
    5. Чтобы изучить быструю реакцию на увеличение света, нажмите вверх периодов 8 актинических световых шагов и введите 20 (рисунок 3A), чтобы установить продолжительность каждого шага в 20 с. Чтобы установить ступенчатый актинический свет как 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 и 200 мкмоль фотон·м−2·с−1, нажмите на High E и Step Up и измените значения на 200 и 34 соответственно (рисунок 3B).
    6. После 15 мин темной акклиматизации измерьте флуоресценцию Chl-a каждого образца, аналогичную шагам 3.2.6-3.2.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что значения RσPSII и RσPSII находятся в оптимальном диапазоне (0,03-0,08)48.
  2. Влияние на планктонную стадию
    1. Культивируйте отобранный образец Colacium sp. в среде AF-6 при температуре in situ , как на этапах 3.1.1-3.1.5.
    2. Переведите культивируемый Colacium sp. в FLW и акклиматизируйте при температуре in situ менее 200 мкмоль фотонов·м−2·с−1 в течение 3 дней.
    3. Переложить 1 мл акклиматизированных образцов в три стеклянных флакона с 10 мл ФЛВ.
    4. Добавить 200 мкмоль· L−1 CaCl2· H2O (обработка Ca), 40 мкмоль· L−1 MnCl3 (обработка Mn), или сверхчистая вода (контрольная) во флаконы. Инкубируют образцы при фотоне 200 мкмоль·м−2·с−1 при температуре in situ в камере роста.
    5. Через 3 ч и 21 ч измерьте флуоресценцию Chl-a каждого образца, как показано на этапах 3.2.6-3.2.8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Не было выявлено значимого влияния исходной флуоресценции (рис. 5) или флуоресценции Chl-a (Рисунок 6) У S. mucronata до 5 особей (inds.) mL−1. Однако Fv/Fm и NPQNSV были значительно затронуты, когда S. mucronata составлял 7,5 inds·mL−1. Поэтому для измерения фотофизиологии Colacium sp. на присоединенной стадии мы выбрали S. mucronata с более высокой нагрузкой Colacium sp., чтобы достичь достаточного количества Colacium sp. (>50 клеток·mL−1) и низкого количества S. mucronata (≤5 inds·mL−1) в кювете.

В таблице 3 показаны сезонные колебания в фотофизиологии Colacium sp. во время прикрепленной стадии. Хотя температура отбора проб варьировалась, их фотофизиология оставалась относительно постоянной. σ PSII варьировался от 3,42 нм2 до 3,76 нм2 (среднее значение 3,60 нм2), Fv/Fm варьировалось от 0,52 до 0,60 (среднее значение 0,55), а NPQNSV варьировалось от 0,66 до 0,85 (среднее значение 0,82). Чтобы подтвердить эти результаты, мы дополнительно исследовали вариации фотофизиологии Colacium sp. во время планктонной стадии для стационарной фазы в среде AF-6 (таблица 4). Средние Fv/Fm и NPQNSV для прикрепленной стадии были аналогичны таковым планктонной стадии при инкубации в среде AF-6.

Чтобы определить влияние Ca и Mn на фотофизиологию Colacium sp. как на прикрепленной, так и на планктонной стадиях, мы провели эксперименты по обогащению Ca и Mn. Образцы были взяты из тростникового района озера Бива 7 мая 2021 года. Для присоединенной стадии Colacium sp. в темных условиях не было существенной разницы в фотофизиологических параметрах среди методов лечения, за исключением NPQNSV между обработками Mn и Ca через 3 ч, где Ca < Mn (рисунок 7A, C, E). Кроме того, ответы σ PSII', Fq'/Fm' и NPQNSV на увеличение света на присоединенной стадии не показали четких различий между методами лечения (рисунок 8A,C,E и рисунок 9A,C,E). Тем не менее, NPQNSV, как правило, был ниже при лечении Ca, чем контроль при низкой интенсивности света через 21 ч (11 и 25 мкмоль фотон·м−2·с−1, рисунок 9Е). Для планктонной стадии σ PSII был значительно ниже в Mn, чем Ca обработки через 3 ч (рисунок 7B). Fq′/Fm′ был значительно выше, но NPQNSV был ниже при лечении Mn, чем в контроле через 21 ч (рисунок 7D,F). При увеличении света Mn имел тенденцию к снижению σ PSII и увеличению Fq'/Fm′ во время планктонной стадии по сравнению с контролем через 3 ч (рисунок 8D). Аналогичным образом, Mn значительно снижал NPQNSV во время планктонной стадии по сравнению с контролем через 21 ч (рисунок 9F). Подобно присоединенной стадии, кальций незначительно улучшал NPQNSV для планктонной стадии при увеличении света (рисунок 9F). Однако Ca уменьшал Fq'/Fm′ и увеличивал NPQNSV для планктонной стадии по сравнению с обработкой Mn под 44-200 мкмоль фотон·м−2·с−1 через 3 ч (рисунок 8D,F).

Figure 1
Рисунок 1: Colacium sp. и вещество организма Scapholeberis mucronata. (А) Инфицированный S. mucronata. (B) Инфицированный S. mucronata фиксируется глутаровым альдегидом. (C) Прикрепленные клетки Colacium к живой S. mucronata. (D) Прикрепленные клетки Colacium на линьке панциря. (E, F) Colacium sp. планктонной (пальмелла) стадии. (G) Неинфицированный S. mucronata. Стрелки указывают на клетки колациума. Шкала: 200 мкм (A, B и G), 10 мкм (C, E и F) и 100 мкм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Промывка зоопланктона путем пипетки под фильтрованной озерной водой (FLW). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Пользовательский интерфейс программного обеспечения Act2Run. (A) Время воздействия на каждый шаг актинического света; B) число ступеней и поток фотонов актинического света; c) сочетание длин волны возбуждения; D) последовательность насыщения и релаксации флешлетов; e) частоты и интенсивность водяных рубашки и насосов для смешивания проб; (F) Поток фотонов вспышки возбуждения при 444 (здесь обозначается как 450), 512 (530) и 633 нм (624), напряжение фотоумножителя трубки (PMT), а также реплики и интервал последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Флуоресцентное считывание образца водорослей в программном обеспечении Act2Run. Красная и синяя линии обозначают необработанный флуоресцентный сигнал последовательностью вспышек и кривых, вписывающихся как в фазы насыщения, так и в фазы релаксации соответственно. Для получения более подробной информации см. Kolber et al.2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Влияние плотности S. mucronata на исходную флуоресценцию. Маленькие точки представляют реплики (n = 3). Также показаны результаты теста ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Влияние плотностей S. mucronata на (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm и (D) NPQNSV для Colacium sp. во время планктонной стадии. Маленькие точки представляют реплики (n = 3). Colacium sp. культивировали в среде AF-6. Также представлены результаты пост-хок теста ANOVA и Tukey. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Ответы (A,B) поперечного сечения поглощения, (C,D) фотохимии PSII и (E,F) нефотохимического гашения (A,C,E) присоединенной стадии и (B,D,F) планктонной стадии Colacium sp. через 3 ч и 21 ч после добавления Ca и Mn. Маленькие точки представляют реплики (n = 4). Также представлены результаты пост-хок теста ANOVA и Tukey. * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Быстрые световые реакции (A, B) поперечного сечения поглощения, (C,D) фотохимии PSII и (E,F) нефотохимического гашения Colacium sp. в прикрепленной и планктонной стадиях по протоколу ступенчатого света через 3 ч после добавления Ca и Mn. C, контроль; Са, 200 мкМ Са; Mn, 40 мкМ Mn. Значительные различия между (a) C и Ca, (b) C и Mn и (c) Ca и Mn при каждом потоке PAR, при этом уровень значимости p < 0,05 показан на каждой панели. Панель ошибок, среднее значение SD (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Быстрые световые реакции (A,B) поперечного сечения поглощения, (C,D) фотохимии PSII и (E,F) нефотохимического гашения Colacium sp. в присоединенной и планктонной стадиях к ступенчатому протоколу света через 21 ч после добавления Ca и Mn. C, контроль; Са, 200 мкМ Са; Mn, 40 мкМ Mn. Значительные различия между (a) C и Ca, (b) C и Mn и (c) Ca и Mn при каждом потоке PAR, при этом уровень значимости p < 0,05 показан на каждой панели. Панель ошибок, среднее значение SD (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Срок Определение Единиц
Базовая флуоресценция Значение Fo без флуоресценции Chl-a
F' Флуоресценция при нулевой вспышке измерения одного оборота при C>0
Фо (ʹ) Минимальный выход флуоресценции PSII (при фоновом освещении) при нулевой вспышке
Фв (ʹ) Fm(ʹ) − Fo(ʹ)
Фм (ʹ) Максимальный выход флуоресценции PSII (при фоновом освещении)
Фв/Фм Максимальная фотохимическая эффективность PSII в темноте
Fqʹ/Fmʹ Максимальная фотохимическая эффективность PSII при фоновом освещении, (Fmʹ− F)/(Fmʹ)
NPQNSV Нормализованная закалка Штерна-Волмера, FOʹ/(Fmʹ − FOʹ)
[РКИИ] Концентрация реакционного центра
RσPSII (ʹ) Вероятность закрытия RCII во время первой вспышки фазы насыщения одного оборота (при фоновом освещении)
σ PSII (ʹ) Функциональное поперечное сечение поглощения PSII для вспышки возбуждения (при фоновом освещении) нм2

Таблица 1: Термины, используемые в настоящем протоколе.

Компонент Количество
НаНО3 140 мг· Л−1
NH4NO3 22 мг· Л−1
МгСО4·7Н2О 30 мг· Л−1
Х2ПО4 10 мг· Л−1
К2ХПО4 5 мг· Л−1
CaCl2·2H2O 10 мг· Л−1
CaCO3 10 мг· Л−1
Фе-цитрат* 2 мг· Л−1
Лимонная кислота* 2 мг· Л−1
Биотин 0,002 мг· Л−1
Вит.B 1 0,01 мг· Л−1
Вит.B 6 0,001 мг· Л−1
Вит.B 12 0,001 мг· Л−1
Следы металлов 1 мл·л−1
(FeCl3·6H2O) (1,0 мг·мл−1)
(MnCl3·4H2O) (0,4 мг·мл−1)
(ZnSO4·7H2O) (0,005 мг·мл−1)
(КоКл2·6Н2О) (0,002 мг·мл−1)
(Na2MoO4) (0,004 мг·мл−1)
(Na2-ЭДТА) (7,5 мг·мл−1)

Таблица 2: Рецепт для среды AF-6. Отрегулируйте pH до 6,6. Растворить Fe-цитрат и лимонную кислоту в теплом H2O отдельно и добавить HCl (1 мл·л−1) после смешивания обоих реагентов. Содержание следовых металлов показано в скобках.

Дата отбора проб Образец No. Температура воды.
(°С) 		Плотность S. mucronata
(инд.· мл−1)		 Плотность клеток Colacium sp.
(инд.· мл−1)		 σ PSII (нм2) Фв/Фм NPQNSV
Апрель 27/2020 No 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
ГП 0.22 0.01 0.04
Май 21/2020 No 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
ГП 0.16 0.02 0.06
No 3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
ГП 0.09 0.01 0.02
No 4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
ГП 0.12 0.00 0.02
Июнь 18/2020 No 5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
ГП 0.16 0.02 0.06
No 6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
ГП 0.09 0.01 0.02
No 7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
ГП 0.12 0.00 0.02
Июль 20/2020 No 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
ГП 0.10 0.00 0.00
Значить 3.60 0.55 0.82
С.Д. 0.120349 0.03 0.10

Таблица 3: Фотофизиология Colacium sp. прилагается к S. mucronata.

Дата отбора проб Образец No. Терпимая Температура роста (°C) σ PSII (нм2) Фв/Фм NPQNSV
Май 21/2020 No 1 АФ-6 19.4 2.72 0.65 0.53
ГП 0.03 0.00 0.01
Июнь 18/2020 No 2 АФ-6 22.4 3.07 0.55 0.84
ГП 0.08 0.02 0.07
Июль 20/2020 No 3 АФ-6 27.5 2.90 0.58 0.73
ГП 0.06 0.01 0.02
Значить 2.90 0.59 0.70
С.Д. 0.18 0.05 0.16

Таблица 4: Фотофизиология Colacium sp. планктонной стадии. Каждый образец измеряли на стационарной фазе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол впервые продемонстрировал, что фотофизиология Colacium sp. во время прикрепленной стадии в естественной среде сопоставима с его планктонной стадией в среде AF-6. Кроме того, кишечное содержимое голодающего S. mucronata не влияло на исходный уровень и флуоресценцию Chl-a, когда плотность составляла ≤5 inds·mL−1 (рисунок 5 и рисунок 6). Эти результаты свидетельствуют о том, что этот протокол может измерять фотофизиологию Colacium sp. во время прикрепленной стадии без коррекции при низком содержании субстрата организма. Однако результаты этапов 3.2.1-3.2.8 показали, что наибольшее содержание S. mucronata существенно повлияло на Fv/Fm и NPQNSV, но не на FO и σ PSII (рисунок 4). Здесь возможно, что более высокая плотность организма усугубила физическую нагрузку на людей Colacium sp. и впоследствии снизила фотосинтетическую активность. Для измерений при высоком обилии субстратных организмов или других видов влияние плотности субстратных организмов на исходный уровень и флуоресценцию Chl-a требует дополнительного внимания.

FRRf были использованы для изучения влияния манипуляций питательными веществами на линейный поток электронов и нефотохимическое закаление фитопланктона22,56,57. Первичные результаты показывают, что обогащение Ca и Mn значительно различалось между стадиями жизни Colacium sp. (рисунок 7, рисунок 8 и рисунок 9). В частности, марганец явно улучшал (максимальный) фотохимический выход PSII (Fv/Fm и Fq′/Fm') и уменьшал рассеивание тепла (NPQNSV)50 планктонных стадий в темных (рисунок 7D,F) и световых условиях (рис. 8D,F и рисунок 9D,F). Эти результаты могут быть связаны с уменьшением размера антенны на PSII, σ PSII и σ PSII' (рисунок 7B и рисунок 8B), что снижает избыточное поглощение света58,59. Измерение размера антенны в дополнение к потоку энергии между комплексами PSII позволит более точно измерить реакцию водорослей10. Этот протокол также позволяет исследовать ограничения фотосинтеза другими ресурсами. Например, ограничения азота и фосфора были изучены в различных сообществах фитопланктона, но не в эпизойных водорослях, несмотря на прогнозируемое воздействие на Colacium41 и морские эпизойные диатомовые водоросли60,61. В дополнение к питательным веществам, световая среда может дополнительно влиять на распространение эпизойных водорослей44.

Как показано на рисунке 7, рисунке 8 и рисунке 9, FRRf кюветного типа позволяет нам одновременно изучать питательные и световые эффекты без длительного времени инкубации и усилий измерения. Этот ступенчатый световой протокол (шаг 6.1.5) также может рисовать кривые быстрого света относительных скоростей переноса электронов (rETR = Fq′/Fm′× свет) против света в качестве аналога для производства и кривых блеска62. Однако, хотя линейный поток электронов в PSII может быть оценен по фотофизиологическим параметрам FRRf, он не обязательно аналогичен скорости фиксации углерода63,64. Для оценки первичного производства на основе углерода при оценке сообществ субъектов следует изучить потребность в электронах на фиксацию CO2 (Фe, C), которая может изменяться во времени и пространстве5,48.

Если планктоновая сеть забита мусором, предварительно отрежируйте более крупной сеткой, такой как 5-миллиметровая сетка, или соберите зоопланктоны непосредственно из озерной воды с помощью пипетки без фильтрации. Следует отметить, что некоторые повреждения могут произойти с прикрепленными водорослями, даже если фильтрация проводится осторожно с использованием относительно большого (200 мкм) размера ячеек. Хотя результаты показывают, что стандартное отклонение параметров PSII было небольшим (таблица 3), а средние значения параметров были очень похожи на значения культивируемой планктонной стадии (таблица 4), отбор проб без фильтрации может быть идеальным.

Другим ограничением этого исследования было получение σ PSII. Актинический свет и затухание флуоресценции Chl-a могут оказывать значительное влияние/искажение на FRRfs, который опирается на оптически тонкие образцы для точного определения σ PSII65. Хотя мы показали, что S. mucronata не влияет на σ PSII планктонных клеток Colacium, это следует исследовать в связи с σ PSII прикрепленных клеток Colacium. Кроме того, для оценки σ PSII in situ66 потребуется спектральный поправочный коэффициент (SCF), поскольку длина волны возбуждения системы ACT2 (444 нм) отличается от спектрального распределения световой среды in situ. В общем, метод фильтровальной прокладки используется для измерения Chl-определенного спектра поглощения для расчета SCF. Эта процедура необходима для оценки первичной продуктивности водорослей по FRRfs. Поскольку мы не смогли собрать достаточное количество прикрепленных клеток Colacium в течение периода исследования, Chl-специфический спектр поглощения должен быть изучен в будущих исследованиях.

Реализация FRRf типа кюветы должна зависеть от размера субстрата, так как перифитные водоросли требуют прикрепления субстрата. Например, исследования водорослей на неразрушимых веществах, таких как горные породы67, более крупные организмы26,68 или симбиотические водоросли, включая Symbiodinium, связанный с твердыми кораллами10,69,70, могут потребовать погружного типа FRRf69. И наоборот, если базибионт достаточно мал, чтобы подвешивать себя в кювете, FRRf типа кюветы может быть достаточно в дополнение к PAM типа кюветы, такой как бентические водоросли16,17,18. Действительно, недавние исследования изучили FRRf типа кюветы для измерения фотофизиологии ледяных водорослей24,25. Кроме того, включение вспышки возбуждения на 512 и 633 нм позволяет применять цианобактерии с различными антенными пигментами PSII, фикоэритринами и фикоцианинами и, следовательно, различными пиками поглощения с Chl-a71. Поскольку современные модели FRRf, включающие длины волн мультивозбуждения, являются полезными инструментами для изучения фотофизиологии и продуктивности цианобактерий7,66,72, они должны быть полезными методами оценки бентических цианобактерий, если влияние толщины образца на фотофизиологические параметры будет улучшено65 . В будущих исследованиях FRRf должны быть нацелены на более широкий круг субъектных организмов, чтобы пролить дальнейшее понимание сложных механизмов фотофизиологии водорослей в различных средах обитания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не могут раскрывать информацию.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Фондом совместных исследований префектуры Сига под названием «Исследование качества воды и среды дна озера для защиты надежности водной среды» в рамках японского гранта на региональное возрождение и Фонда исследований и развития технологий в области окружающей среды (No 5-1607) министерства окружающей среды Японии. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Авторы хотели бы поблагодарить Enago (www.enago.jp) за обзор английского языка.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolber, Z., Falkowski, P. G. Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1646-1665 (1993).
  2. Kolber, Z. S., Prášil, O., Falkowski, P. G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1367 (1), 88-106 (1998).
  3. Oxborough, K., Moore, C. M., Suggett, D. J., Lawson, T., Chan, H. G., Geider, R. J. Direct estimation of functional PSII reaction center concentration and PSII electron flux on a volume basis: a new approach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry (FRRf) data. Limnology and Oceanography: Methods. 10 (3), 142-154 (2012).
  4. Smyth, T. J., Pemberton, K. L., Aiken, J., Geider, R. J. A methodology to determine primary production and phytoplankton photosynthetic parameters from fast repetition rate fluorometry. Journal of Plankton Research. 26 (11), 1337-1350 (2004).
  5. Lawrenz, E., et al. Predicting the electron requirement for carbon fixation in seas and oceans. PLoS ONE. 8 (3), 58137 (2013).
  6. Zhu, Y., et al. Relationship between light, community composition and the electron requirement for carbon fixation in natural phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 580, 83-100 (2017).
  7. Schuback, N., Tortell, P. D. Diurnal regulation of photosynthetic light absorption, electron transport and carbon fixation in two contrasting oceanic environments. Biogeosciences. 16 (7), 1381-1399 (2019).
  8. Cosgrove, J., Borowitzka, M. A. Chlorophyll fluorescence terminology: an introduction. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 1-17 (2010).
  9. McKew, B. A., et al. The trade-off between the light-harvesting and photoprotective functions of fucoxanthin-chlorophyll proteins dominates light acclimation in Emiliania huxleyi (clone CCMP 1516). New Phytologist. 200 (1), 74-85 (2013).
  10. Warner, M. E., Lesser, M. P., Ralph, P. J. Chlorophyll fluorescence in reef building corals. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 209-222 (2010).
  11. Bhagooli, R., et al. Chlorophyll fluorescence - A tool to assess photosynthetic performance and stress photophysiology in symbiotic marine invertebrates and seaplants. Marine Pollution Bulletin. 165, 112059 (2021).
  12. Zavafer, A., Labeeuw, L., Mancilla, C. Global trends of usage of chlorophyll fluorescence and projections for the next decade. Plant Phenomics. 2020, 6293145 (2020).
  13. Goto, N., Tanaka, Y., Mitamura, O. Relationships between carbon flow through freshwater phytoplankton and environmental factors in Lake Biwa, Japan. Fundamental and Applied Limnology/Archiv für Hydrobiologie. 184 (4), 261-275 (2014).
  14. Napoléon, C., Raimbault, V., Claquin, P. Influence of nutrient stress on the relationships between PAM measurements and carbon incorporation in four phytoplankton species. PLOS ONE. 8 (6), 66423 (2013).
  15. Morris, E. P., Kromkamp, J. C. Influence of temperature on the relationship between oxygen- and fluorescence-based estimates of photosynthetic parameters in a marine benthic diatom (Cylindrotheca closterium). European Journal of Phycology. 38 (2), 133-142 (2003).
  16. Fraga, S., Rodríguez, F., Bravo, I., Zapata, M., Marañón, E. Review of the main ecological features affecting benthic dinoflagellate blooms. Cryptogamie, Algologie. 33 (2), 171-179 (2012).
  17. McMinn, A., et al. Quantum yield of the marine benthic microflora of near-shore coastal Penang, Malaysia. Marine and Freshwater Research. 56 (7), 1047-1053 (2005).
  18. Salleh, S., McMinn, A. The effects of temperature on the photosynthetic parameters and recovery of two temperate benthic microalgae, Amphora cf. coffeaeformis and Cocconeis cf. sublittoralis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 47 (6), 1413-1424 (2011).
  19. McMinn, A., Pankowskii, A., Ashworth, C., Bhagooli, R., Ralph, P., Ryan, K. In situ net primary productivity and photosynthesis of Antarctic sea ice algal, phytoplankton and benthic algal communities. Marine Biology. 157 (6), 1345-1356 (2010).
  20. Garbary, D. J., Bird, C. J., Kim, K. Y. Sporocladopsis jackii, sp. nov. (Chroolepidaceae, chlorophyta): a new species from eastern Canada and Maine symbiotic with the mud snail, Ilyanassa obsoleta (Gastropoda). Rhodora. 107 (929), 52-68 (2005).
  21. Suggett, D. J., Oxborough, K., Baker, N. R., MacIntyre, H. L., Kana, T. M., Geider, R. J. Fast repetition rate and pulse amplitude modulation chlorophyll a fluorescence measurements for assessment of photosynthetic electron transport in marine phytoplankton. European Journal of Phycology. 38 (4), 371-384 (2003).
  22. Hughes, D. J., et al. Impact of nitrogen availability upon the electron requirement for carbon fixation in Australian coastal phytoplankton communities. Limnology and Oceanography. 63 (5), 1891-1910 (2018).
  23. Melrose, D. C., Oviatt, C. A., O'Reilly, J. E., Berman, M. S. Comparisons of fast repetition rate fluorescence estimated primary production and 14C uptake by phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 311, 37-46 (2006).
  24. Yoshida, K., Seger, A., Kennedy, F., McMinn, A., Suzuki, K. Freezing, melting, and light stress on the photophysiology of ice algae: ex situ incubation of the ice algal diatom Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae) using an ice tank. Journal of Phycology. 56 (5), 1323-1338 (2020).
  25. Selz, V., et al. Ice algal communities in the Chukchi and Beaufort Seas in spring and early summer: composition, distribution, and coupling with phytoplankton assemblages. Limnology and Oceanography. 63 (3), 1109-1133 (2018).
  26. Falasco, E., Bo, T., Ghia, D., Gruppuso, L., Bona, F., Fenoglio, S. Diatoms prefer strangers: non-indigenous crayfish host completely different epizoic algal diatom communities from sympatric native species. Biological Invasions. 20 (10), 2767-2776 (2018).
  27. Møhlenberg, F., Kaas, H. Colacium vesiculosum Ehrenberg (Euglenophyceae), infestation of planktonic copepods in the Western Baltic. Ophelia. 31 (2), 125-132 (1990).
  28. Zalocar, Y., Frutos, S. M., Casco, S. L., Forastier, M. E., Vallejos, S. V. Prevalence of Colacium vesiculosum (Colaciales: Euglenophyceae) on planktonic crustaceans in a subtropical shallow lake of Argentina. Revista De Biologia Tropical. 59 (3), 1295-1306 (2011).
  29. Barea-Arco, J., Pérez-Martínez, C., Morales-Baquero, R. Evidence of a mutualistic relationship between an algal epibiont and its host, Daphnia pulicaria. Limnology and Oceanography. 46 (4), 871-881 (2001).
  30. Decaestecker, E., Declerck, S., De Meester, L., Ebert, D. Ecological implications of parasites in natural Daphnia populations. Oecologia. 144 (3), 382-390 (2005).
  31. Allen, Y. C., Stasio, B. T. D., Ramcharan, C. W. Individual and population level consequences of an algal epibiont on Daphnia. Limnology and Oceanography. 38 (3), 592-601 (1993).
  32. Willey, R. L., Cantrell, P. A., Threlkeld, S. T. Epibiotic euglenoid flagellates increase the susceptibility of some zooplankton to fish predation. Limnology and Oceanography. 35 (4), 952-959 (1990).
  33. Green, J. Parasites and epibionts of Cladocera. The Transactions of the Zoological Society of London. 32 (6), 417-515 (1974).
  34. Evans, M. S., Sicko-Goad, L. M., Omair, M. Seasonal occurrence of Tokophrya quadripartita (Suctoria) as epibionts on adult Limnocalanus macrurus (Copepoda: Calanoida) in southeastern Lake Michigan. Transactions of the American Microscopical Society. 98 (1), 102-109 (1979).
  35. Chiavelli, D. A., Mills, E. L., Threlkeld, S. T. Host preference, seasonality, and community interactions of zooplankton epibionts. Limnology and Oceanography. 38 (3), 574-583 (1993).
  36. Willey, R. L., Willey, R. B., Threlkeld, S. T. Planktivore effects on zooplankton epibiont communities: epibiont pigmentation effects. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1818-1822 (1993).
  37. Rosowski, J. R., Willey, R. L. Colacium libellae sp. nov. (euglenophyceae), a photosynthetic inhabitant of the larval damselfly rectum. Journal of Phycology. 11 (3), 310-315 (1975).
  38. Willey, R. L., Threlkeld, S. T. Organization of crustacean epizoan communities in a chain of subalpine ponds. Limnology and Oceanography. 38 (3), 623-627 (1993).
  39. Al-Dhaheri, R. S., Willey, R. L. Colonization and reproduction of the epibiotic flagellate Colacium vesiculosum (euglenophyceae) on Daphnia pulex. Journal of Phycology. 32 (5), 770-774 (1996).
  40. Rosowski, J. R. Photosynthetic euglenoids. Freshwater Algae of North America. , Elsevier Science. USA. 383-422 (2003).
  41. Rosowski, J. R., Kugrens, P. Observations on the euglenoid Colacium with special reference to the formation and morphology of attachment material. Journal of Phycology. 9 (4), 370-383 (1973).
  42. Salmaso, N., Tolotti, M. Other phytoflagellates and groups of lesser importance. Encyclopedia of Inland Waters. , Academic Press. 174-183 (2009).
  43. Threlkeld, S. T., Chiavelli, D. A., Willey, R. L. The organization of zooplankton epibiont communities. Trends in Ecology & Evolution. 8 (9), 317-321 (1993).
  44. Bertolo, A., Rodríguez, M. A., Lacroix, G. Control mechanisms of photosynthetic epibionts on zooplankton: an experimental approach. Ecosphere. 6 (11), (2015).
  45. Pringsheim, E. G. Notiz über Colacium (Euglenaceae). Österreichische Botanische Zeitschrift. 100 (3), 270-275 (1953).
  46. Wołowski, K., Duangjan, K., Peerapornpisal, Y. Colacium minimum (Euglenophyta), a new epiphytic species for Asia. Polish Botanical Journal. 60 (2), 179-185 (2015).
  47. Martin, J. H., Knauer, G. A. The elemental composition of plankton. Geochimica et Cosmochimica Acta. 37 (7), 1639-1653 (1973).
  48. Kazama, T., Hayakawa, K., Kuwahara, V. S., Shimotori, K., Imai, A., Komatsu, K. Development of photosynthetic carbon fixation model using multi-excitation wavelength fast repetition rate fluorometry in Lake Biwa. PLOS ONE. 16 (2), 0238013 (2021).
  49. Chesney, T., Sastri, A. R., Beisner, B. E., Nandini, S., Sarma, S. S. S., Juneau, P. Application of fluorometry (Phyto-PAM) for assessing food selection by cladocerans. Hydrobiologia. 829 (1), 133-142 (2019).
  50. Wang, Q., Yang, S., Wan, S., Li, X. The significance of calcium in photosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1353 (2019).
  51. Dau, H., Haumann, M. Eight steps preceding O-O bond formation in oxygenic photosynthesis-A basic reaction cycle of the photosystem II manganese complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767 (6), 472-483 (2007).
  52. Suthers, I., Bowling, L., Kobayashi, T., Rissik, D. Sampling methods for plankton. Plankton: A guide to their ecology and monitoring for water quality. , CSIRO Publishing. Melbourne. 63-90 (2019).
  53. Błędzki, L. A., Rybak, J. I. Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, with notes on ecology, distribution, methods and introduction to data analysis. , Springer. Switzerland. (2016).
  54. Kato, S. Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. (Euglenophyceae). Japanese Journal of Phycology (Sorui). 30, 63-67 (1982).
  55. Serôdio, J., Campbell, D. A. Photoinhibition in optically thick samples: Effects of light attenuation on chlorophyll fluorescence-based parameters. Journal of Theoretical Biology. 513, 110580 (2021).
  56. Sylvan, J. B., Quigg, A., Tozzi, S., Ammerman, J. W. Eutrophication-induced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: evidence from fast repetition rate fluorometry. Limnology and Oceanography. 52 (6), 2679-2685 (2007).
  57. Browning, T. J., et al. P. Nutrient regulation of late spring phytoplankton blooms in the midlatitude North Atlantic. Limnology and Oceanography. 65 (6), 1136-1148 (2020).
  58. Pausch, F., Bischof, K., Trimborn, S. Iron and manganese co-limit growth of the Southern Ocean diatom Chaetoceros debilis. PLOS ONE. 14 (9), 0221959 (2019).
  59. Ferroni, L., Baldisserotto, C., Fasulo, M. P., Pagnoni, A., Pancaldi, S. Adaptive modifications of the photosynthetic apparatus in Euglena gracilis Klebs exposed to manganese excess. Protoplasma. 224 (3), 167-177 (2004).
  60. Gaiser, E. E., Bachmann, R. W. Seasonality, substrate pereference and attachment sites of epizoic diatoms on cladoceran zooplankton. Journal of Plankton Research. 16 (1), 53-68 (1994).
  61. Totti, C., et al. The diversity of epizoic diatoms: relationships between diatoms and marine invertebrates. The Diversity of Epizoic Diatoms. 16, 323-343 (2011).
  62. Perkins, M., Effler, S. W., Strait, C. M. Phytoplankton absorption and the chlorophyll a-specific absorption coefficient in dynamic Onondaga Lake. Inland Waters. 4 (2), 133-146 (2014).
  63. Kromkamp, J., Capuzzo, E., Philippart, C. J. M. Measuring phytoplankton primary production: review of existing methodologies and suggestions for a common approach. EcApRHA Deliverable WP 3.2. 28, (2017).
  64. Hughes, D., et al. Roadmaps and detours: active chlorophyll-a assessments of primary productivity across marine and freshwater systems. Environmental Science & Technology. 52 (21), 12039-12054 (2018).
  65. Perkins, R. G., et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. 4, Springer. Dordrecht. 237-275 (2010).
  66. Schuback, N., Flecken, M., Maldonado, M. T., Tortell, P. D. Diurnal variation in the coupling of photosynthetic electron transport and carbon fixation in iron-limited phytoplankton in the NE subarctic Pacific. Biogeosciences. 13 (4), 1019-1035 (2016).
  67. Schreiber, U., Gademann, R., Ralph, P. J., Larkum, A. W. D. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements. Plant and Cell Physiology. 38 (8), 945-951 (1997).
  68. Garbary, D. J., Miller, A. G., Scrosati, R. A. Ascophyllum nodosum and its symbionts: XI. The epiphyte Vertebrata lanosa performs better photosynthetically when attached to Ascophyllum than when alone. Algae. 29 (4), 321-331 (2014).
  69. Gorbunov, M. Y., Kolber, Z. S., Lesser, M. P., Falkowski, P. G. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. Limnology and Oceanography. 46 (1), 75-85 (2001).
  70. Yellowlees, D., Warner, M. Photosynthesis in symbiotic algae. Photosynthesis in Algae. 14, Springer. Dordrecht. 437-455 (2003).
  71. Wojtasiewicz, B., Stoń-Egiert, J. Bio-optical characterization of selected cyanobacteria strains present in marine and freshwater ecosystems. Journal of Applied Phycology. 28 (4), 2299-2314 (2016).
  72. Aardema, H. M., Rijkeboer, M., Lefebvre, A., Veen, A., Kromkamp, J. C. High-resolution underway measurements of phytoplankton photosynthesis and abundance as an innovative addition to water quality monitoring programs. Ocean Science. 15 (5), 1267-1285 (2019).

Tags

Биология выпуск 177 настольный FRRf Colacium sp. эпибионт эпизойные водоросли озеро Бива фотофизиология
Измерение фотофизиологии прикрепленной стадии <em>Colacium</em> sp. с помощью флуорометра с быстрой частотой повторения типа кюветы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter