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Biology

使用比色皿型快速重复率荧光计测量 Colacium sp.附着阶段的光生理学

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

快速重复率荧光计（FRRf）是测量光系统II光生理学和初级生产率的有益方法。在这里，我们描述了一种方案，使用比色皿型FRRf测量底物浮游动物上上生性藻类， Colacium sp.的PSII光生理学。

Abstract

快速重复率荧光计（FRRf）是测量光系统II（PSII）光生理学和初级生产率的有益方法。虽然FRRf可以测量各种真核藻类和蓝藻的PSII吸收截面（σ PSII），最大光化学效率（Fv / Fm），有效光化学效率（Fq/ Fm'）和非光化学淬灭（NPQNSV），但迄今为止几乎所有的FRRf研究都集中在浮游植物上。在这里，该协议描述了如何测量在生藻属的PSII光生理学。 Ehrenberg 1834（Euglenophyta），在其附着阶段（附着在浮游动物上），使用比色皿型FRRf。首先，我们估计了底物浮游动物（Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776，Cladocera，Daphniidae）对基线荧光和浮游可乐菌属的σ PSII，Fv / Fm，Fq'/Fm'和NPQNSV的影响。为了验证这种方法，我们记录了粘液链球菌附着的Colacium sp.的光生理学测量结果，并将这些结果与其浮游阶段进行了比较。具有代表性的结果表明，该协议如何确定钙（Ca）和锰（Mn）对Colacium sp.光生理学的影响，并确定Mn富集在附着和浮游阶段之间的各种影响。最后，我们讨论了该协议对其他周生藻类的适应性。

Introduction

叶绿素可变荧光是测量藻类光系统II（PSII）光生理学的有用工具。藻类通过改变其PSII光生理学来应对各种环境压力，例如过量的光照和营养缺乏。快速重复率荧光计 （FRRf） 是测量 PSII 光生理学1，2 和估算初级生产力1，3，4 的常用方法，能够监测浮游植物 PSII 光生理学以及跨宽空间和时间尺度的初级生产力5，6，7。FRRf可以同时测量PSII（σ PSII）吸收截面，反应中心（[RCII]）浓度，最大光化学效率（Fv / Fm），有效光化学效率（Fq'/Fm'）和非光化学淬灭（NPQNSV）（表1）。通常，Fv/Fm 和 Fq′/Fm′ 被定义为 PSII 活性 8，而 NPQNSV 被定义为相对散热能量9。

重要的是，FRRf的单周转（ST）闪光完全降低了初级醌电子受体QA，但不会降低塑性醌池。相反，脉冲幅度调制（PAM）荧光计的多次周转（MT）闪光可以减少两者。与MT方法相比，ST方法具有明显的优势，通过同时测量Fv / Fm，Fq′/ Fm'，NPQNSV和σ PSII10的恢复动力学来识别NPQNSV的可能起源。迄今为止，已有几种类型的FRRf仪器，如潜水式、比色皿式和流通型。潜水式 FRRf 可在海洋和湖泊中进行原位测量，而比色皿型 FRRf 适用于测量小样品量。流通型通常用于连续测量地表水中浮游植物的光生理学。

鉴于 PAM 荧光计（包括比色皿型）的发展，适用于广泛的受试者11，PAM 荧光计在藻类光生理学研究中仍然比 FRRf 更常见12。例如，尽管这些工具之间的样品室结构和比色皿容量仅略有不同，但比色皿型PAM已应用于浮游植物13，14，15，底栖微藻16，17，18，冰藻19和生化藻类20，而比色皿型FRRf主要应用于浮游植物21，22，23 和有限数量的冰藻群落24，25。鉴于其有效性，比色皿型FRRf同样适用于底栖和表生藻类。因此，扩展其应用将为PSII光生理学提供相当多的见解，特别是对于鲜为人知的生代藻类光生理学。

生代藻类很少受到关注，很少有研究检查它们的PSII光生理学20，26，很可能是因为它们在水生食物网中的作用很小27，28。然而，包括表生性藻类在内的表生元可以对浮游动物群落动态产生积极影响，例如增加繁殖和存活率29，30，以及对过程产生负面影响，例如增加下沉率29，31 和对视觉捕食者的脆弱性32，33，34，35，36.因此，探索控制浮游动物群落中表观生物动力学的环境和生物学因素至关重要。

在生代藻类中，Colacium Ehrenberg 1834（Euglenophyta）是一种常见的淡水藻类群32，37，38，39，具有不同的生命阶段，包括附着（图1A-D），非运动浮游（图1E，F）和运动浮游阶段40，41.在非运动浮游阶段，细胞以单细胞浮游生物，聚集菌落或单层片状菌落的形式存在，被粘液覆盖42。在附着阶段，Colacium sp.使用从细胞前端排泄的粘液37，39，41附着在底物生物（碱性）上，特别是微甲壳类41，43。它们的生命周期还包括从蜕皮的外骨骼或死亡的基底骨骼中分离出来，并与鞭毛一起游泳以找到另一种底物生物体39。浮游和附着阶段都可以通过有丝分裂40增加其种群规模。虽然它们的附着阶段被假设为收集资源的进化特征，如light44和微量元素41，45，46，或作为分散策略27，但关于这些方面的实验证据很少37，41，44，关键附着机制在很大程度上是未知的。例如，Rosowski和Kugrens预计Colacium从基质桡足类41中获得锰（Mn），集中在外骨骼47中。

在这里，我们描述了如何使用比色皿型FRRf测量浮游藻类的PSII光生理学以及用Colacium sp.细胞靶向附着藻类（附着在浮游动物身上）的相关应用方法。我们使用配备三个发光二极管（LED）的Act2系统，它们提供以444 nm，512 nm和633 nm48为中心的闪光激发能量。在这里，444 nm（蓝色）对应于叶绿素a（Chl-a）的吸收峰，而512nm（绿色）和633nm（橙色）分别对应于藻红素和藻蓝蛋白的吸收峰。荧光信号检测峰为682 nm，半带宽为30 nm。由于在自然环境中很难找到Colacium sp.的浮游阶段，因此收集了它们附着的阶段进行实验。在众多的底物生物中，Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776（Branchiopoda，Daphniidae;图1A，B，G）是最容易处理的，因为它们的游泳速度慢，体型大（400-650μm）和独特的行为（倒挂在水面上）。因此，该协议使用附着在S. mucronata上的Colacium sp.作为Colacium-basibiont系统的案例研究。为了避免来自肠道内容物的荧光，S. mucronata被饿死。由于之前的一项研究报告称，来自肠道内容物（摄入的藻类）的荧光信号在40分钟后显示五倍49，我们预计90分钟的饥饿足以最大限度地减少肠道含量荧光影响FRRf测量的可能性，同时对Colacium sp.的实验压力的影响最小，例如营养缺乏。此外，该方案还用于阐明Colacium sp.的附着机理，并确定钙（Ca）和锰（Mn）两种金属如何影响浮游和附着阶段的光生理学。钙以多种方式在光合途径50中起关键作用，并且两种金属都是构建PSII51的析氧复合物所必需的。由于钙和锰高度集中在甲壳类浮游动物47的甲壳中，我们假设如果该生命阶段在附着阶段从S. mucronata获得这些元素，则Colacium sp.光生理学可能对浮游阶段的Ca和Mn富集反应更突出。

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Protocol

1. 抽样

  1. 通过水桶从水面收集湖水。为了靶向附着在S. mucronata（图1A-C）上的Colacium sp.使用100μm尼龙网过滤0.5-10 L的湖水52。
    注意： S. mucronata 通常密集聚集在浅层，富营养化，浑浊的水中，例如芦苇（芦苇）区域。
  2. 将浓缩样品储存在500 mL塑料瓶中，加入350 mL湖水。存放在黑暗条件下。
  3. 在实验室中，将样品水倒入500 mL烧杯中，让它沉降几分钟。
  4. 通过0.2μm孔径过滤器过滤湖水。
  5. 拿起 S。在100倍放大倍率的光学显微镜下使用移液器的 粘液管 个体。根据Błędzki和Rybak53进行物种鉴定。
  6. 将它们转移到放置在载玻片上的0.2μm过滤湖水（FLW）中。
    注： S. mucronata 可以游到水面或附着在烧杯壁上。
  7. 检查 S。光学显微镜下的 粘液 。
  8. 洗 S.使用FLW（3滴或更多）的 粘液体 个体以防止其他生物体的污染（图2）。
  9. 保留 S。在40μmol光子·m−2·s−1的生长室中原位温度下，粘液。

2. S .基线荧光上的粘液

  1. S. 穆克罗纳塔 栽培
    1. 在光学显微镜下以100倍放大倍率使用移液器拾取 S. mucronata 个体，并使用FLW洗涤，如步骤1.8所示。
    2. 使用电动空气泵通过空气石给自来水充气至少1周。将 300 mL 充气自来水倒入 350 mL 玻璃罐中。
    3. 将小球藻（1 mg C·L−1）喂入，并在生长室中保持在40μmol光子·m−2·s−1下，在20°C下。
    4. 大约14天后，使用移液器在光学显微镜下以100倍放大倍率拾取5-30个人，并将其接种到300 mL清洁的充气自来水中以保持培养基新鲜。
  2. 设置 FRRf
    1. 启动 Act2Run 软件。
    2. 单击“选项”选项卡，然后在“操作模式”中选择 Act2 FLC（白色 LED）以设置光化 LED 颜色。
    3. 在主窗口中荧光-光曲线设置的步骤1处单击“暗”值，然后键入30以设置暗期的持续时间（图3A）。
    4. 单击组合指示灯 B、C和 D 以关闭绿色和橙色指示灯（图3C）。
    5. 单击“周六”下“Fets”和“音高”的值，然后分别键入100和2，以设置饱和阶段闪光灯的数量和间距（图3D）。
    6. 单击Rel下的Fets和Pitch的值，并分别键入40和60，以设置弛豫阶段闪光灯的数量和音高（图3E）。
    7. 通过单击“ 在FLC期间 ”（图3F）激活水套泵，以在测量过程中控制样品温度。
    8. 通过单击 自动指示灯 和 自动PMT 激活（图3F）。
    9. 单击“ 同步 ”以连接 FRRf-Act2。
  3. 断续器测量
    1. 为了检查浮游动物个体对基线荧光的影响，准备成虫 S。从步骤2.1.1-2.1.4中的培养物中获取 的mucronata （体型400-650μm），没有任何附着的生物体。
    2. 为了避免肠道内容物发出荧光， 在20°C下将FLW中的个体饿死至少90分钟。
    3. 将 1.5 mL FLW 倒入比色皿中。在100倍放大倍率的光学显微镜下使用移液器拾取0，1，5和10 个S. mucronata 个体。
    4. 转移 S. 将粘液状体 放入比色皿中，加入FLW，使样品达到2 mL。
    5. 在FRRf测量之前，在20°C的低光（1-10μmol光子·m-2·s-1）下适应15分钟。
    6. 单击 “行动 2 运行” 以开始测量。每个样品重复测量>3次。
    7. 从结果图中读取 Fo 值（图 4）。

3. 底物生物对Chl-a荧光的影响

  1. 可乐菌 种栽培
    1. 准备FLW和AF-6培养基54 进行培养（表2）。
    2. 如步骤1.1和1.2中收集附着在S. mucronata上的Colacium sp.，并在生长室中保持原位温度。
    3. 在100倍放大倍率下，使用移液器在光学显微镜下用蜕皮（图1D）拾取Colacium sp.。用FLW清洗它们，如步骤1.8所示。
    4. 无菌接种 可乐菌 属和AF-6培养基，在干净的工作台上接种10 mL玻璃管中。
    5. 在生长室中将培养物保持在200μmol光子·m−2·s−1 的原位温度下。每天至少用手轻轻摇动玻璃管一次，以防止细胞沉降。
      注意：为了保持聚集菌落的衰减效应尽可能低，请在FRRf测量之前在显微镜下检查菌落。细胞聚集可能导致密集菌落并影响藻类光生理学55。
  2. 断续器测量
    1. 为了检查浮游动物个体对来自Colacium sp.的Chl-a荧光的影响，准备成虫S。 mucronata（体型400-650μm）没有任何附着的生物体。
    2. 为了避免肠道内容物发出荧光， 请使FLW中的个体挨饿至少90分钟。
    3. 设置比色皿式快速重复率荧光计（FRRf）。
    4. 将1.5 mL预培养的 Colacium sp.亚样品倒入比色皿中。传输 0、5、10 和 15 S。 将粘液体 放入这些比色皿中，加入2μm过滤培养基，使样品达到2mL。
    5. 在进行FRRf测量之前，在20°C的低光（1-10μmol光子·m-2·s-1）下适应15分钟。
      注：测量期间将样品保持在孵育温度
    6. 单击 “行动 2 运行” 以开始测量。每个样品重复测量>3次。
    7. 从结果图中读取FO和Fm值（图4）。
      注：检查RσPSII值（表1），该值显示LED功率是否在最佳范围内，以正确估计PSII参数。当自动 LED 被激活时，Act2run 系统控制 LED 功率以达到最佳 RσPSII 范围 （0.042-0.064）。在之前的研究中，实验RσPSII临界值定义为0.03和0.0848。
    8. 为了校正基线荧光22，请使用0.2μm孔径滤光片过滤培养基并测量荧光。从 FO 和 Colacium sp. 的 Fm 中减去基线样本的 FO，或在“选项”选项卡的“设置”中修改“空白校正”值。

4. 芸属 光生理学（附着阶段）

  1. 在光学显微镜下使用移液器分离具有Colacium sp.的S. mucronata个体。
  2. 洗 S.使用FLW的 mucronata ，如步骤1.8所示。
  3. 转移 S. 粘液 成100毫升FLW。对于饥饿，在黑暗条件下 原位 温度下保存90分钟。
  4. 将 1.5 mL FLW 倒入比色皿中。
  5. 传输 ~10 S。 将粘液菌 个体与 Colacium sp. 放入比色皿中。对于测量，每2 mL需要超过100 个Colacium 细胞。加入FLW，使样品达到2 mL。
  6. 在低光（1-10μmol光子·m−2·s−1）下在原位温度下适应15分钟。
  7. 为了枚举附着的细胞的数量，在进行FRRf测量后用戊二醛（2%最终体积）固定样品。在 S的几个焦深和位置拍照。光学显微镜下的 粘液 。

5. 鞘翅目 （浮游期）的光生理学

  1. 在AF-6培养基中以步骤3.1.1-3.1.5中的原位温度培养取样的Colacium sp.。
  2. 对于固定期，取2mL培养的 Colacium sp. 并倒入比色皿中。
  3. 在低光（1-10μmol光子·m−2·s−1）下在原位温度下适应15分钟。

6. 添加Ca和Mn对 Colacium sp.光生理学的影响

  1. 对附加舞台的影响
    1. 在光学显微镜下使用移液器分离具有Colacium sp.的S. mucronata个体。使用FLW洗涤，如步骤1.8所示。
    2. 将六个人转移到12个装有30毫升FLW的玻璃烧杯中。确保每个烧杯含有>100个 Colacium sp.细胞。
    3. 添加200微摩尔·L−1 氯化钙2·H2O（钙处理），40 μmol·L−1 MnCl4（Mn处理）或超纯水（对照）到每个烧杯。将样品在生长室中以原位温度在200μmol光子·m−2·s−1下孵育。
    4. 在3小时和21小时，将所有个体和蜕皮转移到含有2mL培养基的比色皿中。
    5. 要检查对增加光的快速响应，请单击8个光化光步骤周期的 向上 ，并键入20（图3A）以设置每个步骤的持续时间为20秒。要将逐步光化光设置为0，11，25，44，68，101，144和200μmol光子·m−2·s−1，请单击 High E 和 Step Up ，分别将值更改为200和34（图3B）。
    6. 在黑暗驯化15分钟后，测量每个样品的Chl-a 荧光，类似于步骤3.2.6-3.2.8。
      注意：验证 RσPSII 和 RσPSII' 值是否在最佳范围 （0.03-0.08）48 内。
  2. 对浮游阶段的影响
    1. 在AF-6培养基中以步骤3.1.1-3.1.5中的原位温度培养取样的Colacium sp.。
    2. 将培养的芪螈属转移到FLW中，并在低于200μmol光子·m−2·s−1的原位温度下适应3天。
    3. 将1 mL的驯化样品转移到三个装有10 mL FLW的玻璃小瓶中。
    4. 添加200微摩尔·L−1 氯化钙2·H2O（钙处理），40 μmol·L−1 MnCl3（Mn处理）或超纯水（对照）到小瓶。将样品在生长室中以原位温度在200μmol光子·m−2·s−1下孵育。
    5. 在3小时和21小时，按照步骤3.2.6-3.2.8测量每个样品的Chl-a 荧光。

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Representative Results

多达5个个体（inds）mL−1的基线荧光（图5）或Chl-a荧光（图6）没有显着影响。然而，当粘液链球菌为7.5 inds·mL−1时，Fv/Fm和NPQNSV受到显著影响。因此，为了测量Colacium sp.在附着阶段的光生理学，我们选择了具有较高Colacium sp.负荷的S. mucronata，以达到足够的Colacium sp.丰度（>50个细胞·mL−1）和少量的S. mucronata（≤5 inds·mL−1）。

表3显示了附着阶段Colacium sp.光生理学的季节性变化。虽然采样温度变化，但它们的光生理学保持相对恒定。σ PSII从3.42 nm2到3.76 nm2（平均3.60 nm2）不等，Fv/Fm从0.52到0.60（平均0.55）不等，NPQNSV从0.66到0.85（平均0.82）不等。为了验证这些结果，我们进一步研究了AF-6培养基中固定期浮游阶段的Colacium sp.光生理学的变化（表4）。附着阶段的平均Fv / Fm和NPQNSV与在AF-6培养基中孵育的浮游阶段相似。

为了确定Ca和Mn在附着和浮游阶段对Colacium sp.光生理学的影响，我们进行了Ca和Mn富集实验。2021年5月7日从琵琶湖的芦苇区采集了样本。对于黑暗条件下Colacium sp.的附着阶段，除了3 h时Mn和Ca处理之间的NPQNSV外，处理间的光生理参数差异无统计学意义，其中Ca图7A，C，E）。此外，σ PSII'，Fq'/Fm'和NPQNSV在附着阶段对增加的光的反应显示不同处理之间没有明显差异（图8A，C，E和图9A，C，E）。然而，在21小时的低光照强度下，NPQNSV在Ca处理中往往低于对照（11和25μmol光子·m−2·s−1，图9E）。对于浮游阶段，Mn处理中的σ PSII在3 h时显着低于Ca处理（图7B）。Fq′/Fm′显著较高，但NpQNSV在Mn处理中在21 h时低于对照（图7D，F）。在增加的光照下，与3 h的对照相比，Mn在浮游阶段倾向于降低σ PSII并增加Fq′/Fm′（图8D）。同样，与21小时对照相比，Mn在浮游阶段显着降低了NPQNSV（图9F）。与附着阶段类似，钙在增加的光照下，浮游阶段的NPQNSV略有改善（图9F）。然而，与Mn处理相比，在3 h时，在44-200μmol光子·m−2·s−1下，Ca降低了浮游阶段的Fq′/Fm′并增加了NPQNSV（图8D，F）。

Figure 1
图1：Colacium sp.和物质生物Scapholeberis mucronata。 （A）感染的S. mucronata。 （B）用戊二醛固定的感染的粘液链球菌。（C）附着在活的S. mucronata上的Colacium细胞。（D）将Colacium细胞附着在蜕皮甲壳上。（E，F）浮游（棕榈）阶段的Colacium sp.。（G） 未感染的粘液链球菌。 箭头表示可乐细胞。比例尺：200 μm（A、B 和 G）、10 μm（C、E 和 F）和 100 μm （D）。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图 2：通过在过滤的湖水 （FLW） 下移液清洗浮游动物。请单击此处查看此图的放大图。

Figure 3
图3：Act2运行软件用户界面（A）每个光化光步骤的曝光时间;（二）光化光的步数和光子通量;（三）激发波长的组合;（D） 饱和度和弛豫闪光灯序列;（E） 水套和样品混合泵的频率和强度;（F）激发闪光的光子通量在444（这里表示为450），512（530）和633nm（624），光电倍增管（PMT）电压，以及序列的重复和间隔。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 4
图4：Act2Run软件上藻类样品的荧光读数。 红色和蓝色线分别通过饱和弛豫阶段的闪光灯和曲线拟合序列表示原始荧光信号。有关详细信息，请参阅 Kolber et al.2 。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 5
图5： 粘液链球菌 密度对基线荧光的影响。 小点表示重复 （n = 3）。还显示了方差分析检验的结果。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 6
图6：粘液链球菌密度对浮游期（A）FO（B）σ PSII，（C）Fv/Fm和（D）NPQNSV对Colacium sp.的影响。 小点表示重复 （n = 3）。在AF-6培养基中培养Colacium sp.。还介绍了方差分析和Tukey事后检验的结果。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 7
图7：（A，B）吸收截面，（C，D）PSII光化学和（E，F）非光化学对 Colacium sp.附着阶段和（B，D，F）浮游阶段在Ca和Mn添加后3小时和21小时的响应。 小点表示重复 （n = 4）。还介绍了方差分析和Tukey事后检验的结果。* p < 0.05。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 8
图8：（A，B）吸收横截面，（C，D）PSII光化学和（E，F）非光化学猝灭 的Colacium sp.在附着和浮游阶段的快速光响应，在Ca和Mn添加后3小时逐步光协议。 C、控制;钙， 200 μM 钙;（a）C和Ca，（b）C和Mn以及（c）Ca和Mn在每种PAR通量处的显着差异，每个面板中显示 p <0.05的显着差异。误差线，平均 SD （n = 4）。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 9
图9：（A，B）吸收横截面，（C，D）PSII光化学和（E，F）在附着和浮游阶段的 Colacium sp.的非光化学淬灭的快速光响应，在Ca和Mn添加后21小时逐步光协议。 C、控制;钙， 200 μM 钙;（a）C和Ca，（b）C和Mn以及（c）Ca和Mn在每种PAR通量处的显着差异，每个面板中显示 p <0.05的显着差异。误差线，平均 SD （n = 4）。 请点击此处查看此图的放大版本。

术语 定义 单位
基线荧光 无 Chl-a 荧光的 Fo 值
F' 当C>0时，单个周转测量的第零次闪光处的荧光
Fo （ʹ） 第零闪光灯时的最低PSII荧光产量（在背景光下）
Fv （ʹ） Fm（ʹ） − Fo（ʹ）
Fm （ʹ） 最大PSII荧光产量（在背景光下）
Fv/Fm 黑暗下的最大PSII光化学效率
Fqʹ/Fmʹ 背景光下的最大PSII光化学效率，（Fmʹ− F）/（Fmʹ）
NPQNSV 归一化艉-福尔默淬火，FOʹ/（Fmʹ − FOʹ）
[RCII] 反应中心浓度
RσPSII （ʹ） RCII在单个周转饱和阶段的第一个闪光灯期间关闭的概率（在背景光下）
σ PSII （ʹ） 用于激发闪光灯的PSII的功能吸收横截面（在背景光下） 纳米2

表1：此协议中使用的术语。

元件 数量
纳诺3 140毫克·L−1
NH4NO3 22毫克·L−1
镁SO4·7H2O 30毫克·L−1
KH2PO4 10毫克·L−1
K2HPO4 5毫克·L−1
氯化钙2·2H2O 10毫克·L−1
钙三极管 10毫克·L−1
柠檬酸铁* 2毫克·L−1
柠檬酸* 2毫克·L−1
生物素 0.002毫克·L−1
维生素.B 1 0.01毫克·L−1
维生素.B 6 0.001毫克·L−1
维生素.B 12 0.001毫克·L−1
痕量金属 1 毫升·升-1
（二氯化铁3·6H2O） （1.0毫克·毫升-1）
（氯化锰3·4H2O） （0.4毫克·毫升-1）
（氧化锌4·7H2O） （0.005毫克·毫升−1）
（二氯化钴2·6H2O） （0.002毫克·毫升−1）
（Na2MoO4） （0.004毫克·毫升−1）
（Na2-乙二胺四乙酸钠） （7.5毫克·毫升-1）

表2：AF-6培养基的配方。 将pH值调节至6.6。将柠檬铁和柠檬酸分别溶解在温热的H2 O中，混合后加入HCl（1 mL·L−1）。痕量金属的内容显示在括号中。

采样日期 样品编号 水温
（°C） 		粘液链球菌 密度
（行业·毫升−1）		 可乐菌 属细胞密度
（行业·毫升−1）		 σ锂离子 体 （nm2） Fv/Fm NPQNSV
四月 27，2020 编号 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
硒 0.22 0.01 0.04
五月 21/2020 编号 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
硒 0.16 0.02 0.06
第3期 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
硒 0.09 0.01 0.02
第4期 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
硒 0.12 0.00 0.02
六月 18，2020 第5名 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
硒 0.16 0.02 0.06
第6名 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
硒 0.09 0.01 0.02
编号7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
硒 0.12 0.00 0.02
七月 20，2020 编号：8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
硒 0.10 0.00 0.00
意味 着 3.60 0.55 0.82
南德文 0.120349 0.03 0.10

表3：附着在S. mucronata上的Colacium sp.的光生理学。

采样日期 样品编号 中等 生长温度（°C） σ锂离子 体 （nm2） Fv/Fm NPQNSV
五月 21/2020 编号 1 AF-6 19.4 2.72 0.65 0.53
硒 0.03 0.00 0.01
六月 18，2020 编号 2 AF-6 22.4 3.07 0.55 0.84
硒 0.08 0.02 0.07
七月 20，2020 第3期 AF-6 27.5 2.90 0.58 0.73
硒 0.06 0.01 0.02
意味 着 2.90 0.59 0.70
南德文 0.18 0.05 0.16

表4：浮游期Colacium sp.的光生理学。在静止阶段测量每个样品。

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Discussion

该协议首次证明，在自然环境中附着阶段，Colacium sp.的光生理学与其在AF-6介质中的浮游阶段相当。此外，当密度为≤5 inds·mL−1时，饥饿的S. mucronata的肠道内容物不影响基线和Chl-a荧光（图5和图6）。这些结果表明，该协议可以在低底物生物丰度下测量附着阶段Colacium sp.的光生理学，而无需校正。然而，步骤3.2.1-3.2.8的结果表明，最高的粘液链球菌丰度对Fv/Fm和NPQNSV的影响显著，但对FO和σ PSII的影响不大（图4）。在这里，较高的生物密度可能会加剧Colacium sp.个体的身体压力，从而降低光合活性。对于在高丰度的底物生物或其他物种下测量，底物生物密度对基线和Chl-a荧光的影响需要进一步关注。

FRRfs已被用于研究营养操纵对浮游植物线性电子流动和非光化学淬灭的影响22，56，57。初步结果表明，Colacium sp.生命阶段之间的Ca和Mn富集差异显著（图7，图8和图9）。具体而言，锰明显提高了PSII（Fv/Fm和Fq′/Fm′）的（最大）光化学产率，并降低了黑暗（图7D，F）和光照条件下浮游级的散热（NPQNSV）50（图8D，F和图9D，F）。这些结果可能源于PSII、σ PSII和σ PSII'（图7B和图8B）上的天线尺寸减小，从而减少了多余的光吸收58，59。除了测量PSII复合物之间的能量流外，测量天线尺寸还可以更精确地测量藻类响应10。该协议还允许检查其他资源的光合作用局限性。例如，氮和磷的局限性已经在各种浮游植物群落中进行了检查，但在生后藻类中却没有，尽管预测对Colacium41和海洋表生性硅藻的影响60，61。除营养物质外，光环境还可以进一步影响表生藻类的分布44。

如图7、图8和图9所示，比色皿型FRRf使我们能够同时检查营养和光照效应，而无需较长的孵育时间和测量工作。这种逐步光协议（步骤6.1.5）还可以绘制相对电子传输速率（rETR = Fq′/Fm′×光）与光的快速光曲线，作为生产与光的类似物62。然而，尽管PSII中的线性电子流可以通过FRRf从光生理参数估计，但它不一定类似于碳固定速率63，64。为了估算碳基初级生产，在评估受试者群落时，应检查每个CO2固定的电子需求量（Фe，C），该需求量可能在时间和空间上有所不同5，48。

如果浮游生物网被碎屑堵塞，请用较大的网状物（例如5毫米网状网）预先屏蔽，或使用移液器直接从湖水中采摘浮游动物，无需过滤。应该注意的是，即使使用相对较大的（200μm）网状尺寸轻轻地进行过滤，也会对附着的藻类造成一些损害。虽然结果表明PSII参数的标准偏差很小（表3），并且参数的平均值与培养浮游阶段的平均值非常相似（表4），但未经过滤的采样可能是理想的。

本研究的另一个局限性是推导σ PSII。光化光和Chl-a荧光衰减会对FRRfs产生重大影响/失真，FRRfs依赖于光学薄样品进行准确的σ PSII测定65。虽然我们表明S. mucronata不影响浮游可乐细胞的σ PSII，但应该检查与附着的Colacium细胞的σ PSII有关。此外，由于ACT2系统的激发波长（444 nm）与原位光环境的光谱分布不同，因此原位σ PSII66估计需要光谱校正因子（SCF）。通常，滤光片技术用于测量Chl-a比吸收光谱以计算SCF。该程序对于通过FRRfs估计藻类初级生产力是必要的。由于我们无法在研究期间收获足够的附着的Colacium细胞，因此应在未来的研究中检查Chl-a特异性吸收光谱。

实施比色皿型 FRRf 应取决于底物大小，因为围生藻类需要底物附着。例如，对坚不可摧物质（如岩石67、大型生物26、68或共生藻类，包括与硬珊瑚相关的共生藻类）的研究可能需要潜水型FRRf69。相反，如果碱性蛋白足够小，可以悬浮在比色皿中，那么除了比色皿型PAM（例如底栖藻类16，17，18）之外，比色皿型FRRf可能就足够了。事实上，最近的研究已经探索了一种比色皿型FRRf，用于测量冰藻的光生理学24，25。此外，在512和633 nm处打开激发闪光灯可以应用于具有不同PSII天线颜料，藻红素和藻蓝藻的蓝藻，从而使用Chl-a71实现不同的吸收峰。由于目前包含多激发波长的FRRf模型是检查蓝藻光生理学和生产力的有用工具7，66，72，如果样品厚度对光生理参数的影响得到改善，这些应该是评估底栖蓝藻的有用方法65.在未来的研究中，FRRfs应针对更广泛的受试者生物，以进一步了解不同栖息地藻类光生理学的复杂机制。

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Disclosures

作者没有披露要声明。

Acknowledgments

这项工作得到了滋贺县合作研究基金的支持，该基金在日本振兴地区补助金和日本环境省环境研究与技术发展基金（第5-1607号）下，题为“保护水环境健全性的水质和湖底环境研究”。https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html。作者要感谢Enago（www.enago.jp）的英语评论。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

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生物学，第177期，台式FRRf， Colacium sp.，epibiont，Epibiont，Epizoic藻类，琵琶湖，光生理学
使用比色皿型快速重复率荧光计测量 <em>Colacium</em> sp.附着阶段的光生理学
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Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

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