Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling af fotofysiologi af vedhæftet fase af colacium sp. ved hjælp af et Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

Fluorometer med hurtig gentagelseshastighed (FRRf) er en gavnlig metode til måling af fotosystem II fotofysiologi og primær produktivitet. Her beskriver vi en protokol til måling af PSII-fotofysiologi af epizoisk alge, Colacium sp. på substrat zooplankton ved hjælp af kuvette-type FRRf.

Abstract

Fluorometer med hurtig gentagelseshastighed (FRRf) er en gavnlig metode til måling af fotosystem II (PSII) fotofysiologi og primær produktivitet. Selvom FRRf kan måle PSII-absorptionstværsnit (σ PSII), maksimal fotokemisk effektivitet (Fv / Fm), effektiv fotokemisk effektivitet (Fq ′/Fm′) og ikke-fotokemisk slukning (NPQNSV) for forskellige eukaryote alger og cyanobakterier, har næsten alle FRRf-undersøgelser til dato fokuseret på fytoplankton. Her beskriver protokollen, hvordan man måler PSII-fotofysiologi af en epizoisk alge Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), i sin vedhæftede fase (knyttet til zooplankton), ved hjælp af kuvette-type FRRf. For det første estimerede vi virkningerne af substrat zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) på baseline fluorescens og σ PSII, Fv / Fm, Fq '/ Fm' og NPQNSV af planktonisk Colacium sp. For at validere denne metode registrerede vi fotofysiologiske målinger af vedhæftet Colacium sp. på S. mucronata og sammenlignede disse resultater med dets planktoniske stadium. Repræsentative resultater viste, hvordan protokollen kunne bestemme virkningerne af calcium (Ca) og mangan (Mn) på Colacium sp. fotofysiologi og identificere de forskellige virkninger af Mn-berigelse mellem vedhæftede og planktoniske stadier. Endelig diskuterer vi tilpasningsevnen af denne protokol til andre perifytiske alger.

Introduction

Klorofylvariabel fluorescens er et nyttigt værktøj til måling af algefotosystem II (PSII) fotofysiologi. Alger reagerer på forskellige miljøbelastninger, såsom overskydende lys- og næringsstofmangel, ved at ændre deres PSII-fotofysiologi. Fluorometer med hurtig gentagelseshastighed (FRRf) er en almindelig metode til måling af PSII-fotofysiologi1,2 og estimering af primær produktivitet1,3,4, som muliggør overvågning af fytoplankton PSII-fotofysiologi samt primær produktivitet på tværs af brede rumlige og tidsmæssige skalaer5,6,7. FRRf kan samtidig måle PSII (σ PSII) absorptionstværsnit, reaktionscenter ([RCII]) koncentration, maksimal fotokemisk effektivitet (Fv/Fm), effektiv fotokemisk effektivitet (Fq′/Fm′) og ikke-fotokemisk slukning (NPQNSV) (tabel 1). Generelt defineres Fv/Fm og Fq′/Fm′ som PSII-aktivitet8, mens NPQNSV defineres som relativ varmeafledningen energi9.

Det er vigtigt, at enkeltomsætningsglimt (ST) af FRRf fuldt ud reducerer den primære quinonelektronacceptor, QA, men ikke plastoquinonpuljen. Omvendt kan multipel omsætning (MT) blink fra et pulsamplitudemodulationsfluorometer (PAM) reducere begge. ST-metoden har en klar fordel i forhold til MT-metoden, når den mulige oprindelse af NPQNSV identificeres ved samtidig at måle genvindingskinetik af Fv/ Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV og σ PSII10. Til dato er flere typer FRRf-instrumenter, såsom nedsænket type, kuvette-type og flow-through-type, kommercielt tilgængelige. FRRf af nedsænkningstypen muliggør in situ-målinger i oceaner og søer, mens FRRf af kuvettetypen er velegnet til måling af små prøvevolumener. Gennemstrømningstypen bruges almindeligvis til kontinuerligt at måle fytoplanktons fotofysiologi i overfladevand.

I betragtning af udviklingen af PAM-fluorometre, herunder kuvettetypen, til en bred vifte af forsøgspersoner11 er PAM-fluorometre stadig mere almindelige end FRRF'er i algefotofysiologisk forskning12. For eksempel, selvom prøvekammerstrukturen og kuvettekapaciteten mellem disse værktøjer kun adskiller sig lidt, er KUVETTE-typen PAM blevet anvendt på fytoplanktoner13,14,15, bentiske mikroalger16,17,18, isalger19 og epizoiske alger20, mens KUVette-typen FRRf primært er blevet anvendt på fytoplanktoner21,22,23 og et begrænset antal isalgesamfund24,25. På grund af sin effektivitet er KUVETTE-TYPE FRRF lige så anvendelig på bentiske og epizoiske alger. Derfor vil udvidelsen af dens anvendelse give betydelig indsigt i PSII-fotofysiologi, især for mindre kendt epizoisk algefotofysiologi.

Epizoiske alger har fået lidt opmærksomhed, med få undersøgelser, der undersøger deres PSII-fotofysiologi20,26, sandsynligvis på grund af deres mindre roller i akvatiske fødebaner27,28. Epibionter, herunder epizoiske alger, kan imidlertid påvirke zooplanktonsamfundets dynamik positivt, såsom stigende reproduktions- og overlevelsesrater29,30, samt negative påvirkningsprocesser, såsom stigende synkehastighed29,31 og sårbarhed over for visuelle rovdyr32,33,34,35,36 . Derfor er det afgørende at udforske de miljømæssige og biologiske faktorer, der styrer epibiontdynamikken i zooplanktonsamfund.

Blandt epizoiske alger er Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) en almindelig ferskvands-, algegruppe32,37,38,39 med forskellige livsstadier, herunder vedhæftet (figur 1A-D), ikke-bevægelig planktonisk (figur 1E,F) og bevægelige planktoniske stadier40,41 . Under det ikke-bevægelige planktoniske stadium lever celler som enkeltcelleplanktoner, aggregerede kolonier eller etlags arkkolonier, dækket af slimhinde42. I det vedhæftede stadium anvender Colacium sp. slimhinde udskilt fra den forreste ende af cellen37,39,41 til at binde sig til substratorganismer (basibionter), især mikrokrebsdyr41,43. Deres livscyklus indebærer også at løsrive sig fra det smeltede exoskelet eller døde basibiont og svømme med deres flagella for at finde en anden substratorganisme39. Både planktoniske og vedhæftede stadier kan øge deres befolkningsstørrelse ved mitose40. Selvom deres vedhæftede stadium antages at være et evolutionært træk til indsamling af ressourcer, såsom lys44 og sporstoffer41,45,46 eller som en spredningsstrategi27, er der kun få eksperimentelle beviser tilgængelige om disse aspekter37,41,44, og de vigtigste fastgørelsesmekanismer er stort set ukendte. Rosowski og Kugrens forventede f.eks., at Colacium opnår mangan (Mn) fra substrat copepods41, koncentreret i exoskelettet47.

Her beskriver vi, hvordan man måler PSII-fotofysiologi af planktonalger og den tilhørende anvendelsesmetode til målretning af vedhæftede alger (fastgørelse til zooplankton) med Colacium sp.-celler ved hjælp af kuvette-typen FRRf. Vi bruger Act2-systemet udstyret med tre lysemitterende dioder (LED'er), der giver flash excitation energi centreret ved 444 nm, 512 nm og 633 nm48. Her svarer 444 nm (blå) til absorptionstoppen af chrophyll a (Chl-a), mens 512 nm (grøn) og 633 nm (orange) svarer til absorptionstoppene af henholdsvis phycoerythrin og phycocyanin. Den fluorescerende signaldetekteringstop er 682 nm med 30 nm halv båndbredde. Da det er svært at finde det planktoniske stadium af Colacium sp. i naturlige miljøer, blev deres vedhæftede fase indsamlet til eksperimenterne. Blandt de talrige substratorganismer,Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figur 1A, B, G) er en af de enkleste at håndtere på grund af deres langsomme svømmehastighed, store kropsstørrelse (400-650 μm) og unikke adfærd (hængende på hovedet på vandoverfladen). Derfor bruger denne protokol Colacium sp. fastgjort på S. mucronata som et casestudie af Colacium-basibiont-systemet. For at undgå fluorescens afledt af tarmindholdet blev S. mucronata sultet. Da en tidligere undersøgelse rapporterede, at fluorescenssignalet fra tarmindholdet (indtagne alger) viser et femdoblingsfald efter 40 min49, forventede vi, at 90 minutters sult ville være nok til at minimere muligheden for, at tarmindholdsfluorescens påvirker FRRf-målingen med minimale virkninger af eksperimentel stress til Colacium sp., såsom næringsstofmangel. Desuden blev denne protokol anvendt til at præcisere fastgørelsesmekanismen for Colacium sp. og bestemme, hvordan to metaller, calcium (Ca) og mangan (Mn) påvirker fotofysiologien af både planktoniske og vedhæftede trin. Calcium spiller nøgleroller i de fotosyntetiske veje50 på flere måder, og begge metaller er nødvendige for at konstruere de iltudviklende komplekser i PSII51. Da calcium og mangan er stærkt koncentreret i rygskjoldet af krebsdyr zooplankton47, antager vi, at Colacium sp. fotofysiologi kan reagere mere fremtrædende på Ca og Mn berigelse i planktonisk fase, hvis dette livsstadium opnår disse elementer fra S. mucronata under det vedhæftede stadium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøveudtagning

  1. Saml søvand fra overfladen med en spand. For at målrette Colacium sp. fastgjort til S. mucronata (figur 1A-C) filter 0,5-10 L søvand ved hjælp af et 100 μm nylonnet net52.
    BEMÆRK: S. mucronata ofte tæt aggregeret i lavt, eutrofisk, mudret vand, såsom blandt reed (phragmites) områder.
  2. Opbevar de koncentrerede prøver i 500 ml plastflasker med 350 ml søvand. Opbevares i mørke forhold.
  3. I laboratoriet hældes prøvevandet i et 500 ml bægerglas og lad det sætte sig i et par minutter.
  4. Filtrer søvandet gennem et 0,2 μm porestørrelsesfilter.
  5. Hent S. mucronata individer ved hjælp af en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse. Udfør artsidentifikation i henhold til Błędzki og Rybak53.
  6. Overfør dem til en dråbe 0,2-μm filtreret søvand (FLW) placeret på et glasglas.
    BEMÆRK: S. mucronata kan svømme til overfladen eller fastgøres til bægervæggen.
  7. Tjek S. mucronata under let mikroskopi.
  8. Vask S. mucronata individer, der bruger FLW (3 dråber eller mere) for at forhindre forurening fra andre organismer (figur 2).
  9. Behold S. mucronata ved en in situ-temperatur i et vækstkammer under 40 μmol foton·m−2·s−1.

2. Virkninger af S . mucronata på baseline fluorescens

  1. S. mucronata dyrkning
    1. Pick up S. mucronata individer ved hjælp af en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse og vask ved hjælp af FLW, som i trin 1.8.
    2. Luft vand fra hanen ved hjælp af en elektrisk luftpumpe via en luftsten i mindst 1 uge. Hæld 300 ml luftet ledningsvand i en 350 ml glasburk.
    3. Foder chlorella (1 mg C·L-1) og hold ved 20 °C under 40 μmol foton·m−2·s−1 i et vækstkammer.
    4. Efter ca. 14 dage skal du afhente 5-30 personer ved hjælp af en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse og inokulere dem i 300 ml rent, luftet ledningsvand for at holde mediet frisk.
  2. Opsætning af FRRf
    1. Start Act2Run-softwaren.
    2. Klik på fanen Indstillinger, og vælg Act2 FLC (hvide lysdioder) i Driftsform for at indstille farven på de aktiniske lysdioder.
    3. Klik på værdien af Mørk på trin 1 i indstillingerne for fluorescerende lyskurve i hovedvinduet, og skriv 30 for at indstille varigheden af den mørke periode (figur 3A).
    4. Klik på LED-kombinationen B, C og D for at slukke for de grønne og orange lysdioder (figur 3C).
    5. Klik på værdien af Fets og Pitch under Sat, og skriv henholdsvis 100 og 2 for at indstille antallet og tonehøjden for flashlet i mætningsfasen (figur 3D).
    6. Klik på værdien af Fets og Pitch under Rel, og skriv henholdsvis 40 og 60 for at indstille antallet og tonehøjden for flashlet i afslapningsfasen (figur 3E).
    7. Aktivér vandkappepumpen ved at klikke på Under FLC (figur 3F) for at kontrollere prøvetemperaturen under målingen.
    8. Aktivér ved at klikke på Auto-LED og Auto-PMT (figur 3F).
    9. Klik på Synkroniser for at forbinde FRRf-Act2.
  3. FRRf-målinger
    1. For at undersøge virkningerne af zooplankton individer på baseline fluorescens, forberede voksen S. mucronata (kropsstørrelse 400-650 μm) fra kulturen i trin 2.1.1-2.1.4 uden tilknyttede organismer.
    2. For at undgå fluorescens fra tarmindholdet skal individerne i FLW sultes ved 20 ° C i mindst 90 minutter.
    3. Hæld 1,5 ml FLW i en kuvette. Pick up 0, 1, 5 og 10 S. mucronata individer ved hjælp af en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse.
    4. Overfør S. mucronata individer i kuvetten og tilsæt FLW for at bringe prøven op til 2 ml.
    5. Akklimatiseret under svagt lys (1-10 μmol foton·m−2·s−1) ved 20 °C i 15 minutter før FRRf-måling.
    6. Klik på Act2 Run for at starte målingen. Gentag målingerne >3 gange pr. prøve.
    7. Læs Fo-værdien fra resultatplottet (figur 4).

3. Virkninger af substratorganisme på Chl- en fluorescens

  1. Colacium sp. dyrkning
    1. Forbered FLW og AF-6 medium54 til dyrkning (tabel 2).
    2. Saml Colacium sp. fastgjort til S. mucronata som i trin 1.1 og 1.2 og opbevares ved in situ-temperatur i et vækstkammer.
    3. Pick up Colacium sp. med en smeltet karapace (figur 1D) ved hjælp af en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse. Vask dem med FLW, som i trin 1.8.
    4. Aseptisk podning Colacium sp. og AF-6 medium i et 10 ml glasrør på en ren bænk.
    5. Hold kulturen ved in situ-temperatur under 200 μmol foton·m−2·s−1 i et vækstkammer. Ryst glasrøret forsigtigt i hånden mindst en gang om dagen for at forhindre celleafvikling.
      BEMÆRK: For at holde dæmpningseffekten af aggregerede kolonier så lav som muligt skal du kontrollere kolonierne under et mikroskop inden FRRf-måling. Celleaggregering kan forårsage tætte kolonier og påvirke algefotofysiologien55.
  2. FRRf-målinger
    1. For at undersøge virkningerne af zooplankton individer på Chl-a fluorescens fra Colacium sp., forberede voksen S. mucronata (kropsstørrelse 400-650 μm) uden tilknyttede organismer.
    2. For at undgå fluorescens fra tarmindholdet skal du sulte individerne i FLW i mindst 90 minutter.
    3. Opsæt et KUVETTE-type fluorometer med hurtig gentagelseshastighed (FRRf).
    4. Hæld en 1,5 ml delprøve af prækultureret Colacium sp. i en kuvette. Overfør 0, 5, 10 og 15 S. mucronata individer i disse kuvetter og tilsæt 2 μm filtreret medium for at bringe prøven op til 2 ml.
    5. Akklimatiseres under svagt lys (1-10 μmol foton·m−2·s−1) ved 20 °C i 15 minutter, før FRRf-målingen foretages.
      BEMÆRK: Vedligehold prøverne ved inkubationstemperatur under målinger
    6. Klik på Act2 Run for at starte målingen. Gentag målingerne >3 gange pr. prøve.
    7. Læs FO- og Fm-værdierne fra resultatplottet (figur 4).
      BEMÆRK: Kontroller RσPSII-værdien (tabel 1), som viser, om LED-effekten er inden for det optimale område for at estimere PSII-parametrene korrekt. Når Auto-LED'en er aktiveret, styrer Act2run-systemet LED-strømmen for at opnå et optimalt RσPSII-område (0,042-0,064). Den eksperimentelle RσPSII-afskæringsværdi blev defineret til 0,03 og 0,08 i en tidligere undersøgelse48.
    8. For at korrigere baselinefluorescensen22 filtreres kulturmediet ved hjælp af et 0,2 μm porestørrelsesfilter og fluorescensen måles. Træk FO af basisprøven fra FO og Fm i Colacium sp., eller rediger værdien Tom korrektion i Indstillinger under fanen Indstillinger.

4. Fotofysiologi af Colacium sp. (vedhæftet fase)

  1. Isoler S. mucronata individer med Colacium sp. ved hjælp af en pipette under et optisk mikroskop.
  2. Vask S. mucronata ved hjælp af FLW, som i trin 1.8.
  3. Overfør S. mucronata i en 100 ml FLW. Ved sult skal du opbevares under mørke forhold ved in situ-temperatur i 90 minutter.
  4. Hæld 1,5 ml FLW i en kuvette.
  5. Overfør ~ 10 S. mucronata individer med Colacium sp. i en kuvette. Til målinger er der brug for mere end 100 Colaciumceller pr. 2 ml. Tilsæt FLW for at bringe prøven op til 2 ml.
  6. Akklimatisere under svagt lys (1-10 μmol foton·m−2·s−1) ved in situ-temperatur i 15 min. Mål Chl-a fluorescens som i trin 3.2.6-3.2.8.
  7. For at opregne antallet af vedhæftede celler skal prøven fastgøres med glutaraldehyd (2% endeligt volumen) efter at have taget FRRf-målingen. Tag billeder på flere brændvidder og positioner af S. mucronata under et lysmikroskop.

5. Fotofysiologi af Colacium sp. (planktonisk stadium)

  1. Kultivér udtaget Colacium sp. i AF-6-medium ved in situ-temperatur som i trin 3.1.1-3.1.5.
  2. Til den stationære fase skal du tage 2 ml dyrket Colacium sp. og hæld i en kuvette.
  3. Akklimatisere under svagt lys (1-10 μmol foton·m−2·s−1) ved in situ-temperatur i 15 min. Mål Chl-a fluorescens som i trin 3.2.6-3.2.8.

6. Virkninger af Ca og Mn tilsætning på fotofysiologi af Colacium sp.

  1. Virkninger på vedhæftet fase
    1. Isoler S. mucronata individer med Colacium sp. ved hjælp af en pipette under et optisk mikroskop. Vask med FLW, som i trin 1.8.
    2. Overfør seks personer hver til 12 glasbægre med 30 ml FLW. Sørg for, at hvert bægerglas indeholder > 100 Colacium sp. celler.
    3. Tilsæt 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (Ca-behandling), 40 μmol· L-1 MnCl4 (Mn-behandling) eller ultrarent vand (kontrol) til hvert bægerglas. Inkubere prøverne under 200 μmol foton·m−2 ·s−1 ved in situ temperatur i et vækstkammer.
    4. Ved 3 timer og 21 timer overføres alle individer og smeltede skind til en kuvette med 2 ml af mediet.
    5. For at undersøge den hurtige reaktion på stigende lys skal du klikke på Op af perioderne med 8 aktiniske lystrin og type 20 (figur 3A) for at indstille varigheden af hvert trin i 20 s. For at indstille det trinvise aktiniske lys som 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 og 200 pmol foton·m−2·s−1 skal du klikke på Høj E og Trin op og ændre værdierne til henholdsvis 200 og 34 (figur 3B).
    6. Efter 15 minutters mørk akklimatisering måles Chl-a fluorescens af hver prøve svarende til trin 3.2.6-3.2.8.
      BEMÆRK: Kontroller, at værdierne for RσPSII og RσPSII ligger inden for det optimale område (0,03-0,08)48.
  2. Virkninger på planktonisk stadium
    1. Kultivér udtaget Colacium sp. i AF-6-medium ved in situ-temperatur som i trin 3.1.1-3.1.5.
    2. Overfør den dyrkede Colacium sp. til FLW og akklimatiseret ved in situ-temperatur mindre end 200 μmol foton·m-2·s-1 i 3 dage.
    3. 1 ml af de akklimatiserede prøver overføres til tre glashætteglas med 10 ml FLW.
    4. Tilsæt 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (Ca-behandling), 40 μmol· L-1 MnCl3 (Mn-behandling) eller ultrarent vand (kontrol) til hætteglas. Inkubere prøverne under 200 μmol foton·m−2·s−1 ved in situ-temperatur i et vækstkammer.
    5. Ved 3 timer og 21 timer måles Chl-a-fluorescens af hver prøve som i trin 3.2.6-3.2.8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der var ingen signifikant effekt af baseline fluorescens (figur 5) eller Chl-a fluorescens (figur 6) af S. mucronata op til 5 personer (inds.) ml-1. Fv/Fm og NPQNSV blev dog signifikant påvirket, da S. mucronata var 7,5 inds·ml-1. Derfor valgte vi til måling af fotofysiologien af Colacium sp. under det vedhæftede stadium S. mucronata med den højere byrde af Colacium sp. for at nå tilstrækkelig Colacium sp. overflod (>50 celler · ml -1) og et lavt antal S. mucronata (≤5 inds · ml -1) i kuvetten.

Tabel 3 viser sæsonvariation i fotofysiologi af Colacium sp. i det vedhæftede stadium. Selvom prøveudtagningstemperaturen varierede, forblev deres fotofysiologi relativt konstant. σ PSII varierede fra 3,42 nm2 til 3,76 nm2 (gennemsnit 3,60 nm2), Fv/Fm varierede fra 0,52 til 0,60 (gennemsnit 0,55), og NPQNSV varierede fra 0,66 til 0,85 (gennemsnit 0,82). For at validere disse resultater undersøgte vi yderligere variationer i Colacium sp. fotofysiologi under planktonstadiet for den stationære fase i AF-6-mediet (tabel 4). Gennemsnitlig Fv/Fm og NPQNSV for det vedhæftede trin svarede til dem i planktonstadiet, når de blev inkuberet i AF-6-medium.

For at bestemme effekten af Ca og Mn på Colacium sp. fotofysiologi i både de vedhæftede og planktoniske stadier udførte vi Ca og Mn berigelse eksperimenter. Prøver blev taget fra reedområdet ved Biwa-søen den 7. maj 2021. For det vedhæftede stadium af Colacium sp. under mørke forhold var der ingen signifikant forskel i fotofysiologiske parametre blandt behandlingerne, bortset fra NPQNSV mellem Mn- og Ca-behandlinger ved 3 timer, hvor Ca < Mn (figur 7A, C, E). Endvidere viste σ PSII′, Fq′/Fm′ og NPQNSV-reaktioner på stigende lys under det vedhæftede trin ingen klare forskelle mellem behandlingerne (figur 8A, C, E og figur 9A, C, E). NPQNSV havde imidlertid en tendens til at være lavere i Ca-behandlingen end kontrollen ved en lav lysintensitet ved 21 timer (11 og 25 μmol foton·m−2·s−1, figur 9E). For planktonstadiet var σ PSII signifikant lavere i Mn end Ca-behandlingen ved 3 timer (figur 7B). Fq′/Fm′ var signifikant højere, men NPQNSV var lavere i Mn-behandlingen end kontrollen ved 21 timer (figur 7D,F). Under stigende lys havde Mn en tendens til at falde σ PSII og øge Fq′/Fm′ under planktonisk stadium sammenlignet med kontrollen ved 3 timer (figur 8D). Tilsvarende reducerede Mn signifikant NPQNSV under planktonstadiet sammenlignet med kontrollen ved 21 timer (figur 9F). I lighed med det vedhæftede trin forbedrede calcium lidt NPQNSV for planktonstadiet under stigende lys (figur 9F). Ca reducerede imidlertid Fq′/Fm′ og øgede NPQNSV for planktonstadiet sammenlignet med Mn-behandling under 44-200 μmol foton·m−2·s−1 ved 3 timer (figur 8D,F).

Figure 1
Figur 1: Colacium sp. og stoforganismen Scapholeberis mucronata. (A) Inficeret S. mucronata. (B) Inficeret S. mucronata fastgjort med glutaraldehyd. (C) Vedhæftede Colacium-celler på levende S. mucronata. (D) Vedhæftede Colacium-celler på det smeltede rygskjold. (E, F) Colacium sp. af planktonisk (palmella) stadium. G) Ikke-inficeret S. mucronata. Pile angiver Colacium-celler. Skalastænger: 200 μm (A, B og G), 10 μm (C, E og F) og 100 μm (D). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vask af zooplankton ved pipettering under filtreret søvand (FLW). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Act2Run-softwarens brugergrænseflade. (A) Eksponeringstid for hvert aktinisk lystrin; B) Antal trin og fotonflux af aktinisk lys (C) Kombination af excitationsbølgelængde; D) Mætnings- og afslapningsflashletsekvens E) Frekvenser og intensiteter af vandkappen og prøveblandingspumperne (F) Fotonflux af excitationsflash ved 444 (betegnet som 450 her), 512 (530) og 633 nm (624), fotomultiplikatorrør (PMT) spænding og replikater og sekvensinterval. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Fluorescensaflæsning af algeprøven på Act2Run-software. De røde og blå linjer angiver rå fluorescenssignal ved hjælp af en sekvens af blink og kurve, der passer i henholdsvis mætnings- og afslapningsfaser. Se Kolber et al.2 for flere detaljer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Effekten af S. mucronata densitet på baseline fluorescens. De små prikker repræsenterer replikater (n = 3). Resultaterne af ANOVA-testen vises også. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Virkningerne af S. mucronata densiteter på (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv / Fm og (D) NPQNSV for Colacium sp. under planktonisk stadium. De små prikker repræsenterer replikater (n = 3). Colacium sp. blev dyrket i AF-6 medium. Resultaterne af ANOVA og Tukey post-hoc test præsenteres også. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Reaktioner af (A,B) absorptionstværsnit, (C,D) PSII-fotokemi og (E,F) ikke-fotokemisk slukning af (A,C,E) vedhæftet trin og (B,D,F) planktonisk stadium af Colacium sp. ved 3 timer og 21 timer efter Ca og Mn-tilsætning. De små prikker repræsenterer replikater (n = 4). Resultaterne af ANOVA og Tukey post-hoc test præsenteres også. * p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Hurtige lysresponser af (A, B) absorptionstværsnit, (C,D) PSII-fotokemi og (E,F) ikke-fotokemisk slukning af Colacium sp. i vedhæftede og planktoniske trin til trinvis lysprotokol ved 3 timer efter Ca og Mn-tilsætning. C, kontrol; Ca, 200 μM Ca; Signifikante forskelle mellem (a) C og Ca, (b) C og Mn og (c) Ca og Mn og (c) Ca og Mn ved hver PAR-flux med et signifikansniveau på p < 0,05 vist i hvert panel. Fejllinje, Gennemsnitlig SD (n = 4). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Hurtige lysresponser af (A,B) absorptionstværsnit, (C,D) PSII-fotokemi og (E,F) ikke-fotokemisk slukning af Colacium sp. i vedhæftede og planktoniske trin til trinvis lysprotokol ved 21 timer efter Ca og Mn-tilsætning. C, kontrol; Ca, 200 μM Ca; Signifikante forskelle mellem (a) C og Ca, (b) C og Mn og (c) Ca og Mn og (c) Ca og Mn ved hver PAR-flux med et signifikansniveau på p < 0,05 vist i hvert panel. Fejllinje, Gennemsnitlig SD (n = 4). Klik her for at se en større version af denne figur.

Udtryk Definition Enheder
Baseline fluorescens Fo værdi uden Chl-a fluorescens
F' Fluorescens ved nulte flashlet af en enkelt omsætningsmåling, når C>0
Fo (ʹ) Minimum PSII-fluorescensudbytte (under baggrundslys) ved nul flashlet
Fv (ʹ) Fm(ʹ) − Fo(ʹ)
Fm (ʹ) Maksimalt PSII-fluorescensudbytte (under baggrundslys)
Fv/Fm Maksimal PSII fotokemisk effektivitet under mørke
Fqʹ/Fmʹ Maksimal PSII-fotokemisk effektivitet under baggrundsbelysning (Fmʹ− F)/(Fmʹ)
NPQNSV Normaliseret Stern-Volmer slukning, FOʹ/(Fmʹ − FOʹ)
[RCII] Koncentration af reaktionscenter
RσPSII (ʹ) Sandsynligheden for, at en RCII lukkes under det første blink i en enkelt omsætningsmætningsfase (under baggrundslys)
σ PSII (ʹ) PSII's funktionelle absorptionstværsnit til excitationsblink (under baggrundsbelysning) Nm2

Tabel 1: Udtryk, der anvendes i denne protokol.

Komponent Kvantitet
NaNO3 140 mg· L−1
44 KR. 22 mg· L−1
MgSO4·7H2O 30 mg· L−1
KH2PO4 10 mg· L−1
K2HPO4 5 mg· L−1
CaCl2·2H2O 10 mg· L−1
CaCO3 10 mg· L−1
Fe-citrat* 2 mg· L−1
Citronsyre* 2 mg· L−1
Biotin 0,002 mg· L−1
Vit.B 1 0,01 mg· L−1
Vit.B 6 0,001 mg· L−1
Vit.B 12 0,001 mg· L−1
Spor metaller 1 mL·L−1
(FeCl3·6H2O) (1,0 mg·ml-1)
(MnCl3·4H2O) (0,4 mg·ml-1)
(ZnSO4·7H2O) (0,005 mg·ml−1)
(CoCl2·6H2O) (0,002 mg·ml-1)
(Na2MoO4) (0,004 mg·ml−1)
(Na2-EDTA) (7,5 mg·ml-1)

Tabel 2: Opskrift på AF-6 medium. Juster pH til 6,6. Fecitrat og citronsyre opløses separat i varm H2O, og HCl (1 ml·L-1) opløses efter blanding af begge reagenser. Indhold af spormetaller er vist i parentes.

Dato for prøveudtagning Eksempel nr. Vand temp.
(°C) 		S. mucronata tæthed
(inds.· ml−1)		 Colacium sp. celletæthed
(inds.· ml−1)		 σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
Maj 27/2020 Nr. 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
SE 0.22 0.01 0.04
Maj 21/2020 Nr. 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
Nr. 3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
Nr. 4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
18. jun. 2020 Nr. 5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
Nr. 6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
Nr. 7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
Maj 20/2020 Nr. 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
SE 0.10 0.00 0.00
Betyde 3.60 0.55 0.82
S.D. 0.120349 0.03 0.10

Tabel 3: Fotofysiologi af Colacium sp. fastgjort på S. mucronata.

Dato for prøveudtagning Eksempel nr. Medium Væksttemperatur (°C) σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
Maj 21/2020 Nr. 1 AF-6 19.4 2.72 0.65 0.53
SE 0.03 0.00 0.01
18. jun. 2020 Nr. 2 AF-6 22.4 3.07 0.55 0.84
SE 0.08 0.02 0.07
Maj 20/2020 Nr. 3 AF-6 27.5 2.90 0.58 0.73
SE 0.06 0.01 0.02
Betyde 2.90 0.59 0.70
S.D. 0.18 0.05 0.16

Tabel 4: Fotofysiologi af Colacium sp. planktonisk stadium. Hver prøve blev målt i den stationære fase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol viste for første gang, at fotofysiologi af Colacium sp. under det vedhæftede stadium i et naturligt miljø kan sammenlignes med dets planktoniske stadium i AF-6-medium. Derudover påvirkede tarmindholdet i udsultet S. mucronata ikke baseline og Chl-a fluorescens, når densiteten var ≤5 inds·ml-1 (figur 5 og figur 6). Disse resultater tyder på, at denne protokol kan måle fotofysiologi af Colacium sp. under det vedhæftede stadium uden korrektion under lav substratorganisme overflod. Resultaterne fra trin 3.2.1-3.2.8 viste imidlertid, at den højeste forekomst af S. mucronata påvirkede Fv/Fm og NPQNSV betydeligt, men ikke FO og σ PSII (figur 4). Her er det muligt højere organismetæthed forværret fysisk stress på Colacium sp. individer og efterfølgende nedsat fotosyntetisk aktivitet. For målinger under en stor forekomst af substratorganismer eller andre arter kræver virkningerne af substratorganismens tæthed på basislinjen og Chl-a-fluorescens yderligere opmærksomhed.

FRRF'er er blevet brugt til at undersøge virkningen af næringsstofmanipulation på den lineære elektronstrøm og ikke-fotokemisk slukning af fytoplankton22,56,57. De primære resultater viser, at Ca og Mn berigelse varierede signifikant mellem Colacium sp. livsstadier (figur 7, figur 8 og figur 9). Specifikt forbedrede mangan klart det (maksimale) fotokemiske udbytte af PSII (Fv/Fm og Fq′/Fm′) og reducerede varmeafledningen (NPQNSV)50 af planktoniske stadier under mørke (figur 7D,F) og lysforhold (figur 8D,F og figur 9D,F). Disse resultater kan stamme fra reduceret antennestørrelse på PSII, σ PSII og σ PSII′ (figur 7B og figur 8B), hvilket reducerer overskydende lysabsorption58,59. Måling af antennestørrelse ud over energistrømmen mellem PSII-komplekser ville muliggøre mere præcise målinger af algeresponsen10. Denne protokol tillader også undersøgelse af fotosyntesebegrænsninger af andre ressourcer. For eksempel er kvælstof- og fosforbegrænsninger blevet undersøgt i forskellige fytoplanktonsamfund, men ikke i epizoiske alger, på trods af forudsagte virkninger på Colacium41 og marine epizoiske diatomer60,61. Ud over næringsstoffer kan lysmiljøet yderligere påvirke epizoernes fordeling44.

Som vist i figur 7, figur 8 og figur 9 giver FRRf af kuvettetypen os mulighed for samtidig at undersøge nærings- og lyseffekter uden lange inkubationstider og måleindsats. Denne trinvise lysprotokol (trin 6.1.5) kan også tegne kurver for hurtigt lys for relative elektrontransporthastigheder (rETR = Fq′/Fm′× lys) vs. lys som analog til produktion vs. lyskurver62. Selvom lineær elektronstrøm i PSII kan estimeres ud fra fotofysiologiske parametre af FRRf, er den imidlertid ikke nødvendigvis analog med carbonfikseringshastigheden63,64. Til estimering af kulstofbaseret primærproduktion bør elektronbehov pr. CO2-fiksering (Фe, C), som kan variere tidsmæssigt og rumligt5,48, undersøges, når man vurderer fagsamfund.

Hvis planktonnettet er tilstoppet af snavs, skal du forscreene med et større net, såsom et 5 mm netnet, eller plukke zooplanktoner direkte fra søvandet ved hjælp af en pipette uden filtrering. Det skal bemærkes, at der kan opstå en vis skade på de vedhæftede alger, selv når filtreringen udføres forsigtigt ved hjælp af en relativt stor (200 μm) maskestørrelse. Selv om resultaterne viser, at PSII-parametrenes standardafvigelse var lille (tabel 3), og gennemsnitsværdierne for parametrene var meget lig dem i det dyrkede planktoniske stadium (tabel 4), kan prøveudtagning uden filtrering være ideel.

En anden begrænsning af denne undersøgelse var at udlede σ PSII. Aktinisk lys og Chl-a fluorescensdæmpning kan udøve en stor indflydelse/forvrængning på FRRF'erne, som er afhængige af optisk tynde prøver for nøjagtig σ PSII-bestemmelse65. Selvom vi viste, at S. mucronata ikke påvirkede σ PSII af planktoniske Colacium-celler, bør det undersøges relateret til σ PSII af de vedhæftede Colacium-celler. Desuden vil der være behov for en spektralkorrektionsfaktor (SCF) til σ PSII in situ66-estimeringen, da EXCITATIONSBØLGELÆNGDEN FOR ACT2-SYSTEMET (444 nm) adskiller sig fra spektralfordelingen af in situ-lysmiljøet. Generelt bruges filterpudeteknikken til at måle Chl-et specifikt absorptionsspektrum til beregning af SCF. Denne procedure er nødvendig for at estimere FRRF'ernes primære algeproduktivitet. Da vi ikke kunne høste nok vedhæftede Colacium-celler gennem undersøgelsesperioden, bør Chl-a-a specifikke absorptionsspektrum undersøges i fremtidige undersøgelser.

Implementering af KUVETTE-TYPE FRRF bør afhænge af substratstørrelsen, da perifytiske alger kræver en substratfastgørelse. For eksempel kan undersøgelser af alger på uforgængelige stoffer, såsom klipper67, større organismer26,68 eller symbiotiske alger, herunder symbiodinium forbundet med hårde koraller10,69,70, kræve FRRf69 af nedsænket type. Omvendt, hvis basibionten er lille nok til at suspendere sig selv i en kuvette, kan en KUVETTE-TYPE FRRF være tilstrækkelig ud over en kuvette-type PAM, såsom bentiske alger16,17,18. Faktisk har nylige undersøgelser undersøgt en KUVETTE-TYPE FRRF til måling af fotofysiologien af isalger24,25. Desuden muliggør tænding af excitationsblitzen ved 512 og 633 nm anvendelsen på cyanobakterier med forskellige PSII-antennepigmenter, phycoerythrins og phycocyaniner og dermed forskellige absorptionstoppe med Chl-a71. Da de nuværende FRRf-modeller, der indeholder multi-excitationsbølgelængder, er nyttige værktøjer til undersøgelse af cyanobakteriefotofysiologi og produktivitet7,66,72, bør disse være nyttige metoder til vurdering af bentiske cyanobakterier, hvis virkningerne af prøvetykkelse på fotofysiologiske parametre ville blive forbedret65 . I fremtidige undersøgelser bør FRRF'er rettes mod en bredere vifte af forsøgsorganismer for at give yderligere indsigt i algefotofysiologiens komplekse mekanismer på tværs af forskellige levesteder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger at erklære.

Acknowledgments

Arbejdet blev støttet af Collaborative Research Fund fra Shiga Prefecture med titlen "Study on water quality and lake-bottom environment for the protection of the solidness of water environment" under det japanske tilskud til regional revitalisering og Environment Research and Technology Development Fund (nr. 5-1607) fra Miljøministeriet, Japan. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Forfatterne vil gerne takke Enago (www.enago.jp) for den engelsksprogede anmeldelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolber, Z., Falkowski, P. G. Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1646-1665 (1993).
  2. Kolber, Z. S., Prášil, O., Falkowski, P. G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1367 (1), 88-106 (1998).
  3. Oxborough, K., Moore, C. M., Suggett, D. J., Lawson, T., Chan, H. G., Geider, R. J. Direct estimation of functional PSII reaction center concentration and PSII electron flux on a volume basis: a new approach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry (FRRf) data. Limnology and Oceanography: Methods. 10 (3), 142-154 (2012).
  4. Smyth, T. J., Pemberton, K. L., Aiken, J., Geider, R. J. A methodology to determine primary production and phytoplankton photosynthetic parameters from fast repetition rate fluorometry. Journal of Plankton Research. 26 (11), 1337-1350 (2004).
  5. Lawrenz, E., et al. Predicting the electron requirement for carbon fixation in seas and oceans. PLoS ONE. 8 (3), 58137 (2013).
  6. Zhu, Y., et al. Relationship between light, community composition and the electron requirement for carbon fixation in natural phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 580, 83-100 (2017).
  7. Schuback, N., Tortell, P. D. Diurnal regulation of photosynthetic light absorption, electron transport and carbon fixation in two contrasting oceanic environments. Biogeosciences. 16 (7), 1381-1399 (2019).
  8. Cosgrove, J., Borowitzka, M. A. Chlorophyll fluorescence terminology: an introduction. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 1-17 (2010).
  9. McKew, B. A., et al. The trade-off between the light-harvesting and photoprotective functions of fucoxanthin-chlorophyll proteins dominates light acclimation in Emiliania huxleyi (clone CCMP 1516). New Phytologist. 200 (1), 74-85 (2013).
  10. Warner, M. E., Lesser, M. P., Ralph, P. J. Chlorophyll fluorescence in reef building corals. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 209-222 (2010).
  11. Bhagooli, R., et al. Chlorophyll fluorescence - A tool to assess photosynthetic performance and stress photophysiology in symbiotic marine invertebrates and seaplants. Marine Pollution Bulletin. 165, 112059 (2021).
  12. Zavafer, A., Labeeuw, L., Mancilla, C. Global trends of usage of chlorophyll fluorescence and projections for the next decade. Plant Phenomics. 2020, 6293145 (2020).
  13. Goto, N., Tanaka, Y., Mitamura, O. Relationships between carbon flow through freshwater phytoplankton and environmental factors in Lake Biwa, Japan. Fundamental and Applied Limnology/Archiv für Hydrobiologie. 184 (4), 261-275 (2014).
  14. Napoléon, C., Raimbault, V., Claquin, P. Influence of nutrient stress on the relationships between PAM measurements and carbon incorporation in four phytoplankton species. PLOS ONE. 8 (6), 66423 (2013).
  15. Morris, E. P., Kromkamp, J. C. Influence of temperature on the relationship between oxygen- and fluorescence-based estimates of photosynthetic parameters in a marine benthic diatom (Cylindrotheca closterium). European Journal of Phycology. 38 (2), 133-142 (2003).
  16. Fraga, S., Rodríguez, F., Bravo, I., Zapata, M., Marañón, E. Review of the main ecological features affecting benthic dinoflagellate blooms. Cryptogamie, Algologie. 33 (2), 171-179 (2012).
  17. McMinn, A., et al. Quantum yield of the marine benthic microflora of near-shore coastal Penang, Malaysia. Marine and Freshwater Research. 56 (7), 1047-1053 (2005).
  18. Salleh, S., McMinn, A. The effects of temperature on the photosynthetic parameters and recovery of two temperate benthic microalgae, Amphora cf. coffeaeformis and Cocconeis cf. sublittoralis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 47 (6), 1413-1424 (2011).
  19. McMinn, A., Pankowskii, A., Ashworth, C., Bhagooli, R., Ralph, P., Ryan, K. In situ net primary productivity and photosynthesis of Antarctic sea ice algal, phytoplankton and benthic algal communities. Marine Biology. 157 (6), 1345-1356 (2010).
  20. Garbary, D. J., Bird, C. J., Kim, K. Y. Sporocladopsis jackii, sp. nov. (Chroolepidaceae, chlorophyta): a new species from eastern Canada and Maine symbiotic with the mud snail, Ilyanassa obsoleta (Gastropoda). Rhodora. 107 (929), 52-68 (2005).
  21. Suggett, D. J., Oxborough, K., Baker, N. R., MacIntyre, H. L., Kana, T. M., Geider, R. J. Fast repetition rate and pulse amplitude modulation chlorophyll a fluorescence measurements for assessment of photosynthetic electron transport in marine phytoplankton. European Journal of Phycology. 38 (4), 371-384 (2003).
  22. Hughes, D. J., et al. Impact of nitrogen availability upon the electron requirement for carbon fixation in Australian coastal phytoplankton communities. Limnology and Oceanography. 63 (5), 1891-1910 (2018).
  23. Melrose, D. C., Oviatt, C. A., O'Reilly, J. E., Berman, M. S. Comparisons of fast repetition rate fluorescence estimated primary production and 14C uptake by phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 311, 37-46 (2006).
  24. Yoshida, K., Seger, A., Kennedy, F., McMinn, A., Suzuki, K. Freezing, melting, and light stress on the photophysiology of ice algae: ex situ incubation of the ice algal diatom Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae) using an ice tank. Journal of Phycology. 56 (5), 1323-1338 (2020).
  25. Selz, V., et al. Ice algal communities in the Chukchi and Beaufort Seas in spring and early summer: composition, distribution, and coupling with phytoplankton assemblages. Limnology and Oceanography. 63 (3), 1109-1133 (2018).
  26. Falasco, E., Bo, T., Ghia, D., Gruppuso, L., Bona, F., Fenoglio, S. Diatoms prefer strangers: non-indigenous crayfish host completely different epizoic algal diatom communities from sympatric native species. Biological Invasions. 20 (10), 2767-2776 (2018).
  27. Møhlenberg, F., Kaas, H. Colacium vesiculosum Ehrenberg (Euglenophyceae), infestation of planktonic copepods in the Western Baltic. Ophelia. 31 (2), 125-132 (1990).
  28. Zalocar, Y., Frutos, S. M., Casco, S. L., Forastier, M. E., Vallejos, S. V. Prevalence of Colacium vesiculosum (Colaciales: Euglenophyceae) on planktonic crustaceans in a subtropical shallow lake of Argentina. Revista De Biologia Tropical. 59 (3), 1295-1306 (2011).
  29. Barea-Arco, J., Pérez-Martínez, C., Morales-Baquero, R. Evidence of a mutualistic relationship between an algal epibiont and its host, Daphnia pulicaria. Limnology and Oceanography. 46 (4), 871-881 (2001).
  30. Decaestecker, E., Declerck, S., De Meester, L., Ebert, D. Ecological implications of parasites in natural Daphnia populations. Oecologia. 144 (3), 382-390 (2005).
  31. Allen, Y. C., Stasio, B. T. D., Ramcharan, C. W. Individual and population level consequences of an algal epibiont on Daphnia. Limnology and Oceanography. 38 (3), 592-601 (1993).
  32. Willey, R. L., Cantrell, P. A., Threlkeld, S. T. Epibiotic euglenoid flagellates increase the susceptibility of some zooplankton to fish predation. Limnology and Oceanography. 35 (4), 952-959 (1990).
  33. Green, J. Parasites and epibionts of Cladocera. The Transactions of the Zoological Society of London. 32 (6), 417-515 (1974).
  34. Evans, M. S., Sicko-Goad, L. M., Omair, M. Seasonal occurrence of Tokophrya quadripartita (Suctoria) as epibionts on adult Limnocalanus macrurus (Copepoda: Calanoida) in southeastern Lake Michigan. Transactions of the American Microscopical Society. 98 (1), 102-109 (1979).
  35. Chiavelli, D. A., Mills, E. L., Threlkeld, S. T. Host preference, seasonality, and community interactions of zooplankton epibionts. Limnology and Oceanography. 38 (3), 574-583 (1993).
  36. Willey, R. L., Willey, R. B., Threlkeld, S. T. Planktivore effects on zooplankton epibiont communities: epibiont pigmentation effects. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1818-1822 (1993).
  37. Rosowski, J. R., Willey, R. L. Colacium libellae sp. nov. (euglenophyceae), a photosynthetic inhabitant of the larval damselfly rectum. Journal of Phycology. 11 (3), 310-315 (1975).
  38. Willey, R. L., Threlkeld, S. T. Organization of crustacean epizoan communities in a chain of subalpine ponds. Limnology and Oceanography. 38 (3), 623-627 (1993).
  39. Al-Dhaheri, R. S., Willey, R. L. Colonization and reproduction of the epibiotic flagellate Colacium vesiculosum (euglenophyceae) on Daphnia pulex. Journal of Phycology. 32 (5), 770-774 (1996).
  40. Rosowski, J. R. Photosynthetic euglenoids. Freshwater Algae of North America. , Elsevier Science. USA. 383-422 (2003).
  41. Rosowski, J. R., Kugrens, P. Observations on the euglenoid Colacium with special reference to the formation and morphology of attachment material. Journal of Phycology. 9 (4), 370-383 (1973).
  42. Salmaso, N., Tolotti, M. Other phytoflagellates and groups of lesser importance. Encyclopedia of Inland Waters. , Academic Press. 174-183 (2009).
  43. Threlkeld, S. T., Chiavelli, D. A., Willey, R. L. The organization of zooplankton epibiont communities. Trends in Ecology & Evolution. 8 (9), 317-321 (1993).
  44. Bertolo, A., Rodríguez, M. A., Lacroix, G. Control mechanisms of photosynthetic epibionts on zooplankton: an experimental approach. Ecosphere. 6 (11), (2015).
  45. Pringsheim, E. G. Notiz über Colacium (Euglenaceae). Österreichische Botanische Zeitschrift. 100 (3), 270-275 (1953).
  46. Wołowski, K., Duangjan, K., Peerapornpisal, Y. Colacium minimum (Euglenophyta), a new epiphytic species for Asia. Polish Botanical Journal. 60 (2), 179-185 (2015).
  47. Martin, J. H., Knauer, G. A. The elemental composition of plankton. Geochimica et Cosmochimica Acta. 37 (7), 1639-1653 (1973).
  48. Kazama, T., Hayakawa, K., Kuwahara, V. S., Shimotori, K., Imai, A., Komatsu, K. Development of photosynthetic carbon fixation model using multi-excitation wavelength fast repetition rate fluorometry in Lake Biwa. PLOS ONE. 16 (2), 0238013 (2021).
  49. Chesney, T., Sastri, A. R., Beisner, B. E., Nandini, S., Sarma, S. S. S., Juneau, P. Application of fluorometry (Phyto-PAM) for assessing food selection by cladocerans. Hydrobiologia. 829 (1), 133-142 (2019).
  50. Wang, Q., Yang, S., Wan, S., Li, X. The significance of calcium in photosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1353 (2019).
  51. Dau, H., Haumann, M. Eight steps preceding O-O bond formation in oxygenic photosynthesis-A basic reaction cycle of the photosystem II manganese complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767 (6), 472-483 (2007).
  52. Suthers, I., Bowling, L., Kobayashi, T., Rissik, D. Sampling methods for plankton. Plankton: A guide to their ecology and monitoring for water quality. , CSIRO Publishing. Melbourne. 63-90 (2019).
  53. Błędzki, L. A., Rybak, J. I. Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, with notes on ecology, distribution, methods and introduction to data analysis. , Springer. Switzerland. (2016).
  54. Kato, S. Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. (Euglenophyceae). Japanese Journal of Phycology (Sorui). 30, 63-67 (1982).
  55. Serôdio, J., Campbell, D. A. Photoinhibition in optically thick samples: Effects of light attenuation on chlorophyll fluorescence-based parameters. Journal of Theoretical Biology. 513, 110580 (2021).
  56. Sylvan, J. B., Quigg, A., Tozzi, S., Ammerman, J. W. Eutrophication-induced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: evidence from fast repetition rate fluorometry. Limnology and Oceanography. 52 (6), 2679-2685 (2007).
  57. Browning, T. J., et al. P. Nutrient regulation of late spring phytoplankton blooms in the midlatitude North Atlantic. Limnology and Oceanography. 65 (6), 1136-1148 (2020).
  58. Pausch, F., Bischof, K., Trimborn, S. Iron and manganese co-limit growth of the Southern Ocean diatom Chaetoceros debilis. PLOS ONE. 14 (9), 0221959 (2019).
  59. Ferroni, L., Baldisserotto, C., Fasulo, M. P., Pagnoni, A., Pancaldi, S. Adaptive modifications of the photosynthetic apparatus in Euglena gracilis Klebs exposed to manganese excess. Protoplasma. 224 (3), 167-177 (2004).
  60. Gaiser, E. E., Bachmann, R. W. Seasonality, substrate pereference and attachment sites of epizoic diatoms on cladoceran zooplankton. Journal of Plankton Research. 16 (1), 53-68 (1994).
  61. Totti, C., et al. The diversity of epizoic diatoms: relationships between diatoms and marine invertebrates. The Diversity of Epizoic Diatoms. 16, 323-343 (2011).
  62. Perkins, M., Effler, S. W., Strait, C. M. Phytoplankton absorption and the chlorophyll a-specific absorption coefficient in dynamic Onondaga Lake. Inland Waters. 4 (2), 133-146 (2014).
  63. Kromkamp, J., Capuzzo, E., Philippart, C. J. M. Measuring phytoplankton primary production: review of existing methodologies and suggestions for a common approach. EcApRHA Deliverable WP 3.2. 28, (2017).
  64. Hughes, D., et al. Roadmaps and detours: active chlorophyll-a assessments of primary productivity across marine and freshwater systems. Environmental Science & Technology. 52 (21), 12039-12054 (2018).
  65. Perkins, R. G., et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. 4, Springer. Dordrecht. 237-275 (2010).
  66. Schuback, N., Flecken, M., Maldonado, M. T., Tortell, P. D. Diurnal variation in the coupling of photosynthetic electron transport and carbon fixation in iron-limited phytoplankton in the NE subarctic Pacific. Biogeosciences. 13 (4), 1019-1035 (2016).
  67. Schreiber, U., Gademann, R., Ralph, P. J., Larkum, A. W. D. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements. Plant and Cell Physiology. 38 (8), 945-951 (1997).
  68. Garbary, D. J., Miller, A. G., Scrosati, R. A. Ascophyllum nodosum and its symbionts: XI. The epiphyte Vertebrata lanosa performs better photosynthetically when attached to Ascophyllum than when alone. Algae. 29 (4), 321-331 (2014).
  69. Gorbunov, M. Y., Kolber, Z. S., Lesser, M. P., Falkowski, P. G. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. Limnology and Oceanography. 46 (1), 75-85 (2001).
  70. Yellowlees, D., Warner, M. Photosynthesis in symbiotic algae. Photosynthesis in Algae. 14, Springer. Dordrecht. 437-455 (2003).
  71. Wojtasiewicz, B., Stoń-Egiert, J. Bio-optical characterization of selected cyanobacteria strains present in marine and freshwater ecosystems. Journal of Applied Phycology. 28 (4), 2299-2314 (2016).
  72. Aardema, H. M., Rijkeboer, M., Lefebvre, A., Veen, A., Kromkamp, J. C. High-resolution underway measurements of phytoplankton photosynthesis and abundance as an innovative addition to water quality monitoring programs. Ocean Science. 15 (5), 1267-1285 (2019).

Tags

Biologi udgave 177 bænk-top FRRf Colacium sp. epibiont epizoiske alger Biwa-søen fotofysiologi
Måling af fotofysiologi af vedhæftet fase af <em>colacium</em> sp. ved hjælp af et Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter