Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى قياس المعلمات الديناميكية (النتوءات ، التراجع ، الكشكشة) للنتوءات على حافة الخلايا المنتشرة.
Abstract
يعتمد تطوير وتوازن الكائنات الحية متعددة الخلايا على التنظيم المنسق لهجرة الخلايا. هجرة الخلايا هي حدث أساسي في بناء وتجديد الأنسجة ، وهي حاسمة في التطور الجنيني ، والاستجابات المناعية ، والتئام الجروح. يساهم خلل تنظيم حركة الخلايا في الاضطرابات المرضية ، مثل الالتهاب المزمن وورم خبيث سرطاني. تبدأ هجرة الخلايا وغزو الأنسجة والمحور العصبي ونمو التشعبات مع نتوءات حافة الخلية بوساطة بلمرة الأكتين. هنا ، نصف طريقة بسيطة وفعالة وموفرة للوقت للتصوير والتحليل الكمي لديناميكيات نتوء حافة الخلية أثناء الانتشار. تقيس هذه الطريقة السمات المنفصلة لديناميكيات غشاء حافة الخلية، مثل النتوءات والتراجع والكشكشة، ويمكن استخدامها لتقييم كيفية تأثير التلاعب بمنظمات الأكتين الرئيسية على نتوءات حافة الخلية في سياقات متنوعة.
Introduction
هجرة الخلايا هي عملية حاسمة تتحكم في تطور ووظيفة جميع الكائنات الحية. تحدث هجرة الخلايا في كل من الحالات الفسيولوجية ، مثل التكوين الجنيني ، والتئام الجروح ، والاستجابة المناعية ، وفي الحالات المرضية ، مثل ورم خبيث سرطاني وأمراض المناعة الذاتية. على الرغم من الاختلافات في أنواع الخلايا التي تشارك في أحداث الهجرة المختلفة، فإن جميع أحداث حركية الخلايا تشترك في آليات جزيئية مماثلة، والتي تم حفظها في التطور من البروتوزوا إلى الثدييات، وتتضمن آليات مشتركة للتحكم في الهيكل الخلوي يمكنها استشعار البيئة، والاستجابة للإشارات، وتعديل سلوك الخلية استجابة لذلك1.
يمكن أن تكون المرحلة الأولية في هجرة الخلايا هي تكوين نتوءات ديناميكية للغاية في الحافة الأمامية للخلية. خلف الصفيحة يمكن للمرء أن يجد الصفيحة ، التي تزاوج بين الانقباض بوساطة الميوسين II وتتوسط الالتصاق بالركيزة الأساسية. يتم تحفيز Lamellipodia بواسطة محفزات خارج الخلية مثل عوامل النمو والسيتوكينات ومستقبلات التصاق الخلايا ويتم دفعها بواسطة بلمرة الأكتين ، والتي توفر القوة الفيزيائية التي تدفع غشاء البلازما إلى الأمام 2,3. وقد تورطت العديد من الإشارات والبروتينات الهيكلية في هذا. من بينها Rho GTPases ، التي تعمل بشكل منسق مع إشارات أخرى لتنشيط البروتينات المنظمة للأكتين مثل مركب Arp 2/3 ، وبروتينات عائلة WASP ، وأعضاء عائلات Formin و Spire في lamellipodia2,4,5.
بالإضافة إلى بلمرة الأكتين ، هناك حاجة إلى نشاط الميوسين II لتوليد قوى انقباضية في الصفيحة والصفائح الأمامية. هذه الانقباضات، التي تعرف أيضا بأنها تراجعات حافة الخلية، يمكن أن تنتج أيضا عن إزالة بلمرة الأكتين الشجيري في محيط الخلية، وهي ضرورية لتطوير الحافة الرائدة الصفائحية والسماح للنتوء باستشعار مرونة المصفوفة خارج الخلية والخلايا الأخرى وتحديد اتجاه الهجرة6،7،8 . ستشكل نتوءات حافة الخلية التي لا يمكن أن تلتصق بالركيزة كشكشة غشائية محيطية ، وهياكل تشبه الورقة تظهر على السطح البطني للصفيحة والصفائح وتتحرك إلى الوراء بالنسبة لاتجاه الهجرة. عندما يفشل الصفائحي في الالتصاق بالركيزة ، يتشكل صفيحة خلفية تحتها ويدفع ميكانيكيا الرقائقي الأول نحو السطح البطني العلوي. خيوط الأكتين في الكشكشة التي كانت موازية سابقا للركيزة أصبحت الآن عمودية عليها ، ويتم الآن وضع الكشكشة فوق الصفائح المتقدمة. الكشكشة التي تتحرك إلى الوراء تعود إلى السيتوسول وتمثل آلية خلوية لإعادة تدوير الأكتين الرقائقي9,10.
هنا ، نصف فحصا لقياس ديناميكيات نتوء حافة الخلية. يستخدم فحص النتوء الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني لقياس ديناميكيات نتوء حافة الخلية الواحدة لمدة 10 دقائق خلال مرحلة انتشار الخلية. يتم تحليل ديناميكيات النتوء عن طريق توليد kymographs من هذه الأفلام. من حيث المبدأ، يضفي الكيموغراف بيانات كمية مفصلة عن الجسيمات المتحركة في مخطط مكاني زماني لإنتاج فهم نوعي لديناميكيات حافة الخلية. يتم رسم شدة الجسيم المتحرك لجميع مكدسات الصور في مخطط زمني مقابل مكاني، حيث يمثل المحور X والمحور Y الوقت والمسافة، على التوالي11. تستخدم هذه الطريقة تحليل kymograph اليدوي مع ImageJ للحصول على بيانات كمية مفصلة ، مما يتيح استرداد المعلومات من الأفلام والصور في حالة انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء و / أو كثافة الميزات العالية ، وتحليل الصور التي تم الحصول عليها في المجهر الضوئي تباين الطور أو جودة الصورة الرديئة.
يعد فحص ديناميكيات نتوء حافة الخلية الموصوف هنا طريقة سريعة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة. على هذا النحو ، ولأنه ثبت أنه يرتبط ارتباطا مباشرا بهجرة الخلايا 11,12 ، يمكن استخدامه كطريقة أولية لاختبار ديناميكيات الهيكل الخلوي المشاركة في حركة الخلية قبل اتخاذ قرار بإجراء طرق أكثر تطلبا للموارد. علاوة على ذلك ، فإنه يتيح أيضا القياس الكمي لكيفية تأثير التلاعب الجيني (الضربة القاضية أو الضربة القاضية أو هياكل الإنقاذ) للبروتينات الهيكلية الخلوية على ديناميكيات الهيكل الخلوي باستخدام منصة مباشرة. الفحص هو نموذج مفيد لاستكشاف ديناميكيات الهيكل الخلوي في سياق هجرة الخلايا ويمكن استخدامه لتوضيح الآليات والجزيئات الكامنة وراء حركة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة بار إيلان.
ملاحظة: يظهر في الشكل 1 تصوير رسومي خطوة بخطوة للإجراء الموضح في هذا القسم.
1. زراعة الخلايا
ملاحظة: الخلايا المستخدمة في البروتوكول هي الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEFs) التي تم إنشاؤها من أجنة E11.5-13.5 من الفئران C57BL/6 من النوع البري. تم إنشاء MEFs الأولية وفقا لبروتوكول مختبر Jacks13. تم تجميع الخلايا من خمسة أجنة مختلفة معا وخلدها عن طريق العدوى بناقل فيروسي رجعي يعبر عن مستضد SV40 T كبير يليه اختيار مع 4 mM Histidinol لمدة 3 أسابيع.
- خلايا الاستزراع في ألواح زراعة الأنسجة التي تحتوي على وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) الذي يحتوي على 1 جم / لتر من الجلوكوز ، و 1٪ من الجلوتامين ، و 1٪ من البنسلين - الستربتومايسين ، و 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS) (انظر جدول المواد) ، في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
- استزرع الخلايا حتى التقاء 90٪ -95٪ وانقسمت بنسبة 1: 5 كل 2-3 أيام.
2. طلاء طبق من الزجاج السفلي
ملاحظة: يجب إجراء طلاء الطبق ذو القاع الزجاجي في غطاء محرك السيارة المزروع للأنسجة في ظروف معقمة.
- أضف 2 مل من محلول 1N HCl في وسط طبق ذو قاع زجاجي (جدول المواد) واحتضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظة: تهدف هذه المرحلة إلى إزالة البقايا من الزجاج التي قد تعطل التصوير لاحقا. - اغسل الطبق ذو القاع الزجاجي ثلاث مرات ب 2 مل من 1x PBS (جدول المواد) لكل منهما.
- تمييع الفيبرونيكتين (انظر جدول المواد) إلى 10 ميكروغرام / مل في 1x PBS. أضف 200 ميكرولتر من محلول الفيبرونيكتين المخفف إلى المركز الزجاجي للطبق. حضانة في 37 درجة مئوية (حاضنة زراعة الأنسجة) لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن احتضان الطبق ذو القاع الزجاجي بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على سطح مستو. - خلال وقت حضانة طلاء الفيبرونيكتين ، قم بإعداد محلول BSA (جدول المواد) بنسبة 1٪ في 1x PBS ، وقم بالتصفية من خلال 0.2 ميكرومتر ، وإزالة الطبيعة عن طريق الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي تم تسخينه مسبقا.
- اغسل الطبق المطلي بقاع الزجاج ثلاث مرات مع 2 مل من 1x PBS لكل منهما.
- أضف 2 مل من محلول BSA المشوه إلى المركز الزجاجي واحتضنه لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (حاضنة زراعة الأنسجة).
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن احتضان الطبق ذو القاع الزجاجي بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على سطح مستو. - اغسل الطبق ذو القاع الزجاجي 3 مرات مع 2 مل من 1x PBS لكل منهما.
ملاحظة: يجب إجراء حضانة الأطباق ذات القاع الزجاجي مع الفيبرونيكتين لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية لتغطية السطح بشكل صحيح. قد لا ينتج عن وقت الحضانة الأقصر طلاء مناسب ، ونتيجة لذلك ، قد لا يكون النمط الظاهري للخلية مرتبطا بتنشيط الإنتغرين. طبقة BSA خاملة ولن تؤثر على ديناميكيات النتوء وتهدف إلى منع المواقع المحتملة الحرة للالتصاق الخلايا المستقلة عن التكامل. يجب تشويه BSA قبل الطلاء لمنعه من تحفيز موت الخلايا المبرمج ، والذي يمكن أن يؤثر على ديناميكيات حافة الخلية.
3. إعداد الخلايا للتصوير
- قبل ست عشرة إلى ثماني عشرة ساعة من التجربة ، قم بلوحة الخلايا للوصول إلى التقاء 70٪ -80٪ في اليوم التالي. بالنسبة ل MEFs ، لوحة 0.7 × 106 خلايا لكل لوحة زراعة الأنسجة قطرها 10 سم قبل يوم من إجراء التجربة.
ملاحظة: من أجل تجربة نتوء ناجحة ، من المهم أن يتم استخدام الخلايا خلال مرحلة نموها اللوغاريتمي. لتحقيق ذلك ، يجب أن تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪ في يوم التجربة. ستؤدي الكثافة العالية للخلايا إلى وقت انتشار أطول و / أو عائق في التعلق أثناء التجربة. - في يوم التجربة ، أضف 2 مل من محلول التربسين (جدول المواد) لكل صفيحة زراعة أنسجة قطرها 10 سم واحتضنها لمدة 2-3 دقائق في حاضنة زراعة الأنسجة حتى تنفصل الخلايا. قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة 5 مل من الوسط الكامل.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وطبق 20000 خلية في 2 مل من الوسط الكامل على طبق من قاع الزجاج مطلي كما هو موضح أعلاه (القسم 2).
ملاحظة: يعتمد عدد الخلايا المستخدمة للطلاء على حجم الخلايا ونوعها. بالنسبة للخلايا المنتشرة الأكبر أو الأكثر ، قم بلوحة 10000 خلية فقط للحصول على خلايا كافية للتصوير. من المهم اختيار خلايا مفردة لا تلمس لأن الاتصال من خلية إلى خلية يمكن أن يغير سلوكيات الانتشار الجوهرية للخلية. - احتضن الأطباق ذات القاع الزجاجي بخلايا مطلية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: خلال هذه المرحلة ، تلتصق الخلايا بركيزة الفيبرونيكتين وتنتشر فوقها. عند قياس النتوءات أثناء انتشار الخلايا ، يجب السماح للخلايا بالانتشار لمدة 15 دقيقة بعد الطلاء وقبل التصوير. يمكن إجراء التصوير في غضون نافذة زمنية تتراوح بين 15 دقيقة إلى ~ 1 ساعة بعد الطلاء ، وعلى أي حال ، قبل أن تبدأ الخلايا في الهجرة.
4. إعداد المجهر والتصوير
ملاحظة: تتوفر العديد من أنظمة الفحص المجهري للخلايا الحية. النظام المستخدم هنا هو مجهر مقلوب من طراز Leica AF6000 مجهز بوحدات CO2 والتدفئة ويتم توصيله بكاميرا CMOS رقمية ORCA-Flash 4.0 V2 .
- قم بتشغيل وحدة التدفئة قبل 1 ساعة على الأقل من التصوير واضبطها على 37 درجة مئوية.
- قم بتشغيل وحدة CO2 قبل 10 دقائق على الأقل من التصوير واضبطها على 5٪ CO2.
- قم بتشغيل المجهر والكاميرا والكمبيوتر.
- افتح برنامج اقتناء المجهر (انظر جدول المواد). اختر المجلد لحفظ الصور الملتقطة واكتب اسم ملف. احفظ كل فيلم كملف جديد.
- اضبط التكبير على عدسة جافة بمعدل 40 ضعفا، وتباين الطور. اضبط الفاصل الزمني على 5 ثوان ، وإجمالي مدة الفيلم 10 دقائق.
- بعد 15 دقيقة من حضانة الخلايا المطلية ، ضع الطبق ذو القاع الزجاجي مع الخلايا الملتصقة في المحول وقم بإصلاحه. أدخل المحول مع الطبق في فتحته في مرحلة المجهر.
- اخلع غطاء الطبق وضع غطاء CO2 بدلا من ذلك. افتح صمام CO2 .
ملاحظة: تأكد من نظافة غطاء CO2 قبل وضعه فوق الطبق ذي القاع الزجاجي. الغطاء القذر سيقلل من جودة الأفلام. امسح الجانب السفلي من غطاء CO2 بمنديل خال من الوبر منقوع بالإيثانول بنسبة 70٪ لإزالة الغبار والأوساخ. امسح مرة ثانية بمنديل جاف خال من الوبر. - عرض الخلايا والعثور على خلية مناسبة للتصوير. تأكد من أن الخلية في بؤرة التركيز وابدأ في الحصول على الفيلم.
5. تحليل الصور
ملاحظة: يتم إجراء تحليل الصور باستخدام ImageJ (جدول المواد) على النحو التالي:
- افتح الفيلم الذي تم الحصول عليه في ImageJ.
- باستخدام الأداة المستقيمة في شريط الأدوات الرئيسي، اصنع ثمانية أسطر من 20 وحدة عشوائية كل منها عموديا على النتوءات، بما في ذلك الصفيحة وحافة الخلية، في ترتيب شعاعي كل 45 درجة، كما هو موضح في الشكل 2A.
- في شريط الأدوات الرئيسي، انتقل إلى مكدسات الصور > > Reslice. سيؤدي ذلك إلى صورة kymograph ، والتي تصف حركة النقاط المفردة داخل غشاء الخلية (الشكل 2B). يجب تنفيذ هذا الإجراء لكل سطر من الأسطر الثمانية بشكل منفصل.
- استخراج وعدد يدويا من صور kymograph المعنية عدد النتوءات والتراجع والكشكشة في كل من المناطق الثماني في الخلية ، والتي تتميز بخطوط الشبكة. تمثل هذه الأرقام تواتر النتوءات والتراجع والكشكشة لكل 10 دقائق (الشكل 2C ، D).
ملاحظة: يمكن تمييز الكشكشة عن الهياكل الأخرى بناء على مظهرها الداكن في المجهر المتباين مرحليا وحركتها الجاذبة المركزية ، والتي تبدأ عند حافة الخلية وتنتهي عند حدود جسم الخلية ، والتي يمكن ملاحظتها في الأفلام المكتسبة. تجدر الإشارة إلى أنه عند تحديد حجم النتوء والتراجع وتردد الكشكشة ، يجب ملاحظة الأفلام كعنصر تحكم في القياس الكمي وخاصة لتحديد الكشكشة. - تحديد ثبات البروز والمسافة والسرعة عن طريق تحليل الكيموغرافيا. لكل من الكيموجراف الذي تم إنشاؤه، يمثل المحور X المسافة، ويمثل المحور Y الزمن.
- لقياس مسافة البروز، اتبع الخطوات 5.6.1-5.6.2.
- ارسم خطا عموديا من قاعدة النتوء إلى أعلى قمة للنتوء. اضغط على M في ImageJ لقياس طول الخط بالبكسل.
- لتحويل الطول من البيكسلات إلى ميكرومتر، تأكد من أن نسبة البكسل إلى ميكرومتر معروفة.
ملاحظة: نسبة μm إلى البكسل هي الطول الفعلي للبكسل على كاميرا CCD / التكبير الكلي. حجم البكسل هو سمة مميزة لكل نوع من الكاميرات. على سبيل المثال ، بالنسبة للكاميرا المستخدمة في هذه الدراسة ، يبلغ حجم البكسل 6.5 ميكرومتر × 6.5 ميكرومتر ، والطول المادي 6.5 ميكرومتر والتكبير الذي استخدمناه هو 40 ضعفا. لذلك ، فإن نسبة μm إلى pixel للكاميرا لدينا هي 0.1625 μm / pixel. في التحليل ، بالنسبة لخط بطول 30 بكسل ، ستكون مسافة البروز 30 بكسل × 0.1625 ميكرومتر / بكسل = 4.875 ميكرومتر (الشكل 3).
- لقياس وقت البروز (الثبات؛ مقدار الوقت الذي يقضيه البروز بارزا قبل التراجع)، اتبع الخطوات 5.7.1-5.7.2.
- ارسم خطا أفقيا من بداية البروز (من اليسار إلى اليمين) إلى منطقة أعلى ذروة. اضغط على M في ImageJ لقياس طول الخط بالبكسل.
- لتحويل الطول من بكسل إلى دقائق، احسب نسبة البيكسل إلى الدقيقة. تعتمد هذه القيمة على الفاصل الزمني بين الصور.
ملاحظة: في هذا المثال، الفاصل الزمني بين الصور هو 5 ثانية، ونسبة الحد الأدنى/البكسل هي 0.0833، وطول الخط الأفقي هو 8 بكسلات. لذلك ، فإن وقت البروز هو 8 بكسل × 0.0833 دقيقة / بكسل = 0.6664 دقيقة.
- قم بقياس وحساب وقت التراجع بشكل مشابه لوقت البروز لخط مرسوم أفقيا عند قاعدة البروز من حيث تكون ذروة النتوء إلى قاعدته على اليمين (السطر X2 في الشكل 3).
- احسب سرعة البروز بقسمة مسافة البروز على زمن النتوء. احسب سرعة التراجع بقسمة مسافة البروز على زمن التراجع. في هذا المثال، تحسب سرعة البروز على أنها 4.875 ميكرومتر/0.6664 دقيقة = 7.315 ميكرومتر/دقيقة، وسرعة التراجع متطابقة لأن الخط الذي يمثل الزمن يكون بنفس الطول.
ملاحظة: عند مقارنة أنواع الخلايا المختلفة ، أي الخلايا التي تعبر عن النوع البري والبنى الطافرة لنفس البروتين ، من الضروري إجراء تحليل أعمى ، لذلك لا يتم إدخال أي تحيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في التجربة الموصوفة في الشكل 2 ، تم طلاء MEFs المخلدة على أطباق ذات قاع زجاجي مغلفة مسبقا بالفيبرونيكتين لتنشيط الإشارات بوساطة integrin ، والتي تم حظرها بواسطة BSA المشوهة ، لمنع المواقع المحتملة الحرة للالتصاق الخلايا التي لا تعتمد على تنشيط integrin. للوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي عند التقاء 70٪ -80٪ من الخلايا في يوم التجربة ، تم طلاء 0.7 × 106 MEFs في لوحة زراعة الأنسجة التي يبلغ قطرها 10 سم قبل 16 ساعة من التجربة. في يوم التجربة ، تم تربسين الخلايا وعدها ، وتم طلاء 20000 خلية على طبق زجاجي مغلف بالفيبرونيكتين / BSA. تم احتضان الطبق لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق وانتشار الخلايا قبل التصوير. بعد الحضانة ، تم وضع اللوحة في غرفة حاضنة المجهر (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) ، وتم تصوير الخلايا المفردة باستخدام عدسة جافة 40x في ضوء المرحلة. تم إجراء التصوير بين 15 دقيقة إلى 1 ساعة بعد الطلاء قبل أن تبدأ الخلايا في الهجرة. تم الحصول على الصور كل 5 ثوان لمدة 10 دقائق ، مما أسفر عن 121 صورة لكل خلية (الفيلم التكميلي 1).
تم إجراء تحليل الصور باستخدام ImageJ. باستخدام الأداة المستقيمة في شريط الأدوات الرئيسي ، تم إنشاء 20 خطا مستقيما تعسفيا بطول وحدة على شبكة شعاعية في نفس الأماكن كل 45 درجة في جميع الخلايا (الشكل 2A). لإنشاء كيموجراف، استخدمنا أوامر Image > Stack > Reslice، والتي أسفرت عن صورة kymograph تصف حركة النقاط المفردة داخل غشاء الخلية (الشكل 2B-D). تم استخراج عدد النتوءات والتراجع والكشكشة التي تشكلت خلال 10 دقائق من الفيلم في كل منطقة من المناطق الثماني في الخلايا ، والتي تتميز بخطوط الشبكة ، وتم عدها يدويا من صور kymograph المعنية ، وتم رسمها في رسم بياني على أنها نتوءات / تراجعات / ترددات كشكشة لكل 10 دقائق. وكان متوسط الترددات التي تم الحصول عليها 5.1/10 دقائق للنتوءات والتراجع و 2.1/10 دقيقة للكشكشة (الشكل 2E).
تم حساب مسافة النتوء ووقت البروز ووقت التراجع وسرعات البروز والتراجع من الكيموجراف المتولدة. في الكيموغراف التمثيلي في الشكل 3 ، كانت مسافة البروز 30 بكسل × 0.1625 ميكرومتر / بكسل = 4.875 ميكرومتر ، وكان وقت البروز 8 بكسل × 0.0833 دقيقة / بكسل = 0.6664 دقيقة ، وكان وقت التراجع 8 بكسل × 0.0833 دقيقة / بكسل = 0.6664 دقيقة. تم حساب سرعات البروز والتراجع على أنها 4.875 ميكرومتر / 0.6664 دقيقة = 7.315 ميكرومتر / دقيقة.
عند قياس نتوء حافة الخلية ، من المهم اختيار الخلايا التي هي في مرحلة انتشارها. يظهر مثال على خلية مناسبة للتحليل في الشكل 2A والفيلم التكميلي 1. بعد تحليل الكيموغرافيا ، يمكن تمييز النتوءات والتراجع والكشكشة بسهولة في هذه التجربة. يوضح الشكل 4 مثالا على الخلايا الليفية من النوع البري غير المناسب للتحليل. بعد تحليل الأحاديث ، في الخطوط (الشرائح) 1 و 3 و 5 و 7 ، على سبيل المثال ، لا يمكن تمييز النتوءات الواضحة. في هذه الحالة ، انتهت الخلية من الانتشار ولكنها لم تبدأ في التحرك بعد ، وبالتالي لا يمكن ملاحظة العديد من حركات الغشاء.
الشكل 1: المراحل التجريبية لفحص البروز. (أ) يضاف محلول HCl 1N إلى الطبق ذو القاع الزجاجي لمدة 20 دقيقة (B) بعد غسله في PBS ، يضاف محلول fibronectin 10 ميكروغرام / مل إلى الجزء الزجاجي من الطبق ويتم تحضينه لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. (C) يتم حظر قاع زجاج الطبق عن طريق الحضانة في 1٪ BSA مشوهة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. (D) يتم تربسين لوحة زراعة الأنسجة من 70٪ -80٪ من الخلايا الليفية المتقاربة وحسابها (E) يتم طلاء 20000 خلية في طبق من أسفل الزجاج و (F) يتم تحضينها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالانتشار. (ز) توضع الصفيحة في غرفة رطبة بالمجهر مع 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ، ويتم إجراء التصوير الحي بواسطة المجهر الضوئي المتباين الطوري. (ح) تخضع الأفلام والصور الخلوية لتحليل الكروموغرافيا بواسطة الصورة J. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تحليل صورة فحص البروز. (أ) صورة تمثيلية ل MEF في ImageJ مع ثمانية مقاطع عرضية غشائية مبينة للقياس الكمي خلال 10 دقائق. شريط المقياس ، 20 ميكرومتر ( B ) توليد كيموغراف في الصورة J. (C) كيموغراف تمثيلي من المقطع العرضي الذي يمكن تمييز النتوءات والتراجع والكشكشة. (D) الكيموجراف الناتجة بعد تحليل الصورة خلال 10 دقائق في الصورة J باستخدام الأمر Reslice . (ه) القياس الكمي للنتوءات والتراجع وترددات الكشكشة لكل 10 دقائق من الفيلم والكيموغراف اللذين تم تحليلهما. متوسط تردد النتوء لكل 10 دقائق = 5.1 ، متوسط تردد التراجع لكل 10 دقائق = 5.125 ، متوسط تردد الكشكشة لكل 10 دقائق = 2.1. تم تحليل ثمانية كيموغراف من فيلم واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل وتقدير ثبات البروز والمسافة والسرعة. في الكيموغراف التمثيلي، يمثل المحور X الوقت بالدقيقة (من اليسار إلى اليمين)، ويظهر المحور Y المسافة بالميكرومتر. يمثل X1 وقت البروز (الثبات) ، ويمثل X2 وقت التراجع ، ويمثل Y مسافة البروز. يتم حساب سرعة البروز بقسمة مسافة البروز (Y) على زمن البروز (X1). يتم حساب سرعة التراجع بقسمة مسافة البروز (Y) على زمن التراجع (X2). في هذا المثال، كانت مسافة البروز 30 بكسل × 0.1625 ميكرومتر/بكسل = 4.875 ميكرومتر، وكان وقت البروز 8 بكسل × 0.0833 دقيقة/بكسل = 0.6664 دقيقة، وكان وقت التراجع 8 بكسل × 0.0833 دقيقة/بكسل = 0.6664 دقيقة. تم حساب سرعة النتوء/التراجع على أنها 4.875 ميكرومتر/0.6664 دقيقة، = 7.315 ميكرومتر/دقيقة ، يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال على خلية يجب استبعادها من التحليل. (أ) مثال على خلية غير مناسبة للتحليل. شريط المقياس ، 20 ميكرومتر (B) يظهر تحليل الكيموغرافيا لهذه الخلية ، خاصة في إعادة الشريحة 1،3،5،7 ، عدم وجود نتوءات واضحة. في هذه الحالة ، انتهت الخلية من الانتشار ولكنها لم تبدأ في التحرك بعد ، وبالتالي لا يمكن ملاحظة العديد من نتوءات الغشاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم التكميلي 1. تم طلاء MEF على طبق زجاجي مطلي بالفيبرونيكتين وتم تصويره باستخدام مجهر فيديو تباين الطور بفواصل زمنية لمدة 10 دقائق باستخدام هدف جاف 40x / 1.4 NA. يشار إلى الوقت بالثواني. شريط مقياس ، 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعد ديناميكيات نتوء حافة الخلية ، التي تتكون من نتوءات وتراجعات وكشكشة ، شرطا أساسيا وحدثا محتملا يحد من المعدل في حركة الخلية. هنا نصف طريقة سريعة وبسيطة لقياس ديناميكيات نتوءات حافة الخلية أثناء الانتشار. تتيح هذه الطريقة التصوير لفترة قصيرة ، وتولد كمية كبيرة من البيانات ، ولا تتطلب وضع العلامات الفلورية للخلايا أو معدات الفحص المجهري الفلوري باهظة الثمن ، ويمكن استخدامها كطريقة أولية لاختبار ديناميكيات الهيكل الخلوي المشاركة في حركية الخلية قبل اتخاذ قرار بإجراء طرق أكثر تطلبا للموارد. علاوة على ذلك ، يمكن للمرء استخدام الخلايا القاضية أو الضربة القاضية و / أو طفرات البروتين في هذا الفحص كأداة سريعة وبسيطة لتحديد البروتينات الحرجة وآليات الإشارات المحتملة المشاركة في ديناميكيات الهيكل الخلوي.
تجدر الإشارة إلى أنه من المهم اختيار الخلايا الصحيحة لتحليل النتوءات. يتم احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة قبل الحصول على الأفلام للسماح بالانتشار. إذا قرر المرء قياس البروز أثناء الانتشار (على عكس قياس النتوءات أثناء الهجرة) ، فيجب تصوير الخلايا التي هي في مرحلة انتشارها أثناء الحصول على الفيلم فقط. الخلايا التي لم تبدأ في الانتشار ليست مناسبة لتحليل الكيموغرافيا. الخلايا التي أكملت مرحلة انتشارها ولكنها لم تبدأ في التحرك (الشكل 4) لن تكون مناسبة للتحليل أيضا. يمكن لحركة نواتها أن تميز هذه الخلايا: أثناء الانتشار ، تكون النواة ثابتة ، بينما أثناء هجرة الخلية ، تكون النواة ديناميكية وتتمركز في الجانب الخلفي من الخلية لبناء محور رائد للنواة المركزية نحو اتجاه الهجرة. هناك مشكلة شائعة أخرى في المراحل اللاحقة من التصوير وهي الحالة التي تلمس فيها الخلايا بعضها البعض. يجب استبعاد هذه الأفلام من التحليل ، حيث يمكن أن تتداخل التفاعلات والإشارات من الخلايا المجاورة مع ديناميكيات نتوء حافة الخلية.
في هذه المخطوطة، نصف تحليل ديناميكيات نتوء حافة الخلية باستخدام المجهر الضوئي المتباين الطوري. يمكن توسيع هذه الطريقة لقياس ديناميكيات المكونات داخل الخلايا باستخدام المجهر الفلوري أيضا. غالبا ما يتم وصف هذا الاستخدام الشائع للكيموغرافيا الفلورية لقياس ديناميكيات الهياكل الخلوية الهيكلية داخل الخلايا. على سبيل المثال ، استخدم Dogget و Breslin الكروموغرافيا لخلايا HUVEC المنقولة GFP-actin لتحليل ديناميكيات ألياف إجهاد الأكتين ودوران 14.
استخدم هذا البروتوكول والعديد من الأوراق السابقة الأخرى الخلايا الليفية المطلية على الفيبرونيكتين لفحص نتوء حافة الخلية وكذلك لاختبارات حركية الخلايا ثنائية الأبعاد. تستخدم الخلايا الليفية بشكل شائع في مقايسات الحركة وغيرها من المقايسات ذات الصلة مثل مقايسة ديناميكيات نتوء حافة الخلية لأنها وسيطة ومتحركة ولها هياكل هيكلية خلوية واضحة مثل lamellipodia و filopodia والالتصاقات البؤرية. على الرغم من أننا لا نصف الفحص لأنواع الخلايا والركائز الأخرى ، إلا أنه يمكن بسهولة تعديل هذه الطريقة. على سبيل المثال، في الوثائق الأولى لفحص ديناميكيات الصفيحة، الذي قمنا نحن وآخرون بتعديله ليصبح مقايسة ديناميكيات نتوء حافة الخلية11، استخدم المؤلفون الخلايا الكيراتينية التي تم تحفيزها للهجرة بواسطة EGF في فحص الخدش، مما يدل على أنه يمكن تطبيق أنواع الخلايا الأخرى والمحفزات الأخرى على هذا الفحص. علاوة على ذلك ، على الرغم من أننا نصف قياس ديناميكيات نتوء حافة الخلية أثناء انتشار الخلايا ، إلا أنه يمكن استخدام نفس الطريقة عن طريق قياس ديناميكيات النتوءات أثناء هجرة الخلايا ، كما هو موضح ، على سبيل المثال ، في Bear et al.12 و Hinz et al.11.
في الواقع ، استخدمت العديد من المختبرات هذا الفحص على MEFs لتوضيح ديناميكيات الهيكل الخلوي وآليات الإشارة في الماضي. على سبيل المثال ، استخدم ميلر وآخرون سابقا فحص النتوء لإثبات أن Abl2 / Arg يتوسط الاتصال بين الأكتين والأنابيب الدقيقة عند حافة الخلية15. أثبت برايس وآخرون باستخدام الفحص أن خلايا الكورتاكتين القاضية قد أضعفت حركة الخلايا التي تتشارك في الداخل مع ضعف في استمرار النتوءات الرقائقية. ينتج هذا العيب عن ضعف في تجميع الالتصاقات جديدة في نتوءات16. استخدم Lapetina et al. اختبار نتوء حافة الخلية في Abl2 / Arg بالضربة القاضية وخلايا الكورتكتين القاضية التي تم إنقاذها باستخدام طفرات من البروتينين لتوضيح آلية تنظيم Abl2 / Arg بوساطة نتوءات حافة الخلية 17. باستخدام نفس المقايسة ، أثبت ميلر وآخرون أيضا أن Arg ينظم بلمرة الأكتين بوساطة N-WASP وما يترتب على ذلك من ديناميكيات نتوء حافة الخلية 18. لقد استخدمنا مؤخرا اختبار نتوء حافة الخلية لإثبات أن التيروزين كيناز غير المستقبلات Pyk2 ينظم ديناميكيات النتوءات وهجرة الخلايا اللاحقة عبر التفاعلات المباشرة وغير المباشرة مع بروتين المحول CrkII. في هذه الورقة ، استخدمنا Pyk2-WT و Pyk2-/- و Crk-WT وضربة قاضية MEF ، وإنقاذ الطفرات ، وتجارب epistasis لتوضيح التفاعلات الجزيئية والتسلسل الهرمي للإشارة بين البروتينين أثناء بروز حافة الخلية. وتتيح آلية التنظيم المعقدة الجديدة هذه الضبط الدقيق لديناميكيات نتوء حافة الخلية وما يترتب عليها من هجرة الخلايا من ناحية، إلى جانب التنظيم الصارم لحركية الخلية من ناحية أخرى19. باستخدام فحص نتوء حافة الخلية ، زادت الأوراق المذكورة أعلاه وغيرها من الأوراق التي تلت ذلك بشكل كبير من معرفتنا بآليات تنظيم نتوءات حافة الخلية بشكل خاص وهجرة الخلايا بشكل عام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في المصالح للإفصاح عنهما.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح NIH MH115939 و NS112121 و NS105640 و R56MH122449-01A1 (إلى أنتوني ج. كوليسكي) ومن مؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنح رقم 1462/17 و 2142/21) (إلى هافا جيل هين).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
- Kurosaka, S., Kashina, A.
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Jacks laboratory protocol. , Available from: http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs (2021).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
