Summary
Detta protokoll syftar till att mäta de dynamiska parametrarna (utsprång, indragningar, volanger) av utsprång vid kanten av spridande celler.
Abstract
Utvecklingen och homeostasen av multicellulära organismer är beroende av samordnad reglering av cellmigration. Cellmigration är en viktig händelse vid konstruktion och regenerering av vävnader och är avgörande för embryonal utveckling, immunologiska svar och sårläkning. Dysregulering av cellmotilitet bidrar till patologiska störningar, såsom kronisk inflammation och cancermetastasering. Cellmigration, vävnadsinvasion, axon och dendritutväxt initieras alla med aktinpolymerisationsmedierade cellkantsutsprång. Här beskriver vi en enkel, effektiv och tidsbesparande metod för avbildning och kvantitativ analys av cellkantsutsprångsdynamik under spridning. Denna metod mäter diskreta egenskaper hos cellkantsmembrandynamiken, såsom utsprång, indragningar och volanger, och kan användas för att bedöma hur manipuleringar av viktiga aktinregulatorer påverkar cellkantsutsprång i olika sammanhang.
Introduction
Cellmigration är en kritisk process som styr utvecklingen och funktionen hos alla levande organismer. Cellmigration sker i både fysiologiska tillstånd, såsom embryogenes, sårläkning och immunsvar, och i patologiska tillstånd, såsom cancermetastaser och autoimmun sjukdom. Trots skillnader i celltyper som deltar i olika migrationshändelser delar alla cellmotilitetshändelser liknande molekylära mekanismer, som har bevarats i evolutionen från protozoer till däggdjur, och involverar gemensamma cytoskelettkontrollmekanismer som kan känna av miljön, svara på signaler och modulera cellbeteende som svar1.
Ett första steg i cellmigration kan vara bildandet av mycket dynamiska utsprång vid cellens framkant. Bakom lamellipodiet kan man hitta lamellen, som kopplar aktin till myosin II-medierade kontraktilitet och förmedlar vidhäftning till det underliggande substratet. Lamellipodi induceras av extracellulära stimuli såsom tillväxtfaktorer, cytokiner och celladhesionsreceptorer och drivs av aktinpolymerisation, vilket ger den fysiska kraften som skjuter plasmamembranet framåt2,3. Många signalerings- och strukturproteiner har varit inblandade i detta; bland dem är Rho GTPaser, som verkar samordnat med andra signaler för att aktivera aktinreglerande proteiner såsom Arp 2/3-komplexet, WASP-familjeproteiner och medlemmar av Formin- och Spire-familjerna i lamellipodia2,4,5.
Förutom aktinpolymerisation krävs myosin II-aktivitet för att generera kontraktila krafter vid lamellipodiet och den främre lamellen. Dessa sammandragningar, även definierade som cellkantsindragningar, kan också bero på depolymerisation av dendritiskt aktin vid cellperiferin och är kritiska för att utveckla den lamellipodiella framkanten och låta utsprånget känna av flexibiliteten hos den extracellulära matrisen och andra celler och bestämma migrationsriktningen6,7,8 . Cellkantsutsprång som inte kan fästa vid substratet kommer att bilda perifera membranvolanger, arkliknande strukturer som uppträder på den ventrala ytan av lamellipodi och lamell och rör sig bakåt i förhållande till migrationsriktningen. Eftersom lamellipodiet inte fäster vid substratet bildas ett bakre lamellipodium under det och skjuter mekaniskt det första lamellipodiet mot den övre ventrala ytan. Aktinfilamenten i volangen som tidigare var parallella med substratet blir nu vinkelräta mot det, och volangen är nu placerad ovanför det framåtskridande lamellipodiet. Ruffle som rör sig bakåt faller tillbaka i cytosolen och representerar en cellulär mekanism för återvinning av lamellipodial aktin9,10.
Här beskriver vi en analys för mätning av cellkantsutsprångsdynamik. Utskjutningsanalysen använder time-lapse-videomikroskopi för att mäta utskjutningsdynamiken med en enda cellkant i 10 minuter under cellens spridningsfas. Utskjutningsdynamiken analyseras genom att generera kymografer från dessa filmer. I princip ger en kymograf detaljerade kvantitativa data om rörliga partiklar i ett spatiotemporalt diagram för att ge en kvalitativ förståelse av cellkantdynamiken. Intensiteten hos den rörliga partikeln ritas för alla bildstaplar i ett tids- kontra rymddiagram, där X-axeln respektive Y-axeln representerar tid och avstånd11. Denna metod använder en manuell kymografanalys med ImageJ för att få detaljerade kvantitativa data, vilket gör det möjligt att hämta information från filmer och bilder vid lågt signal-brusförhållande och / eller hög funktionsdensitet och analys av bilder som förvärvats i faskontrastljusmikroskopi eller dålig bildkvalitet.
Cellkantsutskjutningsdynamikanalysen som beskrivs här är en snabb, enkel och kostnadseffektiv metod. Som sådan, och eftersom det har visat sig direkt korrelera med cellmigration11,12, kan det användas som en preliminär metod för att testa cytoskelettdynamik som är involverad i cellmotilitet innan man bestämmer sig för att utföra mer resurskrävande metoder. Dessutom möjliggör det också kvantitativ mätning av hur genetiska manipulationer (knockout, knockdown eller räddningskonstruktioner) av cytoskelettproteiner påverkar cytoskelettdynamiken med hjälp av en enkel plattform. Analysen är en lärorik modell för att utforska cytoskelettdynamik i samband med cellmigration och kan användas för att belysa de mekanismer och molekyler som ligger bakom cellmotilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella Djurvårds- och användningskommittén (IACUC) vid Bar-Ilan University.
OBS: En steg-för-steg-grafisk bild av proceduren som beskrivs i detta avsnitt visas i figur 1.
1. Cellodling
OBS: Cellerna som används i protokollet är musembryonal fibroblaster (MEF) som genererades från E11.5-13.5 embryon av vild typ C57BL / 6 möss. Primära MEF genererades enligt Jacks laboratorieprotokoll13. Celler från fem olika embryon samlades ihop och odödliggjordes genom infektion med en retroviral vektor som uttrycker SV40 stort T-antigen följt av selektion med 4 mM Histidinol i 3 veckor.
- Odlingsceller i vävnadsodlingsplattor innehållande Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) innehållande 1 g/L glukos, 1 % glutamin, 1 % penicillinstreptomycin och 10 % fetalt bovint serum (FBS) (se materialtabell), i en fuktad inkubator med 5 % CO2 vid 37 °C.
- Odla cellerna tills 90% -95% sammanflöde och delas i ett förhållande av 1:5 var 2-3: e dag.
2. Glasbottenskålbeläggning
OBS: Glasbottenbeläggning bör utföras i vävnadsodlingshuven under sterila förhållanden.
- Tillsätt 2 ml 1N HCl-lösning i mitten av en glasbottenskål (materialtabell) och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur (RT).
OBS: Detta steg är avsett att ta bort rester från glaset som kan avbryta avbildningen senare. - Tvätta glasbottenskålen tre gånger med 2 ml 1x PBS (Table of Materials) vardera.
- Späd fibronektin (se materialförteckningen) till 10 μg/ml i 1x PBS. Tillsätt 200 μL av den utspädda fibronektinlösningen till skålens glascentrum. Inkubera vid 37 °C (vävnadsodlingsinkubator) i 1 timme.
OBS: Alternativt kan glasskålen inkuberas över natten vid 4 ° C på en plan yta. - Under inkubationstiden för fibronektinbeläggning bereds 1 % BSA-lösning (Table of Materials) i 1x PBS, filtrera genom 0,2 μm och denaturera genom att inkubera vid 70 °C i 30 min i ett förvärmt vattenbad.
- Tvätta den belagda glasbottenskålen tre gånger med 2 ml 1x PBS vardera.
- Tillsätt 2 ml denaturerad BSA-lösning till glascentret och inkubera i 1 timme vid 37 °C (vävnadsodlingsinkubator).
OBS: Alternativt kan glasskålen inkuberas över natten vid 4 ° C på en plan yta. - Tvätta glasbottenskålen 3 gånger med 2 ml 1x PBS vardera.
OBS: Inkubation av glasbottenskålar med fibronektin bör utföras i minst 1 timme vid 37 ° C för att belägga ytan ordentligt. Kortare inkubationstid kanske inte ger korrekt beläggning, och som ett resultat kan cellfenotyp inte vara relaterad till integrinaktivering. BSA-skiktet är inert och kommer inte att påverka utskjutningsdynamiken och är avsett att blockera fria potentiella platser för integrinoberoende cellvidhäftning. BSA måste denatureras före beläggning för att förhindra att den inducerar cellapoptos, vilket kan påverka cellkantdynamiken.
3. Beredning av celler för avbildning
- Sexton till arton timmar före experimentet, platta cellerna för att nå 70% -80% sammanflöde följande dag. För MEF, platta 0,7 x 106 celler per 10 cm diameter vävnadsodlingsplatta en dag innan experimentet utförs.
OBS: För ett framgångsrikt utskjutningsexperiment är det viktigt att cellerna kommer att användas under sin logaritmiska tillväxtfas. För att uppnå detta bör cellerna nå 70% -80% sammanflöde på experimentets dag. En högre densitet av celler kommer att resultera i en längre spridningstid och / eller hinder för fastsättning under experimentet. - På experimentdagen tillsätt 2 ml trypsinlösning (materialtabell) per 10 cm diameter vävnadsodlingsplatta och inkubera i 2-3 minuter i en vävnadsodlingsinkubator tills cellerna lossnar. Inaktivera trypsin genom att tillsätta 5 ml av det kompletta mediet.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och platta 20 000 celler i 2 ml av hela mediet på en glasbottenskål belagd enligt ovan (avsnitt 2).
OBS: Antalet celler för plätering beror på storleken och typen av celler. För större eller fler spridda celler, platta endast 10 000 celler för att ha tillräckligt med celler för avbildning. Det är viktigt att välja enskilda celler som inte rör vid varandra eftersom cell-till-cell-kontakt kan förändra cell-inneboende spridningsbeteenden. - Inkubera glasbottenskålarna med pläterade celler i vävnadsodlingsinkubatorn i 15 min.
OBS: Under detta stadium fäster cellerna vid fibronektinsubstratet och sprids över det. Vid mätning av utsprång under cellspridning bör celler tillåtas spridas i 15 minuter efter plätering och före avbildning. Avbildning kan utföras inom ett tidsfönster mellan 15 minuter och ~ 1 timme efter plätering, och i alla fall innan cellerna börjar migrera.
4. Mikroskopinstallation och avbildning
OBS: Olika live-cell mikroskopisystem finns tillgängliga. Systemet som används här är ett Inverterat Leica AF6000-mikroskop utrustat med CO2 - och värmeenheter och är anslutet till en ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS-kamera.
- Slå på värmeenheten minst 1 timme före avbildning och ställ in den på 37 °C.
- Slå på CO2-enheten minst 10 minuter före avbildning och ställ in den på 5% CO2.
- Slå på mikroskopet, kameran och datorn.
- Öppna programvaran för förvärv av mikroskop (se Materialtabell). Välj mappen för att spara tagna bilder och skriv ett filnamn. Spara varje film som en ny fil.
- Ställ förstoringen på en 40x torr lins, faskontrast. Ställ in tidsintervallet på 5 s, total filmlängd 10 min.
- Efter 15 minuters inkubation av de pläterade cellerna, placera glasskålen med vidhäftade celler i adaptern och fixa den. Sätt i adaptern med skålen i sitt slits i mikroskopsteget.
- Ta av disklocket och lägg CO2-locket istället. Öppna CO2-ventilen .
OBS: Se till att CO2-locket är rent innan du placerar det ovanpå glasskålen. Ett smutsigt lock minskar filmkvaliteten. Torka av undersidan av CO2-locket med en luddfri torkduk blöt med 70% etanol för att avlägsna damm och smuts. Torka av en andra gång med en torr luddfri torka. - Visa cellerna och hitta en lämplig cell för avbildning. Se till att cellen är i fokus och starta filmförvärv.
5. Bildanalys
OBS: Bildanalys utförs med hjälp av ImageJ (Table of Materials) enligt följande:
- Öppna den förvärvade filmen i ImageJ.
- Använd verktyget Straight i huvudverktygsfältet och gör åtta rader med 20 godtyckliga enheter var och en vinkelrätt mot utsprången, inklusive lamellen och cellkanten, i ett radiellt arrangemang var 45°, som visas i figur 2A.
- I huvudverktygsfältet går du till Bild > staplar > Reslice. Detta kommer att ge en kymografbild, som beskriver rörelsen av enskilda punkter i cellmembranet (figur 2B). Denna åtgärd bör utföras för varje rad av de åtta raderna separat.
- Extrahera och räkna manuellt från respektive kymografbilder antalet utsprång, indragningar och volanger i var och en av de åtta regionerna i cellen, markerade med rutnätslinjerna. Dessa siffror representerar frekvensen av utsprång, indragningar och volanger per 10 minuter (figur 2C, D).
OBS: Ruffles kan särskiljas från andra strukturer baserat på deras mörka utseende i faskontrastmikroskopi och deras centripetala rörelse, som börjar vid cellkanten och slutar vid cellkroppens kant, vilket kan observeras i de förvärvade filmerna. Observera att när man kvantifierar utskjutning, indragning och volangfrekvens bör filmer observeras som en kontroll för kvantifiering och särskilt för att definiera volanger. - Bestäm utskjutningspersistensen, avståndet och hastigheten genom kymografianalys. För var och en av de genererade kymograferna representerar X-axeln avstånd och Y-axeln representerar tid.
- Följ stegen 5.6.1-5.6.2 för att mäta utskjutningsavståndet.
- Rita en vinkelrät linje från utsprångets botten till utsprångets högsta topp. Tryck på M i ImageJ för att mäta längden på linjen i pixlar.
- För att konvertera längden från pixlar till μm, se till att förhållandet mellan pixel och μm är känt.
OBS: Förhållandet μm till pixel är den fysiska längden på en pixel på CCD-kameran / total förstoring. Pixelstorleken är karakteristisk för varje typ av kamera. Till exempel, för kameran som används i denna studie är pixelstorleken 6.5 μm x 6.5 μm, den fysiska längden är 6.5 μm och förstoringen vi använde är 40x. Därför är förhållandet μm till pixel för vår kamera 0.1625 μm / pixel. I analysen, för en linje i längden på 30 pixlar, skulle utskjutningsavståndet vara 30 pixlar x 0,1625 μm / pixel = 4,875 μm (figur 3).
- För att mäta utskjutningstiden (persistens; hur lång tid ett utsprång spenderar utskjutande innan det dras tillbaka), följ steg 5.7.1-5.7.2.
- Rita en horisontell linje från början av utsprånget (vänster till höger) till regionen med den högsta toppen. Tryck på M i ImageJ för att mäta längden på linjen i pixlar.
- Om du vill konvertera längden från pixlar till minuter beräknar du förhållandet mellan pixel och min. Det här värdet beror på intervallet mellan bilderna.
I det här exemplet är intervallet mellan bilder 5 s, förhållandet min/pixel är 0,0833 och den horisontella linjelängden är 8 pixlar. Därför är utskjutningstiden 8 pixlar x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.
- Mät och beräkna indragningstiden på samma sätt som utskjutningstiden för en linje som dras horisontellt vid utsprångets bas varifrån utsprångets topp är till dess bas till höger (linje X2 i figur 3).
- Beräkna utskjutningshastigheten genom att dividera utskjutningsavståndet med utskjutningstiden. Beräkna indragningshastigheten genom att dividera utskjutningsavståndet med indragningstiden. I det här exemplet beräknas utskjutningshastigheten som 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., och indragningshastigheten är identisk eftersom linjen som representerar tiden är lika lång.
OBS: Vid jämförelse av olika celltyper, dvs celler som uttrycker vildtyp och mutanta konstruktioner av samma protein, är det absolut nödvändigt att utföra en blindad analys, så ingen bias introduceras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I experimentet som beskrivs i figur 2 pläterades odödliga MEF på glasbottenskålar förbelagda med fibronektin för att aktivera integrinmedierad signalering, blockerad av denaturerad BSA, för att blockera fria potentiella platser för cellvidhäftning som inte är beroende av integrinaktivering. För att nå den logaritmiska tillväxtfasen vid 70% -80% sammanflöde av celler på experimentdagen pläterades 0,7 x 106 MEF i en vävnadsodlingsplatta med en diameter på 10 cm 16 timmar före experimentet. På experimentdagen trypsiniserades och räknades celler, och 20 000 celler pläterades på en fibronektin / BSA-belagd glasbottenskål. Skålen inkuberades i 15 minuter vid 37 ° C för att möjliggöra fastsättning och spridning av cellerna före avbildning. Efter inkubation placerades plattan i en mikroskopinkubatorkammare (37 ° C, 5% CO2) och enstaka celler avbildades med en 40x torr lins i fasljus. Avbildning utfördes mellan 15 min och 1 timme efter plätering innan cellerna började migrera. Bilder förvärvades var 5: e sekund i 10 minuter, vilket gav 121 bilder per cell (kompletterande film 1).
Bildanalys utfördes med hjälp av ImageJ. Med hjälp av det raka verktyget i huvudverktygsfältet gjordes 20 godtyckliga enhetslånga raka linjer på ett radiellt rutnät på samma platser var 45: e grad i alla celler (figur 2A). För att generera en kymograf använde vi kommandona Image > Stack > Reslice, vilket gav en kymografbild som beskriver rörelsen av enskilda punkter i cellmembranet (Figur 2B-D). Antalet utsprång, indragningar och volanger som bildades under 10 minuter av filmen i var och en av de åtta regionerna i cellerna, som markeras av rutnätslinjerna, extraherades, räknades manuellt från respektive kymografbilder och ritades i ett diagram som utsprång / indragningar / volangfrekvenser per 10 min. De genomsnittliga frekvenserna som erhölls var 5,1/10 min för utskjutningar och indragningar och 2,1/10 min för volanger (figur 2E).
Utskjutningsavståndet, utskjutningstiden, indragningstiden, utskjutnings- och indragningshastigheterna beräknades utifrån de genererade kymograferna. I den representativa kymografen i figur 3 var utskjutningsavståndet 30 pixlar x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, utskjutningstiden var 8 pixlar x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min, indragningstiden var 8 pixlar x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. Utskjutnings- och indragningshastigheter beräknades till 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min.
Vid mätning av cellkantsutsprång är det viktigt att välja celler som är i sin spridningsfas. Ett exempel på en korrekt cell för analys visas i figur 2A och kompletterande film 1. Efter kymografianalys kan utsprång, indragningar och volanger lätt urskiljas i detta experiment. Ett exempel på en fibroblast av vild typ som inte är lämplig för analys visas i figur 4. Efter kymografianalys, i linjer (skivor) 1, 3, 5, 7, till exempel, kan tydliga utsprång inte särskiljas. I detta fall slutade cellen att sprida sig men började inte röra sig ännu, och därför kan inte många membranrörelser observeras.
Figur 1: Experimentella stadier av utskjutningsanalysen. (A) En 1N HCl-lösning tillsätts till glasskålen i 20 min. (B) Efter tvättar i PBS tillsätts 10 μg/ml fibronektinlösning till skålens glasdel och inkuberas i 1 timme vid 37 °C. (C) Skålens glasbotten blockeras genom inkubation i 1 % denaturerad BSA i 1 timme vid 37 °C. (D) En vävnadsodlingsplatta på 70%-80% sammanflytande fibroblaster trypsiniseras och räknas (E) 20 000 celler pläteras i en glasbottenskål och (F) inkuberas i 15 minuter vid 37 ° C för att tillåta celler att sprida sig. (G) Plattan placeras i en mikroskopfuktkammare med 37 °C i 5 % CO2, och levande avbildning utförs genom faskontrastljusmikroskopi. (H) Cellfilmer och bilder utsätts för kymografianalys av bild J. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utskjutningsanalys bildanalys. (A) Representativ bild av MEF i BildJ med angivna åtta membrantvärsnitt för kvantifiering under 10 min. Skalstång, 20 μm. (B) Generering av en kymograf i bild J. (C) Representativ kymograf från tvärsnitt på vilken utsprång, indragningar och volanger kan särskiljas. (D) Resulterande kymografer efter bildanalys under 10 minuter i bild J med kommandot Reslice . (E) Kvantifiering av utsprång, indragningar och volangfrekvenser per 10 minuter från den analyserade filmen och kymografen. Genomsnittlig utskjutningsfrekvens per 10 min = 5,1, genomsnittlig indragningsfrekvens per 10 min = 5,125, genomsnittlig volangfrekvens per 10 min = 2,1. Åtta kymografer analyserades från en film. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Analys och kvantifiering av utskjutningspersistens, avstånd och hastighet. I den representativa kymografen representerar X-axeln tiden i min (vänster till höger) och Y-axeln visar avståndet i μm. X1 representerar utskjutningstid (persistens), X2 representerar indragningstid och Y representerar utskjutningsavståndet. Utskjutningshastigheten beräknas genom att dividera utskjutningsavståndet (Y) med utskjutningstiden (X1). Indragningshastigheten beräknas genom att dividera utskjutningsavståndet (Y) med indragningstiden (X2). I det här exemplet var utskjutningsavståndet 30 pixlar x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, utskjutningstiden var 8 pixlar x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min., indragningstiden var 8 pixlar x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. Utskjutnings-/indragningshastigheten beräknades till 4,875 μm/0,6664 min. = 7,315 μm/min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på en cell som bör uteslutas från analysen. (A) Ett exempel på en cell som inte är lämplig för analys. Skala bar, 20 μm. (B) Kymografianalysen av denna cell visar, särskilt i re-slice 1,3,5,7, inga tydliga utsprång. I detta fall slutade cellen att sprida sig men började inte röra sig ännu, och därför kan inte många membranutsprång observeras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande film 1. MEF pläterades på en fibronektinbelagd glasbottenskål och avbildades med hjälp av time-lapse-faskontrastvideomikroskopi i 10 minuter med 40x / 1.4 NA torrt mål. Tiden anges i sekunder. Skalstång, 10 μm. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellkantsutsprångsdynamik, bestående av utsprång, indragningar och volanger, är både en förutsättning och en potentiell hastighetsbegränsande händelse i cellmotilitet. Här beskriver vi en snabb och enkel metod för att mäta dynamiken i cellkantsutsprång under spridning. Denna metod möjliggör kortvarig avbildning, genererar en betydande mängd data, kräver inte fluorescerande märkning av celler eller dyr fluorescerande mikroskopiutrustning och kan användas som en preliminär metod för att testa cytoskelettdynamik som är involverad i cellmotilitet innan man beslutar att utföra mer resurskrävande metoder. Dessutom kan man använda knockout- eller knockdown-celler och / eller proteinmutanter i denna analys som ett snabbt och enkelt verktyg för att identifiera kritiska proteiner och potentiella signalmekanismer som är involverade i cytoskelettdynamiken.
Observera att det är viktigt att välja rätt celler för utskjutningsanalys. Cellerna inkuberas i 15 minuter innan filmer förvärvas för att möjliggöra spridning. Om man bestämmer sig för att mäta utsprång under spridning (i motsats till att mäta utsprång under migration), bör endast celler som är i sin spridningsfas under filmförvärv avbildas. Celler som inte började sprida sig är inte lämpliga för kymografianalys. Celler som avslutade sin spridningsfas men inte började röra sig (figur 4) kommer inte heller att vara lämpliga för analys. Rörelsen av deras kärna kan skilja dessa celler: under spridning är kärnan stationär, medan under cellmigration är kärnan dynamisk och lokaliseras på baksidan av cellen för att konstruera en ledande kant-centrosomkärnaxel mot migrationsriktningen. En annan vanlig fråga i de senare stadierna av avbildning är en situation där celler berör varandra. Sådana filmer bör uteslutas från analys, eftersom interaktioner och signaler från angränsande celler kan störa cellkantsutskjutningsdynamiken.
I detta manuskript beskriver vi analysen av cellkantsutsprångsdynamik med hjälp av faskontrastljusmikroskopi. Denna metod kan utvidgas för att mäta dynamiken hos intracellulära komponenter med fluorescensmikroskopi också. Sådan vanlig användning av fluorescerande kymografi beskrivs ofta för att mäta dynamiken i cytoskelettstrukturer i celler. Dogget och Breslin har till exempel använt kymografi av GFP-aktintransfekterade HUVEC-celler för att analysera aktinspänningsfiberdynamik och omsättning14.
Detta protokoll och flera andra tidigare artiklar använde fibroblaster pläterade på fibronektin för cellkantsutsprångsanalysen samt för tvådimensionella cellmotilitetsanalyser. Fibroblaster används ofta för rörlighetsanalyser och andra relaterade analyser såsom cellkantsutsprångsdynamikanalysen eftersom de är mesenkymala och rörliga och har tydliga cytoskelettstrukturer såsom lamellipodi, filopodi och fokala vidhäftningar. Även om vi inte beskriver analysen för andra celltyper och substrat, kan denna metod enkelt modifieras. Till exempel, i den första dokumentationen av lamelldynamikanalysen, som vi och andra modifierade för att bli cellkantsutskjutningsdynamikanalysen11, använde författarna keratinocyter stimulerade att migrera av EGF i en repanalys, vilket visade att andra celltyper och andra stimuleringar kunde tillämpas på denna analys. Även om vi beskriver mätningen av cellkantsutsprångsdynamiken under cellspridning, kan samma metod användas genom att mäta dynamiken i utsprång under migration av celler, vilket demonstreras till exempel i Bear et al.12 och Hinz et al.11.
Faktum är att flera laboratorier har använt denna analys på MEF för att belysa cytoskelettdynamik och signalmekanismer tidigare. Miller et al. hade till exempel tidigare använt utskjutningsanalysen för att visa att Abl2/Arg förmedlar kontakten mellan aktin och mikrotubuli vid cellkanten15. Bryce et al. visade med hjälp av analysen att kortaktin knockdown-celler har nedsatt cellmotilitet som samverkar med försämring av persistensen av lamellipodiella utsprång. Denna defekt beror på försämring vid montering av nya vidhäftningar i utsprång16. Lapetina et al. använde cellkantsutsprångsanalysen i Abl2/Arg knockout- och kortaktinknockdown-celler som räddats med mutanter av de två proteinerna för att belysa en Abl2/Arg-medierad regleringsmekanism cellkantsutsprång17. Med hjälp av samma analys har Miller et al. också visat att Arg reglerar N-WASP-medierad aktinpolymerisation och därmed cellkantsutsprångsdynamik18. Vi har nyligen använt cellkantsutsprångsanalysen för att visa att icke-receptortyrosinkinas Pyk2 reglerar dynamiken i utsprång och efterföljande cellmigration via direkta och indirekta interaktioner med adaptorproteinet CrkII. I det här dokumentet har vi använt Pyk2-WT och Pyk2-/- och Crk-WT och knockdown MEF, räddningsmutanter och epistasexperiment för att belysa molekylära interaktioner och signalhierarki mellan de två proteinerna under cellkantsutsprång. Denna nya komplexa regleringsmekanism möjliggör finjustering av cellkantsutsprångsdynamiken och därmed cellmigration å ena sidan tillsammans med tät reglering av cellmotilitet å andra sidan19. Med hjälp av cellkantsutskjutningsanalysen har ovanstående papper och andra som följde avsevärt ökat vår kunskap om regleringsmekanismerna för cellkantsutsprång i synnerhet och cellmigration i allmänhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag NIH MH115939, NS112121, NS105640 och R56MH122449-01A1 (till Anthony J. Koleske) och från Israel Science Foundation (bidragsnummer 1462/17 och 2142/21) (till Hava Gil-Henn).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
- Kurosaka, S., Kashina, A.
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Jacks laboratory protocol. , Available from: http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs (2021).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
