Summary
Protokollen presenterer en rekke beste praksis-protokoller for innsamling av beinpulver fra åtte anbefalte anatomiske prøvetakingssteder (spesifikke steder på et gitt skjelettelement) over fem forskjellige skjelettelementer fra middelalderske individer (radiokarbon datert til en periode på ca. 1040-1400 CE, kalibrert 2-sigma rekkevidde).
Abstract
Metodene som presenteres her søker å maksimere sjansene for utvinning av menneskelig DNA fra gamle arkeologiske rester samtidig som det begrenser inngangsprøvemateriale. Dette ble gjort ved å målrette anatomiske prøvetakingssteder som tidligere ble bestemt for å gi de høyeste mengdene gammelt DNA (aDNA) i en komparativ analyse av DNA-utvinning over skjelettet. Tidligere forskning har antydet at disse protokollene maksimerer sjansene for vellykket gjenoppretting av gammelt menneskelig og patogen DNA fra arkeologiske rester. DNA-utbytter ble tidligere vurdert av Parker et al. 2020 i en bred undersøkelse av aDNA-bevaring på tvers av flere skjelettelementer fra 11 individer gjenvunnet fra middelalderen (radiokarbon datert til en periode på ca. 1040-1400 e.Kr., kalibrert 2-sigma rekkevidde) kirkegård på Krakauer Berg, en forlatt middelaldersk bosetning nær Peißen Tyskland. Disse åtte prøvetakingspunktene, som spenner over fem skjelettelementer (pars petrosa, permanente molarer, thorax vertebra, distal phalanx og talus) ga vellykket høy kvalitet gammelt menneskelig DNA, hvor utbyttet var betydelig større enn det totale gjennomsnittet på tvers av alle elementer og individer. Avlingene var adekvate til bruk i de fleste vanlige nedstrøms populasjonsgenetiske analyser. Våre resultater støtter fortrinnsrett bruk av disse anatomiske prøvetakingsstedene for de fleste studier som involverer analyser av gammelt menneskelig DNA fra arkeologiske rester. Implementering av disse metodene vil bidra til å minimere ødeleggelsen av dyrebare arkeologiske prøver.
Introduction
Prøvetaking av gamle menneskelige rester med henblikk på DNA-utvinning og analyse er iboende ødeleggende 1,2,3,4. Prøvene i seg selv er verdifulle eksemplarer, og morfologisk bevaring bør bevares der det er mulig. Som sådan er det viktig at prøvetakingspraksis optimaliseres for både å unngå unødvendig ødeleggelse av uerstattelig materiale og for å maksimere sannsynligheten for suksess. Nåværende beste praksis-teknikker er basert på en liten kohorte av studier begrenset til enten rettsmedisinske undersøkelser5,6, studier av gamle prøver der utviklingen av optimal prøvetaking ikke er det direkte målet med studien7, eller dedikerte studier som benytter enten ikke-menneskelige rester8 eller rettet mot et svært lite utvalg av anatomiske prøvetakingssteder (brukt her for å betegne et bestemt område av et skjelettelement hvorfra beinpulver, til bruk i nedstrøms DNA-analyser, ble generert)9,10. Prøvetakingsprotokollene som presenteres her ble optimalisert i den første storskala systematiske studien av DNA-bevaring på tvers av flere skjelettelementer fra flere individer11. Alle prøvene stammet fra skjelettelementer gjenfunnet fra 11 personer utgravd fra kirkekirkegården til den forlatte middelalderbosetningen Krakauer Berg nær Peißen, Sachsen-Anhalt, Tyskland (se tabell 1 for detaljert prøvedemografi) og kan derfor trenge modifisering for bruk med prøver utenfor dette geografiske / tidsmessige området.
| Individ | Sex | Estimert alder ved død | 14 C datoer (CE, Cal 2-sigma) |
| KRA001 | Mannlig | 25-35 | 1058-1219 |
| KRA002 | Kvinnelig | 20-22 | 1227-1283 |
| KRA003 | Mannlig | 25 | 1059-1223 |
| KRA004 | Mannlig | 15 | 1284-1392 |
| KRA005 | Mannlig | 10-12 | 1170-1258 |
| KRA006 | Kvinnelig | 30-40 | 1218-1266 |
| KRA007 | Kvinnelig | 25-30 | 1167-1251 |
| KRA008 | Mannlig | 20 | 1301-1402 |
| KRA009 | Mannlig | Ukjent | 1158-1254 |
| KRA010 | Mannlig | 25 | 1276-1383 |
| KRA011 | Kvinnelig | 30-45 | 1040-1159 |
Tabell 1: Genetisk bestemt kjønn, arkeologisk bestemt estimert alder ved død og radiokarbondatering (14C Cal 2-sigma) for alle de 11 individene som ble samplet. Denne tabellen er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011.
Disse protokollene tillater en relativt enkel og effektiv generering av beinpulver fra åtte anatomiske prøvetakingssteder over fem skjelettelementer (inkludert pars petrosa) med begrenset laboratorieindusert DNA-forurensning. Av disse fem skjelettelementene har syv anatomiske prøvetakingssteder funnet på fire skjelettelementer blitt bestemt til å være levedyktige alternativer til den destruktive prøvetakingen av petrouspyramiden11,12. Disse inkluderer sementum, dentin og massekammer av permanente molarer; kortikale bein samlet fra det overlegne vertebrale hakket så vel som fra kroppen av thoraxvirvler; kortikal bein som stammer fra den dårligere overflaten av den apikale tuft og aksel av de distale phalanges; og det tette kortikale beinet langs den ytre delen av tali. Mens det er flere mye anvendte metoder for prøvetaking av pars petrosa 4,12,13,14, dentin og tannmassekammeret 1,2,15, publiserte metoder som beskriver den vellykkede generasjonen av beinpulver fra sementum 16 , vertebral kropp, dårligere vertebral hakk og talus kan være vanskelig å oppnå. Som sådan demonstrerer vi her optimaliserte prøvetakingsprotokoller for petrouspyramiden (trinn 3.1); cementum (trinn 3.2.1), dentin (trinn 3.2.2) og tannmasse (trinn 3.2.3) av voksne molarer; kortikale bein i vertebral kroppen (trinn 3.3.1) og overlegen vertebral bue (trinn 3.3.2); den distale falanksen (trinn 3.4); og talus (trinn 3.5) for å gjøre effektiv bruk av disse skjelettelementene for både aDNA og rettsmedisinsk forskning mer tilgjengelig.
Protocol
All forskning som presenteres her ble utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av Max Planck Institute for Science of Human History, Jena, Tyskland for arbeid med gamle menneskelige rester. Før du utfører noen trinn i denne protokollen, må du sørge for å overholde alle lokale / statlige / føderale etiske krav knyttet til både å få tillatelse til den vitenskapelige studien og bruk av menneskelige rester for destruktiv prøvetaking i ditt område. Alle prosedyrer/kjemikalieoppbevaring skal utføres i henhold til individuelle retningslinjer for institusjonell sikkerhet.
1. Vurderinger før prøvebehandling
- Behandle prøver med forsiktighet som gamle rester er en uopprettelig og endelig ressurs (f.eks. Prøvetaking bør være så minimalt sløsing som mulig, og alle rester returneres til sine respektive og lovlige leverandører hvis mulig).
- Utfør alle trinnene i et renromsmiljø, helst på et dedikert gammelt DNA-anlegg17,18,19. Bruk personlig verneutstyr (PPE) som består av sterile mikroporøse kjeledresser med hette, sterile hansker (to par), kirurgisk maske, vernebriller og sterile støvler eller sklisikre sko med sterile deksler (se materialtabell). Bytt hansker ofte, spesielt mellom prøvene.
- Rengjør og desinfiser alt utstyr og overflater grundig med blekemiddel/DNA-dekontamineringsløsning/etanol og UV-bestråling (bølgelengde: 254 nm) der det er mulig (f.eks. borekroner, bor, vises/klemmer osv.). Til slutt anbefales det sterkt å ta regelmessige ergonomiske pauser (hver 2-3 time hvis mulig) for å unngå overutmattelse på grunn av renromsmiljøet.
MERK: Alle skjelettrester skal dokumenteres på riktig måte (f.eks. fotografert, veid og om mulig mikro-CT skannet, 3D-avbildet osv.) før prøvetaking (protokoller for passende dokumentasjon dekkes ikke i dette manuskriptet). Alle prøvetakingsprotokoller kan settes på pause mellom prøvetakings-iterasjoner, og prøvene kan lagres på ubestemt tid i et tørt, temperaturkontrollert (25 °C), sterilt miljø.
2. Forbehandling
- Dekontaminere alle anatomiske prøvetakingssteder før beinpulvergenerering for å minimere risikoen for forurensning18.
MERK: Effekten av blekemiddel og / eller overflatefjerning (se MERK i trinn 3.3.2 for overflatefjerningstrinn) for prøvedekontaminering er fortsatt et spørsmål om debatt blant aDNA-forskere 8,19,20,21,22,23,24,25, da begge kan påvirke det totale DNA-utbyttet, spesielt i svært nedbrytte prøver. Som sådan anses følgende trinn som valgfrie og er inkludert her som de ble brukt i alle prøver for å generere de representative resultatene som presenteres i dette papiret. Det anbefales at bruken av disse forbehandlingsprotokollene bestemmes fra sak til sak basert på molekylær applikasjon, alder, sjeldenhet og nivå av morfologisk nedbrytning av hvert prøvesett.- Utfør all prøvetaking i et dedikert rent rom under en UV-lysutstyrt polymerasekjedereaksjonshette (PCR) eller biosikkerhetsskap med luftstrømmen slått av. Fordel steril aluminiumsfolie over benken for å fange opp eventuelt benpulver/fragmenter.
- Sørg for at alle beinfragmenter gjenvinnes (for repatriering) før folien kastes. Bytt folien mellom behandlingen av hvert skjelettelement. Kast brukt folie i en autoklaverbar biohazard pose / beholder.
- Fjern så mye løs smuss/detritus som mulig fra anatomiske prøvetakingssteder ved å tørke området forsiktig av med en lofri, tørr steril våtserviett (se Materialtabell). Kast våtserviettene i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere.
- Dekontaminerer den rensede overflaten ved å tørke av med en steril våtserviett fuktet med fortynnet kommersielt blekemiddel (~0,01 % v/v, fortynnet med ultrarent DNase/RNase fritt vann) og la det inkubere i 5 minutter. Kast våtserviettene i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere.
FORSIKTIG: Blekemiddel er et svært etsende og reaktivt kjemikalie; Derfor bør egnede sikkerhetstiltak være på plass før bruk. - Fjern så mye gjenværende blekemiddel som mulig fra det anatomiske prøvetakingsstedet med en steril klut fuktet med ultrarent DNase / RNase-fritt vann. Kast våtserviettene i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere.
- Utsett alle rengjorte anatomiske prøvetakingssteder for UV-stråling i 30 minutter (bølgelengde: 254 nm), og la det tørke helt ved romtemperatur. Sørg for at de anatomiske prøvetakingsstedene er helt tørre før du fortsetter med prøvetaking eller går tilbake til lagring for ikke bare å gjøre beinpulvergenerering enklere, men også for å forhindre ytterligere nedbrytning av prøven (f.eks. Mugg).
FORSIKTIG: Eksponering for UV-stråling kan være skadelig for øynene. - Flytt umiddelbart til prøvetaking eller oppbevar skjelettelementer i et tørt, temperaturkontrollert (25 °C) sterilt miljø.
3. Generering av beinpulver
MERK: Følgende protokoller er ment for bruk i DNA-ekstraksjon etter Dabney et al. 2019 protokoll26.
- Prøvetaking av pars petrosa
MERK: Denne protokollen er tilpasset prosedyrer beskrevet i Pinhasi et al. 20194 og presenteres her for brukervennlighet. Denne protokollen representerer ikke den nåværende, minst destruktive metoden for prøvetaking av pars petrosa. Som sådan anbefales det å bruke protokollen beskrevet av Sirak et al. 201713 eller Orfanou et al. 202014 for prøver der morfologisk bevaring er av største betydning.- Utfør all prøvetaking i et dedikert rent rom under en UV-lysutstyrt PCR-hette eller biosikkerhetsskap (bølgelengde: 254 nm) med luftstrømmen slått av. Fordel steril aluminiumsfolie over benken for å fange opp eventuelt benpulver/fragmenter.
- Sørg for at alle beinfragmenter og så mye pulver som mulig gjenvinnes (for repatriering) før folie kastes. Bytt folie mellom hver prøvetaking. Kast den brukte folien i en autoklaverbar biohazard pose / beholder.
- Fest det tørre, dekontaminerte elementet ved hjelp av en sterilisert klemme eller skrue.
- Skjær pars petrosa i to langs den overlegne sulcus petrosus (se figur 1) ved hjelp av en standard gullsmedsag utstyrt med et 0,6 mm blad (se materialtabell) på middels hastighet for å unngå overoppheting (se MERKNAD nedenfor trinn 3.1.6).
FORSIKTIG: Pars petrosa er veldig tett, og som sådan kan det være vanskelig å kutte. Pass på at elementet holdes forsvarlig klemt for å unngå skade. Kast eventuelle ødelagte sagblader i riktig skarpe beholder. - Fjern petrousdelene fra klemmen. Gjenopprett og lagre eventuelt løst/overflødig materiale.
- Legg veiepapir i en steril veiebåt
- Hold petrousdelen over veiepapiret, kutt siden vippet mot veiebrettet. Bor inn i det tette kortikale beinet mellom ansiktskanalen og mastoid antrum (virker blankere enn det omkringliggende materialet, se figur 1) ved hjelp av tannbor utstyrt med en liten målebit (se materialtabell) og sett til middels hastighet, middels dreiemoment for å produsere beinpulver.
MERK: Boring/skjæring bør gjøres i korte støt ved lave til middels hastigheter for å unngå overoppheting av beinet og potensielt ødelegge/skade DNA. Anekdotisk, når den tette delen av petrous begynner å overopphetes, kan en lukt beskrevet som matlaging av bacon observeres. Avslutt boringen/saging umiddelbart og la beinet hvile til det er tilstrekkelig kjølig før det gjenopptas. - Gjenta boringen til ca. 50-100 mg pulver er samlet i veiepapiret, målt ved hjelp av en lukket balanse nøyaktig til minst 0,01 mg (se materialtabell).
MERK: Der det er mulig er det foreslått å samle 100 mg benpulver for å tillate to replikere DNA-ekstraksjon av 50 mg hver. Dette kan imidlertid ikke alltid være mulig basert på enten begrensning av de anatomiske prøvetakingsstedene selv (f.eks. den distale falanksen, tannmassekammeret) eller behovet for morfologisk bevaring. For andre steder, for eksempel sementum, kan betydelig mindre enn 50 mg av materialet være tilgjengelig. Imidlertid har sementum, tannmassekammer og distal falanks alle vist seg å gi signifikant endogent DNA 11,27,28, til tross for lavere innledende inngang av beinpulver fra ekstraksjonsprosessen. - Overfør pulver fra veiepapiret til et 2 ml merket low-bind, safe-lock-rør for ekstraksjon eller lagring. Oppbevar prøver ved -20 °C, på ubestemt tid.
- Oppbevar gjenværende ben/overflødig pulver i et tørt, temperaturkontrollert (25 °C) sterilt miljø til retur/hjemsendelse kan fullføres.
- Kast alt avfall i autoklaverbare biohazard poser eller beholdere. Sterilisere/dekontaminere alt gjenbrukbart utstyr (f.eks. klemmer, borekroner, bor, sager osv.) ved hjelp av blekemiddel-/DNA-dekontamineringsløsning/etanol og UV-eksponering (bølgelengde: 254 nm), alt etter hva som er aktuelt, mellom hver prøvetaking.
Figur 1: Tinningbein inkludert pars petrosa. (A) Prøveskjæring som viser plasseringen av petrouspyramiden og sulcus petrosa. (B) Petrous del etter skjæring som fremhever de tette områdene som skal bores. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Prøvetaking av permanente jeksler
MERK: For prøvetaking av permanente jeksler, forhåndsvelg in situ molarer med smeltede røtter og ideelt sett uten karies, sprekker i emaljen eller overdreven slitasje for best resultat. Fjern eventuell tannkalkulusprøvetaking og oppbevar ved -20 °C for mulige fremtidige analyser av det orale mikrobiomet (prosedyre som ikke er dekket her).- Prøvetaking av sementum
- Utfør all prøvetaking i et dedikert rent rom under en UV-lysutstyrt PCR-hette eller biosikkerhetsskap (bølgelengde: 254 nm) med luftstrømmen slått av. Fordel steril aluminiumsfolie over benken for å fange opp eventuelt benpulver/fragmenter.
- Sørg for at alle beinfragmenter og så mye pulver som mulig gjenvinnes (for repatriering) før folie kastes. Bytt folie mellom hver prøvetaking. Kast brukt folie i en autoklaverbar biohazard pose / beholder.
- Legg et ark med veiepapir i et sterilt veiebrett.
- Hold / fest den dekontaminerte molaren ved emaljen, roten ned, over et veiebrett ved hjelp av en håndholdt klemme som en justerbar skiftenøkkel (se materialtabell).
- Utstyr en tannbor med et diamantkantet sirkulært skjærehjul. Når boret er satt til en middels hastighet/dreiemomentinnstilling, berører du lett kanten av borkronen til roten i en vinkel på omtrent -20°.
- Skrap nedover i skuffen for å fjerne/samle det gule, ytterste materialet fra roten (cementum). Stopp oppsamlingen når det lysere (hvite) materialet i dentinet blir synlig.
NOTAT: Det er viktig å matche rotasjonsretningen til skjærebiten i forhold til oppsamlingsbrettet for å unngå at pulveret blir aerosolisert og potensielt kaster bort prøven ved å savne brettet helt. Cementumet er spesielt rikt på DNA; Imidlertid er typiske utbytter av materiale mye mindre enn andre anatomiske prøvetakingssteder (~ 7-20 mg) 11,27,28. - Registrer massen av pulver samlet i veiepapir ved hjelp av en lukket balanse nøyaktig til minst 0,01 mg (se materialtabell).
- Overfør pulver fra veiepapiret til et 2 ml lavbindende, sikkert låseslange for ekstraksjon. Oppbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
- Prøvetaking av massekammeret
- Etter at sementumet er samlet (om ønskelig), seksjoner molaren langs cemento-emaljekrysset ved hjelp av en gullsmedsag for å fjerne kronen (se figur 2).
- Legg et nytt ark veiepapir i et nytt veiebrett.
- Fest kroneseksjonen i en håndholdt klemme eller skrue over veiebrettet. Hold kuttet side vippet nedover og bor / skrape materiale som første pass med en tannbor utstyrt med en liten gauge borekrone (se Materialtabell) langs kantene av massekammeret i kronedelen (se figur 2).
MERK: Bare den første passeringen av det indre av massekammeret skal samles og merkes som massemateriale (5-15 mg typisk utbytte), noe dypere inn i tannen betraktes som dentin. - Vri tannen med den nedre delen vendt ned, trykk på klemmen med en hammer, og samle det frigjorte pulveret på veiepapiret.
- Registrer vekten av pulveret som er samlet i veiepapiret ved hjelp av en lukket balanse som er nøyaktig til minst 0,01 mg (se materialtabell).
- Overfør pulver fra veiepapiret til et 2 ml lavbindende, trygt låserør for ekstraksjon. Oppbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
- Prøvetaking av dentinet
- Legg et nytt ark veiepapir i et nytt veiebrett.
- Hold kroneseksjonen over veiebrettet (i henhold til trinn 3.2.2.3), bor ut og samle ytterligere 50-100 mg dentin målt ved hjelp av en lukket balanse nøyaktig til 0,01 mg (se materialtabell) fra det indre av massekammeret på samme måte for ytterligere dentinprøvetaking (se figur 2).
- Overfør benpulver fra veiepapiret til et 2 ml lavbindende, trygt låserør for ekstraksjon. Oppbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
- Oppbevar de resterende tannbitene/overflødig pulver i et tørt, temperaturkontrollert (25 °C) sterilt miljø til retur/hjemsendelse kan fullføres.
- Kast alt avfall i autoklaverbare biohazard poser eller beholdere. Sterilisere/dekontaminere alt gjenbrukbart utstyr (f.eks. klemmer, borekroner, bormaskiner, sager osv.) ved hjelp av blekemiddel-/DNA-dekontamineringsløsning/etanol- og UV-eksponeringer (bølgelengde: 254 nm) etter behov, mellom hver prøvetaking.
- Prøvetaking av sementum
Figur 2: Permanent molar pre-prøvetaking . (A) Forbehandlet molar før prøvetaking, som viser krone, cementum (gulaktig lag av roten) og skjærestedet ved cemento-emaljekrysset. (B) Den samme molare postsementumsamlingen, som viser kuttstedet ved cemento-emaljekrysset. (C) Molar etterskjæring og prøvetaking som viser anatomiske prøvetakingssteder for tannmassekammeret og dentin i kronen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Prøvetaking av brystvirvlene
- Prøvetaking av vertebrallegemet
- Utfør all prøvetaking i et dedikert rent rom under en UV-lysutstyrt PCR-hette eller biosikkerhetsskap (bølgelengde: 254 nm) med luftstrømmen slått av. Fordel steril aluminiumsfolie over benken for å fange opp eventuelt benpulver/fragmenter.
- Sørg for at alle beinfragmenter og så mye pulver som mulig gjenvinnes (for repatriering) før folie kastes. Bytt folie mellom hver prøvetaking. Kast brukt folie i en autoklaverbar biohazard pose / beholder.
- Legg et lite ark veiepapir i et standard veiebrett.
- Fest ryggvirvlene med en klemme eller håndvise, med vertebralkroppen utover.
- Hold ryggvirvlene over veiebrettet med virvellegemet vippet nedover. Ved hjelp av en tannbor utstyrt med en liten borekrone (se materialtabell) satt til lavt hastighets høyt dreiemoment, bor du langs den ytterste kanten (dårligere og overlegen) av det kortikale beinet som omgir det avstivende indre vevet i vertebrallegemet (se figur 3).
- Skrap biten mot det kortikale laget over et standard vektbrett til 50-100 mg materiale er samlet opp, målt ved hjelp av en lukket balanse nøyaktig til 0,01 mg (se materialtabell).
- Overfør benpulver fra veiepapiret til et 2 ml lavbindende, sikkert låseslange for ekstraksjon. Oppbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
- Prøvetaking av den overlegne vertebrale buen
MERK: Dette trinnet er valgfritt. Fjern og kast det ytterste laget av det kortikale beinet i den overlegne vertebrale buen ved hjelp av en tannbor utstyrt med en liten borekrone (se materialtabell) ved å skrape den langs overflaten19. Dette er ikke foreslått for prøvetaking fra vertebrallegemet, da laget av kortikale bein generelt er veldig tynt og sannsynligvis vil bli helt utarmet av denne prosessen (se MERKNAD i avsnitt 2).- Legg et lite ark veiepapir i et standard veiebrett.
- Fest ryggvirvlene i en håndklemme/vise med virvelprosessen utover, overlegent aspekt ned.
- Mens du holder ryggvirvlene, overlegent aspekt nede, over et veiebrett, bor du oppover i midten av det V-formede hakket dannet ved fusjon av den spinøse prosessen med lamellene (se figur 3) ved hjelp av en tannbor med en liten målerbit (se materialtabell) satt til lav hastighet og høyt dreiemoment.
- Avslutt boring når det er et merkbart fall i motstanden. Endre boreposisjonen litt og gjenta til 50-100 mg benpulver er samlet, målt ved hjelp av en lukket balanse nøyaktig til 0,01 mg (se materialtabell).
- Overfør benpulver fra veiepapiret til et 2 ml lavbindrør for ekstraksjon. Oppbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
- Gjenværende ben-/overflødig pulver oppbevares i et tørt, temperaturkontrollert (25 °C) sterilt miljø frem til retur/hjemsendelse.
- Kast alt avfall i autoklaverbare biohazard poser eller beholdere. Sterilisere/dekontaminere alt gjenbrukbart utstyr (f.eks. klemmer, borekroner, bor, sager osv.) ved hjelp av blekemiddel-/DNA-dekontamineringsløsning/etanol- og UV-eksponering (bølgelengde: 254 nm), alt etter hva som er aktuelt, mellom hver prøvetaking.
- Prøvetaking av vertebrallegemet
Figur 3: Vertebral kropp og overlegen vertebral bue kortikale bein anatomiske prøvetakingssteder av thorax vertebra. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Prøvetaking av distal falanks
MERK: Dette trinnet er valgfritt. Fjern og kast det ytterste laget av skaftets kortikale bein og/eller apikale tuft ved hjelp av et tannbor utstyrt med en liten borekrone ved å skrape den langs overflaten19. Dette er kanskje ikke mulig for prøver med for tynne kortikale bein- eller juvenilrester (se MERKNAD i avsnitt 2).- Utfør all prøvetaking i et dedikert rent rom, under en UV-lysutstyrt PCR-hette eller biosikkerhetsskap (UV-bølgelengde: 254 nm) med luftstrømmen slått av. Fordel steril aluminiumsfolie over benken for å fange opp eventuelt benpulver/fragmenter.
- Sørg for at alle beinfragmenter og så mye pulver som mulig gjenvinnes (for repatriering) før folie kastes. Bytt folie mellom hver prøvetaking. Kast brukt folie i en autoklaverbar biohazard pose / beholder.
- Legg et lite ark veiepapir i et standard veiebrett.
- Fest prøven i håndholdt klemme/vise, overordnet side oppover.
- Hold prøven over veiebrettet, samle beinpulver fra det kortikale beinet fra den nedre siden av den apikale tuften og akselen ved å bore gjennom de ytterste tette lagene (se figur 4) ved hjelp av en tannbor utstyrt med en liten borekrone (se materialtabell).
- Avslutt boring når det er en markert reduksjon i motstand, da dette betyr lettere, avbrytende materiale. Gjenta denne prosessen, utstrålende utover fra den første boringen til minst 50-100 mg beinpulver er samlet, målt ved hjelp av en lukket balanse nøyaktig til 0,01 mg (se materialtabell).
- Overfør benpulver fra veiepapiret til et 2 ml lavbindende, trygt låserør for ekstraksjon. Oppbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
- Oppbevar gjenværende ben/overflødig pulver i et tørt, temperaturkontrollert (25 °C) sterilt miljø frem til retur/hjemsendelse.
- Kast alt avfall i autoklaverbare biohazard poser eller beholdere. Sterilisere/dekontaminere alt gjenbrukbart utstyr (f.eks. klemmer, borekroner, bor, sager osv.) ved hjelp av blekemiddel-/DNA-dekontamineringsløsning/etanol og UV-eksponering, alt etter hva som er aktuelt, mellom hver prøvetaking.
MERK: For mindre prøver (f.eks. Juvenile prøver) kan det være betydelig mindre enn de foreslåtte 50-100 mg kortikale beinene som er tilgjengelige for prøve. Men selv i lave mengder har dette anatomiske prøvetakingsstedet vist seg å være spesielt rik på DNA11.
Figur 4: Distal falanks som viser plasseringen av tett kortikal bein langs skaftet og undersiden av den apikale tuften. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Prøvetaking av Talus
- Utfør all prøvetaking i et dedikert rent rom under en UV-lysutstyrt PCR-hette eller biosikkerhetsskap (bølgelengde: 254 nm) med luftstrømmen slått av. Fordel steril aluminiumsfolie over benken for å fange opp eventuelt benpulver/fragmenter.
- Sørg for at alle beinfragmenter og så mye pulver som mulig gjenvinnes (for repatriering) før folie kastes. Bytt folie mellom hver prøvetaking. Kast brukt folie i en autoklaverbar biohazard pose / beholder.
- Legg et lite ark veiepapir i et standard veiebrett.
- Fest prøven i håndholdt klemme/vise, kuppel oppover.
- Hold talus, kuppel oppover og medial overflate mot samleren, over veiebrettet. Skrap kortikale bein fra talushalsen til en dybde på ~ 1 mm (se figur 5) ved hjelp av en tannbor med en lavmålsbit (se materialtabell) satt til lav hastighet og høyt dreiemoment.
- Endre boreposisjonen litt og gjenta til ca. 50-100 mg benpulver er samlet opp, målt ved hjelp av en lukket balanse nøyaktig til 0,01 mg (se materialtabell).
- Overfør benpulver fra veiepapiret til et 2 ml lavbindrør for ekstraksjon. Oppbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
- Oppbevar gjenværende ben/overflødig pulver i et tørt, temperaturkontrollert (25 °C) sterilt miljø til retur/hjemsendelse kan fullføres.
- Kast alt avfall i autoklaverbare biohazard poser eller beholdere. Sterilisere/dekontaminere alt gjenbrukbart utstyr (f.eks. klemmer, borekroner, bor, sager osv.) ved hjelp av blekemiddel-/DNA-dekontamineringsløsning/etanol og UV-eksponering (bølgelengde: 254 nm), alt etter hva som er aktuelt, mellom hver prøvetaking.
Figur 5: Prøvetakingsområde av talus for kortikal beinrestitusjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
MERK: Talus har svært lite kortikal bein (et tynt ytre lag). Materialet skal ikke bare hentes fra overflaten, men også det underliggende tette laget av avstivende bein.
Representative Results
I en separat studie 11 ble DNA ekstrahert fra beinpulver generert fra hvert anatomisk prøvetakingssted hos11 individer, ved hjelp av en standard DNA-ekstraksjonsprotokoll optimalisert for korte fragmenter fra forkalket vev2. Enkeltstrengede biblioteker ble deretter produsert28 og sekvensert på en HiSeq 4000 (75 bp paired-end) til en dybde på ~ 20.000.000 leser per prøve. De resulterende sekvensdataene ble deretter evaluert for endogent humant DNA-innhold ved bruk av EAGER pipeline29 (BWA-innstillinger: Frølengde på 32, 0,1 mismatch-straff, kartleggingskvalitetsfilter på 37). Alle representative resultater rapporteres ved å bruke de samme beregningene som Parker et al. 202011 for konsistens. Biblioteker fra de pulveriserte delene av pars petrosa ga i gjennomsnitt høyere endogent DNA enn noen av de andre 23 anatomiske prøvetakingsstedene som ble undersøkt (figur 6A-B). De syv ekstra anatomiske prøvetakingsstedene som presenteres i denne protokollen (sementum, første pass av tannmassekammeret og dentin av permanente molarer, kortikale bein fra vertebrallegemet og overlegen vertebral bue av thorax vertebra; kortikal bein fra apikal tuft av distal phalanx; og kortikal bein fra talushalsen) produserte de nest høyeste utbyttene (uten statistisk signifikans mellom disse anatomiske prøvetakingsstedene; Figur 6A-B; Tilleggsfil 1: EndogendDNAPreCap). Disse alternative stedene produserte alle konsekvent DNA-utbytter som er tilstrekkelige for standard populasjonsgenetiske analyser som mitokondrielle analyser og enkeltnukleotidpolymorfisme (SNP) analyser. Dupliseringsratene i biblioteker som stammet fra alle anatomiske prøvetakingssteder var lave (klyngefaktorer < 1,2 i gjennomsnitt, beregnet som forholdet mellom alle kartavlesninger og unike kartavlesninger, tabell 2; Tilleggsfil 1: ClusterFactor), noe som indikerer at alle bibliotekene som ble vist var av svært høy kompleksitet. Tilsvarende var gjennomsnittlige eksogene estimater for human DNA-forurensning lave, i gjennomsnitt < 2 % (X-kromosomkontaminering hos menn, n = 7, som rapportert av ANGSD30-rørledningen) på alle anatomiske prøvetakingssteder bortsett fra den overlegne vertebrale buen (gjennomsnittlig estimert forurensning: 2,11 %, med en prøve fjernet som en uteligger; KRA005: 19,52%, se tabell 2; Tilleggsfil 1: Xkontaminering). Gjennomsnittlig fragmentlengde (etter filtrering for å fjerne alle avlesninger < 30 bp) var lavest i materialet samlet inn fra tannmassekammeret og dentin, uten signifikant variasjon blant andre anatomiske prøvetakingssteder (henholdsvis 55,14 bp og 60,22 bp, sammenlignet med en gjennomsnittlig median på 62,87, parvise p-verdier < 0,019, tabell 2; Tilleggsfil 1: AvgFragLength). I tillegg inneholder tennene og brystvirvlene hver flere anatomiske prøvetakingssteder der høy endogen DNA-utvinning ble observert, noe som gjør dem spesielt egnet som alternativer til pars petrosa.
Figur 6: Menneskelig DNA-innhold for alle screenede prøver. Svarte linjer representerer det totale gjennomsnittet, mens røde linjer representerer medianen (solid: human DNA proportion, stiplet: kartlagt menneskelig lesing per million leser generert). Individuelle anatomiske prøvetakingssteder med en gjennomsnittlig human DNA-andel høyere enn det totale gjennomsnittet (8,16%) er fargelagt i alle analyser. (A) Andelen leser kartlegging til hg19 referansegenomet. Den blå stiplede linjen representerer det teoretiske maksimumet gitt rørledningens kartleggingsparametere (generert ved hjelp av Gargammel31 for å simulere en tilfeldig fordeling på 5 000 000 avlesninger fra referansegenomet hg19 med simulert skade). Individuelle midler (svart X) og median (rød sirkel) rapporteres for de prøvene med en høyere gjennomsnittlig menneskelig DNA-andel enn det totale gjennomsnittet. Konfidensintervaller angir øvre og nedre grense ekskludert statistiske avvik. (B) Antall unike leser kartlegging til hg19 referanse genom per million leser av sekvensering innsats (75 bp paret slutten). Konfidensintervaller angir øvre og nedre grense ekskludert statistiske avvik. Dette tallet er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 2: Gjennomsnittlige dupliseringsnivåer (kartleggingsavlesninger/unike avlesninger), gjennomsnittlige og median fragmentlengder og X-kromosomkontamineringsestimater for alle anatomiske prøvetakingssteder. Feil rapportert som standardfeil for gjennomsnittet. Denne tabellen er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011.
| Prøvetakingssted | Gjennomsnittlig dupliseringsfaktor (# kartlagt leser /# unike kartlagte leser) | Gjennomsnittlig fragmentlengde i bp | Gjennomsnittlig estimert andel av X-kromosomforurensning |
| Petrous pyramide | 1.188 ± 0.006 | 65,40 ± 1,36 | 0.000 ± 0.003 |
| Sementum | 1.197 ± 0.028 | 67,28 ± 1,76 | 0,011 ± 0,003 |
| Dentin | 1.188 ± 0.061 | 60,22 ± 2,37 | 0,002 ± 0,007 |
| Kjøtt | 1.179 ± 0.024 | 55,14 ± 2,90 | 0,013 ± 0,006 |
| Distal falanks | 1.191 ± 0.049 | 65,95 ± 1,08 | 0,013 ± 0,005 |
| Vertebral kropp | 1.194 ± 0.037 | 66.14 ± 1.03 | 0,008 ± 0,003 |
| Overlegen vertebral bue | 1.19 ± 0.017 | 63.02 ± 1.23 | 0,021 ± 0,009* |
| Talus | 1.198 ± 0.010 | 68.20 ± 1.24 | 0,011 ± 0,003 |
| *Prøve KRA005 fjernet som uteligger kl. 0,1952 |
Tilgjengelighet av kode
Alle analyseprogrammer og R-moduler som brukes i analysene av dette manuskriptet er fritt tilgjengelig fra sine respektive forfattere. All tilpasset R-kode er tilgjengelig på forespørsel.
Datatilgjengelighet
Alle rådata som brukes i beregningen av representative resultater er fritt tilgjengelig i European Nucleotide Archive ENA data repository (tiltredelsesnummer PRJ-EB36983) eller supplerende materialer av Parker, C. et al.11.
Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Nåværende praksis i gammel menneskelig populasjonsgenetikk er å fortrinnsvis prøve fra pars petrosa (trinn 2.1) når det er mulig. Pars petrosa kan imidlertid være et vanskelig utvalg å oppnå, da det er høyt verdsatt for et mylder av skjelettvurderinger (f.eks. Befolkningshistorie 32, estimering av fosteralder ved død33 og kjønnsbestemmelse34), og historisk sett kan prøvetaking av pars petrosa for DNA-analyse være svært ødeleggende3,4 (inkludert protokollen som presenteres her, selv om nye, minimalt invasive protokoller13,14 nå er allment vedtatt for å lindre denne bekymringen). Dette forsterkes av det faktum at inntil ganske nylig, en storstilt, systematisk studie av menneskelig DNA-utvinning over skjelettet ikke hadde blitt forsøkt11, noe som gjør det utfordrende å finne en passende prøvetakingsstrategi når petrouspyramiden ikke er tilgjengelig.
Protokollene som presenteres her bidrar til å lindre denne utfordringen ved å gi et sett med optimaliserte prosedyrer for DNA-prøvetaking fra arkeologiske / rettsmedisinske skjelettrester, inkludert pars petrosa, samt syv alternative anatomiske prøvetakingssteder over fire ekstra skjelettelementer. De kritiske trinnene som er inkludert, er alle ment å minimere muligheten for DNA-tap / skade på grunn av enten ineffektiv prøvetaking (trinn 2.1.6 og 3.2.1.3) eller overoppheting av prøver under boring / kutting (trinn 3.1.6). I tillegg har det blitt bemerket gjennom hele protokollen at det kan være nødvendig å endre / utelate forbehandlingstrinnene for å sikre best mulig ytelse i svært forringede prøver. Det skal også bemerkes at selv blant de utvalgte elementene som presenteres her, er det fortsatt flere mulige alternative prøvetakingsteknikker (spesielt for pars petrosa13,14), samt god plass til ytterligere optimalisering av de underutnyttede anatomiske prøvetakingsstedene som presenteres her (dvs. talus: trinn 2.5 og ryggvirvlene: trinn 2.3).
Det er også viktig å huske på at disse protokollene er designet og testet ved hjelp av gamle juvenile-voksne rester av høy kvalitet (god morfologisk bevaring) med henblikk på endogene humane DNA-analyser. Resultatene som presenteres kan ikke strekke seg til mer høyt forringede materialer, andre bevaringskontekster, spedbarnsrester, ikke-menneskelige rester eller studier av patogener eller mikrobiomet, da det fortsatt er behov for en større undersøkelse av bruken av disse protokollene i flere sammenhenger. I tillegg kan de alternative skjelettelementene som presenteres her (tennene, ryggvirvlene, distal falanks og tali) være utfordrende å tildele et enkelt individ blant blandede rester, noe som nødvendiggjør prøvetaking fra flere elementer for å sikre en enkelt opprinnelse. Til tross for disse begrensningene kan det å gjøre disse protokollene allment tilgjengelige bidra til å lindre noe av heterogeniteten rundt prøvevalg og behandling ved å gi et generalisert og kvantitativt optimalisert rammeverk for bruk i et bredt spekter av fremtidige aDNA / rettsmedisinske studier på menneskelige rester.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke laboratoriepersonalet ved Max Planck Institute for Science of Human History for deres hjelp i utviklingen og implementeringen av disse protokollene. Dette arbeidet ville ikke vært mulig uten innspill og hardt arbeid fra Dr. Guido Brandt, Dr. Elizabeth Nelson, Antje Wissegot og Franziska Aron. Denne studien ble finansiert av Max Planck Society, Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtaler No 771234 - PALEoRIDER (WH, ABR) og Starting Grant No. 805268 CoDisEASe (til KIB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #16 Dental Drill Bit | NTI | H1-016-HP | example drilling bit |
| 0.6 mm scroll saw blade | Fisher Scientific | 50-949-097 | blade for Jewellers Saw |
| 22mm diamond cutting wheel | Kahla | SKU 806 104 358 514 220 | Dremel cutting attachment |
| Commercial Bleach | Fisher Scientific | NC1818018 | |
| Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil | Fisher Scientific | 15-078-29X | |
| DNA LoBind Tubes (2 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment | Dremel | 225-01 | Dremel flexible extension |
| Dremel 4300 Rotary Tool | Dremel | 4300 | Example drill |
| Dremel collet and nut kit | Dremel | 4485 | Adapters for various Dremel tool attachments/bits |
| Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag | Fisher Scientific | 17-988-501 | |
| Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 13-698-792 | |
| Ethanol (Molecular Biology Grade) | Millipore Sigma | 1.08543 | |
| FDA approved level 2 Surgical Mask | Fisher Scientific | 50-206-0397 | PPE |
| Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-041-171X | PPE |
| Fisherbrand Safety Glasses | Fisher Scientific | 19-130-208X | PPE |
| Granger Stationary Vise | Fisher Scientific | NC1336173 | benchtop vise |
| Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Jewellers Saw | Fisher Scientific | 50-949-231 | |
| Kimwipes | Sigma-Aldritch | Z188956 | |
| Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet | Fisher Scientific | 30-368-1101 | |
| LookOut DNA Erase | Millipore Sigma | L9042-1L | |
| Medium weighing boat | Heathrow Scientific | HS120223 | |
| MSC 10pc plier/clamp set | Fisher Scientific | 50-129-5352 | Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting |
| Sartorius Quintix Semi-Micro Balance | Fisher Scientific | 14-560-019 | enclosed balance |
| Tyvek coveralls with hood | Fisher Scientific | 01-361-7X | PPE |
| Weigh paper | Heathrow Scientific | HS120116 |
References
- Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).
- Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).
- Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains. Royal Society Open Science. 6 (10), 191059 (2019).
- Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis. Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).
- Latham, K. E., Miller, J. J. DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts. Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).
- Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management. Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).
- Gamba, C., et al. Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
- Alberti, F., et al. Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans. Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).
- Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).
- Sirak, K., et al. Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA. Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).
- Parker, C., et al. A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons. Scientific Reports. 10 (1), 18225 (2020).
- Pinhasi, R., et al. Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone. PLoS ONE. 10 (6), 0129102 (2015).
- Sirak, K. A., et al. A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis. BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).
- Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w (2020).
- Damgaard, P. B., et al. Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth. Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).
- Harney, É, et al. A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth. Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).
- Cooper, A., Poinar, H. N. Ancient DNA: Do it right or not at all. Science. 289 (5482), 1139 (2000).
- Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
- Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
- Boessenkool, S., et al. Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones. Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).
- García-Garcerà, M., et al. Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics. PLoS ONE. 6 (8), 24161 (2011).
- Malmström, H., et al. More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA. Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).
- Basler, N., et al. Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone. BMC Research Notes. 10, 754 (2017).
- Kemp, B. M., Smith, D. G. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).
- Korlević, P., et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth. BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).
- Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).
- Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).
- Gansauge, M. -T., et al. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).
- Peltzer, A., et al. EAGER: efficient ancient genome reconstruction. Genome Biology. 17 (1), 60 (2016).
- Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. ANGSD: analysis of next generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 15, 356 (2014).
- Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA. Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).
- Ponce de León, M. S., et al. Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).
- Nagaoka, T., Kawakubo, Y. Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death. Forensic Science International. 248, 188 (2015).
- Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone. American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).
