Abstract
एंडोथेलियम एक गतिशील एकीकृत संरचना है जो एंजियोजेनेसिस, हेमोस्टेसिस, सूजन और होमियोस्टैसिस जैसे कई शारीरिक कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। एंडोथेलियम एथेरोस्क्लेरोसिस, उच्च रक्तचाप और मधुमेह जैसे पैथोफिज़ियोलॉजी में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एंडोथेलियल कोशिकाएं रक्त और लसीका वाहिकाओं के आंतरिक अस्तर का निर्माण करती हैं और संरचना और कार्य में विषमता प्रदर्शित करती हैं। विभिन्न समूहों ने हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं या परिपक्व रक्त आउटग्रोथ एंडोथेलियल कोशिकाओं (या एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाली कोशिकाओं) से प्राप्त एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के साथ मानव परिधीय रक्त से प्राप्त एंडोथेलियल कोशिकाओं की कार्यक्षमता का मूल्यांकन किया है। ये कोशिकाएं चिकित्सीय और रोग मॉडलिंग के लिए एक ऑटोलॉगस संसाधन प्रदान करती हैं। ज़ेनोजेनिक कोशिकाएं समान परिस्थितियों में उठाए गए आनुवंशिक रूप से समान जानवरों का उपयोग करके प्राप्त उनकी उपलब्धता और समरूपता के कारण चिकित्सीय का एक वैकल्पिक स्रोत प्रदान कर सकती हैं। इसलिए, पोर्सिन परिधीय रक्त से अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव रक्त आउटग्रोथ एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और विस्तार के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इन कोशिकाओं का उपयोग कई अनुप्रयोगों जैसे कार्डियोवैस्कुलर ऊतक इंजीनियरिंग, सेल थेरेपी, रोग मॉडलिंग, ड्रग स्क्रीनिंग, एंडोथेलियल सेल जीव विज्ञान का अध्ययन, और इन विट्रो सह-संस्कृतियों के लिए क्सीनट्रांसप्लांटेशन में भड़काऊ और जमावट प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए किया जा सकता है।
Introduction
एंडोथेलियम एक अत्यधिक जटिल, गतिशील संरचना और संवहनी दीवार का एक महत्वपूर्ण घटक है। यह रक्त वाहिकाओं की आंतरिक सतह को परिसंचारी रक्त और आसपास के ऊतकों के बीच एक भौतिक इंटरफ़ेस प्रदान करने के लिए पंक्तिबद्ध करता है। यह विषम संरचना एंजियोजेनेसिस, सूजन, वासोरेग्यूलेशन और हेमोस्टेसिस 1,2,3,4 जैसे विभिन्न कार्यों को करने के लिए जानी जाती है। एंडोथेलियल कोशिकाओं की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाएं एक व्यापक रूप से अध्ययन की जाने वाली कोशिका प्रकार हैं। हालांकि, रोगी-विशिष्ट बैच परिवर्तनशीलता, असंगत फेनोटाइप और न्यूनतम विभाजन दक्षता एक सेल स्रोत निर्धारित करने की आवश्यकता का सुझाव देती है जो इनसभी विशेषताओं में सुधार कर सकती है।
प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक समरूप आबादी प्राप्त करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं में उच्च प्रोलिफेरेटिव क्षमता नहींहोती है। इसलिए, संवहनी पुनर्जनन का अध्ययन करने और पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न समूहों ने परिधीय रक्त से प्राप्त विभिन्न प्रकार की एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने और उनका आकलन करने की कोशिश की है, जैसे, एंडोथेलियल पूर्वज कोशिकाएं (ईपीसी) या रक्त आउटग्रोथ एंडोथेलियल कोशिकाएं (बीओईसी) 6,7,8,9।. स्पिंडल के आकार के प्रारंभिक ईपीसी हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) से उत्पन्न होते हैं और परिपक्व एंडोथेलियल कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए सीमित विकास शक्ति और सीमित एंजियोजेनिक क्षमता होती है। इसके अलावा, वे भड़काऊ मोनोसाइट्स से निकटता से मिलते जुलते हैं। इसके अलावा, कार्यात्मक, प्रसार, परिपक्व एंडोथेलियल कोशिकाओं में अंतर करने की उनकी क्षमता अभी भीबहस का विषय है 6,7,9,10. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) की निरंतर संस्कृति कोशिकाओं की एक द्वितीयक आबादी को जन्म दे सकती है जिसे देर से बढ़ने वाले ईपीसी, बीओईसी, या एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाली कोशिकाओं (ईसीएफसी) 6,7,9,10 के रूप में जाना जाता है। 2018 में, ईपीसी की सीमाओं, उनके नामकरण की अस्पष्टता के साथ-साथ ईपीसी11 के तहत लगातार समूहीकृत कई अलग-अलग सेल प्रकारों के साथ सामंजस्य की सामान्य कमी को स्वीकार किया। इसके विपरीत, बीओईसी संवहनी मरम्मत, स्वास्थ्य और बीमारी और सेल थेरेपी में उनकी भूमिका के लिए मान्यता प्राप्त हो गए हैं। इन कोशिकाओं के आगे के अध्ययन और चिकित्सीय उपयोग इन सेल प्रकारों को लगातार पूर्वज कोशिकाओं से प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल पर निर्भर करेंगे।
बीओईसी जैसी प्राथमिक कोशिकाओं को अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव परिपक्व एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक सरोगेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताहै। बीओईसी प्रारंभिक ईपीसी से फेनोटाइपिक रूप से अलग हैं और विशिष्ट एंडोथेलियल विशेषताओं जैसे कोबलस्टोन आकृति विज्ञान और पालन जंक्शनों की अभिव्यक्ति और कैवोले12 प्रदर्शित करते हैं। हेब्बेल एट अल 13,14,15 द्वारा जीन प्रोफाइलिंग में पाया गया कि बीओईसी या ईसीएफसी सच्चे एंडोथेलियल कोशिकाएं हैं क्योंकि वे माइक्रोवस्कुलर और बड़े पोत गठन को बढ़ावा देते हैं। इस प्रकार, बीओईसी का उपयोग पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं और आनुवंशिक भिन्नता का मूल्यांकन करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकताहै। उन्हें संवहनी पुनर्जननके लिए सेल थेरेपी के लिए एक उत्कृष्ट सेल स्रोत भी माना जाता है। इसलिए, इन अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को लगातार प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल आवश्यक है।
जबकि बीओईसी मानव पैथोफिजियोलॉजिकल और आनुवंशिक भिन्नता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं, बीओईसी का एक अधिक समरूप स्रोत अधिक मजबूत और विश्वसनीय प्रयोगात्मक और चिकित्सीय परिणाम प्रदान कर सकता है। समानपरिस्थितियों में उठाए गए आनुवंशिक रूप से समान जानवरों से प्राप्त क्सीनोजेनिक सेल स्रोतों का उपयोग करके बेहतर समरूपता प्राप्त की जा सकती है। जबकि क्सीनोजेनिक सेल स्रोत एक मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए प्रवण हैं, इम्यूनोमॉड्यूलेशन रणनीतियों को कोशिकाओं सहित इम्यूनोकम्पैटिबल जानवरों और पशु उत्पादों को उत्पन्न करने के लक्ष्य के साथ विकसित किया जा रहा है। सूअर, विशेष रूप से, परिधीय रक्त का एक प्रचुर स्रोत हैं और आमतौर पर मनुष्यों के लिए शारीरिक और शारीरिक समानता के कारण चिकित्सा उपकरणों और अन्य उपचारों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसलिए, यह अध्ययन पोर्सिन परिधीय रक्त से अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव बीओईसी के अलगाव और विस्तार के लिए प्रोटोकॉल को परिष्कृत करता है। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल रक्त की अपेक्षाकृत छोटी मात्रा से बड़ी संख्या में बीओईसी प्राप्त करने के लिए एक सीधा और विश्वसनीय तरीका है। एक ही रक्त के नमूने से लाखों कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए संस्कृतियों को कई मार्गों के माध्यम से विस्तारित किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी पशु अध्ययनों को विस्कॉन्सिन और मेयो क्लिनिक के मेडिकल कॉलेज में संबंधित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
नोट: इस अध्ययन में, यॉर्कशायर / लैंडरेस / ड्यूरोक क्रॉस घरेलू सूअर (सस डोमेस्टिकस), नर और मादा, 40-80 किलोग्राम, 3-6 महीने के बच्चों का उपयोग किया गया था।
1. पोर्सिन परिधीय रक्त का संग्रह
- सामग्री तैयार करें।
- बाँझ लवण में हेपरिन घोल को 100 यू / एमएल तक पतला करें।
- दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों और दो 60 एमएल सिरिंज में से प्रत्येक में 3-4 एमएल हेपरिन समाधान जोड़ें।
- एक एक्सटेंशन ट्यूब में बिना पतला हेपरिन घोल (1,000 यू / एमएल) खींचें।
- हेपरिन से भरे विस्तार ट्यूब के एक छोर पर 19 ग्राम सुई और दूसरे छोर पर हेपरिन युक्त 60 एमएल सिरिंज कनेक्ट करें।
- संस्थागत नीतियों के अनुसार एक सुअर को एनेस्थेटाइज करें
- एनेस्थीसिया को प्रेरित करने के लिए एट्रोपिन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा), टिलेटामाइन / ज़ोलाज़ेपम (2-5 मिलीग्राम / किग्रा), और ज़ाइलेज़िन (2 मिलीग्राम / किग्रा) के आईएम इंजेक्शन का प्रबंधन करें।
नोट: पशु के बेहोश होने और मैंडिबुलर मांसपेशियों के गैर-कठोर होने के बाद पर्याप्त संज्ञाहरण प्राप्त किया जाता है। - जानवर को लापरवाह स्थिति में रखें और स्थिरता प्रदान करने के लिए दोनों तरफ रोल-अप तौलिए रखें।
- संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर एक नेत्र मरहम लागू करें।
- कंबल, हीटिंग पैड और / या गर्म प्रक्रिया तालिका सहित संज्ञाहरण के दौरान थर्मल समर्थन प्रदान करें।
- एनेस्थीसिया को प्रेरित करने के लिए एट्रोपिन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा), टिलेटामाइन / ज़ोलाज़ेपम (2-5 मिलीग्राम / किग्रा), और ज़ाइलेज़िन (2 मिलीग्राम / किग्रा) के आईएम इंजेक्शन का प्रबंधन करें।
- बीटाडीन स्क्रब के घोल के साथ ऊरु कमर क्षेत्र को साफ करें।
- 19 ग्राम सुई के साथ ऊरु नस या धमनी को पंचर करें और धीरे-धीरे (~ 1-2 एमएल / एस) सिरिंज में 50 एमएल रक्त खींचें।
नोट: बहुत तेजी से ड्राइंग कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है। - सुई को जगह पर छोड़ते हुए, तुरंत एक्सटेंशन ट्यूब को गांठ दें और 60 एमएल सिरिंज को डिस्कनेक्ट कर दें।
- धीरे-धीरे रक्त को हेपरिन युक्त 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को कसकर लपेटें, धीरे से मिश्रण करने के लिए कुछ बार उलटा करें, और बर्फ पर रखें।
- शेष हेपरिन युक्त 60 एमएल सिरिंज को एक्सटेंशन ट्यूब से कनेक्ट करें, एक्सटेंशन ट्यूब को अनकिंक करें, और धीरे-धीरे सिरिंज में अतिरिक्त 50 एमएल रक्त खींचें।
- धमनी या नस से तुरंत सुई निकालें और धीरे-धीरे विस्तार ट्यूब से शेष रक्त को सिरिंज में खींचें।
- एक्सटेंशन ट्यूब से 60 एमएल सिरिंज को डिस्कनेक्ट करें और धीरे-धीरे रक्त को शेष हेपरिन युक्त 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को कसकर लपेटें, धीरे से मिश्रण करने के लिए कुछ बार उलटा करें, और बर्फ पर रखें।
- सुअर के ऊरु कमर क्षेत्र में दबाव हेमोस्टेसिस लागू करें।
- संस्थागत नीतियों के अनुसार सुअर को पुनर्प्राप्त करें। लगातार जानवर की निगरानी करें जब तक कि वह उरोस्थि की स्थिरता बनाए रखने और नियमित आवास / केनेल क्षेत्र में लौटने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
2. मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव
- चार 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ रक्त को 1: 1 पतला करें।
नोट: इस काम को सेल कल्चर को दूषित करने से बचने के लिए एक सड़न रोकनेवाली तकनीक का उपयोग करके सेल कल्चर हुड में किया जाना चाहिए। - आठ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 25 एमएल कमरे के तापमान के लिए तैयार घनत्व ढाल समाधान जोड़ें।
- पिपेट की नोक पर ट्यूब को एक तेज कोण पर पकड़कर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब वाले प्रत्येक घनत्व ढाल घोल के अंदर 25 मिलीलीटर रक्त/खारा घोल को बहुत धीरे-धीरे पिपेट करें।
नोट: रक्त समाधान को घनत्व ढाल समाधान के शीर्ष पर धीरे से परत करना चाहिए और एक अच्छी तरह से परिभाषित इंटरफ़ेस बनाए रखना चाहिए। - ट्यूबों को 560 x g और कमरे के तापमान (RT) पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, यदि संभव हो तो सेंट्रीफ्यूज ब्रेक को अक्षम करें। - प्रत्येक ट्यूब से बफी कोट (घनत्व ढाल समाधान के ऊपर और स्पष्ट प्लाज्मा के नीचे मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की बादल परत) को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करने के लिए एक पतली पिपेट का उपयोग करें और दो नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में समान रूप से वितरित करें। ट्यूबों वाले घनत्व ढाल समाधान को छोड़ दें।
नोट: घनत्व ढाल समाधान और प्लाज्मा को यथासंभव कम से कम एकत्र करते हुए जितना संभव हो उतना बफी कोट एकत्र करें।
3. कोशिकाओं की धुलाई और चढ़ाना
- फाइब्रोनेक्टिन के साथ 6-वेल प्लेट कोट करें।
- बाँझ पानी में 1 मिलीग्राम / एमएल तक पतला करके मानव प्लाज्मा फाइब्रोनेक्टिन का स्टॉक समाधान बनाएं। एलिकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 3 एमएल पीबीएस में फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक समाधान के 600 μL को पतला करके फाइब्रोनेक्टिन के 3.6 मिलीलीटर का कार्यशील समाधान बनाएं।
- फाइब्रोनेक्टिन वर्किंग सॉल्यूशन के 600 μL को 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें और समान रूप से लेपित होने तक धीरे से चट्टान को हिलाएं।
- फाइब्रोनेक्टिन को कुओं को कोट करने के लिए 30 मिनट प्रतीक्षा करें और धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं से घोल को बाहर निकालें।
- फाइब्रोनेक्टिन को कोट करने की प्रतीक्षा करते समय, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को धो लें।
- 45 एमएल पीबीएस के साथ ट्यूबों को टॉप अप करें।
- कम ब्रेक के साथ 560 x g और 4 °C पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। दोनों ट्यूबों से सतह पर तैरनेवाला को अलग करें।
- पीबीएस के 25 एमएल में प्रत्येक सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
- इसे दूसरी बार धोने के लिए दोहराएं।
- पीबीएस के 5 एमएल में प्रत्येक सेल गोली को पुन: निलंबित करें और प्रत्येक ट्यूब में 0.8% अमोनियम क्लोराइड समाधान के 15 एमएल जोड़ें।
नोट: यह कदम शेष लाल रक्त कोशिकाओं को अलग करना है। - 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज के साथ ट्यूबों को 560 x g और कम ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए टॉप अप करके कोशिकाओं को पहले की तरह धोएं। दोनों ट्यूबों से सतह पर तैरनेवाला को अलग करें।
- पीबीएस के 25 एमएल में प्रत्येक सेल गोली को पुन: निलंबित करें और दूसरी बार धोने के लिए दोहराएं।
- प्रत्येक सेल गोली को 6 एमएल ईजीएम -2 कल्चर माध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1 एक्स एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ पूरक करें जिसमें 10,000 यू / एमएल पेनिसिलिन, 10 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 25 μg / mL एम्फोटेरिसिन शामिल हैं।
नोट: ईजीएम -2 संस्कृति माध्यम में ईबीएम -2 संस्कृति माध्यम शामिल है जो 200 μL हाइड्रोकार्टिसोन, 2 एमएल मानव फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (एचएफजीएफ-बी), संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) के 500 μL, इंसुलिन जैसे विकास कारक (आर3 IGF-1) के पुनः संयोजक एनालॉग के 500 μL, एस्कॉर्बिक एसिड के 500 μL, मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (एचईजीएफ) के 500 μL के साथ पूरक है। एम्फोटेरिसिन के 500 μL, और 500 μL हेपरिन प्रति 500 एमएल। - धीरे से सेल निलंबन के 2 एमएल को फाइब्रोनेक्टिन-लेपित 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें और समान रूप से लेपित होने तक धीरे से चट्टान बनाएं।
नोट: लक्ष्य एंडोथेलियल कॉलोनियों की संख्या को अधिकतम करने के लिए जितना संभव हो उतनी कोशिकाओं को बीज देना है।
4. सेल संस्कृति
- 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 100% आर्द्रता पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
- अगले दिन, धीरे से प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें।
नोट: फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग के शिथिल रूप से पालन करने वाली कोशिकाओं को परेशान न करने के लिए कोमल होना महत्वपूर्ण है। - अगले दिन, प्रत्येक कुएं से 1.5 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम को धीरे-धीरे हटाकर और इसे 1.5 एमएल ताजा संस्कृति माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करके आधा संस्कृति माध्यम परिवर्तन करें।
- अगले 5 दिनों में से प्रत्येक पर, धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं में एक पूर्ण संस्कृति माध्यम परिवर्तन करें (प्रति कुएं 2 एमएल ताजा संस्कृति माध्यम)।
- उसके बाद, धीरे से प्रति सप्ताह तीन बार संस्कृति माध्यम बदलें।
- नियमित रूप से कम शक्ति (4x उद्देश्य) प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत सेल संस्कृतियों की कल्पना करें।
नोट: प्लेटिंग के 7-10 दिनों के बाद कुओं में अनुगामी रक्त आउटग्रोथ एंडोथेलियल सेल (बीओईसी) कॉलोनियां दिखाई देने लगेंगी। गैर-अनुयायी सेल प्रकारों को मध्यम परिवर्तनों के साथ छोड़ दिया जाएगा, और अन्य अनुयायी सेल प्रकार धीरे-धीरे समाप्त हो जाएंगे क्योंकि बीओईसी कालोनियां बढ़ती हैं। - बीओईसी को फाइब्रोनेक्टिन-लेपित टी -75 फ्लास्क में पारित करें जब ~ 70% -80% कंफ्लुएंट हो और प्रति सप्ताह तीन बार संस्कृति माध्यम को बदलना जारी रखें।
नोट: सीडिंग घनत्व को इसके बजाय टी 25 फ्लास्क में कॉलोनियों को पार करके नियंत्रित किया जा सकता है। बाद के अंशों को फाइब्रोनेक्टिन-कोटिंग की आवश्यकता नहीं होती है, और संस्कृति माध्यम परिवर्तन ों को प्रति सप्ताह दो बार तक कम किया जा सकता है। - मार्ग 1-3 से कोशिकाओं का उपयोग प्रयोगों के लिए किया जा सकता है या एक ठंड माध्यम में स्थानांतरित किया जा सकता है और भविष्य के उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
सुसंस्कृत कोशिकाओं की आकृति विज्ञान संस्कृति की शुरुआत से देखा गया था जब तक कि बीओईसी कॉलोनियों का अवलोकन नहीं किया गया था (चित्रा 1)। अनुयायी कोशिकाओं की एक छोटी आबादी ने संस्कृति व्यंजनों से जुड़ना और बढ़ना शुरू कर दिया, जबकि गैर-अनुयायी कोशिकाओं को संस्कृति माध्यम परिवर्तनों के साथ हटा दिया गया (चित्रा 1 बी)। कॉलोनियां पहली बार 6 वें दिन एक केंद्रीय बिंदु से रेडियल रूप से बाहर की ओर बढ़ने वाली एंडोथेलियल जैसी कोशिकाओं के संग्रह के रूप में दिखाई दीं (चित्रा 1 डी)। जैसे-जैसे संस्कृति आगे बढ़ी, सेल कॉलोनियां अधिक घनी हो गईं और परिपक्व एंडोथेलियल कोशिकाओं (चित्रा 1 एफ) के समान एक कोबलस्टोन आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया। विशिष्ट एंडोथेलियल कोबलस्टोन आकृति विज्ञान एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बीओईसी की एक आसान प्रारंभिक पहचान प्रदान करता है।
एंडोथेलियल सेल कॉलोनियां आमतौर पर संस्कृति के 10-14 दिनों में पासिंग के लिए तैयार होती हैं। इस समय, 6-वेल प्लेट आमतौर पर 93% -98% की प्रतिशत व्यवहार्यता के साथ ~ 1 मिलियन कोशिकाओं का उत्पादन करेगी। पहले मार्ग के दौरान, एंडोथेलियल कोशिकाएं टी 75 फ्लास्क में ~ 6-10 मिलियन कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए विस्तार करेंगी।
बीओईसी के मॉर्फोजेनेसिस का आकलन करने के लिए, बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स (जैसे, मैट्रीगेल) को 15 अच्छी एंजियोजेनेसिस प्लेटों पर 10 μL / वेल पर चढ़ाया गया था और पोलीमराइजेशन की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। मार्ग 2 कोशिकाओं को तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर बीज दिया गया था और 14 घंटे और 24 घंटे के समय बिंदुओं पर चित्रित किया गया था। प्रति कुएं लगभग 3,500 कोशिकाओं का घनत्व एक नेटवर्क और ट्यूब जैसी संरचनाओं को बनाने में सक्षम था। सीरम मुक्त माध्यम (एफबीएस को छोड़कर पूरक के साथ ईजीएम -2) के लिए 14 घंटे के भीतर ट्यूब गठन देखा गया और पूर्ण विकास माध्यम (एफबीएस सहित पूरक के साथ ईजीएम -2) के लिए 24 घंटे के भीतर। एफबीएस जोड़ने से एंडोथेलियल सेल-विशिष्ट विकास कारक (जैसे, वीईजीएफ) पतला हो सकता है और अन्य सिग्नलिंग कारकों को पेश किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप ट्यूब गठन प्रक्रिया में देरी होती है। 2 डी चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग सीरम-मुक्त माध्यम (चित्रा 2 ए, बी) और पूर्ण विकास माध्यम (चित्रा 2 सी, डी) में ट्यूब गठन की छवि बनाने के लिए किया गया था। दोनों मीडिया स्थितियों में कोशिकाओं को रूपात्मक भेदभाव से गुजरना पड़ा और तेजी से केशिका ट्यूब जैसी संरचनाओं के व्यापक नेटवर्क में व्यवस्थित किया गया। ये संरचनाएं विवो केशिका नेटवर्क से मिलती-जुलती संगठित सेलुलर डोरियों से बनी थीं। इसके अलावा, 20x आवर्धन पर माइक्रोग्राफ एंडोथेलियल कोशिकाओं के जटिल बहुकोशिकीय संगठन और उनके रूपात्मक भेदभाव को विस्तार से चित्रित करते हैं। मीडिया स्थितियों के बीच कोई रूपात्मक अंतर नहीं देखा गया था। केशिका ट्यूब जैसी संरचनाओं का व्यापक नेटवर्क दृढ़ता से सुसंस्कृत कोशिकाओं को परिपक्व और कार्यात्मक एंडोथेलियल कोशिकाओं में भेदभाव करने का सुझाव देता है।
बीओईसी को आगे परिपक्व एंडोथेलियल सेल मार्कर सीडी 31 या प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु -1 (पीईसीएएम 1) (चित्रा 3 ए, बी) की अभिव्यक्ति की विशेषता थी। बीओईसी ने सीडी 31 की समान अभिव्यक्ति दिखाई। इसके अलावा, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने ईपीसी की अनुपस्थिति की पुष्टि की क्योंकि कोशिकाओं ने पीबीएमसी के सकारात्मक नियंत्रण समूह (चित्रा 3 सी, डी) की तुलना में मोनोसाइट मार्कर सीडी 14 के लिए नकारात्मक दाग दिया।
चित्र 1: फेनोटाइप प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियां। सुसंस्कृत बीओईसी की प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों को पहले मार्ग के बाद (ए) दिन 0, (बी) दिन 2, (सी) दिन 4, (डी) दिन 6, (ई) दिन 8, और (एफ) पर 10 गुना आवर्धन पर देखा गया। स्केल सलाखों: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: रूपात्मक भेदभाव और मार्ग 2 बीओईसी का संगठन। केशिका ट्यूब जैसी संरचनाओं में मार्ग 2 बीओईसी के रूपात्मक भेदभाव और संगठन को सीरम-मुक्त माध्यम के लिए 14 घंटे के भीतर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में और पूर्ण विकास माध्यम के लिए 24 घंटे के भीतर देखा गया था। (ए) 4 x पर सीरम-मुक्त माध्यम, (B) 20x पर सीरम-मुक्त माध्यम, (C) 4x पर पूर्ण विकास माध्यम, और (D) 20x पर पूर्ण विकास माध्यम। स्केल सलाखों: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: सीडी 31 और सीडी 14 के साथ बीओईसी का लक्षण वर्णन। (ए) मार्ग 2-3 बीओईसी को हरे रंग में देखे गए एंटी-सीडी 31-एफआईटीसी एंटीबॉडी का उपयोग करके पीईसीएएम 1 के लिए दाग दिया गया था और (बी) संबंधित चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी छवियों का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं को निलंबन में दाग दिया गया था, और निलंबन को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर चित्रित किया गया था। (सी) सकारात्मक नियंत्रण परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) की तुलना में सीडी 14-एएफ 700 एंटीबॉडी के साथ बीओईसी का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। सकारात्मक सीडी 14 धुंधला नीले और बिना दाग वाली कोशिकाओं में लाल रंग में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
बीओईसी एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग विभिन्न वैज्ञानिक और चिकित्सीय दृष्टिकोण 7,8,16 में किया जा सकता है। बीओईसी का उपयोग संवहनी रोगों और कैंसर 5,19,20,21 के विकास के लिए जिम्मेदार प्रमुख कारकों को स्पष्ट करने के लिए ईसी जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए किया गया है। बीओईसी का उपयोग चिकित्सीय अनुप्रयोगों जैसे संवहनी पुनर्जनन और जीन वितरण22,23,24 में भी किया गया है। आनुवंशिक रूप से संशोधित बीओईसी को उनकी एंटीएंजियोजेनिक ट्यूमर चिकित्सीय क्षमता25,26 के लिए जाना जाता है। इसके अलावा, बीओईसी की एंजियोजेनिक क्षमता उन्हें वैस्कुलराइजेशन और नियोवैस्कुलराइजेशन17,27 के उद्देश्य से सेलुलर थेरेपी के लिए उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाती है। भले ही कई अध्ययनों का वर्णन है कि मानव परिधीय रक्त 6,7,8,9 से बीओईसी कैसे प्राप्त करें, अंतर्निहित पैथोफिजियोलॉजिकल और आनुवंशिक भिन्नता के कारण मानव कोशिका स्रोतों की परिवर्तनशीलता स्वस्थ क्सीनोजेनिकस्रोतों 9,13,18 से बीओईसी प्राप्त करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता का सुझाव देती है।
पोर्सिन परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से बीओईसी को कुशलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। महत्वपूर्ण कदमों में जल्द से जल्द रक्त के नमूनों को संसाधित करना और घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद बफी कोट परतों की कुशल कटाई शामिल है ताकि संस्कृति में जाने वाले व्यवहार्य पीबीएमसी की संख्या को अधिकतम किया जा सके। प्रारंभिक प्लेटिंग घनत्व और कोशिकाओं का समय पर पासिंग इन सेल प्रकारों के लगातार अलगाव को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण विचार हैं। 100 एमएल की शुरुआती रक्त मात्रा एक छह-वेल प्लेट के लिए पीबीएमसी की एक उचित संख्या प्रदान करती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सुअर से सुरक्षित रूप से एकत्र किए जा सकने वाले रक्त की अधिकतम मात्रा पशु शरीर के वजन के साथ भिन्न होगी। सूअरों के लिए एक सुरक्षित एक बार अधिकतम रक्त की मात्रा संग्रह शरीर के वजन के 8 एमएल प्रति किलोग्राम है। इसके अलावा, मार्ग 0 से मार्ग 1 तक प्रारंभिक कॉलोनियों का समय पर पारित होना भी आवश्यक है। यदि सीडिंग घनत्व बहुत कम है या यदि कोशिकाएं संकुचित हो जाती हैं तो कोशिकाएं प्रसार करना बंद कर देती हैं। जैसे-जैसे कोशिकाएं कंफ्लुएंट हो जाती हैं, वे एक लम्बी मेसेनकाइमल आकृति विज्ञान और फेनोटाइप में बदलना शुरू कर देती हैं। सीडिंग घनत्व को टी 75 फ्लास्क के बजाय टी 25 फ्लास्क में कॉलोनियों को पार करके भी नियंत्रित किया जा सकता है। प्रारंभिक मीडिया परिवर्तन के दौरान अनुयायी सेल प्रकारों को न खोने के लिए सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता है क्योंकि गैर-अनुयायी ईपीसी को त्यागते समय जितना संभव हो उतने अनुयायी कोशिकाओं को पकड़ना बहुत जरूरी है। यह प्रोटोकॉल लगभग 1 सप्ताह में आउटग्रोथ सेल कॉलोनियों का उत्पादन करता है।
प्रोटोकॉल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है। एंडोथेलियल सेल कॉलोनियों का विस्तार अनुमानित 90% -95% संस्कृतियों में हासिल किया जाता है। विफलता आमतौर पर एंडोथेलियल सेल कॉलोनियों के गठन की कमी के कारण होती है, जिसका अर्थ है कि यदि कम से कम एक एंडोथेलियल सेल कॉलोनी बनती है, तो वे लगभग हमेशा संस्कृति में विस्तार करने के लिए आगे बढ़ेंगे। विफलता के स्रोतों में यादृच्छिक परिवर्तनशीलता, रक्त संग्रह के दौरान कोशिकाओं की अत्यधिक कतरनी, संस्कृति में रोगाणुओं को दूषित करना और प्रसंस्करण चरणों के दौरान मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उच्च नुकसान शामिल है। एक असफल संस्कृति के बाद, एक दूसरी संस्कृति आमतौर पर सफल होगी, यह दर्शाता है कि जानवरों के बीच परिवर्तनशीलता एक प्रमुख कारक नहीं है। इच्छामृत्यु के तुरंत बाद रक्त एकत्र करते समय प्रोटोकॉल भी सफल होता है, यह दर्शाता है कि धोने के कदम कुशलतापूर्वक इच्छामृत्यु एजेंटों को निर्दोष स्तर तक कम करते हैं।
परिसंचारी रक्त कोशिका आबादी में विविधता के बावजूद, बीओईसी जो ईपीसी से बहुत अलग हैं, प्राप्त किए गए थे। बीओईसी अनुयायी पीबीएमसी के एक छोटे से उप-समूह से प्राप्त होते हैं जिनमें सीडी 14 अभिव्यक्ति की कमी होती है। सीडी 14 धुंधला (चित्रा 3 सी, डी) की अनुपस्थिति से इसकी पुष्टि की गई थी। शुरुआती अंशों में बीओईसी संस्कृतियों से मोनोसाइटिक ईपीसी की निकासी को या तो कोशिका मृत्यु या गैर-पालन द्वारा समझाया जा सकता है। बीओईसी की कोबलस्टोन आकृति विज्ञान (चित्रा 1 ई, एफ) एक स्पष्ट एंडोथेलियल फेनोटाइप का सुझाव देता है। इसके अलावा, सतह मार्कर सीडी 31 (चित्रा 3 ए) की समान अभिव्यक्ति परिपक्व एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक समरूप आबादी का तात्पर्य है। इसके अलावा, सीरम-मुक्त (चित्रा 2 ए, बी) और पूर्ण विकास मीडिया (चित्रा 2 सी, डी) दोनों में बीओईसी के केशिका मोर्फोजेनेसिस उनकी अंतर्निहित एंजियोजेनिक क्षमता 6,8 को दर्शाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न पोर्सिन बीओईसी के पिछले विश्लेषण से पता चला है कि ये कोशिकाएं वॉन विलेब्रांड कारक अभिव्यक्ति और लेक्टिन बाइंडिंग28 के लिए अतिरिक्त रूप से सकारात्मक हैं।
परिसंचारी रक्त में पीबीएमसी की बहुतायत, जिसमें से बीओईसी उभरते हैं, पशु स्रोतों से चिकित्सीय बीओईसी की लगभग असीम आपूर्ति प्राप्त करने के लिए एक मजबूत विधि की व्यवहार्यता का समर्थन करता है। एक बार तकनीक में महारत हासिल करने के बाद, बीओईसी का उपयोग संवहनी मरम्मत और पुनर्जनन, रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और एंडोथेलियल सेल जीव विज्ञान अध्ययन सहित कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। पोर्सिन बीओईसी की समरूपता और मनुष्यों में चिकित्सीय स्रोत के रूप में उनकी संगतता की पुष्टि करने के लिए चल रहे अध्ययनों की आवश्यकता है।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा एंडोथेलियल सेल कॉलोनियों के विस्तार का जोखिम है जो उत्पन्न करने में विफल रहती है। विफलता दर 5% -10% होने का अनुमान है, और इन उदाहरणों में, एक दूसरा प्रयास आवश्यक है। जब सफलता का आश्वासन महत्वपूर्ण होता है, तो रक्त की दोगुनी मात्रा एकत्र की जा सकती है, और प्रोटोकॉल का पालन दो स्वतंत्र संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए समानांतर में किया जा सकता है। इसके अलावा, हमारा अनुभव स्वस्थ यॉर्कशायर / लैंडरेस / ड्यूरोक क्रॉस घरेलू सूअरों (सस डोमेस्टिकस), नर और मादा, 40-80 किलोग्राम, 3-6 महीने की उम्र तक सीमित है। अन्य नस्लों, उम्र और प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ सफलता दर अज्ञात है।
प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि बीओईसी फेनोटाइप के लिए एक निश्चित मार्कर मौजूद नहीं है। यहां और पिछले काम28 में, इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न पोर्सिन बीओईसी को कई बीओईसी मार्करों के लिए विशेषता दी गई है, लेकिन बीओईसी फेनोटाइप की समझ विकसित हो रही है। बीओईसी को मार्ग 2-3 में भी विशेषता है और उच्च मार्ग पर फेनोटाइप अज्ञात है। मनुष्यों की तुलना में पोर्सिन बीओईसी का एक लाभ सुअर के रक्त की तैयार आपूर्ति है, जो अधिक लगातार संस्कृतियों की पीढ़ी और सुसंगत, कम मार्ग कोशिकाओं की मजबूत आपूर्ति की अनुमति देता है।
चिकित्सीय दृष्टिकोण में पोर्सिन कोशिकाओं का उपयोग करने की प्रमुख सीमाओं में से एक मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया29 है। मानव प्रत्यारोपण के लिए क्सीनोजेनिक कोशिकाओं की इम्युनोजेनेसिटी को कम करने के लिए कई इम्यूनोमॉड्यूलेशन रणनीतियों की जांच की जा रही है, जैसे कि विरोधी भड़काऊ एजेंट और सीआरआईएसपीआर / सीएएस आनुवंशिक हेरफेर30,31,32। हाल के अध्ययनों ने मानव पूरक नियामक प्रोटीन (एचसीआरपी) 33 की अभिव्यक्ति और ए 1,3- गैलेक्टोसिलट्रांसफेरेज़ डिलीटेड (जीटीकेओ) 32,34 सूअरों की शुरूआत का प्रस्ताव दिया है। ये प्रगति पोर्सिन बीओईसी सहित ज़ेनोजेनिक कोशिकाओं के चिकित्सीय अनुप्रयोग के लिए वादा करती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक एनआईएच / एनएचएलबीआई आर 00 एचएल 129068 से वित्त पोषण को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R.
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al.
