Abstract
Endotelet är en dynamisk integrerad struktur som spelar en viktig roll i många fysiologiska funktioner såsom angiogenes, hemostas, inflammation och homeostas. Endotelet spelar också en viktig roll i patofysiologier som ateroskleros, hypertoni och diabetes. Endotelceller bildar det inre fodret av blod och lymfkärl och uppvisar heterogenitet i struktur och funktion. Olika grupper har utvärderat funktionaliteten hos endotelceller härledda från humant perifert blod med fokus på endoteliala stamceller härledda från hematopoetiska stamceller eller mogna endotelceller (eller endotelkolonibildande celler). Dessa celler ger en autolog resurs för terapi och sjukdomsmodellering. Xenogena celler kan utgöra en alternativ behandlingskälla på grund av deras tillgänglighet och homogenitet som uppnås genom användning av genetiskt likartade djur som föds upp under liknande förhållanden. Därför har ett robust protokoll för isolering och expansion av mycket proliferativa endotelceller från perifert svin presenterats. Dessa celler kan användas för många tillämpningar såsom kardiovaskulär vävnadsteknik, cellterapi, sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening, studier av endotelcellbiologi och in vitro-samkulturer för att undersöka inflammatoriska och koagulationssvar vid xenotransplantation.
Introduction
Endotelet är en mycket komplex, dynamisk struktur och en viktig komponent i kärlväggen. Det leder den inre ytan av blodkärl för att ge ett fysiskt gränssnitt mellan cirkulerande blod och omgivande vävnader. Denna heterogena struktur är känd för att utföra olika funktioner såsom angiogenes, inflammation, vasoregulering och hemostas 1,2,3,4. Humana navelvenendotelceller är en allmänt studerad celltyp för att bedöma funktionaliteten hos endotelceller. Den patientspecifika satsvariabiliteten, inkonsekventa fenotypen och minsta delningseffektiviteten tyder dock på ett behov av att bestämma en cellkälla som kan förbättra alla dessa funktioner5.
Att erhålla en homogen population av primära endotelceller kan vara tekniskt utmanande, och primära endotelceller har inte hög proliferativ kapacitet6. För att studera vaskulär regenerering och utvärdera patofysiologiska processer har olika grupper försökt erhålla och bedöma olika typer av endotelceller härledda från perifert blod, t.ex. endoteliala stamceller (EPC) eller blodutväxande endotelceller (BOEC)6,7,8,9 . De spindelformade tidiga EPC: erna härstammar från hematopoetiska stamceller (HSC) och har begränsad tillväxtstyrka och begränsad angiogen förmåga att producera mogna endotelceller. Dessutom liknar de nära inflammatoriska monocyter. Dessutom är deras förmåga att ytterligare differentiera till funktionella, proliferera, mogna endotelceller fortfarande diskutabel 6,7,9,10. Den kontinuerliga odlingen av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) kan ge upphov till en sekundär population av celler som kallas EPC med sen utväxt, BOEC eller endotelkolonibildande celler (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. erkände 2018 begränsningarna hos EPC, tvetydigheten i deras nomenklatur, tillsammans med en allmän brist på överensstämmelse med många distinkta celltyper kontinuerligt grupperade under EPC11. Däremot har BOECs blivit erkända för sin roll i vaskulär reparation, hälsa och sjukdom och cellterapi. Ytterligare studier och terapeutisk användning av dessa celler kommer att förlita sig på protokoll för att konsekvent härleda dessa celltyper från cirkulerande stamceller.
Primära celler såsom BOEC kan användas som ett surrogat för att erhålla mycket proliferativa mogna endotelceller6. BOEC skiljer sig fenotypiskt från tidiga EPC och uppvisar typiska endotelegenskaper såsom kullerstensmorfologi och uttryck av vidhäftande korsningar och caveolae12. Genprofilering av Hebbel et al.13,14,15 fann att BOEC eller ECFC är de sanna endotelcellerna eftersom de främjar mikrovaskulär och stor kärlbildning. Således kan BOEC användas som ett verktyg för att utvärdera patofysiologiska processer och genetisk variation16. De anses också vara en utmärkt cellkälla för cellterapi för vaskulär regenerering17. Därför är ett standardiserat protokoll för att konsekvent härleda dessa mycket proliferativa celler viktigt.
Medan BOEC ger ett kraftfullt verktyg för att studera mänsklig patofysiologisk och genetisk variation, kan en mer homogen källa till BOEC ge mer robusta och tillförlitliga experimentella och terapeutiska resultat. Överlägsen homogenitet kan uppnås genom användning av xenogena cellkällor som härrör från genetiskt likartade djur som fötts upp under liknande förhållanden18. Medan xenogena cellkällor är benägna att framkalla ett värdimmunsvar, utvecklas immunmodulerande strategier med målet att generera immunkompatibla djur och animaliska produkter, inklusive celler. I synnerhet grisar är en riklig källa till perifert blod och används ofta för att studera medicintekniska produkter och andra terapier på grund av anatomiska och fysiologiska likheter med människor. Därför förfinar denna studie protokollet för isolering och expansion av mycket proliferativa BOEC från perifert blod från svin. Protokollet som beskrivs nedan är en enkel och pålitlig metod för att erhålla ett stort antal BOEC från en relativt liten volym blod. Kulturerna kan expanderas genom flera passager för att generera miljontals celler från ett enda blodprov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier godkändes av respektive institutionella djurvårds- och användningskommittéer (IACUC) vid Medical College of Wisconsin och Mayo Clinic.
OBS: I denna studie användes Yorkshire/Landrace/Duroc cross tamgrisar (Sus domesticus), hane och hona, 40-80 kg, 3-6 månader gamla.
1. Insamling av perifert svin
- Förbered material.
- Späd heparinlösning till 100 E/ml i steril saltlösning.
- Tillsätt 3-4 ml heparinlösning till var och en av två 50 ml koniska rör och två 60 ml sprutor.
- Dra upp outspädd heparinlösning (1 000 E/ml) i ett förlängningsrör.
- Anslut en 19 G nål till ena änden av det heparinfyllda förlängningsröret och en heparininnehållande 60 ml spruta till den andra änden.
- Bedöva en gris enligt institutionella policyer
- Administrera en IM-injektion av atropin (0,05 mg / kg), tiletamin / zolazepam (2-5 mg / kg) och xylazin (2 mg / kg) för att inducera anestesi.
OBS: adekvat anestesi uppnås när djuret är medvetslöst och underkäkens muskler är icke-styva. - Lägg djuret i ryggläge och placera upprullade handdukar på båda sidor för att ge stabilitet.
- Applicera en oftalmisk salva i ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Ge termiskt stöd under anestesi inklusive filtar, värmedynor och / eller uppvärmd procedurtabell.
- Administrera en IM-injektion av atropin (0,05 mg / kg), tiletamin / zolazepam (2-5 mg / kg) och xylazin (2 mg / kg) för att inducera anestesi.
- Rengör lårbensbenet med betadinskrubbalösning.
- Punktera lårbensvenen eller artären med 19 G nålen och dra långsamt (~ 1-2 ml / s) 50 ml blod i sprutan.
OBS: Att rita för snabbt kan skada cellerna. - Lämna nålen på plats, knäpp omedelbart förlängningsröret och koppla bort 60 ml sprutan
- Överför långsamt blodet till ett heparininnehållande 50 ml koniskt rör.
- Tätt täck det 50 ml koniska röret, vänd försiktigt några gånger för att blanda och lägg på is.
- Anslut den återstående heparininnehållande 60 ml sprutan till förlängningsröret, lossa förlängningsröret och dra långsamt ytterligare 50 ml blod i sprutan.
- Ta omedelbart bort nålen från artären eller venen och dra långsamt återstående blod från förlängningsröret in i sprutan.
- Koppla bort 60 ml sprutan från förlängningsröret och överför långsamt blodet till det återstående heparininnehållande 50 ml koniska röret.
- Tätt täck det 50 ml koniska röret, vänd försiktigt några gånger för att blanda och lägg på is.
- Applicera tryckhemostas på grisens lårbensmån.
- Återvinna grisen i enlighet med institutionella policyer. Övervaka djuret kontinuerligt tills det återfår tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggunderlag och återgå till det vanliga inhysnings-/burområdet.
2. Isolering av mononukleära celler
- Späd blodet 1:1 med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i fyra 50 ml koniska rör.
OBS: Detta arbete måste utföras i en cellodlingshuv med en aseptisk teknik för att undvika att kontaminera cellkulturen. - Tillsätt 25 ml rumstemperatur färdig att använda densitetsgradientlösning till åtta 50 ml koniska rör.
- Mycket långsamt pipettera 25 ml blod/saltlösning längs insidan av varje densitetsgradientlösning innehållande 50 ml koniskt rör genom att hålla röret i en skarp vinkel mot pipettspetsen.
OBS: Blodlösningen ska försiktigt skiktas ovanpå densitetsgradientlösningen och upprätthålla ett väldefinierat gränssnitt. - Centrifugera rören i 30 minuter vid 560 x g och rumstemperatur (RT).
OBS: För bästa resultat, inaktivera centrifugbromsen om möjligt. - Använd en tunn pipett för att försiktigt samla upp buffyskiktet (grumligt lager av mononukleära celler ovanför densitetsgradientlösningen och under den klara plasman) från varje rör och fördela jämnt i två nya 50 ml koniska rör. Kassera densitetsgradientlösningen som innehåller rör.
OBS: Samla så mycket av buffyskiktet som möjligt medan du samlar så lite av densitetsgradientlösningen och plasma som möjligt.
3. Tvättning och plätering av celler
- Belägg en 6-brunnsplatta med fibronektin.
- Gör en stamlösning av humant plasmafibronektin genom att späda den till 1 mg/ml i sterilt vatten. Förvara alikvoterna vid -20 °C.
- Gör 3,6 ml av en fungerande lösning av fibronektin genom att späda 600 μL fibronektinstamlösning i 3 ml PBS.
- Överför 600 μL av fibronektinarbetslösningen till varje brunn på en 6-brunnsplatta och skaka försiktigt tills den är jämnt belagd.
- Vänta 30 minuter tills fibronektinet täcker brunnarna och aspirera försiktigt lösningen ur varje brunn.
- Medan du väntar på fibronektinet att belägga, tvätta de mononukleära cellerna
- Fyll på rören med upp till 45 ml PBS
- Centrifugera i 5 min vid 560 x g och 4 °C med låg broms. Aspirera supernatanten från båda rören.
- Resuspendera varje cellpellet i 25 ml PBS.
- Upprepa för att tvätta en andra gång.
- Resuspendera varje cellpellet i 5 ml PBS och tillsätt 15 ml 0,8% ammoniumkloridlösning till varje rör.
OBS: Detta steg är att lysera de återstående röda blodkropparna. - Inkubera på is i 10 min.
- Tvätta cellerna som tidigare genom att fylla på tuber med PBS och centrifugera i 5 minuter vid 560 x g och 4 °C med låg broms. Aspirera supernatanten från båda rören.
- Återsuspendera varje cellpellet i 25 ml PBS och upprepa för att tvätta en andra gång.
- Resuspendera varje cellpellet i 6 ml EGM-2-odlingsmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1x antibiotika/antimykotisk lösning innehållande 10 000 E/ml penicillin, 10 mg/ml streptomycin och 25 μg/ml amfotericin.
OBS: EGM-2-odlingsmediet består av EBM-2-odlingsmedium kompletterat med 200 μL hydrokortison, 2 ml human fibroblasttillväxtfaktor (hFGF-B), 500 μL vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), 500 μL rekombinant analog av insulinliknande tillväxtfaktor (R3IGF-1), 500 μL askorbinsyra, 500 μL human epidermal tillväxtfaktor (hEGF), 500 μL gentamicin/amfotericin och 500 μl heparin per 500 ml. - Överför försiktigt 2 ml av cellsuspensionen till varje brunn på den fibronektinbelagda 6-brunnsplattan och skaka försiktigt tills den är jämnt belagd.
OBS: Målet är att frö så många celler som möjligt för att maximera antalet endotelkolonier som kommer att bildas.
4. Cellodling
- Inkubera cellerna vid 37 °C, 5 %CO2 och 100 % luftfuktighet.
- Nästa dag, tillsätt försiktigt 1 ml färskt odlingsmedium till varje brunn.
OBS: det är viktigt att vara försiktig så att du inte stör celler som är löst vidhäftande mot fibronektinbeläggningen. - Nästa dag, utför en halv kulturmediebyte genom att försiktigt aspirera 1,5 ml odlingsmedium från varje brunn och ersätta den med 1,5 ml färskt odlingsmedium.
- Under var och en av de kommande 5 dagarna, utför försiktigt en fullständig kulturmediumförändring till varje brunn (2 ml färskt odlingsmedium per brunn).
- Byt sedan försiktigt odlingsmediet tre gånger per vecka.
- Visualisera regelbundet cellkulturerna under ljusmikroskopi med låg effekt (4x objektiv).
OBS: Adherent blod utväxt endotelcell (BOEC) kolonier kommer att börja dyka upp i brunnarna 7-10 dagar efter plätering. Icke-vidhäftande celltyper kommer att kasseras med medelstora förändringar, och andra vidhäftande celltyper kommer gradvis att försvinna när BOEC-kolonierna växer. - För in BOEC i en fibronektinbelagd T-75-kolv när ~70%-80% sammanflyter och fortsätt att byta odlingsmedium tre gånger per vecka.
OBS: Sådensiteten kan kontrolleras genom att passera kolonier i en T25-kolv istället. Efterföljande passager kräver inte fibronektinbeläggning, och förändringar i odlingsmediet kan minskas till två gånger per vecka. - Celler från passagerna 1-3 kan användas för experiment eller överföras till ett frysmedel och lagras i flytande kväve för framtida användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De odlade cellernas morfologi observerades från början av odlingen tills BOEC-kolonier observerades (figur 1). En mindre population av vidhäftande celler började fästa vid odlingsskålarna och växa, medan icke-vidhäftande celler avlägsnades med förändringar i odlingsmediet (figur 1B). Kolonier uppträdde först på dag 6 som en samling endotelliknande celler som prolifererar radiellt utåt från en central punkt (figur 1D). När kulturen fortskred blev cellkolonierna tätare och uppvisade en kullerstensmorfologi som liknar mogna endotelceller (figur 1F). Den typiska endotela kullerstensmorfologin ger en enkel preliminär identifiering av BOEC med hjälp av ett ljusmikroskop.
Endotelcellkolonier är vanligtvis redo för passage vid 10-14 dagars kultur. Vid denna tidpunkt kommer 6-brunnsplattan vanligtvis att ge ~ 1 miljon celler med procentuell livskraft på 93% -98%. Under den första passagen kommer endotelceller att expandera för att ge ~ 6-10 miljoner celler i en T75-kolv.
För att bedöma morfogenesen hos BOEC, pläterades basalmembranmatrisen (t.ex. Matrigel) på 15 brunnsangiogenesplattor vid 10 μl/brunn och inkuberades vid 37 °C i 30 minuter för att möjliggöra polymerisation. Passage 2-celler såddes på matrisbelagda plattor med basalmembran och avbildades vid 14 timmar och 24 timmar. En densitet på cirka 3 500 celler per brunn kunde bilda ett nätverk och rörliknande strukturer. Rörbildning noterades inom 14 timmar för serumfritt medium (EGM-2 med tillägg förutom FBS) och inom 24 timmar för komplett tillväxtmedium (EGM-2 med tillskott inklusive FBS). Tillsats av FBS kan ha spätt ut de endotelcellsspecifika tillväxtfaktorerna (t.ex. VEGF) och infört andra signalfaktorer som resulterar i fördröjningen av rörbildningsprocessen. 2D-faskontrastmikroskopi användes för att avbilda rörbildning i serumfritt medium (figur 2A, B) och komplett tillväxtmedium (figur 2C, D). Celler i båda medieförhållandena genomgick morfologisk differentiering och organiserades snabbt i omfattande nätverk av kapillärrörliknande strukturer. Dessa strukturer bestod av organiserade cellulära ledningar som liknade kapillärnätverk in vivo. Vidare illustrerar mikrografer vid 20x förstoring den komplexa multicellulära organisationen av endotelceller och deras morfologiska differentiering i detalj. Det observerades inga morfologiska skillnader mellan medieförhållandena. Det omfattande nätverket av kapillärrörliknande strukturer tyder starkt på differentiering av odlade celler i mogna och funktionella endotelceller.
BOEC karakteriserades vidare av uttrycket av mogen endotelcellmarkör CD31 eller trombocytendotelcelladhesionsmolekyl-1 (PECAM1) (figur 3A, B). BOEC visade enhetligt uttryck av CD31. Vidare bekräftade flödescytometrianalys frånvaron av EPC eftersom cellerna färgades negativt för monocytmarkör CD14 jämfört med den positiva kontrollgruppen av PBMC (figur 3C, D).
Figur 1: Fotomikroskopibilder av fenotyp. Ljusmikroskopibilderna av odlade BOEC observerade vid 10x förstoring på (A) dag 0, (B) dag 2, (C) dag 4, (D) dag 6, (E) dag 8 och (F) efter den första passagen. Skalstänger: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologisk differentiering och organisation av passage 2 BOEC. Morfologisk differentiering och organisering av passage 2 BOEC i kapillärrörliknande strukturer noterades i basalmembranmatrisen inom 14 timmar för serumfritt medium och inom 24 timmar för fullständigt tillväxtmedium. (A) Serumfritt medium vid 4x, (B) Serumfritt medium vid 20x, (C) Komplett tillväxtmedium vid 4x och (D) Komplett tillväxtmedium vid 20x. Skalstänger: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Karakterisering av BOEC med CD31 och CD14. (A) Passage 2-3 BOEC färgades för PECAM1 med anti-CD31-FITC-antikropp som ses i grönt och (B) motsvarande faskontrastmikroskopibilder. Cellerna färgades i suspension, och suspensionen avbildades på ett mikroskopglas. Skalstänger: 200 μm. (C) Flödescytometrianalys av BOECs med CD14-AF700-antikropp jämfört med (D) positiva kontroller perifera mononukleära celler (PBMC). Positiv CD14-färgning visas i blått och ofärgade celler visas i rött. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BOEC är ett kraftfullt verktyg som kan användas i olika vetenskapliga och terapeutiska metoder 7,8,16. BOEC har använts för att analysera EG-genuttryck för att belysa de viktigaste faktorerna som är ansvariga för utvecklingen av kärlsjukdomar och cancer 5,19,20,21. BOEC har också använts i terapeutiska tillämpningar såsom vaskulär regenerering och genleverans22,23,24. Genetiskt modifierade BOEC har varit kända för sin antiangiogena tumörterapeutiska förmåga25,26. Vidare gör den angiogena potentialen hos BOEC dem till utmärkta kandidater för cellulära terapier som syftar till vaskularisering och neovaskularisering17,27. Även om flera studier beskriver hur man erhåller BOEC från humant perifert blod 6,7,8,9, tyder variationen hos humana cellkällor på grund av underliggande patofysiologisk och genetisk variation på ett kritiskt behov av att erhålla BOEC från friska xenogena källor 9,13,18.
Ett detaljerat protokoll för att effektivt härleda BOEC från mononukleära celler från perifert blod hos svin har presenterats. Kritiska steg inkluderar bearbetning av blodprover så snart som möjligt och effektiv skörd av buffy coat-lager efter densitetsgradientcentrifugering för att maximera antalet livskraftiga PBMC som går in i kulturen. Den initiala pläteringstätheten och snabb passage av celler är viktiga överväganden för att erhålla konsekvent isolering av dessa celltyper. En startblodvolym på 100 ml ger ett lämpligt antal PBMC för en enda sexbrunnsplatta. Det bör noteras att den maximala volymen blod som säkert kan samlas in från en gris varierar med djurens kroppsvikt. En föreslagen säker engångs maximal blodvolymsamling för grisar är 8 ml per kg kroppsvikt. Dessutom är det också viktigt att initiala kolonier passerar i rätt tid från passage 0 till passage 1. Cellerna upphör att proliferera om sådddensiteten är mycket låg eller om cellerna når sammanflöde. När cellerna blir sammanflytande börjar de omvandlas till en långsträckt mesenkymal morfologi och fenotyp. Sådensiteten kan också kontrolleras genom att passera kolonier i en T25-kolv i stället för en T75-kolv. Noggrant övervägande krävs för att inte förlora de vidhäftande celltyperna under initial medieförändring eftersom det är mycket viktigt att fånga så många vidhäftande celler som möjligt medan de icke-vidhäftande EPC: erna kasseras. Detta protokoll producerar utväxtcellkolonier på cirka 1 vecka.
Protokollet är mycket reproducerbart och pålitligt. Expanderande endotelcellkolonier uppnås i uppskattningsvis 90% -95% av kulturerna. Fel beror vanligtvis på brist på bildning av endotelcellkolonier, vilket innebär att om minst en endotelcellkoloni bildas, kommer de nästan alltid att fortsätta att expandera i odling. Källor till misslyckande inkluderar slumpmässig variation, överdriven skjuvning av celler under blodinsamling, kontaminerande mikrober i kulturen och hög förlust av mononukleära celler under bearbetningsstegen. Efter en misslyckad kultur kommer en andra kultur vanligtvis att vara framgångsrik, vilket indikerar att variation mellan djur inte är en viktig faktor. Protokollet är till och med framgångsrikt när man samlar blod omedelbart efter eutanasi, vilket indikerar att tvättstegen effektivt minskar dödshjälpmedlen till oskyldiga nivåer.
Oavsett heterogeniteten i den cirkulerande blodcellspopulationen erhölls BOEC som skiljer sig mycket från EPC. BOEC härleds från en liten delmängd av vidhäftande PBMC som saknar CD14-uttryck. Detta bekräftades av frånvaron av CD14-färgning (figur 3C,D). Clearance av monocytiska EPC från BOEC-kulturer i tidiga passager kan förklaras antingen av celldöd eller icke-vidhäftning. Kullerstensmorfologin hos BOEC (figur 1E,F) tyder på en uttalad endotelfenotyp. Dessutom innebär det enhetliga uttrycket av ytmarkör CD31 (figur 3A) en homogen population av mogna endotelceller. Vidare visar kapillärmorfogenesen hos BOEC både i serumfria (figur 2A,B) och kompletta tillväxtmedier (figur 2C,D) deras inneboende angiogena förmåga 6,8. Tidigare analys av BOEC hos svin genererade med hjälp av detta protokoll har visat att dessa celler dessutom är positiva för von Willebrands faktoruttryck och lektinbindning28.
Överflödet av PBMC i cirkulerande blod, från vilket BOEC uppstår, stöder genomförbarheten av en robust metod för att erhålla en praktiskt taget obegränsad tillgång på terapeutiska BOEC från animaliska källor. När tekniken behärskas kan BOEC användas för flera applikationer, inklusive vaskulär reparation och regenerering, sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och endotelcellbiologistudier. Pågående studier behövs för att bekräfta homogeniteten hos BOEC hos svin och deras kompatibilitet som terapeutisk källa hos människa.
En begränsning av detta protokoll är risken för att expanderande endotelcellkolonier inte genererar. Felfrekvensen uppskattas till 5% -10%, och i dessa fall är ett andra försök nödvändigt. När försäkran om framgång är viktig kan dubbelt så mycket blod samlas in, och protokollet kan följas parallellt för att ge två oberoende kulturer. Dessutom är vår erfarenhet begränsad till friska Yorkshire / Landrace / Duroc cross tamgrisar (Sus domesticus), hane och hona, 40-80 kg, 3-6 månader gamla. Framgångsgrader med andra raser, åldrar och experimentella förhållanden är okända.
En annan begränsning i protokollet är att en definitiv markör för BOEC-fenotyp inte existerar. Här och i tidigare arbete28 har de svin BOEC som genereras från detta protokoll karakteriserats för flera BOEC-markörer, men förståelsen av BOEC-fenotypen fortsätter att utvecklas. BOEC karakteriseras också vid passagerna 2-3 och fenotypen vid högre passager är okänd. En fördel med BOEC hos svin jämfört med människor är den färdiga tillförseln av grisblod, vilket möjliggör generering av mer frekventa kulturer och en robust tillförsel av konsekventa celler med låg passage.
En av de största begränsningarna med att använda svinceller i terapeutiska metoder är värdens immunsvar29. Flera immunmodulerande strategier undersöks för att mildra immunogeniciteten hos xenogena celler för human transplantation, såsom antiinflammatoriska medel och CRISPR / Cas genetisk manipulation30,31,32. Nyare studier har föreslagit uttryck av humana komplementära reglerproteiner (hCRP)33 och införande av α1,3-galaktosyltransferasborttagna (GTKO)32,34 grisar. Dessa framsteg är lovande för terapeutisk tillämpning av xenogena celler, inklusive svin BOEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma finansiering från NIH / NHLBI R00 HL129068.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R.
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al.
