Summary
Здесь мы описываем подробный метод выделения митохондрий из скелетных мышц мыши и последующий анализ дыхания по скорости потребления кислорода (OCR) с использованием респирометрических анализов на основе микропластин. Этот конвейер может быть применен для изучения влияния многочисленных экологических или генетических вмешательств на митохондриальный метаболизм.
Abstract
Большая часть энергии клетки получается за счет деградации глюкозы, жирных кислот и аминокислот различными путями, которые сходятся в системе митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS), которая регулируется в ответ на клеточные потребности. Липидная молекула коэнзима Q (CoQ) имеет важное значение в этом процессе путем переноса электронов в комплекс III в цепи переноса электронов (ETC) через постоянные циклы окисления / восстановления. Статус митохондрий и, в конечном счете, здоровье клеток можно оценить, измеряя потребление кислорода внеземными цивилизациями с использованием респирометрических анализов. Эти исследования обычно проводятся в установленных или первичных клеточных линиях, которые культивировались в течение нескольких дней. В обоих случаях полученные параметры дыхания могли отклоняться от нормальных физиологических условий в любом данном органе или ткани.
Кроме того, внутренние характеристики культивируемых одиночных волокон, выделенных из скелетных мышц, препятствуют этому типу анализа. В данной работе представлен обновленный и подробный протокол анализа дыхания в свежеизолированных митохондриях скелетных мышц мыши. Мы также предоставляем решения потенциальных проблем, которые могут возникнуть на любом этапе процесса. Метод, представленный здесь, может быть применен для сравнения показателей потребления кислорода в различных трансгенных моделях мышей и изучения митохондриального ответа на медикаментозное лечение или другие факторы, такие как старение или пол. Это возможный метод ответа на важнейшие вопросы о метаболизме и регуляции митохондриальной биоэнергетики.
Introduction
Митохондрии являются первичными метаболическими органеллами в клетке1. Эти специализированные мембранно-закрытые органеллы используют молекулы питательных веществ для производства энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ) OXPHOS. Этот процесс основан на переносе электронов от донорских молекул в серии окислительно-восстановительных реакций в ETC2. CoQ является единственным окислительно-активным липидом, который эндогенно вырабатывается во всех клеточных мембранах и циркулирующих липопротеинах, которые проявляют антиоксидантную функцию3. Это важный компонент ETC, передающий электроны из NADH-зависимого комплекса I и FADH2-зависимого комплекса II в комплекс III, хотя многие другие редуктазы могут стимулировать восстановление митохондриального CoQ до убихинола в качестве обязательного шага в нескольких клеточных метаболических путях4,5.
На протяжении всего процесса через внутреннюю мембрану митохондрий создается электрохимический протонный градиент, который преобразуется в биологически активную энергию комплексом АТФ-синтазы V2. Следовательно, митохондриальная дисфункция приводит к множеству патологических состояний, в основном затрагивающих ткани с высокими энергетическими потребностями - мозг, сердце и скелетные мышцы6,7. Поэтому крайне важно разработать методы точного анализа митохондриальной биоэнергетики для изучения ее роли в здоровье и болезнях, особенно в высокоэнергетических тканях, таких как скелетные мышцы.
Кислородный электрод типа Кларка был классически использован при изучении митохондриального дыхания8. Однако эта система постепенно вытесняется технологиями с более высоким разрешением, причем особенно популярны технологии потребления кислорода на основе микропластин, такие как анализаторы Agilent Seahorse XF9. В области скелетных мышц эти исследования обычно проводятся в культивируемых клетках, главным образом в увековеченной клеточной линии миобластов C2C12 или первичных культурах, полученных из клеток-сателлитов10,11. Тем не менее, эти исследования не полностью повторяют ситуацию in vivo, особенно при изучении митохондриальной биологии и функционирования на тканевом уровне при конкретных нарушениях, негенетических вмешательствах или генетических манипуляциях.
Кроме того, анализ дыхания в клетках является более сложным из-за дополнительных факторов, включая внемитохондриальную потребность в АТФ и субстратах анализа или сигнальные события, которые могут ввести в заблуждение интерпретацию результатов. В качестве альтернативы также возможно использование одиночных или пучков свежеизолированных миофиберов из мышц. Тем не менее, метод изоляции технически сложен и осуществим только для нескольких типов мышц. В этом случае в основном используются мышцы сгибателя digitorum brevis (FDB) и разгибателя digitorum longus (EDL)10,12,13, хотя в нескольких отчетах также описывается использование других типов мышц14,15.
Также сообщалось о биоэнергетическом профилировании участков скелетных мышц16. Основным преимуществом этого метода является то, что интактные мышцы могут быть изучены (авторы показывают, что нарезка через волокна не нарушает результаты по сравнению с изолированными миофибрами). Однако митохондриальный доступ к субстратам и ингибиторам анализа ограничен, и, таким образом, можно измерить лишь несколько параметров16. Наконец, изолированные митохондрии также могут быть использованы9,17,18,19. В этом случае митохондрии теряют цитозольную среду, что может повлиять на их функцию. Напротив, этот метод гарантирует доступ к субстратам и ингибиторам, позволяет анализировать множество типов образцов и, как правило, требует меньше материала.
В данной работе описан метод выполнения биоэнергетического профилирования изолированных митохондрий из скелетных мышц мыши с использованием респирометрических анализов на основе микропластин (рисунок 1). В частности, подробно описаны три протокола: Анализ связи, CA для оценки степени связи между ETC и механизмом OXPHOS; Анализ потока электронов, EFA для измерения активности отдельных комплексов внеземных цивилизаций; и анализ BOX для определения митохондриальной β окислительной способности. Примечательно, что требуется только небольшое количество образцов по сравнению с обычными методами респирометрии. Используемый здесь протокол изоляции был изменен по сравнению с методом, опубликованным в другом месте18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Сбор у мышей и тканей был выполнен с использованием протоколов, одобренных Комитетом по этике Universidad Pablo de Olavide (Севилья, Испания; протоколы 24/04/2018/056 и 12/03/2021/033) в соответствии с Испанским королевским указом 53/2013, Европейской директивой 2010/63/EU и другими соответствующими руководящими принципами.
1. Подготовка запасов, буферов и реагентов для дыхательных анализов
- Подготовьте следующие складские растворы, которые можно хранить при указанной температуре месяцами. Используйте сверхчистый H2O во всех случаях.
- Растворите таблетки фосфат-буферного физиологического раствора (PBS) в H2O (1 таблетка на 200 мл H2O) для приготовления 1x PBS. Автоклавируйте раствор и храните его при комнатной температуре (RT).
- Растворите 2 г гранул NaOH в 50 мл H2O для получения 1 M NaOH.
- Подготовьте запасы 0,1 М, 1 М, 5 М и 10 М КОН для калибровки рН.
- Добавьте 14,612 г ЭДТА к 70 мл H2O. Добавьте гранулы NaOH до тех пор, пока рН не достигнет 8,0, чтобы ЭДТА полностью растворилась. Добавьте квантовый сатис H2O (QS) к 100 мл. Автоклавируйте полученный раствор 0,5 М ЭДТА (рН 8) и храните его в РТ.
- Добавьте 19 г EGTA к 70 мл H2O. Добавьте гранулы NaOH до тех пор, пока рН не достигнет 8,0, чтобы позволить EGTA полностью раствориться. Добавьте H2O QS к 100 мл. Автоклавируйте полученный раствор 0,5 М ЭГТА (рН 8) и храните его в РТ.
- Добавьте 2 мл 0,5 М ЭДТА к 98 мл PBS. Храните полученный раствор 10 мМ ЭДТА/ПБС на RT.
- Растворите 5,958 г HEPES в 40 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 с KOH и QS до 50 мл с H2O. Отфильтруйте полученный буфер HEPES 0,5 М через сетку 0,45 мкм и сохраните его в RT.
- Растворить 3,402 г KH2PO4 в 50 мл H2O. Отфильтровать полученный 0,5 М раствор KH2PO4 через сетку 0,45 мкм и сохранить его в RT.
- Растворить 9,521 г безводного MgCl2 в 100 мл H2O. Автоклав получившийся 1 M MgCl2 раствор и хранить его в RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это экзотермическая реакция, действуйте с осторожностью и растворяйте MgCl2 на льду.
- Готовят субстрат и исходные растворы ингибиторов (см. табл. 1). Aliquot и хранить их при -20 °C. Избегайте циклов замораживания-оттаивания. В качестве исключения всегда готовьте пировиноградную кислоту непосредственно перед употреблением.
- Препарат в сверхчистом H2O: 0,5 М сукцината, 0,5 М пировиноградной кислоты, 0,5 М яблочной кислоты, 100 мМ АДФ, 1 М аскорбиновой кислоты и 50 мМ N,N,N',N'-тетраметил-пара-фенилен-диамин (TMPD) (защитить от света).
- Готовят в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО): 50 мМ пальмитоил-L-карнитина, 4 мМ ротенона, 20 мМ карбонилцианида-п-трифторметоксифенилгидразона (FCCP), 4 мМ олигомицина и 5 мМ антимицина А.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать 0,1% конечной концентрации ДМСО в микропластинчатых скважинах. Поэтому подготовьте высококонцентрированные стоковые растворы, чтобы оставаться ниже этого предела.
- Подготовьте буферы для выделения митохондрий и количественной оценки белка в день эксперимента. Используйте сверхчистый H2O во всех случаях и держите все буферы на льду, если не указано иное.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экономии времени все реагенты можно взвешивать и хранить в соответствующих контейнерах (например, в пробирках по 15 мл) при правильной температуре в предыдущий день.- Чтобы приготовить 10% свободные жирные кислоты (FFA) BSA, тщательно растворите 150 мг FFA BSA в 1,5 мл H2O путем инверсии / вращения колеса. Не вихрь, чтобы избежать вспенивания.
- Чтобы приготовить 1-кратный реагент Брэдфорда, разбавьте 5-кратный коммерческий раствор H2O и держите его в темноте в RT.
- Для приготовления 8x Mitochondria Buffer (MB) растворите 4,112 г сахарозы и 763 мг HEPES в 15 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2, добавьте 1,6 мл 10% FFA BSA и QS до 20 мл с H2O.
- Чтобы приготовить 20 мл изоляционного буфера 1 (IB1) (4 мл, используемых на образец), растворите 400 мкл 0,5 М ЭДТА, 784 мг D-маннитола и 2,5 мл 8 мб в 15 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS с H2O.
- Чтобы приготовить 5 мл изоляционного буфера 2 (IB2) (500 мкл на образец), растворите 30 мкл 0,5 M EGTA, 196 мг D-маннитола и 625 мкл 8x MB в 4 мл H2O. Отрегулируйте pH до 7,2 и QS с H2O.
- Чтобы приготовить 5 мл резуспенсионного буфера (RB) (200 мкл используется на образец), растворите 120 мг сахарозы, 191,3 мг D-маннита, 50 мкл 0,5 М HEPES и 10 мкл 0,5 М EGTA в 4 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS с H2O.
- Для приготовления 2x mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1) растворяют 1,199 г сахарозы, 2,8 г маннитола, 1 мл 0,5 М KH2PO4, 250 мкл 1 M MgCl2, 200 мкл 0,5 М HEPES и 100 мкл 0,5 М ЭГТА в 20 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS до 25 мл с H2O. Держите во льду в течение коротких периодов. В течение более длительных периодов времени держите его при 4 ° C, чтобы избежать осадков.
- Чтобы подготовить 1-кратную среду для анализа связи (CAM), подготовьте два различных буфера на основе MAS-1: 1) CAM + BSA для собственно анализа CA и 2) CAM-BSA для подготовки ингибиторов анализа. Всегда держите соотношение пируват:малат на уровне 10:1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку BSA может засорять порты для инъекций, разбавьте ингибиторы в CAM без BSA.- Для получения CAM+BSA разбавьте 300 мкл 0,5 М пировиноградной кислоты, 30 мкл 0,5 М яблочной кислоты и 7,5 мл 2x MAS-1 в 6 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2. Добавьте 300 мкл 10% FFA BSA и QS к 15 мл с H2O.
- Для получения CAM-BSA разбавьте 120 мкл 0,5 М пировиноградной кислоты, 12 мкл 0,5 М яблочной кислоты и 3 мл 2x MAS-1 в 2 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS до 6 мл с H2O.
- Чтобы подготовить 1 среду для анализа потока электронов (EFAM), подготовьте буферы EFAM, содержащие BSA, и буферы EFAM без BSA.
- Для приготовления EFAM+BSA разбавьте 300 мкл 0,5 М пировиноградной кислоты, 60 мкл 0,5 М яблочной кислоты, 3 мкл 20 мМ FCCP и 7,5 мл 2x MAS-1 в 6 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2. Добавьте 300 мкл 10% FFA BSA и QS к 15 мл с H2O.
- Для получения EFAM-BSA разводят 120 мкл 0,5 М пировиноградной кислоты, 24 мкл 0,5 М яблочной кислоты, 1,2 мкл 20 мМ FCCP и 3 мл 2x MAS-1 в 2 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS до 6 мл с H2O.
- Для приготовления 1x β среды окисления (BOXM) готовят растворы BOXM, содержащие BSA и BSA.
- Для приготовления BOXM+BSA разбавьте 12 мкл 50 мМ пальмитоил-L-карнитина, 30 мкл 0,5 М яблочной кислоты и 7,5 мл 2x MAS-1 в 7 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2. Добавьте 300 мкл 10% FFA BSA и QS к 15 мл с H2O.
- Для приготовления BOXM-BSA разводят 4,8 мкл 50 мМ пальмитоил-L-карнитина, 12 мкл 0,5 М яблочной кислоты и 3 мл 2x MAS-1 в 2 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,2 и QS до 6 мл с H2O.
2. Рассечение мышц, гомогенизация и изоляция митохондрий
- Поместите все материалы и буферы на лед. Убедитесь, что все материалы холодные в течение всей процедуры, чтобы защитить митохондрии от повреждений.
- Поместите на лед три стакана по 50 мл на образец и добавьте следующие растворы: 10 мл PBS в стакан 1, 10 мл 10 мМ EDTA/PBS в стакан 2 и 4 мл IB1 в стакан 3.
- Усыпляют мышь при вывихе шейки матки. Избегайте эвтаназии CO2 , так как скелетные мышцы могут стать гипоксическими, мешая анализу дыхания.
- Распылите на правую заднюю налимку 70% этанола, чтобы предотвратить выпадение меха, и приклейте конечность к пробковой рассеченной доске. Заклейте и левую переднюю конечность.
- Сделайте разрез стерильным одноразовым скальпелем через кожу с колена до ног.
- Обхватите кожу зубчатыми щипцами на уровне лодыжки и разрежьте ее тонкими ножницами вокруг лодыжки.
- Освободите кожу от подлежащей мускулатуры с помощью пинцета тонкого наконечника в одной руке, одновременно подтягивая ее зубчатыми щипцами в другой руке.
- Рассекните все скелетные мышцы от лодыжки до колена (рисунок 2).
- Удалите всю соединительную ткань над передней (ТА) мышцей большеберцовой кости, чтобы облегчить извлечение мышц с помощью тонкого пинцета и ножниц.
- Найдите четыре дистальных сухожилия мышцы EDL и разделите их близко к их вставкам в пальцах ног. Найдите дистальное сухожилие ТА и обрежьте его близко к его вставке, всегда ниже лодыжки.
- Осторожно потяните сухожилия TA и EDL выше лодыжки, чтобы освободить свободные концы.
- Захватите свободные концы сухожилий и облегчите мышцы от остальной мускулатуры и костей, подтягивая их вверх. Используйте тонкий пинцет или ножницы, чтобы облегчить процесс. Действуйте осторожно, чтобы избежать сокращения миофибры.
- Отрежьте проксимальное сухожилие EDL и мышцу TA как можно ближе к коленной чашечке.
- Переверните мышь вверх дном, чтобы продолжить извлечение икроножной мышцы (ГА) и камбалы.
- Захват кармана, образовавшегося между бицепсом бедра и ГА зубчатыми щипцами. Используйте тонкие ножницы, чтобы отделить эти мышцы и визуализировать проксимальное сухожилие GA.
- Захватите ахиллово сухожилие тонкими щипцами и аккуратно разрежьте его мелкими ножницами. Освободите ГА и камбаловидные мышцы от подлежащей кости, подтянув их вверх через сухожилия. Отрежьте проксимальное сухожилие ГА, освободив его вместе с подстилающей камбалой.
- Тщательно рассекайте оставшиеся мышцы от сухожилия к сухожилию после той же процедуры, пока не останутся только кости.
- Повторно закрепите мышь в исходном положении, чтобы рассекнуть четырехглавую мышцу.
- Отбросьте жировую ткань поверх квадрицепсов на проксимальной стороне с помощью зубчатых щипцов и мелких ножниц.
- Вставьте тонкий пинцет между квадрицепсами и бедренной костью и переместите их в обоих направлениях вдоль оси бедренной кости, чтобы отделить мышцу от кости.
- Захватите дистальные четырехглавые мышечные сухожилия зубчатыми щипцами и разрежьте сухожилие тонкими ножницами как можно ближе к коленной чашечке.
- Потяните квадрицепсы вверх и освободите его при проксимальном введении тонкими ножницами.
- Повторите шаги 4–8 из этого раздела с левой задней конечностью.
- Сначала промойте все мышцы в Стакане 1, а затем в Стакане 2.
- Переведите все мышцы на Стакан 3 и тонко измельчите все мышцы острыми ножницами на льду.
- Переложите суспензию в трубку C (фиолетовую крышку), всегда держа ее во льду.
- Плотно закройте трубку C и прикрепите ее вверх ногами к втулке гомогенизатора. Убедитесь, что образец материала находится в области ротатора/статора. Выберите 1-минутную программу под названием m_mito_tissue_01.
- Разделите гомогенат на две предварительно охлажденные микроцентрифужные трубки по 2 мл и центрифугу по 700 × г в течение 10 мин при 4 °C в настольной центрифуге.
- Переносите супернатанты в новые предварительно охлажденные трубки по 2 мл, тщательно избегая жира и негомогенизированных тканей. Храните гранулы при -80 °C для определения чистоты фрагментации (фракция N) (рисунок 3).
- Центрифугировать супернатанты при 10 500 × г в течение 10 мин при 4 °C.
- Перенесите супернатанты в новые предварительно охлажденные трубки объемом 2 мл и пометьте их как супернатант No 1 (SN1). Храните их при температуре -80 °C для определения чистоты фрагментации (рисунок 3).
- Повторно суспендировать и соединить обе гранулы в общем объеме 500 мкл IB2 во льду.
- Центрифуга при 10 500 × г в течение 10 мин при 4°C.
- Перенесите супернатант в новую предварительно охлажденную трубку объемом 2 мл и пометьте его как Супернатант No 2 (SN2). Храните его при температуре -80 °C для определения чистоты фрагментации (рисунок 3).
- Повторное суспендирование конечной митохондриальной гранулы в 200 мкл RB. Быстро отложите 10 мкл для количественной оценки белка и немедленно добавьте 10 мкл 10% FFA BSA к оставшейся митохондриальной суспензии, чтобы предотвратить повреждение.
- Определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
- Для стандартной кривой готовят 30 мкл последовательных разведений известной концентрации белка в rb-буфере. Например, используйте 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл, 0,0625 мг/мл и 0 мг/мл BSA.
- Подготовьте последовательные разведения митохондриальных образцов 1:3 и 1:6 в буфере RB.
- В плите с плоским дном из 96 скважин первая загрузка 2,5 мкл образца/стандарт на скважину. Затем добавьте 10 мкл 1 M NaOH к каждому образцу и, наконец, 200 мкл 1x реагента Брэдфорда. Хорошо перемешать, избегая пузырьков воздуха. Визуально проверьте, что цвет образцов находится в пределах калибровочной линии. Всегда выполняйте анализ в трех экземплярах.
- Инкубируют пластины в течение 5 мин при RT в темноте и считывают поглощение при 595 нм в микропластинчатом спектрофотометре.
- Рассчитайте стандартную кривую, построив график значений поглощения (ось Y) по отношению к соответствующей концентрации белка в разведениях, полученных на этапе 22.1 в этом разделе (ось X).
- Рассчитайте общее количество белка в митохондриальных образцах путем экстраполяции со стандартной кривой.
3. Подготовка респирометрических анализов на основе микропластин
- Гидратируют респирометрический датчик не менее чем за 12 ч до начала эксперимента с 1 мл калибровочного буфера на лунку. Инкубировать при 37 °C (без CO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидратированные датчики можно использовать до 72 ч. С картриджем следует обращаться осторожно на этом этапе: если что-то касается датчиков, это может повлиять на чувствительность измерения. - Предварительно оградите подготовительную центрифугу с качающимся ротором микропластины ковша и соответствующими микропластинчатыми адаптерами при 4 °C.
- Включите компьютер, откройте программное обеспечение для анализа и выберите нужный протокол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Щелчок слышен, когда программное обеспечение подключается к прибору для измерения потребления кислорода. Датчик нагрева должен быть зеленым и при 37 °C до начала эксперимента. - Готовят растворы ингибиторов из запасов, указанных в разделе 1, этап 2, в соответствии с анализом, который необходимо провести. Подготовьте достаточный объем для каждого раствора. Для справки см. таблицу 1 и таблицу 2 .
- Добавьте соответствующий объем каждого ингибитора в каждый порт, вставьте картридж в прибор для измерения расхода кислорода и начните калибровку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ингибитора в картридж и вставка картриджа в прибор занимает 15-20 мин. Убедитесь, что введены правильные компоненты картриджа. Крышка картриджа и гидроусилитель могут быть выброшены, в то время как картридж датчика и место утилиты необходимы. - Центрифугируют концентрированной митохондриальной суспензией секции 2, стадия 21 при 10 500 × г в течение 10 мин при 4°С.
- Повторное суспендирование митохондриальной гранулы в 100 мкл 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA или 1x BOXM+BSA, в зависимости от протокола, который будет выполнен.
- Далее разбавляют концентрированный митохондриальный образец до конечной концентрации 0,2 мкг/мкл в соответствующей пробирной среде.
- Посейте 50 мкл суспензии (всего 10 мкг белка) на лунку в предварительно охлажденную 24-луночную микропластину на льду. Не добавляйте митохондрии в фон коррекционных колодцев; только добавьте соответствующую среду анализа. Хранить оставшуюся митохондриальную суспензию при -80 °C для определения чистоты фрагментации (рисунок 3).
- Раскрутите микропластинку в предварительно охлажденной препаративной центрифуге при 2000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Противовес для баланса соответственно.
- Нагрейте оставшуюся пробирную среду при 37 °C во время центрифугирования микропластин.
- После центрифугирования оставьте микропластинку на скамейке на 5 минут, чтобы уравновесить. Добавьте 450 мкл теплой пробирной среды для конечного объема 500 мкл на скважину на РТ. Делайте это медленно и осторожно, добавляя среду к стенке колодца, чтобы избежать отсоединения митохондрий.
- Поместите микропластинку немедленно в прибор для измерения расхода кислорода без крышки и запустите протокол (таблица 3). Убедитесь, что первым шагом является 10-минутная инкубация, чтобы позволить микропластине нагреться.
- Как только эксперимент будет завершен, извлеките картридж и микропластинку, выключите прибор и начните анализ.
4. Анализ результатов
- В случае анализов CA и BOX выполните следующие анализы:
- Регистрируют потребление немитохондриального О2 , которое соответствует среднему значению, полученному после инъекции Антимицина А и ротенона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антимицин А и ротенон являются комплексными ингибиторами III и I соответственно. - Рассчитать базальное дыхание путем вычитания немитохондриального потребления O2 из базальных значений (точки измерения 1 и 2).
- Вычтите потребление немитохондриального O2 из значений после инъекции комплекса V субстрата АДФ (инъекция А) для определения митохондриального состояния III.
- Вычтите потребление немитохондриального O2 из значений дыхания после инъекции комплексного ингибитора V олигомицина (инъекция B) для получения митохондриального состояния IVo.
- Рассчитать митохондриальное состояние IIIu путем вычета немитохондриального потребления O2 из дыхания после инъекции FCCP (инъекция C).
ПРИМЕЧАНИЕ: FCCP является мощным митохондриальным окислительным разъединителем фосфорилирования. Синтез АТФ обходится в его присутствии, и внеземные цивилизации достигают максимальной активности. - Вычтите значения базального дыхания из значений IIIu митохондриального состояния для получения митохондриальной резервной емкости, которая представляет собой способность генерировать дополнительный АТФ в случае повышенной потребности в энергии.
- Разделите митохондриальное состояние IIIu на значения состояния IVo для получения коэффициента управления дыханием (RCR).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные или нулевые значения RCR указывают на то, что митохондриальная связь затронута.
- Регистрируют потребление немитохондриального О2 , которое соответствует среднему значению, полученному после инъекции Антимицина А и ротенона.
- В отношении EFA выполните следующие расчеты:
- Получение остаточной активности путем расчета среднего значения после введения ротенона и антимицина А (инъекции А и С).
- Рассчитать комплексную активность I-IV (CI-CIV) путем вычитания остаточной активности из базальных значений (точки измерения 1 и 2).
- Вычтите остаточную активность из значений после инъекции сукцината субстрата CII (инъекция B) для получения активности CII-CIII-CIV.
- Рассчитать активность CIV путем вычета остаточной активности из значений, полученных после инъекции цитохром-с-восстановителей, аскорбиновой кислоты и TMPD (инъекция D).
- Представьте все результаты с помощью гистограмм, как показано на рисунке 4, для извлечения соответствующих выводов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, представленный здесь, позволяет анализировать in vivo митохондриальное дыхание путем выделения митохондрий из скелетных мышц мыши. Схема метода показана на рисунке 1. После рассечения скелетных мышц от задних конечностей (рисунок 2) ткани гомогенизируются, а митохондрии очищаются в изотонических условиях путем последовательных центрифугаций. Чистота различных фракций, полученных в процессе выделения, может быть проанализирована методом вестерн-блоттинга с использованием антител против различных маркеров органелл. На рисунке 3А показан общий профиль белка из различных фракций, показывающий различные белковые популяции в выделенных фракциях.
Рисунок 3B показывает, что все митохондриальное содержимое находится в митохондриальной фракции, о чем свидетельствуют сильные сигналы для маркеров внешних (VDAC и TOMM20) и внутренних (TIMM23) митохондриальных мембран и даже для нуклеоид-ассоциированных белков (mtTFA). Все ядра и цитоскелет (β-актин) присутствуют во фракции N, которая представляет собой ядра и неразорвавшийся материал (рисунок 3C). Более того, большая часть эндоплазматического ретикулума (ER) (Calnexin), плазматической мембраны (Na+/K+-ATPaseα1) или маркеров цитоплазмы (LDHA, HSP70 или AKT) остаются во фракциях SN1 или SN2, подчеркивая высокую чистоту, полученную при выделении (рисунок 3C). Тем не менее, есть несколько следов загрязнения ER в митохондриальной фракции, возможно, из-за близости этих органелл. Учитывая результаты, полученные в последующих дыхательных анализах, описанная здесь процедура выделения дает высокочистые, жизнеспособные митохондриальные препараты.
Анализы CA и BOX позволяют рассчитывать различные митохондриальные состояния в присутствии нескольких субстратов, которые стимулируют определенные метаболические пути. В частности, эти анализы проводятся в присутствии пировиноградной кислоты или пальмитоил-L-карнитина хлорида. Пировиноградная кислота является субстратом цикла Кребса; яблочная кислота является посредником цикла Кребса и индуктором NADH, в то время как пальмитоил-L-карнитин является субстратом пути окисления жирных кислот β. (Рисунок 4А,В). В обоих анализах первым состоянием, которое может быть измерено, является базальная скорость дыхания, которая представляет собой митохондриальное дыхание в присутствии субстратов, первоначально добавленных в среду анализа. Затем достигается митохондриальное состояние III, которое представляет собой выработку АТФ из АДФ и неорганического фосфата, показывая максимальное дыхание в связанном состоянии. Таким образом, происходит увеличение потребления кислорода после добавления АДФ, как видно на рисунке 4А,В.
Кроме того, состояние IVo указывает на утечку протонов, связанную с ингибированием АТФ-синтазы олигомицином, что приводит к снижению дыхания, как это наблюдается на графиках CA и BOX (рисунок 4A,B). Добавление FCCP приводит к состоянию IIIu, которое показывает максимальную дыхательную способность, которую митохондрии могут проявлять в несвязанном состоянии, когда потребление кислорода достигает самого высокого уровня в этих анализах. Чтобы рассчитать все эти состояния, необходимо сначала определить немитохондриальное дыхание, которое получается в конце анализа, когда антимицин А и ротенон вводятся для ингибирования окислительного дыхания. Как показано на рисунке 4A, B, эти значения должны быть всегда ниже базального дыхания и очень близки к нулю в случае анализов с изолированными митохондриями, как эти анализы, описанные здесь. Наконец, параметр RCR должен быть рассчитан для оценки целостности митохондрий. Он отражает, могут ли митохондрии реагировать на АДФ, производя АТФ с высокой скоростью с низкой утечкой протонов. Средние значения RCR, обнаруженные в анализах CA и BOX, составляли соответственно 5,78 ± 1,03 и 3,47 ± 0,42 (рисунок 4A,B), которые согласуются с оптимальными RCR, о которых сообщалось ранее21,22,23,24.
Кроме того, EFA исследует активность комплексов ETC по отдельности или в комбинации путем инъекции специфических субстратов и ингибиторов (рисунок 4C). Активность CI-CIV представляет собой митохондриальное дыхание на основе пируватных и малатовых субстратов, когда комплексы не ингибируются; в этом случае большая часть электронов проходит через CI. Поскольку ротенон является специфическим ингибитором CI, CI блокируется после его добавления, что приводит к снижению потребления кислорода (рисунок 4C). Активность CII-CIII-CIV проявляет дыхание, когда блокируется только CI, а CII активируется: сукцинат, вводимый через порт B, является специфическим субстратом комплекса II (сукцинатдегидрогеназа). Таким образом, CII восстанавливается, инициируя поток электронов от CII к CIV, в то время как CI все еще ингибируется предыдущей инъекцией ротенона, вызывая увеличение потребления кислорода (рисунок 4C). Добавление антимицина А ингибирует CIII, блокируя поток электронов через ЕТЦ и уменьшая потребление кислорода. Кроме того, активность CIV определяется, когда она стимулируется окислением цитохрома C после снижения добавлением аскорбиновой кислоты / TMPD; Рисунок 4C показывает, что активация CIV приводит к увеличению потребления кислорода. Наконец, остаточная активность относится к потреблению кислорода, когда окислительная цепь фосфорилирования инактивируется после добавления ротенона и антимицина А. Это значение устанавливает предпосылки для расчета активности комплексов, как указано на этапах протокола 2.2-2.4 в разделе 4.
Рисунок 1: Схематическая визуализация метода. Сокращения: OCR = норма потребления кислорода; АДФ = аденозиндифосфат; OL = олигомицин; FCCP = карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон; AntA = антимицин А; Гниль = ротенон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рассечение и выделение мышиных скелетных мышц из задних конечностей для анализа митохондриального дыхания. (А) Правую заднюю конечность растягивали и обездвиживали лентой. (B) Разрез был сделан через кожу рядом с лодыжкой, останавливаясь проксимально к колену. Соединительная ткань, покрывающая ТА, была аккуратно удалена. Сухожилия EDL (C) и TA (D) были разделены близко к их вставкам. Сухожилие TA было подтянуто вверх, чтобы облегчить мышцу вдали от подлежащей мускулатуры и кости. Затем ТА разрезали проксимально, близко к вентральному гребню к большеберцовой кости. Точно так же мышца EDL была ослаблена, а проксимальное сухожилие было тщательно разрезано сбоку от колена. (F) Правое заднее скольжение после рассечения ТА и ЭДЛ. (G) В задней задней конечности ахиллово сухожилие было разрезано для рассечения ГА и камбаловидных мышц. (H) ГА и камбала были тщательно освобождены от большеберцовой кости. (I) Оставшиеся мышцы были собраны от лодыжки до колена до тех пор, пока не остались только малоберцовая кость и большеберцовая кости. (J) Задний налим после рассечения. (K) Квадрицепс был препарирован. (L) Все скелетные мышцы собраны для задней митохондриальной изоляции. Процесс был выполнен для обеих задних конечностей. Сокращения: TA = большеберцовая кпереди; EDL = разгибатель digitorum longus; GA = икроножная мышца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Чистота процесса фрагментации. (А) Общий профиль белка окрашивается синим coomassie. (B) Профиль чистоты митохондриального белка. (C) Немитохондриальные маркеры. Различные фракции, полученные при выделении митохондрий, нагружали и инкубировали антителами против различных белков в специфических субклеточных фракциях. Сокращения: фракция N = негомогенизированная ткань и ядра; SN1 = надводный номер 1: цитоплазма + органеллы; SN2 = надводный номер 2: цитоплазма + органеллы; VDAC = зависимый от напряжения анионный канал; TOMM20 = транслоказ наружной митохондриальной мембраны 20; mtTFA = фактор митохондриальной транскрипции А; TIMM23 = транслоказ внутренней митохондриальной мембраны 23; LDHA = лактатдегидрогеназа А; HSP70 = белок теплового шока 70; ER = эндоплазматический ретикулум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты. Биоэнергетическое профилирование митохондрий, выделенных из мышц задних конечностей 13-месячного самца дикой мыши типа C57BL/6N. Точки инъекции различных субстратов и ингибиторов указаны в каждом анализе. Производительность машин ETC и OXPHOS может быть проанализирована с использованием пирувата и малата, или пальмитоил-L-карнитина и малата в качестве субстратов в анализе связи (A) или β окислении анализов FA (B), соответственно. (C) Анализ потока электронов позволяет изучать отдельные митохондриальные комплексы в присутствии пирувата, малата и FCCP; 10 мкг митохондрий были покрыты на лунку. Результаты отображаются после параметра представления средней точки для визуализации результатов в агрегированной форме. Это контрастирует с опцией «точка-точка», которая позволит визуализировать 9 последовательных измерений, обычно выполняемых на каждом этапе измерения. Тип визуализации может быть изменен после завершения анализа в параметрах кинетической линейной диаграммы в аналитическом программном обеспечении. Сокращения: FA = жирные кислоты; OCR = норма потребления кислорода; АДФ = аденозиндифосфат; FCCP = карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон; RCR = коэффициент контроля дыхания; EFA = анализ потока электронов; BOX = β окисления ФА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Анализ сцепления | ||||||
| Порт | Ингибитор | [Сток] | [Инжекционный порт] | [Финал] | Рецепт | |
| Инхиб | КАМ-БСА | |||||
| A | АДП | 100 мМ | 50 мМ | 5 мМ | 650 мкл | 650 мкл |
| B | Олигомицин | 4 мМ | 31.6 мкМ | 3.16 мкМ | 11.3 мкл | 1418.7 мкл |
| C | ФКИП | 20 мМ | 60 мкМ | 6 мкМ | 4.68 мкл | 1555.32 мкл |
| D | Антимицин А // Ротенон | 5 мМ // 4 мМ | 40 мкМ // 50 мкМ | 4 мкМ // 5 мкМ | 13,52 мкл // 21,12 мкл | 1655.36 мкл |
| Анализ потока электронов | ||||||
| Порт | Ингибитор | [Сток] | [Инжекционный порт] | [Финал] | Рецепт | |
| Инхиб | ЭФАМ-БСА | |||||
| A | Ротенон | 4 мМ | 50 мкМ | 5 мкМ | 16.25 мкл | 1283.7 мкл |
| B | Сукцинат | 500 мМ | 100 мМ | 10 мМ | 286 мкл | 1144 мкл |
| C | Антимицин А | 5мМ | 4 мкМ | 4 мкМ | 12.48 мкл | 1547.5 мкл |
| D | Аскорбат // TMPD | 1 м // 50 мМ | 100 мМ // 1 мМ | 10 мМ // 100 мкМ | 169 мкл // 33.8 мкл | 1487.2 мкл |
| Анализ на окисление β | ||||||
| Порт | Ингибитор | [Сток] | [Инжекционный порт] | [Финал] | Рецепт | |
| Инхиб | БОКС-БСА | |||||
| A | АДП | 100 мМ | 40 мМ | 4 мМ | 520 мкл | 780 мкл |
| B | Олигомицин | 4 мМ | 31.6 мкМ | 3.16 мкМ | 11.3 мкл | 1418.7 мкл |
| C | ФКИП | 20 мМ | 60 мкМ | 6 мкМ | 4.68 мкл | 1555.32 мкл |
| D | Антимицин А // Ротенон | 5 мМ // 4 мМ | 40 мкМ // 20 мкМ | 4 мкМ // 2 мкМ | 13,52 мкл // 8,45 мкл | 1668 мкл |
Таблица 1: Приготовление растворов ингибиторов для различных анализов. Столбец [Stock] показывает концентрации исходных растворов соединения, указанные в колонке Ингибитор . [Инжекционный порт] относится к концентрации растворов ингибиторов, которые должны быть загружены в различные порты картриджа, в то время как колонка [Final] указывает конечную концентрацию ингибиторов в скважинах. Наконец, в столбцах Recipe указываются объемы растворов ингибиторов и сред без BSA, которые необходимо смешать для подготовки растворов, загружаемых в инжекционные отверстия. Сокращения: АДФ = аденозиндифосфат; FCCP = карбонилцианид-п-трифторметоксифенилгидразон; TMPD = N,N,N',N'-тетраметил-пара-фенилен-диамин; Inhib = ингибитор; BSA = бычий сывороточный альбумин; CAM-BSA = среда анализа связи без BSA; EFAM-BSA = BSA-среда анализа потока свободных электронов; BOX-BSA = BSA-свободный β-окисление среды для анализа жирных кислот.
| Порт | Объем впрыскивается | Подготовлен запас (26 скважин) |
| A | 50 мкл | 1300 мкл |
| B | 55 мкл | 1430 мкл |
| C | 60 мкл | 1560 мкл |
| D | 65 мкл | 1690 мкл |
Таблица 2: Расчет объемов впрыска.
| Действие | Время (минуты) | Повторение | Порт |
| Калибровать | 15-20 | ||
| Ждать | 10 | ||
| Микс + Ожидание | 1 + 3 | × 2 | |
| Смешивать | 1 | ||
| Мера + Микс | 3 + 1 | × 2 | |
| Впрыскивать | A | ||
| Смешивать | 1 | ||
| Измерять | 3 | ||
| Смешивать | 1 | ||
| Впрыскивать | B | ||
| Смешивать | 1 | ||
| Измерять | 3 | ||
| Смешивать | 1 | ||
| Впрыскивать | C | ||
| Смешивать | 1 | ||
| Измерять | 3 | ||
| Смешивать | 1 | ||
| Впрыскивать | D | ||
| Микс + Мера | 1 + 3 | × 2 |
Таблица 3: Параметры протокола для различных анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Все методы, используемые для изучения митохондриального дыхания, имеют свои ограничения; следовательно, крайне важно выбрать метод, который наилучшим образом соответствует конкретному экспериментальному вопросу. Эта работа предоставляет обновленный и подробный протокол для изоляции митохондрий от скелетных мышц мыши для выполнения различных дыхательных анализов для исследования функции митохондрий. Действительно, изучение митохондриальной биоэнергетики в изолированных митохондриях с использованием технологий на основе микропластин ценно для изучения тканеспецифического дыхания с точки зрения воспроизводимости, надежности и сложности. Кроме того, использование изолированных митохондрий дает контроль над доступностью субстрата, облегчая понимание основных биологических процессов. Другим положительным аспектом использования изолированных митохондрий является то, что можно изучать состояние III, потому что АТФ, генерируемая после инъекции АДФ, не превращается снова в новую АДФ, поскольку большая часть трансмембранных АТФаз теряется. Более того, в анализах, описанных здесь, олигомицин добавляют для блокирования потенциального неспецифического синтеза АТФ20.
В связи с этим протоколом необходимо выделить ряд важных соображений. Во-первых, изолированные митохондрии чрезвычайно чувствительны и должны обрабатываться с осторожностью. Высокое содержание сахарозы и маннитола в используемых буферах обеспечивает оптимальные осмотические условия для защиты изолированных митохондрий от повреждений. Тем не менее, продолжительность анализа должна быть сведена к минимуму, чтобы сохранить жизнеспособность митохондрий и предотвратить отслоение от микропластины после посева. Таким образом, учитывая, что протокольные этапы, такие как приготовление пробирных сред и растворов субстрата и ингибиторов или загрузка ингибиторов в респирометрический картридж, являются трудоемкими, каждый шаг должен быть идеально скоординирован. Кроме того, в отличие от других способов, основанных на ферментативном сбраживании21,24 и гомогенизации раствора и пестика17,19,21,23,24, описанный здесь способ основан на использовании автоматизированного гомогенизатора, обеспечивающего быструю и эффективную гомогенизацию образца. Важно отметить, что митохондриальные суспензии менее чувствительны, если они высококонцентрированы. Таким образом, только готовьте разведения непосредственно перед их использованием. Наконец, важно быстро работать во время собственно респирометрического анализа. Обычно при анализе клеток в культуре в этих анализах выполняют три последовательных этапа измерения после инъекции субстратов или ингибиторов, что приводит к протоколам, которые простираются от 40 до 50 мин., Чтобы обеспечить жизнеспособность изолированных митохондрий на протяжении всей процедуры, количество этапов измерения часто сводится к минимуму из-за их уязвимости19, 23,25, сокращая время, необходимое для завершения респирометрического анализа, до ~20 мин. Протоколы, описанные в этой работе (таблица 3), следуют этой тенденции, хотя другие ранее опубликованные методы сообщают об эффективных профилях OCR с более длинными и более стандартными шагами измерения26.
Например, если два последовательных анализа будут проводиться с одним и тем же набором образцов в один и тот же день, подготовьте все реагенты для второго анализа во время первого, за исключением митохондриальных разведений: только разбавление, посев и вращение митохондрий непосредственно перед началом второго анализа, пока инструмент калибруется. После завершения эксперимента необходимо рассчитать параметр RCR (раздел 4, этап 1.7) для оценки качества используемых митохондриальных препаратов. Обычно значения RCR между 3,5 и 5 означают, что митохондриальная целостность является оптимальной и показывает функциональное связанное окислительное дыхание25. Анализы с более низкими значениями RCR должны быть отброшены, потому что целостность митохондрий была нарушена во время изоляции. В этих случаях рассмотрите возможность промывки митохондриальной гранулы дважды (раздел 2, этапы 19-21)22, как сообщалось ранее.
Во-вторых, поддержание правильного рН на протяжении всей процедуры имеет решающее значение для получения успешных результатов. Убедитесь, что pH всех растворов установлен в соответствии с указаниями, то есть pH 7,2, и что pH всегда корректируется с koH, если не указано иное. Примечательно, что pH буферов, содержащих BSA, не следует измерять непосредственно с помощью pH-метра, поскольку BSA может повредить зонд. Таким образом, отрегулируйте pH в соответствующих буферах перед добавлением BSA. Чтобы избежать изменений рН из-за добавления BSA, всегда используйте FFA BSA. Кроме того, некоторые сверхчистые партии H2O могут быть кислыми, поэтому рекомендуется использовать коммерчески очищенный, pH 7 H2O. Кроме того, необходимо убедиться, что рН-метр правильно откалиброван и что он является подходящей моделью для измерения рН химических веществ, подлежащих подготовке.
В-третьих, крайне важно правильно выполнить этап сбора образцов для измерения белка конечной митохондриальной суспензии (раздел 2, шаг 21), чтобы предотвратить разрушение митохондрий. Быстро, но тщательно повторно суспендируйте гранулу, соберите аликвоту и добавьте FFA BSA к оставшейся суспензии, чтобы сохранить осмотический баланс и защитить митохондрии от повреждений. Если бы FFA BSA уже присутствовали в буфере ресуспенсии и, таким образом, во время количественной оценки белка, высокое содержание белка спутало бы результаты количественной оценки. Вот почему FFA BSA должен быть добавлен после того, как аликвота будет отложена для количественной оценки.
В-четвертых, этот метод очень универсален и может быть адаптирован к потребностям экспериментатора. Например, если исследуемая животная модель характеризуется уменьшением мышечной массы (например, саркопенические мыши), дополнительные мышцы могут увеличить выход митохондрий. Хотя в этой работе использовался взрослый самец мыши C57BL/6N дикого типа, вместо этого могут быть использованы животные любого пола, возраста или генетического фона, а также определенных типов мышц.
В-пятых, дыхательные значения могут отличаться между экспериментами из-за незначительных вариаций в составе буферов и реагентов, которые нужно каждый раз готовить свежими. Возраст, пол, генетический фон или условия окружающей среды также могут оказать глубокое влияние на результаты. Однако успешный эксперимент должен представлять увеличение потребления кислорода после инъекции сложных субстратов, таких как АДФ и сукцинат, снижение после инъекции ингибиторов, таких как олигомицин или ротенон, и заметное увеличение при добавлении мощного разъединителя FCCP. Кроме того, чтобы предотвратить высокую техническую изменчивость, обеспечьте тщательное повторное суспендирование митохондриальных гранул для получения однородных суспензий перед посевом их в микропластину.
В-шестых, если базальные дыхательные значения низкие, рассмотрите возможность проведения эксперимента по титрованию, чтобы скорректировать количество белка для посева. Наконец, поскольку эта работа обеспечивает метод получения сырых митохондриальных экстрактов, ожидается определенный сорт примесей, связанных с другими органеллами, в основном ER. Более агрессивный процесс фрагментации для удаления этих примесей нанес бы ущерб жизнеспособности митохондрий, препятствуя выполнению дыхательных анализов. Если чистота вызывает беспокойство, особенно если она не согласуется между образцами, результаты анализа могут быть нормализованы относительно чистоты митохондрий после запуска западных пятен против различных маркеров органелл (рисунок 3). Насколько нам известно, это первый метод, который подчеркивает опасения по поводу чистоты митохондрий в сырых экстрактах. Обычно в других протоколах респирометрических анализов с изолированными митохондриями такое же количество белкового экстракта высевают в лунки для сравнения образцов, предполагая, что во всех случаях используется одинаковое количество митохондрий. Это разумное предположение, учитывая, что изоляция выполняется параллельно во всех образцах. Однако генетический или экологический фон исследуемых образцов может привести к значительным различиям в чистоте митохондриальных экстрактов. Например, если данная генетическая мутация вызывает повышенное развитие цитоплазматической ЭР, сырые митохондриальные экстракты этих животных могут содержать большее, чем ожидалось, содержание ER и, следовательно, более низкое, чем ожидалось, митохондриальный белок. Таким образом, даже если одинаковое количество общего белка из контрольных и мутантных образцов будет посеяно в микропластину, потребление кислорода мутантами будет недооценено. Следовательно, рекомендуется определить чистоту экстрактов всех исследуемых условий. Если значения сопоставимы, нормализация не требуется. Однако, если значения чистоты среди образцов значительно отличаются от статистической погрешности, которую экспериментатор готов принять, их следует использовать для нормализации результатов потребления кислорода.
Настоящий протокол имеет некоторые ограничения. Следует отметить, что этот метод был оптимизирован для скелетной мышечной ткани, выделенной у мышей. Возможно, потребуется внести коррективы при использовании разных тканей или скелетных мышц разных видов. Кроме того, когда анализы выполняются на изолированных митохондриях, нормальное клеточное микросредотерия теряется из-за отсутствия клеточного контекста и других органелл, которые могли бы взаимодействовать с митохондриями. Это может привести к результатам, которые немного отклоняются от физиологических условий. Наконец, когда митохондрии центрифугируются, они прилипают ко дну лунок. Хотя это совершенно необходимо, потенциальное влияние центрифугирования на их нормальное состояние неизвестно.
Важно учитывать, что после выполнения респирометрических анализов снижение потребления кислорода, связанного с АТФ-связанным или FCCP-стимулируемым дыханием в изолированных митохондриях, может указывать на потенциальные митохондриальные изменения, которые могут быть объяснены 20: 1) ограниченным транспортом субстратов через внутреннюю митохондриальную мембрану, 2) снижением активности ферментов, участвующих в реакциях ограничения скорости специфических метаболических путей, таких как ВНЕЗЕМНЫЕ цивилизации, цикл Кребса, или β-окисление, или 3) нарушение функции внеземных цивилизаций, среди других возможных объяснений.
Таким образом, обновленный метод, описанный здесь, представляет собой адекватный и надежный способ оценки функции ETC и OXPHOS из скелетной мышечной ткани. Он имеет несколько применений для оценки того, как генетические модификации или окружающая среда могут повлиять на митохондриальное дыхание, способствующее определенному фенотипу. Примечательно, что настоящий протокол может быть адаптирован к другим модельным организмам или использоваться с образцами человека для оценки потенциальных митохондриальных дисфункций, связанных с заболеваниями человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить Juan J. Tena за использование гомогенизатора и объектов CABD Proteomics and Animal Farming за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством образования, культуры и спорта Испании через стипендию FPU16/03264 для J.D.H.C., Ассоциацию Française contre les Myopathies (AFM) через стипендиальный грант No 22450 для C.V.-G., институциональный грант MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Департамент регуляции генов и морфогенеза в CABD) и BFU2017-83150-P для J.J.C. Грант Хунты Андалусии P18-RT-4572, Программа финансирования FEDER от Европейского Союза и Министерство науки, инноваций и университетов Испании предоставляют RED2018-102576-T P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al.
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
