Summary
Här beskriver vi en detaljerad metod för mitokondriisolering från musskelettmuskeln och den efterföljande analysen av andning med oxygen consumption rate (OCR) med hjälp av mikroplattbaserade respirometriska analyser. Denna pipeline kan tillämpas för att studera effekterna av flera miljömässiga eller genetiska ingrepp på mitokondriell metabolism.
Abstract
Det mesta av cellens energi erhålls genom nedbrytning av glukos, fettsyror och aminosyror genom olika vägar som konvergerar på mitokondriell oxidativ fosforylering (OXPHOS) -systemet, som regleras som svar på cellulära krav. Lipidmolekylen Koenzym Q (CoQ) är väsentlig i denna process genom att överföra elektroner till komplex III i elektrontransportkedjan (ETC) genom konstanta oxidations- / reduktionscykler. Mitokondriernas status och i slutändan cellulär hälsa kan bedömas genom att mäta ETC-syreförbrukning med hjälp av respirometriska analyser. Dessa studier utförs vanligtvis i etablerade eller primära cellinjer som har odlats i flera dagar. I båda fallen kan de erhållna andningsparametrarna ha avvikit från normala fysiologiska förhållanden i ett givet organ eller vävnad.
Dessutom hindrar de inneboende egenskaperna hos odlade enskilda fibrer isolerade från skelettmuskeln denna typ av analys. Detta dokument presenterar ett uppdaterat och detaljerat protokoll för analys av andning i nyligen isolerade mitokondrier från musskelettmuskeln. Vi tillhandahåller också lösningar på potentiella problem som kan uppstå när som helst i processen. Metoden som presenteras här kan tillämpas för att jämföra syreförbrukningshastigheter i olika transgena musmodeller och studera mitokondriellt svar på läkemedelsbehandlingar eller andra faktorer som åldrande eller kön. Detta är en genomförbar metod för att svara på avgörande frågor om mitokondriell bioenergetik metabolism och reglering.
Introduction
Mitokondrier är de primära metaboliska organellerna i cellen1. Dessa specialiserade membranslutna organeller använder näringsmolekyler för att producera energi i form av adenosintrifosfat (ATP) av OXPHOS. Denna process bygger på överföring av elektroner från givarmolekyler i en serie redoxreaktioner i ETC2. Q är den enda redoxaktiva lipiden som produceras endogent i alla cellulära membran och cirkulerande lipoproteiner som visar antioxidantfunktion3. Det är en väsentlig komponent i ETC, som överför elektroner från NADH-beroende komplex I och FADH2-beroende komplex II till komplex III, även om många andra reduktaser kan driva minskningen av mitokondriell q till ubiqinol som ett obligatoriskt steg i flera cellulära metaboliska vägar4,5.
Under hela processen skapas en elektrokemisk protongradient över det mitokondriella inre membranet, som omvandlas till biologiskt aktiv energi av ATP-syntaskomplexet V2. Följaktligen leder mitokondriell dysfunktion till en myriad av patologiska tillstånd som huvudsakligen påverkar vävnader med höga energibehov - hjärnan, hjärtat och skelettmuskeln6,7. Därför är det grundläggande att utveckla metoder för att noggrant analysera mitokondriella bioenergetik för att undersöka dess roll i hälsa och sjukdom, särskilt i mycket energiska vävnader som skelettmuskler.
Syreelektroden av Clark-typ har klassiskt använts i studien av mitokondriell andning8. Detta system har dock gradvis förskjutits av tekniker med högre upplösning, med mikroplattbaserad syreförbrukningsteknik som Agilent Seahorse XF-analysatorer som är särskilt populära9. Inom skelettmuskelfältet utförs dessa studier vanligtvis i odlade celler, främst i C2C12 odödliggjord mus myoblastcellinje eller primära kulturer härledda från satellitceller10,11. Dessa studier rekapitulerar emellertid inte helt situationen in vivo, särskilt när man undersöker mitokondriell biologi och funktion på vävnadsnivå vid specifika förolämpningar, icke-genetiska ingrepp eller genetiska manipulationer.
Dessutom är andningsanalyser i celler mer komplexa på grund av ytterligare faktorer, inklusive extramitokondriell efterfrågan på ATP- och analyssubstrat eller signalhändelser, vilket kan vilseleda tolkningen av resultaten. Alternativt är det också möjligt att använda singel eller buntar av nyisolerade myofibrer från muskler. Isoleringsmetoden är dock tekniskt utmanande och endast genomförbar för några få muskeltyper. I detta fall används flexor digitorum brevis (FDB) och extensor digitorum longus (EDL) muskler huvudsakligen10,12,13, även om några rapporter beskriver användningen av andra muskeltyper också14,15.
Bioenergetisk profilering av skelettmuskelsektioner har också rapporterats16. Den stora fördelen med denna metod är att intakta muskler kan studeras (författarna visar att skivning genom fibrer inte stör resultaten jämfört med isolerade myofibrer). Mitokondriell tillgång till substrat och analyshämmare är dock begränsad, och således kan endast ett fåtal parametrar mätas16. Slutligen kan isolerade mitokondrier också användas9,17,18,19. I detta fall förlorar mitokondrier sin cytosoliska miljö, vilket kan påverka deras funktion. Däremot garanterar denna metod tillgång till substrat och hämmare, möjliggör analys av en uppsjö av provtyper och kräver vanligtvis mindre material.
Denna uppsats beskriver en metod för att utföra bioenergetisk profilering av isolerade mitokondrier från musskelettmuskeln med hjälp av mikroplattbaserade respirometriska analyser (Figur 1). I synnerhet är tre protokoll detaljerade: kopplingsanalysen, CA för att bedöma graden av koppling mellan ETC och OXPHOS-maskinen; Elektronflödesanalysen, EFA för att mäta aktiviteten hos de enskilda ETC-komplexen. och BOX-analysen för att bestämma mitokondriell β oxidationskapacitet. I synnerhet krävs endast små mängder prover jämfört med konventionella respirometrimetoder. Isoleringsprotokollet som används här har modifierats från den metod som publicerats på annat håll18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mushus och vävnadsinsamling utfördes med hjälp av protokoll som godkänts av Universidad Pablo de Olavide etikkommitté (Sevilla, Spanien; protokoll 24/04/2018/056 och 12/03/2021/033) i enlighet med spanskt kungligt dekret 53/2013, europeiskt direktiv 2010/63/EU och andra relevanta riktlinjer.
1. Beredning av lager, buffertar och reagenser för andningsanalyser
- Förbered följande lagerlösningar, som kan förvaras vid den angivna temperaturen i månader. Använd ultrarent H2O i alla fall.
- Lös upp fosfatbuffrade saltlösningstabletter (PBS) i H2O (1 tablett per 200 ml H2O) för att bereda 1x PBS. Autoklavera lösningen och förvara den vid rumstemperatur (RT).
- Lös upp 2 g NaOH-pellets i 50 ml H2O för att bereda 1 M NaOH.
- Förbered 0,1 M, 1 M, 5 M och 10 M KOH-lager för pH-kalibrering.
- Tillsätt 14,612 g EDTA till 70 ml H2O. Tillsätt NaOH-pellets tills pH når 8,0 så att EDTA helt löses upp. Tillsätt H2O quantum satis (QS) till 100 ml. Autoklavera den resulterande 0,5 M EDTA-lösningen (pH 8) och lagra den på RT.
- Tillsätt 19 g EGTA till 70 ml H2O. Tillsätt NaOH-pellets tills pH når 8,0 så att EGTA kan lösas upp helt. Lägg till H2O QS till 100 ml. Autoklavera den resulterande 0,5 M EGTA-lösningen (pH 8) och förvara den vid RT.
- Tillsätt 2 ml 0,5 M EDTA till 98 ml PBS. Förvara den resulterande 10 mM EDTA/PBS-lösningen vid RT.
- Lös upp 5,958 g HEPES i 40 ml H2O. Justera pH till 7,2 med KOH och QS till 50 ml med H2O. Filtrera den resulterande 0,5 M HEPES-bufferten genom ett 0,45 μm nät och förvara den vid RT.
- Lös upp 3,402 g KH2PO4 i upp till 50 ml H2O. Filtrera den resulterande 0,5 M KH2PO4-lösningen genom ett 0,45 μm nät och förvara den vid RT.
- Lös upp 9,521 g vattenfri MgCl2 i upp till 100 ml H2O. Autoklav den resulterande 1 M MgCl2-lösningen och förvara den vid RT.
OBS: Eftersom detta är en exoterm reaktion, fortsätt med försiktighet och lös upp MgCl2 på is.
- Bereda substrat- och hämmarsubstratlösningar (se tabell 1). Aliquot och förvara dem vid -20 °C. Undvik frys-tina cykler. Som ett undantag, förbered alltid pyruvsyra omedelbart före användning.
- Förbered dig i ultrarena H2O: 0,5 M succinat, 0,5 M pyruvsyra, 0,5 M äppelsyra, 100 mM ADP, 1 M askorbinsyra och 50 mM N,N,N′,N′-tetrametyl-para-fenylen-diamin (TMPD) (skydda mot ljus).
- Bered i 100% dimetylsulfoxid (DMSO): 50 mM palmitoyl-L-karnitin, 4 mM rotenon, 20 mM karbonylcyanid-p-trifluormetoxifenylhydrazon (FCCP), 4 mM oligomycin och 5 mM Antimycin A.
OBS: Överskrid inte 0,1% slutlig DMSO-koncentration i mikroplattbrunnarna. Förbered därför högkoncentrerade stamlösningar för att hålla dig under denna gräns.
- Förbered buffertarna för mitokondriisolering och proteinkvantifiering nyligen på experimentdagen. Använd ultrarent H2O i alla fall och håll alla buffertar på is om inget annat anges.
OBS: För att spara tid kan alla reagenser vägas och förvaras i lämpliga behållare (t.ex. 15 ml rör) vid rätt temperatur föregående dag.- För att bereda 10% fria fettsyror (FFA) BSA, lös noggrant 150 mg FFA BSA i 1,5 ml H2O genom inversion / roterande hjul. Virvla inte för att undvika skumning.
- För att förbereda 1x Bradford-reagens, späd den 5x kommersiella stamlösningen med H2O och håll den i mörkret vid RT.
- För att förbereda 8x Mitokondrier Buffer (MB), lös upp 4,112 g sackaros och 763 mg HEPES i 15 ml H2O. Justera pH till 7,2, tillsätt 1,6 ml 10% FFA BSA och QS till 20 ml med H2O.
- För att förbereda 20 ml isolationsbuffert 1 (IB1) (4 ml används per prov), lös upp 400 μL av 0,5 M EDTA, 784 mg D-mannitol och 2,5 ml 8x MB i 15 ml H2O. Justera pH till 7,2 och QS med H2O.
- För att förbereda 5 ml isolationsbuffert 2 (IB2) (500 μL används per prov), lös upp 30 μL av 0,5 M EGTA, 196 mg D-mannitol och 625 μL av 8x MB i 4 ml H2O. Justera pH till 7,2 och QS med H2O.
- För att bereda 5 ml resuspensionsbuffert (RB) (200 μL används per prov), lös upp 120 mg sackaros, 191,3 mg D-mannitol, 50 μL 0,5 M HEPES och 10 μL 0,5 M EGTA i 4 ml H2O. Justera pH till 7,2 och QS med H2O.
- För att bereda 2x mitokondriell analyslösning-1 (MAS-1), lös upp 1,199 g sackaros, 2,8 g mannitol, 1 ml 0,5 M KH2PO4, 250 μL 1 M MgCl2, 200 μL 0,5 M HEPES och 100 μL 0,5 M EGTA i 20 ml H2O. Justera pH till 7,2 och QS till 25 ml med H2O. Håll i is under korta perioder. Under längre perioder, håll den vid 4 ° C för att undvika nederbörd.
- För att förbereda 1x Kopplingsanalysmedium (CAM), förbered två olika MAS-1-baserade buffertar: 1) CAM + BSA för CA-analysen korrekt och 2) CAM-BSA för beredning av analyshämmarna. Håll alltid pyruvat:malat-förhållandet på 10:1.
OBS: Eftersom BSA kan täppa till injektionsportarna, späd hämmarna i BSA-fri CAM.- För att bereda CAM + BSA, späd 300 μL 0,5 M pyruvsyra, 30 μL 0,5 M äppelsyra och 7,5 ml 2x MAS-1 i 6 ml H2O. Justera pH till 7,2. Tillsätt 300 μL 10% FFA BSA och QS till 15 ml med H2O.
- För att bereda CAM-BSA, späd 120 μL 0,5 M pyruvsyra, 12 μL 0,5 M äppelsyra och 3 ml 2x MAS-1 i 2 ml H2O. Justera pH till 7,2 och QS till 6 ml med H2O.
- För att förbereda 1x Electron Flow Assay medium (EFAM), förbered både BSA-innehållande och BSA-fria EFAM-buffertar.
- För att bereda EFAM + BSA, späd 300 μL 0,5 M pyruvsyra, 60 μL 0,5 M äppelsyra, 3 μL 20 mM FCCP och 7,5 ml 2x MAS-1 i 6 ml H2O. Justera pH till 7,2. Tillsätt 300 μL 10% FFA BSA och QS till 15 ml med H2O.
- För att bereda EFAM-BSA, späd 120 μL 0,5 M pyruvsyra, 24 μL 0,5 M äppelsyra, 1,2 μL 20 mM FCCP och 3 ml 2x MAS-1 i 2 ml H2O. Justera pH till 7,2 och QS till 6 ml med H2O.
- För att bereda 1x β oxidationsmedium (BOXM), förbered BSA-innehållande och BSA-fria BOXM-lösningar.
- För att bereda BOXM + BSA, späd 12 μL 50 mM palmitoyl-L-karnitin, 30 μL 0,5 M äppelsyra och 7,5 ml 2x MAS-1 i 7 ml H2O. Justera pH till 7,2. Tillsätt 300 μL 10% FFA BSA och QS till 15 ml med H2O.
- För att bereda BOXM-BSA, späd 4,8 μL 50 mM palmitoyl-L-karnitin, 12 μL 0,5 M äppelsyra och 3 ml 2x MAS-1 i 2 ml H2O. Justera pH till 7,2 och QS till 6 ml med H2O.
2. Muskeldissektion, homogenisering och mitokondriell isolering
- Placera alla material och buffertar på is. Se till att allt material är iskallt under hela proceduren för att skydda mitokondrier från skador.
- Placera tre 50 ml bägare per prov på is och tillsätt följande lösningar: 10 ml PBS i bägare 1, 10 ml 10 mM EDTA / PBS i bägare 2 och 4 ml IB1 i bägare 3.
- Avliva musen genom cervikal förskjutning. Undvik CO2-eutanasi eftersom skelettmusklerna kan bli hypoxiska och störa andningsanalyserna.
- Spraya höger bakben med 70% etanol för att förhindra att päls tappar och tejpa lemmen på korkdissektionsskivan. Tejpa vänster framben också.
- Gör ett snitt med en steril engångsskalpell genom huden från knä till tå.
- Ta tag i huden med tandade pincett på fotledsnivå och skär den med fin sax runt fotleden.
- Lätta huden bort från den underliggande muskulaturen med en pincett med fin spets i ena handen medan du drar upp den med tandade pincett i den andra handen.
- Dissekera alla skelettmuskler från fotled till knä (Figur 2).
- Ta bort all bindväv över tibialis främre (TA) muskel för att underlätta muskelextraktion med fin pincett och sax.
- Hitta de fyra distala senorna i EDL-muskeln och sektionera dem nära deras insättningar i tårna. Leta reda på TA-distala senan och skär den nära dess införande, alltid under fotleden.
- Dra försiktigt TA- och EDL-senorna ovanför fotleden för att frigöra de lösa ändarna.
- Ta tag i de lösa ändarna av senorna och lätta musklerna bort från resten av muskulaturen och benen genom att dra upp dem. Använd fin pincett eller sax för att underlätta processen. Fortsätt med försiktighet för att undvika myofiberkontraktion.
- Skär den proximala senan i EDL och TA-muskeln så nära knäskålen som möjligt.
- Vänd musen upp och ner för att fortsätta med gastrocnemius (GA) och soleus muskelextraktion.
- Greppa fickan som bildas mellan biceps femoris och GA med tandade pincett. Använd fin sax för att separera dessa muskler och visualisera den proximala GA-senan.
- Ta tag i hälsenena med fina pincett och klipp den försiktigt med en fin sax. Släpp GA- och soleusmusklerna från det underliggande benet genom att dra upp dem genom senorna. Skär den proximala GA-senan som frigör den tillsammans med den underliggande soleusen.
- Dissekera försiktigt de återstående musklerna från sena till sena efter samma procedur tills endast ben återstår.
- Fäst musen igen i det ursprungliga läget för att dissekera quadricepsmuskeln.
- Kasta fettvävnaden över quadriceps på den proximala sidan med tandade pincett och fin sax.
- Sätt in fin pincett mellan quadriceps och lårbenet och flytta dem i båda riktningarna längs lårbensaxeln för att separera muskeln från benet.
- Ta tag i de distala quadricepsmuskelsenorna med tandade pincett och skär senan med fin sax så nära knäskålen som möjligt.
- Dra upp quadriceps och frigör den vid den proximala insättningen med fin sax.
- Upprepa steg 4-8 från det här avsnittet med vänster bakben.
- Skölj alla muskler i Bägare 1 först och sedan i Bägare 2.
- Överför alla muskler till Beaker 3 och finhacka alla muskler med vass sax på is.
- Överför suspensionen till ett C-rör (lila lock), håll den alltid i is.
- Stäng C-röret ordentligt och fäst det upp och ner på homogenisatorns hylsa. Se till att provmaterialet finns i rotatorns/statorns område. Välj det 1-minuters program som heter m_mito_tissue_01.
- Dela homogenatet i två 2 ml förklämda mikrocentrifugrör och centrifug vid 700 × g i 10 min vid 4 °C i en bordscentrifug.
- Överför supernatanterna till nya 2 ml förklämda rör, undvik försiktigt fett och icke-homogeniserad vävnad. Förvara pelletsen vid -80 °C för bestämning av fragmenteringens renhet (fraktion N) (figur 3).
- Centrifugera supernatanterna vid 10 500 × g i 10 min vid 4 °C.
- Överför supernatanterna till nya 2 ml förklämda rör och märk dem som Supernatant Number 1 (SN1). Förvara dem vid -80 °C för bestämning av fragmenteringsrenhet (figur 3).
- Resuspend och kombinera båda pelletsna i en total volym av 500 μL IB2 i is.
- Centrifug vid 10 500 × g i 10 min vid 4 °C.
- Överför supernatanten till ett nytt 2 ml förklämt rör och märk det som Supernatant Number 2 (SN2). Förvara den vid -80 °C för bestämning av fragmenteringsrenhet (figur 3).
- Resuspend den slutliga mitokondriella pelleten i 200 μL RB. Lägg snabbt åt sidan 10 μL för proteinkvantifiering och tillsätt omedelbart 10 μL 10% FFA BSA till den återstående mitokondriella suspensionen för att förhindra skador.
- Bestäm proteinkoncentrationen med Bradford-analysen.
- För standardkurvan, bereda 30 μL seriella utspädningar av känd koncentration av ett protein i RB-buffert. Använd till exempel 1 mg / ml, 0,5 mg / ml, 0,25 mg / ml, 0,125 mg / ml, 0,0625 mg / ml och 0 mg / ml BSA.
- Förbered 1:3 och 1:6 seriella utspädningar av mitokondriella prover i RB-bufferten.
- I en 96-brunns platt bottenplatta, ladda först 2,5 μL prov / standard per brunn. Tillsätt sedan 10 μL 1 M NaOH till varje prov och slutligen 200 μL 1x Bradford-reagens. Blanda väl och undvik luftbubblor. Kontrollera visuellt att färgen på proverna ligger inom kalibreringslinjen. Utför alltid analysen i tre exemplar.
- Inkubera plattorna i 5 min vid RT i mörkret och läs absorbansen vid 595 nm i en mikroplattspektrofotometer.
- Beräkna standardkurvan genom att plotta absorbansvärdena (y-axeln) jämfört med motsvarande proteinkoncentration för de utspädningar som framställts i steg 22.1 i detta avsnitt (x-axeln).
- Beräkna den totala mängden protein i mitokondriella prover genom extrapolering med standardkurvan.
3. Beredning av mikroplattbaserade respirometriska analyser
- Hydrera den respirometriska analyssensorn minst 12 timmar före experimentet med 1 ml kalibreringsbuffert per brunn. Inkubera vid 37 °C (ingen CO2).
OBS: Hydratiserade sensorer kan användas i upp till 72 timmar. Patronen ska hanteras försiktigt under detta steg: om något berör sensorerna kan mätkänsligheten påverkas. - Förbered den preparativa centrifugen med den svängande skopans mikroplattrotor och motsvarande mikroplattadaptrar vid 4 °C.
- Slå på datorn, öppna analysprogramvaran och välj önskat protokoll.
OBS: Ett klick hörs när programvaran ansluts till instrumentet för mätning av syreförbrukning. Värmesensorn ska vara grön och vid 37 °C innan experimentet startar. - Förbered hämmarlösningarna från de bestånd som anges i avsnitt 1, steg 2 enligt den analys som ska utföras. Förbered tillräckligt med volym för varje lösning. Se tabell 1 och tabell 2 för referens.
- Lägg till lämplig volym för varje hämmare i varje port, sätt in patronen i instrumentet för mätning av syreförbrukning och börja kalibrera.
OBS: Att lägga till hämmare i patronen och sätta in patronen i instrumentet tar 15-20 minuter. Se till att rätt patronkomponenter införs. Patronlocket och hydroboostern kan kasseras medan sensorpatron och verktygsplats behövs. - Centrifugera den koncentrerade mitokondriella suspensionen i sektion 2, steg 21 vid 10 500 × g i 10 min vid 4 °C.
- Resuspend den mitokondriella pelleten i 100 μL av 1x CAM + BSA, 1x EFAM + BSA eller 1x BOXM + BSA, beroende på vilket protokoll som ska utföras.
- Späd det koncentrerade mitokondriella provet ytterligare till en slutlig koncentration på 0,2 μg/μL i motsvarande analysmedium.
- Frö 50 μL av suspensionen (totalt 10 μg protein) per brunn i en förklämd 24-brunns mikroplatta på is. Lägg inte till mitokondrier i bakgrundskorrigeringsbrunnarna; lägg bara till motsvarande analysmedium. Förvara den återstående mitokondriella suspensionen vid -80 °C för bestämning av fragmenteringsrenhet (figur 3).
- Snurra mikroplattan i den förklätade preparativa centrifugen vid 2 000 × g i 20 min vid 4 °C. Motvikt för att balansera därefter.
- Värm det återstående analysmediet vid 37 °C under centrifugering av mikroplattor.
- Efter centrifugering, lämna mikroplattan på bänken i 5 minuter för att balansera. Tillsätt 450 μL varmt analysmedium för en slutlig volym på 500 μL per brunn vid RT. Gör detta långsamt och försiktigt, tillsätt mediet till brunnens vägg för att undvika att mitokondrier lossnar.
- Placera mikroplattan omedelbart i syreförbrukningsmätinstrumentet utan lock och starta protokollet (tabell 3). Se till att det första steget är en 10 minuters inkubation så att mikroplattan kan värmas.
- När experimentet är klart tar du bort patronen och mikroplattan, stänger av instrumentet och startar analysen.
4. Analys av resultaten
- När det gäller CA- och BOX-analyserna, utför följande analyser:
- Registrera icke-mitokondrisk O2-konsumtion , vilket motsvarar medelvärdet av de värden som erhållits efter antimycin A och rotenoninjektion.
OBS: Antimycin A och rotenon är komplexa III- respektive I-hämmare. - Beräkna basal andning genom att subtrahera icke-mitokondrisk O2-förbrukning från basalvärden (mätpunkterna 1 och 2).
- Subtrahera icke-mitokondriell O2-konsumtion från värdena efter injektionen av det komplexa V-substratet ADP (injektion A) för att bestämma mitokondriellt tillstånd III.
- Subtrahera icke-mitokondriell O2-konsumtion från andningsvärdena efter injektion av den komplexa V-hämmaren oligomycin (injektion B) för att erhålla mitokondriellt tillstånd IVo.
- Beräkna mitokondriellt tillstånd IIIu genom att dra av icke-mitokondriell O2-förbrukning från andning efter FCCP-injektion (injektion C).
OBS: FCCP är en potent mitokondriell oxidativ fosforyleringskopplare. ATP-syntes kringgås i sin närvaro, och ETC uppnår maximal aktivitet. - Subtrahera basala andningsvärden från mitokondriella tillstånd IIIu-värden för att erhålla mitokondriell outnyttjad kapacitet, vilket är kapaciteten att generera extra ATP vid ökat energibehov.
- Dela mitokondriellt tillstånd IIIu med statliga IVo-värden för att erhålla Respiratory Control Ratio (RCR).
OBS: Negativa eller noll RCR-värden indikerar att mitokondriell koppling påverkas.
- Registrera icke-mitokondrisk O2-konsumtion , vilket motsvarar medelvärdet av de värden som erhållits efter antimycin A och rotenoninjektion.
- Utför följande beräkningar med hänvisning till EFA:
- Erhålla restaktivitet genom att beräkna medelvärdet efter rotenon och Antimycin A-injektion (injektioner A och C).
- Beräkna komplex I till IV (CI-CIV) aktivitet genom att subtrahera restaktivitet från basalvärdena (mätpunkterna 1 och 2).
- Subtrahera restaktivitet från värdena efter injektion av CII-substratsuccinat (injektion B) för att erhålla CII-CIII-CIV-aktivitet.
- Beräkna CIV-aktivitet genom att dra av restaktiviteten från de värden som erhållits efter injektion av cytokrom c-reduktionsmedel, askorbinsyra och TMPD (injektion D).
- Representera alla resultat med hjälp av stapeldiagram, som i figur 4, för att extrahera lämpliga slutsatser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som presenteras här möjliggör in vivo-analys av mitokondriell andning genom isolering av mitokondrier från musskelettmuskeln. En översikt över metoden visas i figur 1. Efter dissekering av skelettmuskler från bakbenen (figur 2) homogeniseras vävnaderna och mitokondrier renas, under isotoniska förhållanden, genom seriella centrifugeringar. Renheten hos de olika fraktionerna som erhålls under isoleringsprocessen kan analyseras av western blot med hjälp av antikroppar mot olika organellmarkörer. Figur 3A visar den allmänna proteinprofilen från de olika fraktionerna som visar distinkta proteinpopulationer i de isolerade fraktionerna.
Figur 3B visar att allt mitokondriellt innehåll finns i mitokondriell fraktion, vilket framgår av de starka signalerna för markörer för de yttre (VDAC och TOMM20) och inre (TIMM23) mitokondriella membranen, och även för nukleoidassocierade proteiner (mtTFA). Alla kärnor och cytoskelett (β-aktin) finns i fraktion N, som representerar kärnor och ostört material (figur 3C). Dessutom förblir de flesta endoplasmatiska retikulum (ER) (Calnexin), plasmamembran (Na +/ K + -ATPaseα1) eller cytoplasmamarkörer (LDHA, HSP70 eller AKT) kvar i SN1- eller SN2-fraktionerna, vilket belyser den höga renheten som erhålls under isolering (figur 3C). Det finns emellertid några spår av ER-kontaminering i mitokondriell fraktion, möjligen på grund av närheten till dessa organeller. Med tanke på de resultat som erhållits i efterföljande andningsanalyser ger isoleringsförfarandet som beskrivs här mycket rena, livskraftiga mitokondriella preparat.
Både CA- och BOX-analyser tillåter beräkning av olika mitokondriella tillstånd i närvaro av flera substrat som stimulerar specifika metaboliska vägar. Specifikt utförs dessa analyser i närvaro av pyruvsyra eller palmitoyl-L-karnitinklorid. Pyruvsyra är ett substrat i Krebs-cykeln; äppelsyra är en Krebs-cykelförmedlare och en NADH-induktor, medan palmitoyl-L-karnitin är ett substrat av fettsyran β oxidationsvägen. (Figur 4A,B). I båda analyserna är det första tillståndet som kan mätas den basala andningshastigheten, vilken representerar mitokondriell andning i närvaro av substraten som ursprungligen tillsattes till analysmediet. Därefter uppnås mitokondriellt tillstånd III, vilket representerar ATP-produktion från ADP och oorganiskt fosfat, vilket visar maximal andning i ett kopplat tillstånd. Således finns det en ökning av syreförbrukningen efter ADP-tillsats, vilket observeras i figur 4A,B.
Vidare indikerar tillstånd IVo protonläckaget associerat med hämningen av ATP-syntas av oligomycin, vilket leder till en minskning av andningen, vilket observerats i CA- och BOX-graferna (figur 4A,B). Tillägget av FCCP leder till State IIIu, som visar den maximala andningskapaciteten som mitokondrier kan visa i ett frikopplat tillstånd när syreförbrukningen når sin högsta nivå i dessa analyser. För att beräkna alla dessa tillstånd är det grundläggande först att bestämma icke-metokondriell andning, vilken erhålls i slutet av analysen när Antimycin A och rotenon injiceras för att hämma oxidativ andning. Som visas i figur 4A,B måste dessa värden alltid ligga under basal andning och mycket nära noll vid analyser med isolerade mitokondrier som dessa analyser som beskrivs här. Slutligen måste RCR-parametern beräknas för att bedöma mitokondriell integritet. Det återspeglar om mitokondrier kan reagera på ADP genom att producera ATP i hög takt med låg protonläcka. De genomsnittliga RCR-värdena som hittades i CA- och BOX-analyserna var 5,78 ± 1,03 respektive 3,47 ± 0,42 (figur 4A,B), vilket är i överensstämmelse med optimala RCR som rapporterats tidigare21,22,23,24.
Dessutom undersöker EFA aktiviteten hos ETC-komplexen individuellt eller i kombination genom injektion av specifika substrat och hämmare (figur 4C). CI-CIV-aktivitet representerar mitokondriell andning baserad på pyruvat- och malatsubstrat när inga komplex hämmas; i detta fall går de flesta elektronerna genom CI. Eftersom rotenon är en specifik hämmare av CI blockeras CI efter dess tillsats, vilket resulterar i minskad syreförbrukning (figur 4C). CII-CIII-CIV-aktivitet visar andning när endast CI blockeras och CII aktiveras: succinat, injicerat genom port B, är ett specifikt substrat av komplex II (succinatdehydrogenas). Således reduceras CII, vilket initierar elektronflödet från CII till CIV, medan CI fortfarande hämmas av den tidigare rotenoninjektionen, vilket ger en ökning av syreförbrukningen (Figur 4C). Antimycin A-tillsats hämmar CIII, blockerar elektronflödet genom ETC och minskar syreförbrukningen. Vidare bestäms CIV-aktiviteten när den stimuleras av cytokrom C-oxidation efter att ha reducerats genom tillsats av askorbinsyra / TMPD; Figur 4C visar att CIV-aktivering ger en ökning av syreförbrukningen. Slutligen avser restaktivitet syreförbrukning när den oxidativa fosforyleringskedjan inaktiveras efter rotenon och Antimycin A-tillsats. Detta värde fastställer bakgrunden för beräkningen av komplexens aktivitet enligt vad som anges i protokollsteg 2.2-2.4 i avsnitt 4.
Figur 1: Schematisk visualisering av metoden. Förkortningar: OCR = syreförbrukningshastighet; ADP = adenosindifosfat; OL = oligomycin; FCCP = karbonylcyanid-p-trifluormetoxifenylhydrazon; AntA = Antimycin A; Rot = rotenon. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Dissektion och isolering av murina skelettmuskler från bakbenen för mitokondriella andningsanalyser. (A) Höger bakben sträcktes och immobiliserades med tejp. (B) Ett snitt gjordes genom huden från bredvid fotleden och stoppade proximalt till knäet. Bindväv som ligger över TA avlägsnades försiktigt. EDL (C) och TA (D) senor sektionerades nära deras insättningar. TA-senan drogs upp för att lätta muskeln bort från den underliggande muskulaturen och benet. Därefter skars TA proximalt, nära den ventrala kammen till tibia. På samma sätt lättades EDL-muskeln bort och den proximala senan skars noggrant vid sidan av knäet. (F) Höger bakben efter TA- och EDL-dissektion. (G) I den bakre bakbenet sektionerades hälsenan för att dissekera GA- och soleusmuskler. (H) GA och soleus befriades försiktigt från tibialbenet. (I) De återstående musklerna samlades in från fotled till knä tills endast fibula och tibialben återstod. (J) Bakben efter dissektion. (K) Quadriceps dissekerades. (L) Alla skelettmuskler som samlats in för bakre mitokondriell isolering. Processen utfördes för båda bakbenen. Förkortningar: TA = tibialis främre; EDL = extensor digitorum longus; GA = gastrocnemius. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fragmenteringsprocessens renhet. (A) Allmän proteinprofil färgad med Coomassie-blå. (B) Mitokondriell proteinrenhetsprofil. (C) Icke-mitokondriska markörer. De olika fraktionerna erhållna under mitokondriernas isolering laddades och inkuberades med antikroppar mot olika proteiner i specifika subcellulära fraktioner. Förkortningar: fraktion N = icke-homogeniserad vävnad och kärnor; SN1 = supernatant nummer 1: cytoplasma + organeller; SN2 = supernatant nummer 2: cytoplasma + organeller; VDAC = spänningsberoende anjonkanal; TOMM20 = translokas av yttre mitokondriellt membran 20; mtTFA = mitokondriell transkriptionsfaktor A; TIMM23 = translokas av inre mitokondriellt membran 23; LDHA = laktatdehydrogenas A; HSP70 = värmechockprotein 70; ER = endoplasmatisk retikulum. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat. Bioenergetisk profilering av mitokondrier isolerade från bakbensmusklerna hos en 13 månader gammal manlig vild typ C57BL/6N mus. Injektionspunkterna för de olika substraten och hämmarna indikeras i varje analys. Prestandan hos ETC- och OXPHOS-maskinerna kan analyseras med pyruvat och malat, eller palmitoyl-L-karnitin och malat som substrat i kopplingsanalysen (A) respektive β oxidation av FA-analyser (B). (C) Elektronflödesanalysen möjliggör studier av enskilda mitokondriella komplex i närvaro av pyruvat, malat och FCCP; 10 μg mitokondrier pläterades per brunn. Resultaten visas efter alternativet för mittpunktsrepresentation för att visualisera resultat i aggregerad form. Detta står i kontrast till punkt-till-punkt-alternativet, vilket skulle möjliggöra visualisering av de 9 på varandra följande mätningarna som vanligtvis utförs under varje mätsteg. Typen av visualisering kan ändras efter avslutad analys under alternativen för kinetiskt linjediagram i analysprogramvaran. Förkortningar: FA = fettsyror; OCR = syreförbrukningshastighet; ADP = adenosindifosfat; FCCP = karbonylcyanid-p-trifluormetoxifenylhydrazon; RCR = andningskontrollförhållande; EFA = Elektronflödesanalys; BOX = β-oxidation av FA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Analys av koppling | ||||||
| Hamn | Hämmare | [Lager] | [Injektionsport] | [Final] | Recept | |
| Inhib | CAM-BSA | |||||
| A | ADP | 100 mM | 50 mM | 5 mM | 650 μL | 650 μL |
| B | Oligomycin | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimycin A // Rotenon | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 50 μM | 4 μM // 5 μM | 13,52 μL // 21,12 μL | 1655,36 μL |
| Analys av elektronflöde | ||||||
| Hamn | Hämmare | [Lager] | [Injektionsport] | [Final] | Recept | |
| Inhib | EFAM-BSA | |||||
| A | Rotenon | 4 mM | 50 μM | 5 μM | 16,25 μL | 1283,7 μL |
| B | Succinat | 500 mM | 100 mM | 10 mM | 286 μL | 1144 μL |
| C | Antimycin A | 5mM | 4 μM | 4 μM | 12,48 μL | 1547,5 μL |
| D | Askorbat // TMPD | 1 M // 50 mM | 100 mM // 1 mM | 10 mM // 100 μM | 169 μL // 33,8 μL | 1487,2 μL |
| β-oxidationsanalys | ||||||
| Hamn | Hämmare | [Lager] | [Injektionsport] | [Final] | Recept | |
| Inhib | BOX-BSA | |||||
| A | ADP | 100 mM | 40 mM | 4 mM | 520 μL | 780 μL |
| B | Oligomycin | 4 mM | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | FCCP | 20 mM | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimycin A // Rotenon | 5 mM // 4 mM | 40 μM // 20 μM | 4 μM // 2 μM | 13,52 μL // 8,45 μL | 1668 μL |
Tabell 1: Beredning av hämmarlösningar för de olika analyserna. Kolumnen [Stock] visar koncentrationerna av stamlösningarna av den förening som anges i inhibitorkolonnen. [Injektionsport] avser koncentrationen av de hämmarlösningar som ska laddas i patronens olika portar, medan kolumnen [Final] indikerar den slutliga koncentrationen av hämmarna i brunnarna. Slutligen anger kolumnerna Recept volymerna av stamhämmarlösningar och BSA-fria medier som måste blandas för att förbereda lösningarna som ska laddas i injektionsportarna. Förkortningar: ADP = adenosindifosfat; FCCP = karbonylcyanid-p-trifluormetoxifenylhydrazon; TMPD = N,N,N′,N′-tetrametyl-para-fenylen-diamin; Inhib = hämmare; BSA = albumin från bovint serum; CAM-BSA = BSA-fritt kopplingsanalysmedium; EFAM-BSA = BSA-fritt elektronflödesanalysmedium; BOX-BSA = BSA-fri β oxidation av fettsyraanalysmedium.
| Hamn | Injicerad volym | Lager beredda (26 brunnar) |
| A | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
Tabell 2: Beräkning av injektionsvolymer.
| Handling | Tid (minuter) | Upprepning | Hamn |
| Kalibrera | 15-20 | ||
| Vänta | 10 | ||
| Blanda + vänta | 1 + 3 | × 2 | |
| Blanda | 1 | ||
| Mät + Blanda | 3 + 1 | × 2 | |
| Injicera | A | ||
| Blanda | 1 | ||
| Mått | 3 | ||
| Blanda | 1 | ||
| Injicera | B | ||
| Blanda | 1 | ||
| Mått | 3 | ||
| Blanda | 1 | ||
| Injicera | C | ||
| Blanda | 1 | ||
| Mått | 3 | ||
| Blanda | 1 | ||
| Injicera | D | ||
| Blanda + mät | 1 + 3 | × 2 |
Tabell 3: Protokollinställningar för de olika analyserna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alla metoder som används för att studera mitokondriell andning har sina begränsningar; Därför är det viktigt att välja den metod som bäst passar en specifik experimentell fråga. Detta arbete ger ett uppdaterat och detaljerat protokoll för att isolera mitokondrier från musskelettmuskeln för att utföra olika andningsanalyser för att undersöka mitokondriell funktion. Faktum är att studien av mitokondriell bioenergetik i isolerade mitokondrier med hjälp av mikroplattbaserad teknik är värdefull för att studera vävnadsspecifik andning när det gäller reproducerbarhet, tillförlitlighet och komplexitet. Vidare ger användningen av isolerade mitokondrier kontroll över substratets tillgänglighet, vilket underlättar förståelsen av de underliggande biologiska processerna. En annan positiv aspekt av att använda isolerade mitokondrier är att det är möjligt att studera tillstånd III eftersom ATP som genereras efter ADP-injektion inte omvandlas igen till ny ADP eftersom de flesta transmembran-ATPaserna går förlorade. I de analyser som beskrivs här tillsätts dessutom oligomycin för att blockera potentiell ospecifik ATP-syntes20.
Flera viktiga överväganden måste belysas för detta protokoll. För det första är isolerade mitokondrier extremt känsliga och bör hanteras med försiktighet. Det höga innehållet av sackaros och mannitol i de buffertar som används säkerställer de optimala osmotiska förhållandena för att skydda de isolerade mitokondrierna från skador. Analysens varaktighet bör dock hållas på ett minimum för att bevara mitokondriell livskraft och förhindra att den lossnar från mikroplattan när den har sådds. Med tanke på att protokollsteg, såsom framställning av analysmedier och substrat- och inhibitorlösningar, eller laddningen av hämmarna i den respirometriska analyspatronen, är tidskrävande, bör varje steg samordnas perfekt. Vidare, till skillnad från andra metoder baserade på enzymatisk matsmältning21,24 och mortel- och stöthomogenisering17,19,21,23,24, bygger den metod som beskrivs här på användningen av en automatiserad homogenisator, vilket möjliggör snabb och effektiv provhomogenisering. Viktigt är att mitokondriella suspensioner är mindre känsliga om de är mycket koncentrerade. Förbered således endast utspädningar omedelbart innan du använder dem. Slutligen är det viktigt att arbeta snabbt under den respirometriska analysen korrekt. Vanligtvis, vid analys av celler i odling i dessa analyser, utförs tre på varandra följande mätsteg efter injektion av substrat eller hämmare, vilket resulterar i protokoll som sträcker sig mellan 40 och 50 min., För att säkerställa livskraften hos de isolerade mitokondrierna under hela proceduren hålls antalet mätsteg ofta till ett minimum på grund av deras sårbarhet19, 23,25, vilket minskar den tid det tar att slutföra den respirometriska analysen till ~ 20 min. De protokoll som beskrivs i detta arbete (tabell 3) följer denna trend, även om andra tidigare publicerade metoder rapporterar effektiva OCR-profiler med längre och mer standardiserade mätsteg26.
Till exempel, om två på varandra följande analyser kommer att köras med samma uppsättning prover samma dag, förbered alla reagenser för den andra analysen under den första utom mitokondriella utspädningar: späd endast utspädning, frö och spinn mitokondrier omedelbart innan den andra analysen påbörjas, medan instrumentet kalibreras. När experimentet är avslutat måste RCR-parametern (avsnitt 4, steg 1.7) beräknas för att bedöma kvaliteten på de mitokondriella preparat som används. Vanligtvis betecknar RCR-värden mellan 3,5 och 5 att mitokondriell integritet är optimal och visar funktionell kopplad oxidativ andning25. Analyser med lägre RCR-värden måste kasseras eftersom mitokondriell integritet äventyrades under isoleringen. Överväg i dessa fall att tvätta mitokondriell pellets två gånger (avsnitt 2, steg 19-21)22, som tidigare rapporterats.
För det andra är det viktigt att upprätthålla rätt pH under hela proceduren för att uppnå framgångsrika resultat. Se till att pH för alla lösningar är inställt enligt anvisningarna, det vill säga pH 7,2, och att pH alltid justeras med KOH om inget annat anges. I synnerhet bör pH-värdet för BSA-innehållande buffertar inte mätas direkt med pH-mätaren eftersom BSA kan skada sonden. Justera således pH i motsvarande buffertar innan du lägger till BSA. För att undvika förändringar i pH på grund av BSA-tillsats, använd alltid FFA BSA. Vidare kan vissa ultrarena H2O-satser vara sura, så användning av kommersiellt renat, pH 7 H2O rekommenderas. Dessutom är det nödvändigt att se till att pH-mätaren är korrekt kalibrerad och att det är lämplig modell för att mäta pH-värdet för de kemikalier som ska beredas.
För det tredje är det viktigt att korrekt utföra provtagningssteget för proteinmätning av den slutliga mitokondriella suspensionen (avsnitt 2, steg 21) för att förhindra mitokondriell destruktion. Resuspend pelletsen snabbt men noggrant, samla en alikvot och tillsätt FFA BSA till den återstående suspensionen för att bevara den osmotiska balansen och skydda mitokondrierna från skador. Om FFA BSA redan fanns i återsuspensionsbufferten, och därmed under proteinkvantifiering, skulle det höga proteininnehållet förvirra kvantifieringsresultaten. Det är därför FFA BSA måste läggas till efter att ha avsatt en alikvot för kvantifiering.
För det fjärde är denna metod mycket mångsidig och kan anpassas till experimenterarens behov. Till exempel, om djurmodellen som studeras kännetecknas av minskad muskelmassa (t.ex. sarkopeniska möss), kan ytterligare muskler öka mitokondriellt utbyte. Även om en vuxen vild typ av manlig C57BL / 6N-mus användes i detta arbete, kan djur av alla kön, åldrar eller genetisk bakgrund, liksom specifika muskeltyper, användas istället.
För det femte kan andningsvärdena skilja sig åt mellan experiment på grund av små variationer i sammansättningen av buffertar och reagenser, som måste beredas färskt varje gång. Ålder, kön, genetisk bakgrund eller miljöförhållanden kan också ha en djupgående inverkan på resultaten. Ett framgångsrikt experiment bör emellertid ge ökningar av syreförbrukningen efter injektion av komplexa substrat såsom ADP och succinat, minskar efter injektionen av hämmare såsom oligomycin eller rotenon och markanta ökningar när den potenta frikopplaren FCCP tillsätts. För att förhindra hög teknisk variation, säkerställa dessutom grundlig återanvändning av mitokondriella pellets för att erhålla homogena suspensioner innan de såddes i mikroplattan.
För det sjätte, om basala andningsvärden är låga, överväga att utföra ett titreringsexperiment för att justera mängden protein för sådd. Slutligen, eftersom detta arbete ger en metod för att erhålla råa mitokondriella extrakt, förväntas en viss grad av orenhet associerad med andra organeller, främst ER. En mer aggressiv fragmenteringsprocess för att avlägsna dessa föroreningar skulle vara skadlig för mitokondriell livskraft, vilket hindrar utförandet av andningsanalyser. Om renhet är ett problem, särskilt om det inte är konsekvent mellan proverna, kan analysresultaten normaliseras i förhållande till mitokondriell renhet efter att ha kört västra fläckar mot olika organellmarkörer (Figur 3). Såvitt vi vet är detta den första metoden som belyser oro över mitokondriell renhet i råa extrakt. Vanligtvis, i andra protokoll för respirometriska analyser med isolerade mitokondrier, frös samma mängd proteinextrakt i brunnarna för att jämföra prover, förutsatt att samma mängd mitokondrier används i alla fall. Detta är ett rimligt antagande med tanke på att isolering utförs parallellt i alla prover. Den genetiska eller miljömässiga bakgrunden hos de prover som studeras kan dock leda till betydande skillnader i mitokondriella extraktens renhet. Till exempel, om en given genetisk mutation orsakar ökad utveckling av cytoplasmatisk ER, kan råa mitokondriella extrakt från dessa djur innehålla större än förväntat ER-innehåll och följaktligen lägre än förväntat mitokondriellt protein. Således, även om samma mängd totalt protein från kontroll- och mutantprover utsädes i mikroplattan, skulle syreförbrukningen hos mutanterna underskattas. Därför rekommenderas att renheten hos extrakten av alla förhållanden som studeras måste bestämmas. Om värdena är jämförbara behövs ingen normalisering. Men om renhetsvärdena bland proverna skiljer sig avsevärt utöver det statistiska fel som experimenteraren är villig att acceptera, bör de användas för att normalisera syreförbrukningsresultaten.
Det nuvarande protokollet har vissa begränsningar. Observera att denna metod har optimerats för skelettmuskelvävnad isolerad från möss. Justeringar kan behöva göras om man använder olika vävnader eller skelettmuskler från olika arter. Dessutom, när analyser utförs på isolerade mitokondrier, förloras den normala cellulära mikromiljön på grund av frånvaron av cellulärt sammanhang och de andra organellerna som kan interagera med mitokondrier. Detta kan leda till resultat som något avviker från fysiologiska förhållanden. Slutligen, när mitokondrierna centrifugeras, fäster de vid botten av brunnarna. Även om det är helt nödvändigt är de potentiella effekterna av centrifugering på deras normala tillstånd okända.
Det är viktigt att ta hänsyn till att en minskning av syreförbrukningen i samband med ATP-bunden eller FCCP-stimulerad andning i isolerade mitokondrier, efter att ha utfört de respirometriska analysanalyserna, kan indikera potentiella mitokondriella förändringar som kan förklaras av20: 1) begränsad transport av substrat över det inre mitokondriella membranet, 2) minskad aktivitet hos de enzymer som är involverade i de hastighetsbegränsande reaktionerna hos specifika metaboliska vägar, såsom ETC, Krebs-cykel eller β-oxidation, eller 3) nedsatt ETC-funktion, bland andra möjliga förklaringar.
Sammanfattningsvis representerar den uppdaterade metoden som beskrivs här ett adekvat och tillförlitligt sätt att bedöma ETC- och OXPHOS-funktionen från skelettmuskelvävnad. Den har flera tillämpningar för att utvärdera hur genetiska modifieringar eller miljön kan påverka mitokondriell andning som bidrar till en specifik fenotyp. Anmärkningsvärt kan det nuvarande protokollet anpassas till andra modellorganismer eller användas med mänskliga prover för att utvärdera potentiella mitokondriella dysfunktioner associerade med mänsklig sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Juan J. Tena för användningen av homogenisatorn och CABD Proteomics and Animal Husbandry-anläggningarna för teknisk support. Detta arbete stöddes av det spanska ministeriet för utbildning, kultur och sport genom stipendium FPU16/03264 till J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) genom stipendiebidrag #22450 till C.V.-G., ett institutionellt bidrag MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis at CABD) och BFU2017-83150-P till JJ.C. Junta de Andalucía-bidraget P18-RT-4572, FEDER-finansieringsprogrammet från Europeiska unionen, och det spanska ministeriet för vetenskap, innovation och universitet beviljar RED2018-102576-T till P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al.
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
