Summary
Dieser Artikel beschreibt eine geeignete Methode zur gleichzeitigen Überwachung dynamischer Veränderungen in Antikörpertitern für zwei Immunglobulin-Isotypen (entweder IgA, IgM oder IgG), die sich aus einer Immunantwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion oder -Impfung ergeben. Dieses "Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel" verwendet drei indirekte Immunoassays, die auf codierten Mikrosphären basieren und mit einem flussbasierten Multiplex-Leser mit "Dual-Channel"-Fähigkeit gelesen werden.
Abstract
Multiplex-Technologien zur gemeinsamen Abfrage mehrerer Biomarker existieren seit mehreren Jahrzehnten; Die Methoden zur Bewertung mehrerer Epitope auf demselben Analyten bleiben jedoch begrenzt. Dieser Bericht beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines Multiplex-Immunbead-Assays für die serologische Untersuchung häufiger Immunglobulin-Isotypen (z. B. IgA, IgM und IgG), die mit einer Immunantwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion oder -Impfung assoziiert sind. Die Assays wurden mit einem strömungsbasierten Multiplex-fluoreszierenden Lesegerät mit Zweikanalfähigkeit durchgeführt. Die Optimierungen konzentrierten sich auf die Analyterfassungszeit, die Detektionsantikörperkonzentration und die Inkubationszeit für den Nachweis von Antikörpern. Analytische Assay-Leistungsmerkmale (z. B. Assay-Bereich (einschließlich unterer und oberer Quantifizierungsgrenzen) sowie Intra- und Inter-Assay-Präzision) wurden entweder für IgG/IgM- oder IgA/IgM-Serotyp-Kombination im Tandem unter Verwendung des "Zweikanal"-Modus festgelegt. Analyterfassungszeiten von 30 min für IgG, 60 min für IgM und 120 min für IgA waren für die meisten Anwendungen geeignet und boten ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Assay-Leistung und Durchsatz. Optimale Detektionsantikörperinkubationen bei 4 μg/ml für 30 min wurden beobachtet und werden für allgemeine Anwendungen empfohlen, da insgesamt eine ausgezeichnete Genauigkeit (prozentualer Varianzkoeffizient (%CV) ≤ 20%) und Sensitivitätswerte beobachtet werden. Der Dynamikbereich für den IgG-Isotyp umfasste mehrere Größenordnungen für jeden Assay (Spike S1, Nucleocapsid und Membranglykoproteine), was robuste Titerbewertungen bei einem Verdünnungsfaktor von 1:500 für klinische Anwendungen unterstützt. Schließlich wurde das optimierte Protokoll auf die Überwachung der Spike S1-Serokonversion für Probanden (n = 4) angewendet, die ein SARS-CoV-2-Impfstoffregime abgeschlossen hatten. Innerhalb dieser Kohorte wurde beobachtet, dass die Spike S1 IgG-Spiegel nach 14 Tagen nach der zweiten Verabreichung der Dosis maximale Titer erreichten, bei einer viel höheren (~ 40-fachen) Signalintensität als entweder IgM- oder IgA-Isotypen. Interessanterweise beobachteten wir hochvariable Spike S1 IgG-Titerzerfallsraten, die weitgehend subjektabhängig waren, was das Thema zukünftiger Studien sein wird.
Introduction
Die gleichzeitige Messung mehrerer krankheitsbezogener Biomarker in biologischen Proben ermöglicht deskriptive und prädiktive Einblicke in pathologische Prozesse. Während herkömmliche immunologische Einzelanalytverfahren, wie z. B. enzymgebundene Immunsorbentien-Assays (ELISAs), der Eckpfeiler quantitativer Analysen sowohl im klinischen als auch im Forschungsumfeld waren, können diese Techniken erhebliche Einschränkungen hinsichtlich des Durchsatzes, der für jede Messung erforderlichen Probenmenge und der Kosteneffizienz aufweisen, die die Untersuchung mehrerer biologischer Elemente, die häufig während des Krankheitsverlaufs miteinander verflochten sind, stark einschränken1 . Die mikrokugelbasierte Multiplexing-Technologie ist zu einer unverzichtbaren Plattform für Diagnose- und Forschungseinrichtungen geworden, da sie Assays kombinieren kann, um den Labordurchsatz zu verbessern, die Probenknappheit zu verringern und wiederholte Tests zu reduzieren, um die Kosteneinsparungen zu maximieren 1,2,3,4. Vor kurzem wurde eine weitere Erweiterung dieser Multiplexing-Leistung mit Instrumenten eingeführt, die über Dual-Reporter-Fähigkeiten verfügen. Die Dual-Reporter-Funktion implementiert zwei fluoreszierende Kanäle für die Detektion und liefert eine weitere Dimension des Multiplexings, die den Nachweis mehrerer Epitope auf demselben Analyten ermöglicht.
Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist der Erreger, der für die aktuelle Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) Pandemie5 verantwortlich ist. Während RT-PCR-Tests für die Infektionsbestätigung zu Beginn des Krankheitsverlaufs von entscheidender Bedeutung sind, haben sich serologische Untersuchungen von Antikörpertitern als unerlässlich für die genaue und vollständige Kritik von Individuen in Bezug auf eine frühere Exposition oder Genesung erwiesen; eine Reaktion auf die Immunisierung; und/oder eine Bewertung der Wirksamkeit der Covid-19-Impfung 6,7.
Dieser Bericht beschreibt Methoden zur Messung der Serokonversion für mehrere virale SARS-CoV-2-Antigene, die ein flussbasiertes Multiplex-Reader-Dual-Reporting-System verwenden. Insbesondere wird der gleichzeitige Nachweis von zwei Antikörper-Subtypen (konfiguriert als IgG / IgM oder IgA / IgM) für ein 3-Plex-SARS-CoV-2-Antigen-Panel beschrieben, das Assays für Spike S1-, Nucleocapsid- und Membranglykoproteine (auch bekannt als Matrix) enthält. Dieser Ansatz bietet ein ideales Unternehmen für die Erfassung der longitudinalen Serokonversion und trägt zu einem wertvollen Werkzeug im Arsenal gegen die Covid-19-Pandemie bei.
Protocol
Alle Probanden wurden mit schriftlicher Einverständniserklärung mit voller Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) des Rush University Medical Center unter dem Protokoll ORA 20101207 unter Einhaltung aller institutionellen Richtlinien für ethisches Forschungsverhalten eingeschrieben. Blut wurde über die konventionelle Phlebotomie in Lavendelvakutainer (K2EDTA) gesammelt und mit empfohlenen Protokollen verarbeitet. Das resultierende Plasma wurde bei -80 °C archiviert, bis Bewertungen durchgeführt wurden.
1. Herstellung von antigenkonjugierten Mikrosphären
- Wählen Sie drei verschiedene Fläschchen mit magnetischen Mikrokugeln mit einzigartigen Perlenregionen aus und zeichnen Sie die Perlen-ID und die Chargeninformationen für jedes verwendete Fläschchen auf.
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für jede einzelne Mikrosphärenregion befolgt. Mikrosphären sind lichtempfindlich und sollten vor längerer Lichteinwirkung geschützt werden. Achten Sie beim Waschen darauf, die Mikrosphären nicht zu stören. Wenn gestört, erlauben Sie eine zweite 60 s Trennung. - Wirbeln Sie den Mikrosphärenbestand für 60 s und beschallen Sie für 5 Minuten vor der Verwendung, um aggregierte Perlen zu dissoziieren.
- Übertragen Sie 1,0 x 106 Perlen auf ein 1,5 ml proteinarmes bindendes Mikrozentrifugenröhrchen.
- Setzen Sie das Rohr in einen Magnetabscheider ein und lassen Sie die Trennung für 60 s erfolgen. Wenn sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Perlenpellet zu stören.
- Entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetabscheider, suspendieren Sie die Perlen mit 100 μL HPLC-Wasser und wirbeln Sie es 30 s lang. Setzen Sie das Rohr für 60 s wieder in den Magnetabscheider und entfernen Sie anschließend den Überstand. Wiederholen Sie dieses Waschprotokoll zweimal.
- Entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Sie die gewaschenen Mikrokugeln in 90 μL 100 mM monobasischem Natriumphosphat, pH 6,2 (Aktivierungspuffer) durch Vortex für 30 s.
- Geben Sie 10 μL 50 mg / ml Sulfo-NHS (verdünnt mit Aktivierungspuffer) zu den Mikrosphären und wirbeln Sie vorsichtig für 10 s. 10 μL 50 mg/ml EDC-Lösung (verdünnt mit Aktivierungspuffer) zugeben und vorsichtig für 10 s vorwirbeln. Inkubieren Sie Mikrokugeln für 20 min bei Raumtemperatur (RT) mit einem sanften Wirbel alle 10 Minuten.
- Wiederholen Sie die Waschschritte 1,4-1,5 mit 50 mM MES, pH 5,0 (Kopplungspuffer) anstelle von LC/MS-Wasser für insgesamt zwei Wäschen.
- Entfernen Sie das Rohr aus dem Magnetabscheider und suspendieren Sie die Perlen mit 100 μL Kupplungspuffer im Wirbel für 30 s, gefolgt von der Zugabe der gewünschten Proteinmenge.
- Bringen Sie das Gesamtvolumen mit dem Kopplungspuffer auf 150 μL. Mischkupplungsreaktion durch Vortex für 30 s und Inkubation für 2 h durch Rotation bei RT.
HINWEIS: Für hierin definierte Assays wurden Konjugationen mit den folgenden Proteinkonzentrationen durchgeführt: Spike S1: 5 μg; Nukleokapsid: 5 μg; Membran: 12,5 μg. - Wiederholen Sie Waschschritt 1.4 mit Phosphat Buffered Saline (PBS)-1% Ziegenserumalbumin, 0,01% Polysorbat-20 (Quench Buffer) anstelle von LC/MS-Wasser für insgesamt zwei Wäschen. Resuspendiert die gewaschenen Mikrokügelchen in 100 μL Quench Buffer mit 0,05% Natriumazid durch Vortex für 30 s.
HINWEIS: Lassen Sie die Perlen mindestens 6 Stunden lang vollständig abschrecken, bevor Sie mit einem anderen Verfahren fortfahren. - Zählen Sie die Anzahl der wiedergewonnenen Mikrosphären mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Zeichnen Sie die beobachtete Perlenkonzentration auf.
- Kühlen Sie die gekoppelten Mikrokugeln bei 4 °C im Dunkeln.
2. Verfahren
- Assay-Leistung (Basisprotokoll)
- Resuspendieren Sie die gekoppelten Mikrosphären durch Wirbel für 30 s und Beschallung für ~ 60-90 s.
- Entfernen Sie die benötigte Menge jedes Perlenkolloides aus dem jeweiligen Röhrchen und kombinieren Sie die Perlenkolloide in einem neuen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Setzen Sie das Rohr in einen Magnetabscheider ein und lassen Sie die Trennung für 60 Sekunden erfolgen. Wenn sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Perlenpellet zu stören.
- Entfernen Sie die Perlen aus dem Separator, suspendieren Sie die Perlen mit 100 μL PBS-1% Rinderserumalbumin, 0,01% Polysorbat-20 (Assay-Puffer) und Wirbel für 30 s. Legen Sie das Rohr in einen Magnetabscheider und lassen Sie die Trennung für 60 s erfolgen. Wiederholen Sie dieses Waschprotokoll (d. h. die Schritte 2.1.3-2.1.4) zweimal.
- Passen Sie die Konzentration der 3-Plex-Arbeitsmikrosphärenmischung an, indem Sie ein geeignetes Volumen Assay-Puffer hinzufügen, um eine Endkonzentration von 100 Mikrosphären pro 1 μL für jedes Ziel zu erzeugen.
- Aliquot 12,5 μL der in Schritt 2.1.5 hergestellten Mikrosphärenmischung in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte oder 25 μL in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- Verdünnen Sie die Plasma-/Serumproben 500-fach im Assay-Puffer. Bereiten Sie Standardproben entsprechend der gewünschten Titration vor.
- 12,5 μL Assay-Puffer als Blindprobe zugeben und jede der verdünnten Probe oder der Norm in jede vorgesehene Vertiefung einer 384-Well-Probenplatte oder 25 μL der leeren, verdünnten Probe oder des Standards in jede Vertiefung einer 96-Well-Probenplatte geben.
- Decken Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung oder -folie ab und inkubieren Sie für 1 h bei RT auf einem auf 700 U / min eingestellten Plattenschüttler.
HINWEIS: Ein Schema für die Verdünnungskurven ist in Tabelle 1 enthalten. - Es wird eine Lösung von Antikörpern gegen den menschlichen Nachweis (sekundäre Antikörperlösungen) bei 4 μg/ml mit Assay-Puffer gemäß Schritt 2.1.11 hergestellt.
- Herstellung von Ziegen-Anti-Mensch-IgM, konjugiert mit Super Bright 436 (SB) / Ziegen-Anti-Human-IgA, Phycoerythrin (PE) Konjugat-Nachweis-Antikörpern bei 4 μg / ml; oder Ziegen-anti-humanes IgM, SB-Konjugat/Ziegen-anti-humanes IgG, PE-Konjugat-Detektionsantikörper bei 4 μg/ml.
HINWEIS: Für ein 384-Well-Plattenformat sind 12,5 μL/Well der vorbereiteten sekundären Antikörperlösung erforderlich, und für ein 96-Well-Plattenformat sind 25 μL/Well erforderlich. - Legen Sie die Platte auf einen Magnetabscheider, waschen Sie sie schnell und kehren Sie sie gewaltsam über einen Biohazard-Behälter um, um Flüssigkeit aus den Bohrlöchern zu entfernen. Wenn die Platte noch umgedreht ist, klopfen Sie die Platte kräftig gegen einen dicken Papierstreifen.
- Waschen Sie jede Vertiefung mit 100 μL Assay-Puffer und entfernen Sie die Flüssigkeit durch gewaltsame Inversion über einen Biohazard-Behälter, wie zuvor beschrieben. Wiederholen Sie diese Schritte (2.1.12-2.1.13) für insgesamt zwei Wäschen. Entsorgen Sie alle gebrauchten Papierbündel in einen Biohazard-Behälter.
- 12,5 μL der sekundären Antikörper-Arbeitslösung zu jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte oder 25 μL zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung oder -folie ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei RT auf einem auf 700 U / min eingestellten Plattenschüttler.
- Wiederholen Sie die Waschschritte 2.1.12-2.1.13
- Fügen Sie 75 μL Assay-Puffer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte oder 100 μL in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu. Decken Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung oder -folie ab und inkubieren Sie für 5 Minuten bei RT auf einem auf 700 U / min eingestellten Plattenschüttler.
- Analysieren Sie 60 μL über den Geräteanalysator gemäß dem Systemhandbuch.
- Optimierung der Inkubationszeit für die Probenerfassung
- Führen Sie die Schritte in Abschnitt 2.1 mit einer Inkubationsdauer von 30 min, 60 min und 120 min in Schritt 2.1.9 aus.
HINWEIS: Inkubationen können entweder mit unterschiedlichen Platten oder durch Pausieren in Schritt 2.1.6 durchgeführt werden, bis zu dem Zeitpunkt, zu dem mit Schritt 2.1.9 fortgefahren werden kann. um die gewünschten Inkubationszeiten zu erreichen. - Fahren Sie mit der Plattenablesung auf dem Analysator fort, indem Sie 60 μL der Assay-Mischung gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwenden.
- Führen Sie die Schritte in Abschnitt 2.1 mit einer Inkubationsdauer von 30 min, 60 min und 120 min in Schritt 2.1.9 aus.
- Optimierung der sekundären Antikörperkonzentration
- Dieses Verfahren ist wie in Abschnitt 2.1 beschrieben durchzuführen, mit Ausnahme der Endkonzentrationen von Reagenzien in der sekundären Antikörper-Arbeitslösung (hergestellt in Schritt 2.1.10-2.1.11), die wie folgt geändert wurde:
Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgM, SB-Konjugat-Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg/ml.
Ziegen-Anti-Human- (oder Kaninchen-) IgA-, PE-Konjugat-Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg/ml.
Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgG, PE-konjugierte Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg/ml.
Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgG, PE-Konjugat / Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgM, SB-Konjugat Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg / ml.
Ziegen-Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgA, PE-Konjugat / Ziege Anti-Mensch (oder Kaninchen) IgM, SB-Konjugat Detektionsantikörper bei 8, 4, 2, 1 und 0,5 μg / ml. - Fahren Sie mit der Plattenablesung auf dem Analysator fort, indem Sie 60 μL der Assay-Mischung gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwenden.
- Dieses Verfahren ist wie in Abschnitt 2.1 beschrieben durchzuführen, mit Ausnahme der Endkonzentrationen von Reagenzien in der sekundären Antikörper-Arbeitslösung (hergestellt in Schritt 2.1.10-2.1.11), die wie folgt geändert wurde:
- Optimierung der Inkubationszeit sekundärer Antikörper
- Führen Sie dieses Verfahren wie in Abschnitt 2.1 beschrieben mit 15 min, 30 min, 60 min und 120 min Inkubationsdauer durch, die in Schritt 2.1.14 definiert sind.
- Fahren Sie mit der Plattenablesung auf dem Analysator fort, indem Sie 60 μL der Assay-Mischung gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwenden.
- Auswertung von Probandenproben mit optimierten Zweikanal-Assays
- Sammeln Sie Probandenplasmaproben (n = 4) an den Tagen -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 und +120 relativ zum Abschluss der Verabreichung des Covid-19-Impfstoffs (d. h. der zweiten Dosis).
HINWEIS: Tag 0 stellt den Zeitpunkt dar, zu dem die Impfung abgeschlossen wurde. - Führen Sie alle Assays unter Verwendung des Basisprotokolls (Abschnitt 2.1.) entweder als IgG/IgM- oder IgA/IgM-Zweikanal-Assay durch.
- Normalisieren Sie die Ergebnisse auf den maximal beobachteten MFI-Wert (Median Fluorescent Intensity) für jedes spezifische Immunglobulin und jeden Assay.
- Sammeln Sie Probandenplasmaproben (n = 4) an den Tagen -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 und +120 relativ zum Abschluss der Verabreichung des Covid-19-Impfstoffs (d. h. der zweiten Dosis).
Representative Results
Typische Assay-Ergebnisse und Leistungsbewertungen
Immunperlen-Assays liefern üblicherweise eine sigmoidale Kurve, wenn sie über mehrere (logarithmische) Größenordnungen ausgewertet werden, wie in jedem der in Abbildung 1 dargestellten Panels dargestellt. Der Benutzer muss experimentell den optimalen Konzentrationsbereich für jeden Analyten im Multiplex definieren, um den gesamten Quantifizierungsbereich zu bestimmen, wobei sicherzustellen ist, dass die Extreme (Bereiche, die sich der unteren Quantifizierungsgrenze [LLOQ] oder der oberen Quantifizierungsgrenze [ULOQ] nähern) nicht überbewertet werden. Der tatsächliche Bereich, der für einen Assay benötigt wird, wird jedoch durch die Verteilung der Zielanalyten in einer biologischen Matrix (d. h. den "Unbekannten") bei einem bestimmten Verdünnungsfaktor bestimmt. Obwohl Standardkurven typischerweise über lineare Regression mit einem 4- oder 5-parametrischen Anpassungsalgorithmus interpretiert werden, bietet der lineare Teil einer gegebenen Kurve typischerweise das größte Vertrauen in die quantitative Genauigkeit mit einem linearen (y = mx + b) Quantifizierungsmodell. Die Anpassung der Kalibrierkurve an die beobachteten Werte für einen Unbekannten bei einem gegebenen Verdünnungsfaktor sollte das Ziel bei der quantitativen Assay-Entwicklung sein.
In diesem Zusammenhang wurde eine 7-Punkt-Standardkurve basierend auf einer seriellen Verdünnungsreihe von 1:5 für jeden der Spike S1-, Nucleocapsid- und Membran-Antikörper ausgewertet, die zwischen 1 μg/ml und 0,000064 μg/ml für Spike S1 und Nucleocapsid und 5 μg/ml und 0,00032 μg/ml für Membrane liegen, wie in Abbildung 1 gezeigt. Die untere Nachweisgrenze (LLOD) für jeden Assay wurde als die niedrigste Analytkonzentration definiert, die ein von ihrem Hintergrund unterscheidbares Signal ergab. LLOD kann durch die zuvor beschriebene Gleichung 8,9, LLOD = LoB + 1,645 (SD-Tiefkonzentrationsprobe) identifiziert werden. LoB ist die untere Grenze von Leerwert, und es ist die "scheinbare" Konzentration des Analyten, die aus dem Rohling erzeugt wird, wenn ein Nullwert erwartet wird, und sie kann mit dieser Gleichung LoB = Mean blank + 1.645(SDblank)8 ermittelt werden. Basierend auf dieser Methode lagen die MFI-Werte für den Spike S1-Assay zwischen 134,38 und 20191,2, wobei 134,38 MFI 0,00024 μg/ml darstellte und als LLOD definiert wurde. Für den Membranassay betrug der praktische MFI-Bereich 52,24 bis 4764,9, wobei 52,24 MFI mit 0,004885 μg/ml berechnet und als LLOD zugeordnet wurde. Der MFI-Bereich für den Nucleocapsid-Assay betrug 517,9 bis 19666,34, wobei 517,9 als 0,00024 μg/ml spezifiziert wurde, was dem LLOD entsprach. Die obere Nachweisgrenze (ULOD) ist definiert als die Konzentration des Analyten, nach der die Änderung des MFI nicht mehr linear ist und die Signalantwort gesättigt ist. Es sei darauf hingewiesen, dass der vollständige sigmoidale Charakter dieser Kurven für die getesteten Standards nicht beobachtbar ist, mit Ausnahme der Nukleokapsidkurve. Angesichts der Tatsache, dass die beobachteten MFI-Werte für alle bisher untersuchten Unbekannten (bei einer Verdünnung von 1:500) jedoch innerhalb des dargestellten Kurvenbereichs für jeden Analyten liegen und leicht mit einer parametrischen 4- oder 5-parametrischen Anpassung über lineare Regression quantifiziert werden können.
Assay-Präzision
Intra-Assay-Präzision: Vier Replikate von Assays wurden auf derselben Platte durchgeführt, um die Assay-Präzision zu bewerten, berechnet als %CV, oder als Quotient aus der Standardabweichung und dem Durchschnitt multipliziert mit 100. Für diese Tabellen wurden die Standardpunkte 2 und 5 ausgewählt, wobei die Werte in Tabelle 2 katalogisiert sind. Der typische akzeptable Schwellenwert für %CV-Werte beträgt ≤20 %, der für diese Daten beobachtet wurde, mit Ausnahme des Schwellenwerts für Standard 2 des Membran-IgG, der sich wahrscheinlich aus Hintergrundwerten ergibt und durch Eliminierung von Außenwerten behoben werden kann (Daten nicht gezeigt). Es sollte beachtet werden, dass eine offensichtliche Instabilität des Ablesewerts für Membranassays beobachtet wurde, bei denen die MFI-Werte <200 betrugen, am häufigsten im Fall von IgA- und IgM-Isotypen.
Inter-Assay-Präzision: Für jeden Assay wurden drei verschiedene Chargen von Wulstsets vorbereitet und getestet, wie für die Intra-Assay-Präzision definiert (oben und wie in Abbildung 1 dargestellt). Die Variabilität zwischen den Assays wurde durch Berechnung des %CV aus den Durchschnittsergebnissen für jede der drei Chargen bewertet, wie in Tabelle 3 dargestellt. Auch hier wird der Schwellenwert für einen akzeptablen %CV auf ≤20% festgelegt, der für alle getesteten Bedingungen gilt (mit einem ähnlichen Effekt mit Standard 2 von Membran-IgG, wie oben gezeigt). Es sollte beachtet werden, dass die Batch-to-Batch-Variabilität der Netto-MFI-Werte häufig innerhalb mehrerer Chargen derselben Immunreagenzien während der kundenspezifischen Assay-Entwicklung beobachtet wird. Die Verwendung einer Kalibrierkurve, die aus einem kommerziell gewonnenen Anti-Ziel-Antikörper (z. B. Kaninchen-Anti-Spike-S1) mit anschließendem Antikörper zum Nachweis von Anti-Spezies aufgebaut wird, kann die Analyseergebnisse konsistent machen und Vergleiche zwischen mehreren Chargen zu unterschiedlichen Zeitpunkten ermöglichen.
Inter-Assay-Präzision mit menschlichen Proben: Die Bewertung der Inter-Assay-Präzision wurde mit menschlichen Plasmaproben (n = 5) wiederholt, die innerhalb eines Monats nach den ersten gemeldeten Symptomen für eine SARS-CoV-2-Infektion gesammelt wurden; durchgeführt mit drei verschiedenen Chargen von Assays (d.h. verschiedenen Präparaten der Perlensets). Diese Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt und zeigen die Genauigkeit mit einem %CV-Wert mit dem typischen oberen Grenzwert von ≤20%. Die gemittelten %CV-Werte für die Spike-S1-, Nucleocapsid- und Membran-IgG-Titer wurden mit 9,9% (Bereich 2,6%-18%), 11,0% (Bereich 3,5%-24,4%) bzw. 7,6% (Bereich 3,2%-12,9%) berechnet. Ähnliche Beobachtungen wurden mit den IgM- und IgA-Titern dieser drei Analyten gemacht, die alle %CV-Werte <20% lieferten. Die einzige Ausnahme bildeten Subject 5 IgM-Titer für das Membranprotein, die anschließend als Ausreißer ausgeschlossen wurden. Die Präzisionswerte für die Auswertungen der menschlichen Probanden stimmen mit denen überein, die oben für die Kaninchenantikörper zu sehen sind, was darauf hindeutet, dass diese Assays leicht umkonfiguriert werden können, um Titer der Antigene in mehreren Spezies mit geringem Einfluss auf die Assay-Präzision zu bewerten. Wie oben erwähnt, gab es eine offensichtliche Instabilität bei den für Membranassays beobachteten Werte, bei denen die MFI-Werte <200 lagen, am häufigsten im Fall von IgA- und IgM-Isotypen.
Optimierung der primären Antikörperkonzentration
Die "Einfangzeit" des Analyten wurde mit den antigenkonjugierten Kügelchen bewertet, und die Antikörper in den Plasmaproben oder in den Standards wurden getestet, indem die Länge der primären Inkubation (30 min, 1 h, 2 h und 4 h) geändert wurde. Die Differenz im durchschnittlichen MFI wird in Abbildung 2 als Quotient aus einer bestimmten Inkubation und der maximalen Inkubationszeit, genannt % Max., zwischen einer 30-minütigen Inkubation (Mindestdauer) und einer 4-stündigen Inkubation (maximale Dauer) dargestellt. Die Werte bei 120 min waren optimal für IgG-Titer für die Spike S1-, die Membran- und die Nucleocapsid-Antikörper, was auf eine schnelle primäre Antikörperbindungskinetik hinweist, die Flexibilität zur Erhöhung des Assay-Durchsatzes ermöglicht. Für die Isotypen IgA und IgM (Daten nicht gezeigt) wurde jedoch eine langsamere Kinetik beobachtet, die Spitzeneinfangmengen zum 4-Stunden-Zeitpunkt zeigt, wie in Abbildung 2 dargestellt. Insgesamt besteht ein Gleichgewicht zwischen der nahenden Assay-Sättigung und der praktischen zeitlichen Zweckmäßigkeit für die Durchführung jedes Assays in der Produktion (zur Maximierung des Durchsatzes). Damit wurden in diesen Befunden geeignete Signale für quantitative Zwecke bei minimalen Inkubationszeiten von 30 min für IgG, 60 min für IgM und 120 min für IgA beobachtet.
Optimierung der sekundären Antikörperkonzentration
Fünf Konzentrationen sekundärer Antikörper (Ziegen-Anti-Human-IgG, PE-konjugiert; Ziegen-Anti-Human-IgA, PE-konjugiert; Ziegen-Anti-Human-IgM, SB-konjugiert) wurden getestet (0,5, 1, 2, 4 und 8 μg/ml). Alle Antikörper zeigten einen breiten Signalbereich, ohne offensichtliche Signalsättigung unter irgendeinem Zustand, wodurch eine lineare Messung für jede der Konzentrationen gewährleistet wurde. Zum Beispiel betrug das durchschnittliche Signal, das aus dem Spike-S1-Assay mit Ziegen-Anti-Human-IgM, SB-konjugiert bei 0,5 μg / ml erzeugt wurde, 13,2% des MFI, das aus dem maximalen Signal (8 μg / ml) erzeugt wurde, während MFI, das von 4 μg / ml erzeugt wurde, 73,3% des MFI betrug, das sich beim maximalen Signal manifestierte. Einzelheiten zum Signalspektrum der anderen Spike-S1-Antikörperisotypen, der Membranantikörper und der Nucleocapsid-Antikörper sind in Tabelle 5 und Abbildung 3 enthalten. In der Praxis spiegelt sich der primäre Einfluss zwischen der optimalen sekundären Antikörperkonzentration und der zuvor angegebenen sekundären Antikörperkonzentration von 4 μg/ml in Bezug auf die Assay-Sensitivität und die Assay-Kosten wider. Das heißt, eine sekundäre Antikörperkonzentration von 8 μg/ml kann für die Anwendung mit niedrigen Antikörpertitern oder geringen Mengen wertvoller Proben wünschenswert sein, aber die mit diesen Assays verbundenen Kosten wären erheblich höher als die Verwendung der zuvor definierten 4 μg/ml-Konzentration. Umgekehrt würden Fälle, in denen hohe Antikörpertiter beobachtet werden sollten (z. B. Personen, die Covid-19-Impfungen erlebt haben oder mit nicht limitierenden Mengen an Sera), durch die Anwendung der geringeren Mengen an sekundären Antikörpern (z. B. 1 μg / ml) ein Kosten-Nutzen-Verhältnis erzielen.
Optimierung der sekundären Antikörperinkubation
Der mögliche Einfluss der Dauer der sekundären Antikörperinkubation wurde ebenfalls untersucht, indem die Länge der Inkubation (15, 30, 60 und 120 min) modifiziert wurde. Im Allgemeinen überschritt die Differenz zwischen dem durchschnittlichen MFI, dargestellt als Quotient aus einer bestimmten Inkubation und der maximalen Inkubationszeit, genannt %Max, zwischen einer 15-minütigen Inkubation (Mindestdauer) und einer 120-minütigen Inkubation (maximale Dauer) 30 %, 55 % und 50 % für die Spike S1-, die Membran- bzw. die Nucleocapsid-Antikörper, was auf einen schnellen kinetischen Schritt in der sekundären Antikörperbindung und ein Mittel zur Erhöhung des Assay-Durchsatzes hinweist. Tabelle 6 enthält Details zu Signaländerungen für alle Inkubationszeiten. Abbildungen der beobachteten Signale aus verschiedenen Inkubationen dieser Analyse sind in Abbildung 4 dargestellt.
Dual-Channel-Leistung und Spezifität
Für jeden Analyten wurde ein einzelner Reporter-Formatlauf (nur IgG-PE, nur IgA-PE oder nur IgM-SB) mit dem Signal verglichen, das für denselben Analyten erzeugt wurde, wenn er in einem Dual-Reporter-Format ausgeführt wurde (z. B. nur Spike S1 IgG-PE im Vergleich zu Spike S1 IgG-PE in Kombination mit Spike S1 IgM-SB im Dual-Reporter-Format). Die Assay-Präzision (ausgedrückt als %CV) für die in den beiden Formaten erzeugten Signale wurde verwendet, um die Beziehung in den Ergebnissen dieses Experiments zu analysieren. Die %CV-Werte der Spike S1-Assays betrugen 6,19 %, 16,4 % bzw. 23 % für IgM, IgG bzw. IgA. Für den Membranassay betrugen die %CV-Werte 3,3 %, 7,9 % bzw. 16,4 % für IgM, IgG bzw. IgA. Schließlich lieferte der Nucleocapsid-Assay %CV-Werte bei 8,7 %, 10,3 % bzw. 24,2 % für IgM, IgG bzw. IgA. Die für die Isotypen IgM und IgA beobachteten Präzisionswerte deuten darauf hin, dass eine längere Inkubationszeit aufgrund der bekannten kinetischen Bindungsunterschiede zwischen diesen Klassen von Immunglobulinen zu überlegenen Assay-Ergebnissen führen kann. Abbildung 4 zeigt die Übereinstimmung zwischen den Formaten der verschiedenen Konzentrationen sekundärer Antikörper.
Um die Spezifität der Reporterkanäle zu bestätigen, wurde ein einzelner Reporterkanal gleichzeitig getestet, während der andere Kanal als Leerzeichen zugewiesen wurde, um sich nach dem unspezifischen Signal zu erkundigen (Blutungseffekt). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es angesichts der hohen Spezifität über das gesamte Spektrum der Bedingungen eine vernachlässigbare Kreuzsignalkontamination zwischen den beiden Reporterkanälen gibt. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Insgesamt beobachteten wir eine Interferenz von 6,45% über Kanal 1 bis Kanal 2. Wenn jedoch die Größe der Signale berücksichtigt wurde, beobachteten wir die folgenden potenziellen Störpegel im Dual-Reporter-Modus: Spike IgG / IgM bei 71,98%, Spike IgA / IgM bei 28,11%; Membran-IgG/ IgM bei 7,41%, Membran-IgA/ IgM bei 134,61%; und Nukleokapsid IgG/ IgM bei 146,03%, Nukleokapsid IgA/ IgM bei 112,13%. In der angegebenen Konfiguration würde dies eine Messung von Spike-IgM in Kombination mit dem IgA-Isotyp, Membran-IgM mit dem IgM-Isotyp und Nukleokapsidmessungen erfordern, die nicht in einem Zweikanalformat durchgeführt werden. Dieser Befund könnte eine Untersuchung der Umkehrung der Kennzeichnungsstrategie erforderlich machen, bei der IgA und IgG in Kanal 2 und IgM in Kanal 1 gemessen werden.
Bewertung von Serokonversionsereignissen nach der Covid-19-Impfung
Die Serokonversion wurde bei vier Probanden nach Beurteilung von IgA, IgM und IgG mit dem Spike S1-Assay zu Zeitpunkten überwacht, die von der Vorimpfung bis vier Monate nach Abschluss der Covid-19-Impfserie reichten. Die Messungen wurden im Zweikanalmodus durchgeführt (IgG/ IgM und IgA/ IgM, wobei die IgM-Werte gemittelt wurden). Alle Probanden erhielten den Impfstoff als 2-stufige Immunisierung gemäß Standardpraxis mit einem Abstand von 21 Tagen zwischen der ersten und zweiten Dose. Die Darstellung der Immunantwort jedes Probanden ist in Abbildung 6A-C dargestellt. Immunantwortwerte für die Nucleocapsid- und Membran-Antigene wurden auf Hintergrundniveaus für alle untersuchten Immunglobuline beobachtet (Daten nicht gezeigt), was mit den Probanden übereinstimmte, die in der Zeit vor der Impfung keine dokumentierte SARS-CoV-2-Infektion hatten. Insgesamt waren die beobachteten Spike-S1-IgA- und IgM-Werte etwa 40-mal niedriger als die IgG-Isotyp-Titer, wobei die Peak-Titer sowohl für die IgM- als auch für die IgG-Isotypen bereits nach 14 Tagen anstiegen und der IgA-Isotyp zwischen dem Zeitpunkt der zweiten Dosis (Tag 0) und 14 Tagen nach der zweiten Dosis Spitzentiter erreichte. je nach Thema. Insbesondere beginnen die Spike S1 IgG-Titer im Laufe der vier Monate nach Abschluss der Impfung mit einer sehr variablen Rate und subjektabhängig zu zerfallen.
Abbildung 1: Repräsentative 3-Plex-Standardkurven. Repräsentative Standardkurven für die drei Analyten; dargestellt als 7-Punkt, 1:5 serielle Verdünnungskurve beginnend bei (A) 1 μg/ml für Spike S1, (B) 5 μg/ml für Membran und (C) 1 μg/ml für Nucleocapsid und Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Optimierung der Inkubationszeit des primären Antikörpers/der Probe: Das durchschnittliche MFI-Signal, das aus verschiedenen Inkubationszeiten von primären Antikörpern/Proben (Antikörperabscheidung) erzeugt wird, reicht von 30 min bis 4 h für die Standards 1-7 (wie in Tabelle 1 angegeben). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Optimierungen der sekundären Antikörperkonzentration und Zweikanalleistung. Die Kurven veranschaulichen den durchschnittlichen MFI (normalisiert auf den höchsten aufgezeichneten Wert in der Reihe), der aus getesteten sekundären Antikörperkonzentrationen im Bereich von 0,5-8 μg/ml hergestellt wird. Jede Instanz wurde sowohl als ein- als auch als zweikanaliger Assay durchgeführt, um Unterschiede im experimentellen Format zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Optimierung der Inkubationszeit von Sekundärantikörpern, Zweikanalformat. Repräsentative Diagramme der beobachteten MFI-Werte (normalisiert auf den höchsten aufgezeichneten Wert in der Reihe) in Bezug auf den Zeitpunkt der Inkubation mit sekundären Antikörpern. Die Experimente wurden als Zweikanal-Assays als (A-C) IgA/IgM- oder (D-F) IgG/IgM-Kombinationen durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Spezifitätsbewertungen für Zweikanal-Assays. Assay-Ergebnisse des Zweikanal-Assay-Formats, wobei eine von jeder Kombination als Leerzeichen bezeichnet wird, um das Fehlen von Cross-Channel-Fluoreszenz- oder Interferenzen zu veranschaulichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Darstellung der Serokonversion nach der Covid-19-Impfung. Plots, die die relativen Titer von (A) IgG-, (B) IgM- und (C) IgA-Antikörpern für das Spike-S1-Antigen während der Covid-19-Impfung veranschaulichen (Vorimpfung - 4 Monate nach Abschluss); Die Zeit wird in Tagen relativ zum Abschluss der Impfserie angegeben; Allgemeine Punkte der Impfstoffverabreichung sind gekennzeichnet (rote Linien). Die Experimente wurden im Zweikanalmodus durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Standardnummer | Verdünnungsreihe | Anti-Spike S1 oder N (μg/ml) | Anti-Membran (μg/ml) |
| Leer | Leer | - | - |
| 1 | STD7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | STD6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | STD5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | STD4 1:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | STD3 1:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | STD2 1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | STD1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |
Tabelle 1: Verdünnungsreihen für Standardkurven: Tabelle der Verdünnungsfaktoren, die für die Standardkurven für den IgG-Serotyp verwendet werden; dargestellt als 7-Punkt, 1:5 serielle Verdünnungskurve beginnend bei 1 μg/ml für α-Spike S1 und α-Nucleocapsid und 5 μg/ml für α-Membran-Antikörper.
| Analytik | Probe | Vertreter 1 | Vertreter 2 | Vertreter 3 | Vertreter 4 | Ave | Sd | %CV |
| Spike S1 | STD2 | 369.4 | 356.9 | 295.2 | 271.5 | 323.3 | 47.4 | 14.6 |
| STD5 | 3869.1 | 3437 | 3970.2 | 4240.7 | 3879.3 | 334 | 8.6 | |
| Membran | STD2 | 40.6 | 37.7 | 49.9 | 27.8 | 39 | 9.1 | 23.3 |
| STD5 | 733.2 | 731.3 | 724 | 678.1 | 716.7 | 26 | 3.6 | |
| Nukleocapsid | STD2 | 1746.7 | 1790.8 | 1577.3 | 1664.8 | 1694.9 | 94.2 | 5.6 |
| STD5 | 15598.1 | 14735.5 | 18369.5 | 17408.5 | 16527.9 | 1657.7 | 10 |
Tabelle 2: Intra-Assay-Präzision: Prozentualer Varianzkoeffizient (%CV), berechnet aus vier Replikaten von Standard-Antikörpergemischen in Standard 2 (STD2) und Standard 5 (STD5) mit einer einzigen Assay-Charge im selben Experiment. Die für Replikate und Durchschnittswerte bereitgestellten Werte stellen die beobachteten MFI-Werte dar.
| Analytik | Probe | Charge 1 | Charge 2 | Charge3 | Ave | Sd | %CV |
| Spike S1 | STD2 | 383.2 | 424.4 | 379.9 | 395.8 | 24.8 | 6.3 |
| STD5 | 5639.7 | 6062.5 | 6384.3 | 6028.8 | 373.4 | 6.2 | |
| Membran | STD2 | 39.1 | 58.5 | 59.1 | 52.2 | 11.4 | 21.8 |
| STD5 | 732.3 | 941.4 | 701.1 | 791.6 | 130.7 | 16.5 | |
| Nukleocapsid | STD2 | 1342.6 | 1621 | 1718.2 | 1560.6 | 195 | 12.5 |
| STD5 | 13543.9 | 14843.2 | 17883.4 | 15423.5 | 2227.2 | 14.4 |
Tabelle 3: Inter-Assay-Präzision mit Standardproben: Prozentualer Varianzkoeffizient (%CV), berechnet aus drei verschiedenen Chargen von Assays, die bei Standard 2 und Standard 5 im selben Experiment ausgewertet wurden. Die für Replikate und Durchschnittswerte bereitgestellten Werte stellen die beobachteten MFI-Werte dar.
| IgG-PE | IgM-SB | IgA-PE | |||||
| MFI-Ave. | %CV | MFI-Ave. | %CV | MFI-Ave. | %CV | ||
| Spike S1 | Betreff 1 | 8002.3 | 17.7 | 1949.5 | 1.3 | 2045.8 | 5.5 |
| Betreff 2 | 19155.8 | 7.3 | 918.6 | 4.1 | 1684.5 | 3.9 | |
| Betreff 3 | 17865.6 | 18.0 | 549.4 | 3.8 | 961.3 | 8.1 | |
| Fach 4 | 11901.1 | 2.6 | 1603 | 4.8 | 8736.4 | 5.5 | |
| Fach 5 | 9801.8 | 4.0 | 1014.1 | 3.0 | 2747.6 | 9.3 | |
| Nukleocapsid | Betreff 1 | 15097.8 | 11.3 | 1049.7 | 9.9 | 5276.5 | 3.9 |
| Betreff 2 | 15204.3 | 12.1 | 265.9 | 5.2 | 6761.3 | 11.9 | |
| Betreff 3 | 18471.7 | 24.4 | 329.1 | 4.5 | 14308 | 2.9 | |
| Fach 4 | 16424.7 | 3.5 | 2418.1 | 0.1 | 4234.7 | 4.2 | |
| Fach 5 | 13344.9 | 3.6 | 225.6 | 10.0 | 13436.5 | 9.7 | |
| Membran | Betreff 1 | 514.6 | 8.6 | 180.6 | 14.0 | 141.2 | 9.8 |
| Betreff 2 | 196.8 | 5.2 | 57 | 20.7 | 55.5 | 13.0 | |
| Betreff 3 | 553.7 | 12.9 | 54.5 | 21.2 | 191.2 | 18.6 | |
| Fach 4 | 377.9 | 3.2 | 68.1 | 22.1 | 62 | 2.3 | |
| Fach 5 | 325.4 | 8.2 | 11.4 | 91.6 | 74.6 | 20.8 |
Tabelle 4: Inter-Assay-Präzision mit menschlichen Proben: Durchschnittlicher prozentualer Varianzkoeffizient (%CV), berechnet aus drei Chargen von Assays, die mit Plasmaproben (500-fach verdünnt) von fünf menschlichen Probanden mit SARS-CoV-2-Infektionen getestet wurden.
| Spike S1 | Membran | Nukleocapsid | |||||
| μg/ml | MFI-Ave. | % Max. | MFI-Ave. | % Max. | MFI-Ave. | % Max. | |
| Igm | 0.5 | 186 | 13.2 | 32 | 25.2 | 132.7 | 13.6 |
| 1 | 304.2 | 21.6 | 45.8 | 36 | 194.4 | 19.9 | |
| 2 | 664.5 | 47.2 | 78.8 | 61.9 | 458.2 | 47 | |
| 4 | 1032.1 | 73.3 | 101.3 | 79.6 | 707.8 | 72.6 | |
| 8 | 1407.1 | 100 | 127.2 | 100 | 975 | 100 | |
| IgG | 0.5 | 809.7 | 4.9 | 27.5 | 15 | 1355.6 | 6.3 |
| 1 | 1696.9 | 10.2 | 40.6 | 22.2 | 2782.1 | 13 | |
| 2 | 4543.8 | 27.3 | 68.3 | 37.3 | 6661.2 | 31.2 | |
| 4 | 10003.5 | 60 | 110.7 | 60.5 | 12605.6 | 59 | |
| 8 | 16662.8 | 100 | 182.9 | 100 | 21360.6 | 100 | |
| IgA | 0.5 | 797.4 | 19.3 | 31.1 | 47.2 | 2056.5 | 16.1 |
| 1 | 1529.5 | 37 | 41.4 | 62.8 | 3869 | 30.4 | |
| 2 | 2261.3 | 54.7 | 48.6 | 73.3 | 6648.9 | 52.2 | |
| 4 | 2320.4 | 56.2 | 48.3 | 73.2 | 6548.1 | 51.4 | |
| 8 | 4132.2 | 100 | 65.9 | 100 | 12744.8 | 100 | |
Tabelle 5: Optimierung der sekundären Antikörperkonzentration: Das durchschnittliche MFI-Signal, das aus verschiedenen Konzentrationen sekundärer Antikörper im Bereich von 0,5 μg/ml bis 8 μg/ml erzeugt wird. Der Wert jedes Signals wird auch als Prozentsatz des Signals bei 8 μg / ml ("Max.") dargestellt, um die relative Signalgröße zu demonstrieren.
| Spike S1 | Membran | Nukleocapsid | |||||
| Inkubationszeit (min.) | MFI-Ave. | % Max. | MFI-Ave. | % Max. | MFI-Ave. | % Max. | |
| Igm | 15 | 1185 | 72.2 | 40.4 | 48.9 | 609.5 | 53.3 |
| 30 | 1416.6 | 86.3 | 58.4 | 70.7 | 894.2 | 78.2 | |
| 60 | 1324.8 | 80.7 | 73.6 | 89.1 | 945.6 | 82.7 | |
| 120 | 1641.2 | 100 | 82.6 | 100 | 1143.2 | 100 | |
| IgG | 15 | 12917.6 | 80.5 | 244.4 | 44.9 | 15429.8 | 80.8 |
| 30 | 14915.4 | 92.9 | 434.7 | 79.9 | 18797 | 98.5 | |
| 60 | 15340.3 | 95.6 | 421.4 | 77.5 | 18694.4 | 97.9 | |
| 120 | 16050.3 | 100 | 544 | 100 | 19085.8 | 100 | |
| IgA | 15 | 3141.9 | 78.2 | 75 | 66.8 | 9103 | 86.6 |
| 30 | 3569.1 | 88.8 | 83.9 | 74.8 | 9563.8 | 91 | |
| 60 | 3539.1 | 88 | 86 | 76.6 | 9555.7 | 90.9 | |
| 120 | 4020 | 100 | 112.2 | 100 | 10512.9 | 100 |
Tabelle 6: Optimierung der Inkubationszeit für sekundäre Antikörper: Das durchschnittliche MFI-Signal, das aus verschiedenen Inkubationszeiten von sekundären Antikörpern im Bereich von 15 min bis 120 min erzeugt wird. Der Wert jedes Signals wird auch als Prozentsatz des Signals bei 120 min ("Max.") dargestellt, um die relative Signalgröße zu demonstrieren.
Discussion
Die Bewertung einer Immunantwort auf SARS-CoV-2-Exposition in Verbindung mit einer RT-PCR-basierten Überwachung des Infektionsstatus wurde gut als Rezept zur Klärung des Genesungsverlaufs von Covid-19, zur Identifizierung von Rekonvaleszentenplasma mit potenziellem therapeutischem Wert und zur Erhebung der Infektionsraten auf Bevölkerungsebenebeschrieben 10,11. Verschiedene Beispiele für das Verständnis der Serokonversion bei menschlichen Probanden sind Protein(antigen)-Arrays 12, Immunoblots13, schnelle immunchromatographische Konstrukte 14 und enzymgebundene Immunsorbentien-Assays (ELISAs) 15,16,17. Jede dieser oben genannten Techniken kann mehrere Immunglobulin-Isotypen einzeln mit geringfügigen Modifikationen beurteilen. Diese Verfahren sind jedoch nicht in der Lage, praktisch umfunktioniert zu werden, um eine parallele Analyse mehrerer Isotypen zu ermöglichen, wie in diesem Manuskript vorgestellt, was Kosten- und Durchsatzfaktoren als Einschränkungen für ihre Verwaltung auf einer populationsbasierten Skalenteststrategie darstellt. Mehrere dieser Anwendungen bieten auch die Möglichkeit, Konzentrationen mehrerer Antigene parallel zu verketten, entweder wie vorgestellt oder in veränderten Formaten, wie z. B. einem Multiplex-ELISA18,19. Schließlich bietet die Immunbead-Plattform die Möglichkeit, Konzentrationen mehrerer Antigene parallelzu bewerten 20,21, war jedoch auf ein einzelnes Epitop (d. h. Immunglobulin-Isotyp) pro Assay beschränkt, es sei denn, das jüngste Instrument mit "Zweikanal"-Assay-Fähigkeiten wird eingesetzt.
In diesem Bericht werden Protokolle aufgezählt, die die zuverlässige Messung mehrerer Epitope in einem Immunperlen-Assay mit dem Instrument im "Zweikanal"-Modus in einer Fallstudie zur Serokonversion von Covid-19-geimpften Personen belegen. Die Methode zeigte eine ausgezeichnete Präzision (%CV-Werte typischerweise <20%) unter Verwendung manueller Assay-Designs, die durch die Integration automatisierter Laborsysteme verbessert werden können. Assay-Sensitivität und Dynamikumfang für alle ausgewählten Analyten und Epitope waren für Routineauswertungen geeignet. Obwohl das Fehlen kommerziell erhältlicher Anti-Antigen-IgA- und IgM-Immunreagenzien die Quantifizierung auf den IgG-Isotyp beschränkte, schließt eine solche Beschränkung nicht aus, dass semiquantitative Bewertungen oder Bewertungen in Bezug auf eine bestimmte Probe als Kalibrant22,23 angeboten werden können.
Der validierte Immunperlen-Assay wurde zugewiesen, um die Serokonversion in einer Kohorte von Personen zu untersuchen, die mit dem Covid-19-Impfstoff immunisiert wurden. Im Gegensatz zu anderen ähnlichen Plattformen ermöglicht die Instrumentierungsfamilie die Prospektion von Serokonversion bei Hunderten von Personen pro Tag in einem manuellen Workflow und Tausenden pro Tag in einem automatisierten Schema. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse, dass der "zweikanalige" Ansatz eine angemessene Sensitivität für die Beschreibung mehrerer Epitope parallel für den identischen Assay aufweist und in einem multianalytischen Kontext praktikabel ist. Ein Unterschied in den Empfindlichkeiten gegenüber Kanal 1 und Kanal 2, wie er mit Phycoerythrin- bzw. Super Bright 436-Fluorophoren durchgeführt wird, kann das Design eines spezifischen Experiments rechtfertigen, um sicherzustellen, dass für ein bestimmtes Experiment tragfähige Analyseergebnisse erzielt werden. Das heißt, die Reservierung von Kanal 1 für Epitope oder Analyten mit geringerer Prävalenz kann notwendig sein, um einen dynamischen Bereich des Assays aufrechtzuerhalten, der die beobachteten Werte von Unbekannten enthält. Über diese Überlegung hinaus war das Assay-Design offensichtlich und sollte für Labors mit begrenzten analytischen Fähigkeiten leicht zugänglich sein. Sicherlich sollte diese Überlegung bei der Betrachtung von Interferenzen zwischen Kanal 1 und Kanal 2 abgewogen werden, wie wir in Abbildung 5 festgestellt haben, wobei Interferenzen durch Isotypen mit höherer Häufigkeit irreführende analytische Fehler für Personen mit viel geringerer Häufigkeit verursachen können, wenn sie in einem Zweikanalformat gemessen werden. Dieses Potenzial für Interferenzen in Situationen mit sehr unterschiedlichen Analytkonzentrationen kann eine erhebliche Einschränkung des Ansatzes darstellen, wenn es in der Assay-Designphase nicht richtig gehandhabt wird.
Zusammenfassend wurde eine Methode zur schnellen Messung von Antikörpertitern aus den wichtigsten Immunglobulin-Isotypen, die mit einer Immunantwort auf eine Covid-19-Infektion oder -Impfung assoziiert sind, vorgestellt. Die Anwendung dieses Ansatzes in Längsschnitt zur Beurteilung der Serokonversion kann Erkenntnisse liefern, die besser genutzt werden könnten, um den Krankheitsverlauf zu steuern und / oder zu überwachen oder alternativ zukünftige Covid-19-Auffrischungsimpfprogramme zu leiten.
Disclosures
Dr. Borgia ist der Erfinder des serologischen Tests, der in diesem zum Patent angemeldeten Manuskript verwendet wird. Der Artikel wird nur deskriptiv präsentiert, ohne dass statistische Analysen vorgelegt werden, um mögliche Verzerrungen durch Autorenkonflikte zu vermeiden.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Rush Biomarker Development Core für die Nutzung ihrer Einrichtungen, dem Rush Biorepository für die Aufnahme von Probanden und die Verarbeitung von Bioproben sowie den Fördernummern SCI16 (J.R.S. und J.A.B.) und 21-00147 (J.R.S. und J.A.B.) der Walder Foundation sowie einer Auszeichnung der Swim Across America Foundation (J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well black side polystyrene microtiter plates | Thermo Fisher | 12-565-346 | |
| Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Prepared in house | ||
| Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Bovine Serum Albumin, heat shock fraction | MilliporeSigma | A-7888-50G | |
| Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0) | Prepared in house | ||
| COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag) | MyBioSource | MBS8574735 | |
| Disposable pipette tips | |||
| EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher | PIA35391 | |
| Goat Albumin, Fraction V Powder | MilliporeSigma | A2514-1G | |
| IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB205009 | |
| IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB204009 | |
| IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB403009 | |
| IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB202009 | |
| IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4 | Thermo Fisher | 62999842 | |
| Instrument Analyzer | Luminex Corp. | INTELLIFLEX-RUO | |
| Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Fisher | 13-698-794 | |
| MagPlex-C Microspheres, Region XXX | Luminex Corp. | MC10XXX-01 | |
| MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate) | MilliporeSigma | M2933 | |
| Microplate aluminum sealing tape | Thermo Fisher | 07-200-683 | |
| Polysorbate-20 | Thermo Fisher | BP337-500 | |
| Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2 | Thermo Fisher | 50-751-7328 | |
| Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag) | Sino Biologicals | 40588-V08B | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag) | Sino Biologicals | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb | Sino Biologicals | 40592-T62 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb | Sino Biologicals | 40588-R0004 | |
| SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb | ProSci | 10-516 | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher | PIA39269 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Water, LC/MS grade | Thermo Fisher | W-64 |
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