Summary
Denne artikkelen beskriver en praktisk metode for overvåking av dynamiske endringer i antistofftitler for to immunglobulin-isotyper samtidig (enten IgA, IgM eller IgG) som følge av en immunrespons på SARS-CoV-2-infeksjon eller vaksinasjon. Dette 'Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel' bruker tre indirekte immunoassays bygget på kodede mikrosfærer som leses ved hjelp av en strømningsbasert multipleksleser med 'tokanals' evne.
Abstract
Multiplex teknologier for avhør av flere biomarkører i konsert har eksistert i flere tiår; Metoder for å evaluere flere epitoper på samme analytt forblir imidlertid begrenset. Denne rapporten beskriver utvikling og optimalisering av en multiplekset immunobeadanalyse for serologisk testing av vanlige immunglobulinisotyper (f.eks. IgA, IgM og IgG) forbundet med immunrespons på SARS-CoV-2 infeksjon eller vaksinasjon. Analyser ble utført ved hjelp av en strømningsbasert, multipleks fluorescerende leser med tokanals evne. Optimaliseringer fokusert på analyttfangsttid, deteksjon av antistoffkonsentrasjon og deteksjon av antistoffinkubasjonstid. Analytiske analyseytelsesegenskaper (f.eks. analyseområde (inkludert nedre og øvre grenser for kvantitet); og intra- og interanalysepresisjon) ble etablert for enten IgG/IgM- eller IgA/IgM-serotypekombinasjonen i tandem ved hjelp av 'dual channel' -modus. Analyte fangsttider på 30 min for IgG, 60 min for IgM og 120 min for IgA var egnet for de fleste applikasjoner, noe som gir en balanse mellom analyseytelse og gjennomstrømning. Optimal deteksjon av antistoffinkubasjoner ved 4 μg/ml i 30 minutter ble observert og anbefales for generelle bruksområder, gitt den generelle utmerkede presisjonen (prosent varianskoeffisient (%CV) ≤ 20%) og følsomhetsverdier observert. Det dynamiske området for IgG-isotypen strakte seg over flere størrelsesordener for hver analyse (Spike S1, Nucleocapsid og Membrane glykoproteiner), som støtter robuste titerevalueringer med en 1:500 fortynningsfaktor for kliniske applikasjoner. Til slutt ble den optimaliserte protokollen brukt til å overvåke Spike S1 serokonversjon for forsøkspersoner (n = 4) som fullførte et SARS-CoV-2 vaksineregime. Innenfor denne kohorten ble Spike S1 IgG-nivåer observert for å nå maksimale titere ved 14 dager etter andre doseadministrasjon, med en mye høyere (~ 40 ganger) signalintensitet enn enten IgM- eller IgA-isotyper. Interessant nok observerte vi svært variable Spike S1 IgG-titerforfallsrater som i stor grad var fagavhengige, noe som vil være tema for fremtidige studier.
Introduction
Samtidig måling av flere sykdomsrelaterte biomarkører i biologiske prøver tillater beskrivende og prediktiv innsikt i patologiske prosesser. Mens konvensjonelle enkeltanalyttimmunologiske prosedyrer, som enzymbundne immunosorbente analyser (ELISAer), har vært hjørnesteinen i kvantitative analyser i både kliniske og forskningsmiljøer, kan disse teknikkene ha betydelige begrensninger når det gjelder gjennomstrømning, mengden prøve som kreves for hver måling, og kostnadseffektivitet som i stor grad begrenser studiet av flere biologiske elementer som ofte er sammenflettet gjennom hele sykdomsforløpet1. . Mikrosfærebasert multipleksingsteknologi har blitt en uunnværlig plattform for både diagnostiske og forskningsfasiliteter for sin evne til å kombinere analyser for å forbedre laboratoriegjennomstrømningen, redusere prøvemangel og redusere repeterende testing for å maksimere kostnadsbesparelsene 1,2,3,4. Nylig har ytterligere utvidelse av denne multiplekse kraften blitt introdusert med instrumenter som har dual-reporter evner. Dual-reporter-funksjonen implementerer to fluorescerende kanaler for deteksjon, og leverer en annen dimensjon av multipleksing, slik at deteksjon av flere epitoper på samme analytt.
Alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er patogenet som er ansvarlig for den nåværende koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) pandemi5. Mens RT-PCR-testing er avgjørende for infeksjonsbekreftelse i begynnelsen av sykdomsforløpet, har serologiske undersøkelser av antistofftitler vist seg å være avgjørende for nøyaktig og fullstendig kritikk av enkeltpersoner angående tidligere eksponering eller gjenoppretting; et svar på immunisering; og/eller en evaluering av covid-19 vaksinasjonseffekt 6,7.
Denne rapporten avgrenser metoder for å måle serokonversjon for flere SARS-CoV-2 virale antigener som bruker et strømningsbasert dobbeltrapporteringssystem med multipleksleser. Nærmere bestemt er samtidig deteksjon av to antistoffundertyper (konfigurert som IgG/IgM eller IgA/IgM) for et 3-plex SARS-CoV-2 antigenpanel som inkluderer analyser for Spike S1, Nucleocapsid og Membrane (aka Matrix) glykoproteiner, beskrevet. Denne tilnærmingen gir en ideell bedrift for fangst av langsgående serokonversjon og bidrar med et verdifullt verktøy i arsenalet mot Covid-19-pandemien.
Protocol
Alle ble påmeldt med skriftlig informert samtykke med full institutional review board (IRB) godkjenning av Rush University Medical Center under protokoll ORA 20101207 med alle institusjonelle retningslinjer for etisk forskningsatferd observert. Blod ble samlet inn via konvensjonell phlebotomy i lavendel vacutainers (K2EDTA) og behandlet med anbefalte protokoller. Det resulterende plasmaet ble arkivert ved -80 °C til vurderinger ble utført.
1. Fremstilling av antigenkonjugede mikrosfærer
- Velg tre forskjellige hetteglass med magnetiske mikrosfærer med unike perleregioner, opptak av perle-ID og partiinformasjon for hvert hetteglass som brukes.
MERK: Følgende trinn vil bli fulgt for hver distinkte mikrosfæreregion. Mikrosfærer er lysfølsomme og bør beskyttes mot langvarig eksponering for lys. Under vasketrinnene, vær forsiktig så du ikke forstyrrer mikrosfærene. Hvis forstyrret, la en annen 60 s separasjon. - Virvel mikrosfæren lager for 60 s og sonikere i 5 min før bruk for å dissosiere aggregerte perler.
- Overfør 1,0 x 106 perler til en 1,5 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør.
- Sett røret inn i en magnetisk separator og la separasjon skje i 60 s. Med røret fortsatt i magnetseparatoren, fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre perlepellet.
- Fjern røret fra magnetseparatoren, resuspend perlene med 100 μL HPLC-klasse vann og virvel i 30 s. Plasser røret tilbake i magnetseparatoren i 60 s, og fjern deretter supernatanten. Gjenta denne vaskeprotokollen to ganger.
- Fjern røret fra magnetseparatoren og resuspend de vaskede mikrosfærene i 90 μL 100 mM monobasisk natriumfosfat, pH 6.2 (Aktiveringsbuffer) med virvel i 30 s.
- Tilsett 10 μL 50 mg/ml Sulfo-NHS (fortynnet med aktiveringsbuffer) til mikrosfærene og virvelen forsiktig i 10 s. Tilsett 10 μL 50 mg/ml EDC-oppløsning (fortynnet med aktiveringsbuffer) og virvel forsiktig i 10 s. Inkuber mikrosfærer i 20 min ved romtemperatur (RT) med en mild virvel hvert 10.
- Gjenta vasketrinnene 1,4-1,5 med 50 mM MES, pH 5,0 (koblingsbuffer) i stedet for LC/MS-grade vann i totalt to vasker.
- Fjern røret fra magnetseparatoren og resuspend perlene med 100 μL koblingsbuffer med virvel i 30 s etterfulgt umiddelbart av tilsetning av ønsket mengde protein.
- Bring det totale volumet til 150 μL med koblingsbuffer. Bland koblingsreaksjonen med virvel i 30 s og inkuber i 2 timer ved rotasjon ved RT.
MERK: For analyser definert heri ble det utført konjugeringer med følgende proteinkonsentrasjoner: Spike S1: 5 μg; Nukleocapsid: 5 μg; Membran: 12,5 μg. - Gjenta vasketrinnet 1,4 med fosfatbufret saltvann (PBS)-1% geitserum albumin, 0,01% polysorbat-20 (quench buffer) i stedet for LC / MS-grade vann for totalt to vasker. Resuspend de vaskede mikrosfærene i 100 μL slukkebuffer som inneholder 0,05% natriumazid med virvel i 30 s.
MERK: La perlene slukke helt i minst 6 timer før du går videre til en annen prosedyre. - Tell antall gjenvunne mikrosfærer ved hjelp av en automatisert celleteller eller et hemocytometer. Registrer den observerte perlekonsentrasjonen.
- Kjøl de koblede mikrosfærene ved 4 °C i mørket.
2. Prosedyrer
- Analyseytelse (basisprotokoll)
- Resuspend de koblede mikrosfærene med virvel i 30 s og soniker for ~ 60-90 s.
- Fjern den nødvendige mengden av hver perlekolloid fra det respektive røret og kombiner perlekolloidene i et nytt 1,5 ml mikrosenterrør.
- Sett røret inn i en magnetisk separator og la separasjon skje i 60 sek. Med røret fortsatt i magnetseparatoren, fjern forsiktig supernatanten uten å forstyrre perlepellet.
- Fjern perlene fra separatoren, resuspend perlene med 100 μL PBS-1% bovint serumalbumin, 0,01% Polysorbat-20 (Analysebuffer) og virvel i 30 s. Plasser røret i en magnetisk separator og la separasjon skje i 60 s. Gjenta denne vaskeprotokollen (dvs. trinn 2.1.3-2.1.4) to ganger
- Juster konsentrasjonen av 3-plex fungerende mikrosfæreblanding ved å legge til et passende volum analysebuffer for å generere en endelig konsentrasjon på 100 mikrosfærer per 1 μL for hvert mål.
- Aliquot 12,5 μL mikrosfæreblanding tilberedt i trinn 2,1,5 i hver brønn på en 384-brønnsplate eller 25 μL i hver brønn på en 96-brønns plate.
- Fortynn plasma/serumprøvene 500 ganger i analysebufferen. Forbered standardprøver i henhold til titrering ønsket.
- Tilsett 12,5 μL analysebuffer som den tomme prøven og tilsett hver av de fortynnede prøvene eller standardene i hver utpekt brønn av en 384-brønns prøveplate eller 25 μL av den tomme, fortynnede prøven eller standarden i hver brønn av en 96-brønns prøveplate.
- Dekk platen med en aluminiumsforsegling eller folie og inkuber i 1 time ved RT på en plate shaker satt til 700 rpm.
MERK: Skjematisk for fortynningskurvene er angitt i tabell 1. - Forbered en løsning av anti-menneskelige deteksjonsantistoffer (sekundære antistoffløsninger) ved 4 μg/ml med analysebuffer som angitt i trinn 2.1.11.
- Forbered geit-anti-menneskelig IgM, konjugert med Super Bright 436 (SB)/Goat-anti-human IgA, Phycoerythrin (PE) Konjugat deteksjon antistoffer ved 4 μg/ml; eller Geit-anti-menneskelig IgM, SB Conjugate/Geit-anti-menneskelig IgG, PE Conjugate påviser antistoffer ved 4 μg/ml.
MERK: For et 384-brønns plateformat er det nødvendig med 12,5 μL/brønn av den tilberedte sekundære antistoffløsningen, og for et 96-brønns plateformat er det nødvendig med 25 μL/brønn. - Plasser platen på en magnetisk separator, vask raskt og inverter kraftig over en biofarebeholder for å fjerne væske fra brønnene. Med platen fortsatt invertert, trykk kraftig på platen mot en tykk vad av papir.
- Vask hver brønn med 100 μL analysebuffer og fjern væsken ved kraftig inversjon over en biofarebeholder, som tidligere beskrevet. Gjenta disse trinnene (2.1.12-2.1.13) for totalt to vasker. Kast alle brukte vads av papir i en biofarebeholder.
- Tilsett 12,5 μL av den sekundære antistoffarbeidsløsningen til hver brønn av en 384-brønnsplate eller 25 μL til hver brønn på en 96-brønns plate. Dekk platen med en aluminiumsforsegling eller folie og inkuber i 30 min på RT på en plate shaker satt til 700 rpm.
- Gjenta vasketrinnene 2.1.12-2.1.13
- Tilsett 75 μL analysebuffer i hver brønn på en 384-brønnsplate eller 100 μL i hver brønn på en 96-brønnsplate. Dekk platen med en aluminiumsforsegling eller folie og inkuber i 5 min på RT på en plate shaker satt til 700 rpm.
- Analyser 60 μL via instrumentanalysatoren i henhold til systemhåndboken.
- Optimalisering av inkubasjonstid for prøvefangst
- Utfør trinnene i avsnitt 2.1 med varighet av inkubasjonstider på 30 min, 60 min og 120 min i trinn 2.1.9.
MERK: Inkubasjoner kan utføres enten med distinkte plater eller ved å sette den på pause i trinn 2.1.6 til tiden for å gå videre til trinn 2.1.9. for å oppnå de ønskede inkubasjonstidene. - Fortsett med plateavlesningen på analysatoren ved hjelp av 60 μL av analyseblandingen i henhold til produsentens anbefalinger.
- Utfør trinnene i avsnitt 2.1 med varighet av inkubasjonstider på 30 min, 60 min og 120 min i trinn 2.1.9.
- Optimalisering av sekundær antistoffkonsentrasjon
- Utfør denne prosedyren som beskrevet i pkt. 2.1, med unntak av de endelige konsentrasjonene av reagenser i den sekundære antistoffarbeidsløsningen (fremstilt i trinn 2.1.10-2.1.11) modifisert som følger:
Geit-anti-menneskelig (eller kanin) IgM, SB-konjugat deteksjon antistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg/ ml.
Geit-anti-menneskelig (eller kanin) IgA, PE-conjugate deteksjon antistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg / ml.
Geit-anti-menneskelig (eller kanin) IgG, PE-konjugat deteksjon antistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg / ml.
Geit-anti-menneskelig (eller kanin) IgG, PE-konjugat/Geit-anti-menneske (eller kanin) IgM, SB-konjugatdeteksjon antistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg/ml.
Geit-anti-menneskelig (eller kanin) IgA, PE-konjugat/Geit-anti-menneske (eller kanin) IgM, SB-konjugatdeteksjonsantistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg/ml. - Fortsett med plateavlesningen på analysatoren ved hjelp av 60 μL av analyseblandingen i henhold til produsentens anbefalinger.
- Utfør denne prosedyren som beskrevet i pkt. 2.1, med unntak av de endelige konsentrasjonene av reagenser i den sekundære antistoffarbeidsløsningen (fremstilt i trinn 2.1.10-2.1.11) modifisert som følger:
- Optimalisering av sekundær antistoff inkubasjonstid
- Utfør denne prosedyren som beskrevet i avsnitt 2.1 med 15 min, 30 min, 60 min og 120 min inkubasjonsvarighet definert i trinn 2.1.14.
- Fortsett med plateavlesningen på analysatoren ved hjelp av 60 μL av analyseblandingen i henhold til produsentens anbefalinger.
- Evaluering av fagprøver med optimaliserte tokanalsanalyser
- Samle inn plasmaprøver (n = 4) på dagene -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 og +120 i forhold til fullføring av Covid-19-vaksine (dvs. andre dose) administrasjon.
MERK: Dag 0 representerer tidspunktet da vaksinasjonen ble fullført. - Utfør alle analyser ved hjelp av Base Protocol (avsnitt 2.1.) som enten en IgG/IgM- eller IgA/IgM tokanalsanalyse.
- Normaliser resultatene til den maksimale observerte median fluorescerende intensitetsverdien (MFI) for hver spesifikke immunglobulin og analyse.
- Samle inn plasmaprøver (n = 4) på dagene -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 og +120 i forhold til fullføring av Covid-19-vaksine (dvs. andre dose) administrasjon.
Representative Results
Typiske analyseresultater og ytelsesevalueringer
Immunobeadanalyser gir vanligvis en sigmoidal kurve når de evalueres over flere (logg) størrelsesordener, som illustrert i hvert av panelene som presenteres i figur 1. Brukeren må eksperimentelt definere det optimale konsentrasjonsområdet for hver analytt i multipleksen for å bestemme hele spekteret av kvantitet, og sikre å ikke overprøve det ekstreme (områder som nærmer seg den nedre grensen for kvantitet [LLOQ] eller øvre kvantitetsgrense [ULOQ]). Det faktiske området som kreves for en analyse, er imidlertid diktert av fordelingen av målanalyttene i en biologisk matrise (dvs. de 'ukjente') ved en gitt fortynningsfaktor. Videre, selv om standardkurver vanligvis tolkes via lineær regresjon med en 4- eller 5-parametrisk tilpasningsalgoritme, gir den lineære delen av en gitt kurve vanligvis størst tillit til kvantitativ nøyaktighet med en lineær (y = mx + b) kvantitetsmodell. Å matche kalibreringskurven med de observerte verdiene for en ukjent ved en gitt fortynningsfaktor bør være målet i kvantitativ analyseutvikling.
I denne forbindelse ble en 7-punkts standardkurve basert på en 1:5 seriell fortynningsserie evaluert for hver av Spike S1, Nukleocapsid og membranantistoffer som varierer mellom 1 μg/ml og 0,000064 μg/ml for Spike S1 og Nucleocapsid og 5 μg/ml og 0,00032 μg/ml for membran, som vist i figur 1. Den nedre grensen for deteksjon (LLOD) for hver analyse ble definert som den laveste analyttkonsentrasjonen som ga et signal som skiller seg fra bakgrunnen. LLOD kan identifiseres ved ligningen beskrevet tidligere 8,9, LLOD = LoB + 1,645 (SDlav konsentrasjonsprøve). LoB er den nedre grensen for blank, og det er den "tilsynelatende" konsentrasjonen av analytt som produseres fra det tomme når en nullverdi forventes, og det kan fastslås ved hjelp av denne ligningen LoB = Gjennomsnittligblank + 1.645(SDtom)8. Basert på denne metoden varierte MFI-verdiene for Spike S1-analysen fra 134,38 til 20191,2, med 134,38 MFI som representerer 0,00024 μg/ml og definert som LLOD. For membrananalysen var det praktiske MFI-området 52,24 til 4764,9, med 52,24 MFI beregnet til å være 0,004885 μg/ml og tildelt som LLOD. MFI-serien for Nucleocapsid-analysen var 517,9 til 19666,34, med 517,9 spesifisert som 0,00024 μg/ml, som var LLOD. Den øvre grensen for deteksjon (ULOD) er definert som konsentrasjonen av analytt hvoretter endringen i MFI ikke lenger er lineær, og signalresponsen er mettet. Det skal bemerkes at den fulle sigmoidale karakteren til disse kurvene ikke er observerbar for standardene som er testet, med unntak av Nucleocapsid-kurven. Men gitt de observerte MFI-verdiene for alle ukjente analysert til dags dato (ved en 1:500 fortynning) er innenfor det presenterte kurveområdet for hver analytt og er lett kvantifisert ved hjelp av en 4- eller 5-parametrisk passform via lineær regresjon.
Analysepresisjon
Intraanalysepresisjon: Fire replikeringer av analyser ble utført på samme plate for å vurdere analysepresisjon, beregnet som %CV, eller kvotienten av standardavviket og gjennomsnittet multiplisert med 100. Standardpunkt 2 og 5 ble valgt for disse tabulasjonene, med verdier katalogisert i tabell 2. Den typiske akseptable øvre grenseterskelen for %CV-verdier er ≤20 %, som ble observert for disse dataene, med unntak av det for standard 2 av membran IgG, som sannsynligvis skyldes bakgrunnsnivåer og kan rettes opp ved å eliminere ytre verdier (data vises ikke). Det skal bemerkes at det ble observert en tilsynelatende ustabilitet til leseverdi for membrananalyser der MFI-verdiene ble <200, oftest når det gjelder IgA- og IgM-isotyper.
Interanalysepresisjon: Tre forskjellige partier perlesett ble utarbeidet for hver analyse og testet, som definert for intraanalysepresisjon (over og som vist i figur 1). Variasjon mellom analyser ble vurdert ved å beregne %CV fra gjennomsnittsresultatene for hver av tre partier, som vist i tabell 3. Igjen er den øvre grenseterskelen for en akseptabel %CV satt til ≤20%, som eksisterer for alle testede forhold (med en lignende effekt med standard 2 av membran IgG, som vist ovenfor). Det skal bemerkes at batch-til-batch variasjon i netto MFI-verdier ofte observeres i flere partier av samme immunoreagenser under tilpasset analyseutvikling. Bruk av en kalibreringskurve reist fra et kommersielt oppnådd anti-mål antistoff (f.eks. kanin anti-Spike S1) etterfulgt av et anti-arts deteksjonsantistoff kan gi konsistens i de analytiske resultatene og tillate sammenligninger mellom flere partier i forskjellige tidsperioder.
Interanalysepresisjon med menneskelige prøver: Evalueringen av interanalysepresisjon ble gjentatt med humane plasmaprøver (n = 5) samlet inn innen en måned etter første rapporterte symptomer for en SARS-CoV-2-infeksjon; utført med tre forskjellige grupper av analyser (dvs. forskjellige preparater av perlesettene). Disse resultatene vises i tabell 4 og viser presisjon med en %CV-verdi med den typiske øvre grenseverdien for øvre terskelverdi på ≤20 %. De gjennomsnittlige %CV-verdiene for spike S1-, nukleocapsid- og membrane-IgG-titere ble beregnet til henholdsvis 9,9 % (område 2,6 %-18 %), 11,0 % (område 3,5 %-24,4 %), og 7,6 % (område 3,2 %-12,9 %). Lignende observasjoner ble gjort med IgM- og IgA-titerne til disse tre analyttene, som alle ga %CV-verdier <20%. Det eneste unntaket til dette var Subjekt 5 IgM-titere for membranproteinet, som senere ble utelukket som en outlier. Presisjonsverdiene for de menneskelige emneevalueringene er i samsvar med de som er sett ovenfor for kaninantistoffene, noe som antyder at disse analysene lett kan omkonfigureres for å evaluere titere av antigenene i flere arter med liten innvirkning på analysepresisjon. Som nevnt ovenfor var det en tilsynelatende ustabilitet å lese verdier observert for membrananalyser der MFI-verdiene ble <200, oftest når det gjelder IgA- og IgM-isotyper.
Optimalisering av primær antistoffkonsentrasjon
Analytten 'fangsttid' ble evaluert med de antigenkonjugede perlene, og antistoffene i plasmaprøvene eller i standardene ble testet ved å endre lengden på den primære inkubasjonen (30 min, 1 t, 2 t og 4 t). Forskjellen i gjennomsnittlig MFI presenteres som kvotienten til en bestemt inkubasjon og maksimal inkubasjonstid, kalt % Maks., i figur 2, mellom en 30 min inkubasjon (minimum varighet) og en 4 timers inkubasjon (maksimal varighet). Verdiene på 120 min var optimale for IgG-titere for Spike S1, membranen og nukleocapsid-antistoffene, noe som indikerer et raskt primært antistoffbindende kinetikk, noe som gir fleksibilitet til å øke analysens gjennomstrømning. Imidlertid ble det observert langsommere kinetikk for isotypene IgA og IgM (data ikke vist), noe som viser toppfangstnivåer ved 4-timers tidspunktet, som vist i figur 2. Samlet sett er det en balanse mellom nærliggende analysemetning og den praktiske tiden for å kjøre hver analyse når den er i produksjon (for å maksimere gjennomstrømningen). Med dette ble egnede signaler for kvantitative formål ved minimal inkubasjonstid på 30 min for IgG, 60 min for IgM og 120 min for IgA observert i disse funnene.
Sekundær optimalisering av antistoffkonsentrasjon
Fem konsentrasjoner av sekundære antistoffer (geit antimenneskelig IgG, PE-konjugert; geit antimenneskelig IgA, PE-konjugert; geit antimenneskelig IgM, SB-konjugert) ble testet (0,5, 1, 2, 4 og 8 μg/ml). Alle antistoffer avslørte et bredt spekter av signal, uten åpenbar signalmetning i noen tilstand, og sikret dermed en lineær måling for noen av konsentrasjonene. Som et eksempel var det gjennomsnittlige signalet generert fra Spike S1-analysen ved hjelp av geit antimenneskelig IgM, SB-konjugert ved 0,5 μg/ml 13,2% av MFI generert fra det maksimale signalet (8 μg/ml), mens MFI generert fra 4 μg/ml var 73,3% av MFI manifestert ved det maksimale signalet. Detaljer om signalområdet fra de andre Spike S1 antistoffisotypene, membranantistoffene og nukleocapsid-antistoffene er inkludert i tabell 5 og figur 3. Som et praktisk punkt reflekteres den primære effekten mellom den optimale sekundære antistoffkonsentrasjonen og den tidligere angitte 4 μg/ml sekundære antistoffkonsentrasjonen når det gjelder analysefølsomhet og analysekostnader. Det vil si at en sekundær antistoffkonsentrasjon på 8 μg/ml kan være ønskelig ved påføring med lave antistofftitre eller lave mengder verdifull prøve, men kostnaden forbundet med disse analysene vil være betydelig høyere enn bruken av den tidligere definerte 4 μg/ml-konsentrasjonen. Omvendt, tilfeller der høye antistofftitler skulle observeres (for eksempel personer som har opplevd Covid-19 vaksinasjoner eller med ikke-begrensende mengder sera) ville se en kostfordel gjennom anvendelsen av de lavere mengdene sekundære antistoffer (f.eks. 1 μg / ml).
Optimalisering av sekundært antistoffinkubasjon
Den potensielle påvirkningen av varigheten av den sekundære antistoffinkubasjonen ble også undersøkt ved å endre lengden på inkubasjonen (15, 30, 60 og 120 min). Generelt er forskjellen i gjennomsnittlig MFI som presentert som kvotienten til en bestemt inkubasjon og maksimal inkubasjonstid, begrepet %Max, mellom en inkubasjon på 15 minutter (minimumsvarighet) og en inkubasjon på 120 minutter (maksimal varighet) oversteg ikke henholdsvis 30 %, 55 % og 50 % for henholdsvis Spike S1, membranen og nukleocapsid-antistoffene, noe som indikerer et raskt kinetisk trinn i sekundær antistoffbinding og et middel for å øke analysen gjennom analysen. Tabell 6 inneholder detaljer om signalendringer for alle inkubasjonstider. Illustrasjoner av de observerte signalene fra ulike inkubasjoner av denne analysen er vist i figur 4.
Tokanals ytelse og spesifisitet
For hver analytt ble et enkelt reporterformat kjørt (bare IgG-PE, bare IgA-PE eller IgM-SB) sammenlignet med signalet som ble generert for samme analytt da det ble kjørt i et dobbeltreporterformat (f.eks. Spike S1 IgG-PE bare versus Spike S1 IgG-PE i kombinasjon med Spike S1 IgM-SB i dobbeltreporterformat). Analysepresisjon (uttrykt som %CV) for signalene som ble opprettet i de to formatene, ble brukt til å analysere forholdet i funnene i dette eksperimentet. %CV-verdiene for Spike S1-analysene var henholdsvis 6,19 %, 16,4 % og 23 % for henholdsvis IgM, IgG og IgA. For membrananalysen var verdiene %CV henholdsvis 3,3 %, 7,9 % og 16,4 % for IgM, IgG og IgA. Til slutt ga Nucleocapsid-analysen %CV-verdier på henholdsvis 8,7 %, 10,3 % og 24,2 % for IgM, IgG og IgA. Presisjonsverdiene som observeres for IgM- og IgA-isotypene, antyder at en lengre inkubasjonstid kan gi overlegne analyseresultater på grunn av de kjente bindingskinetiske forskjellene på tvers av disse klassene av immunglobuliner. Figur 4 viser avtalen mellom formatene for ulike konsentrasjoner av sekundære antistoffer.
For å bekrefte spesifisiteten til reporterkanaler ble en enkelt reporterkanal testet samtidig mens den andre kanalen ble tildelt som en tom for å spørre om det ikke-spesifikke signalet (blødningseffekt). Disse funnene tyder på at det er ubetydelig krysssignalforurensning mellom de to reporterkanalene, gitt den høye spesifisiteten på tvers av spekteret av forhold. Disse funnene er illustrert i figur 5. Totalt sett observerte vi en interferens på 6,45 % på tvers av kanal 1 til kanal 2. Men når størrelsen på signalene ble gjort rede for, observerte vi følgende potensielle interferensnivåer i dobbel reportermodus: Spike IgG / IgM ved 71,98%, Spike IgA / IgM ved 28,11%; Membran IgG/ IgM ved 7,41%, Membran IgA / IgM ved 134,61%; nukleocapsid IgG / IgM ved 146,03%, Nucleocapsid IgA / IgM ved 112,13%. I den angitte konfigurasjonen vil dette kreve måling av Spike IgM i kombinasjon med IgA-isotypen, Membrane IgM med IgM-isotypen og nukleocapsid-målinger som ikke utføres i tokanalsformat. Dette funnet kan kreve utforskning av inversjon av merkingsstrategien der IgA og IgG måles i kanal 2 og IgM i kanal 1.
Evaluering av serokonversjonshendelser etter Covid-19-vaksinasjon
Serokonversjon ble overvåket i fire etter vurdering av IgA, IgM og IgG med Spike S1-analysen på tidspunkter som spenner fra pre-vaksinasjon til fire måneder etter ferdigstillelse av Covid-19 vaksinasjonsserien. Målinger ble utført i tokanalsmodus (IgG/ IgM og IgA / IgM, med IgM-verdier i gjennomsnitt). Alle forsøkspersonene fikk vaksinen som en 2-trinns immunisering, per standard praksis, med et 21-dagers intervall mellom første og andre doser. Plott av hvert emnes immunrespons er vist i figur 6A-C. Immunresponsverdier for nukleocapsid- og membranantigenene ble observert på bakgrunnsnivå for alle immunglobuliner evaluert (data ikke vist), noe som var i samsvar med at forsøkspersonene ikke hadde noen dokumentert tidligere SARS-CoV-2-infeksjon i tiden før vaksinering. Totalt sett var de observerte Spike S1 IgA- og IgM-verdiene omtrent 40 ganger lavere enn IgG-isotypetitrene, med topptitere som krøp så snart som 14 dager for både IgM- og IgG-isotyper og IgA-isotypen nådde topptitre mellom tidspunktet for den andre dosen (dag 0) og 14 dager etter andre dose, avhengig av motivet. Spesielt begynner Spike S1 IgG-titerne å forfalle i løpet av de fire månedene etter fullføring av vaksinasjon med svært variabel hastighet, på en fagavhengig måte.
Figur 1: Representative 3-plex standardkurver. Representative standardkurver for de tre analyttene; presenteres som en 7-punkts, 1:5 seriell fortynningskurve som starter ved (A) 1 μg/ml for Spike S1, (B) 5 μg/ml for membran og (C) 1 μg/ml for nukleocapsid og antistoffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Optimalisering av primær antistoff/prøve inkubasjonstid: Det gjennomsnittlige MFI-signalet produsert fra ulike inkubasjonstider for primær antistoff/prøver (antistofffangst) fra 30 min til 4 timer for standard 1-7 (som angitt i tabell 1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sekundære antistoffkonsentrasjonsoptimaliseringer og tokanalsytelse. Kurver illustrerer den gjennomsnittlige MFI (normalisert til den høyeste registrerte verdien i serien) produsert av testede sekundære antistoffkonsentrasjoner, fra 0,5-8 μg/ml. Hver forekomst ble utført både som en enkelt- og tokanalsanalyse for å sette pris på forskjeller i det eksperimentelle formatet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Optimalisering av sekundære antistoffer inkubasjonstid, tokanalsformat. Representative plott av observerte MFI-verdier (normalisert til den høyeste registrerte verdien i serien) med hensyn til tidspunktet for inkubasjon med sekundære antistoffer. Eksperimenter ble utført som tokanalsanalyser som (A-C) IgA/IgM- eller (D-F) IgG/IgM-kombinasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Spesifisitetsvurderinger for tokanalsanalyser. Analyseresultater fra tokanalsanalyseformatet med en av hver kombinasjon utpekt som blank for å illustrere mangelen på fluorescerende eller interferens på tvers av kanaler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Illustrasjon av serokonversjon etter Covid-19-vaksinasjon. Plott som illustrerer de relative titerne av (A) IgG, (B) IgM og (C) IgA-antistoffer for Spike S1-antigenet i løpet av Covid-19-vaksinasjonen (Pre-vaksinasjon - 4 måneder etter ferdigstillelse); tiden er vist i dager i forhold til ferdigstillelse av vaksinasjonsserien; generelle punkter i vaksineadministrasjonen er indikert (røde linjer). Eksperimenter ble utført i tokanalsmodus, som beskrevet i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Standardnummer | Fortynningsserie | Anti-Spike S1 eller N (μg/ml) | Antimembran (μg/ml) |
| Blank | Blank | - | - |
| 1 | STD7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | STD6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | STD5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | STD4 1:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | STD3 1:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | STD2 1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | STD1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |
Tabell 1: Fortynningsserier for standardkurver: Tabell over fortynningsfaktorer som brukes for standardkurvene for IgG-serotypen; presenteres som en 7-punkts, 1:5 seriell fortynningskurve som starter på 1 μg/ml for α-Spike S1 og α-Nucleocapsid og 5 μg/ml for α-membran antistoffer.
| Analytt | Eksempel | Rep 1 | Rep 2 | Rep 3 | Rep 4 | Ave | Sd | %CV |
| Innsamlingslager S1 | STD2 | 369.4 | 356.9 | 295.2 | 271.5 | 323.3 | 47.4 | 14.6 |
| STD5 | 3869.1 | 3437 | 3970.2 | 4240.7 | 3879.3 | 334 | 8.6 | |
| Membran | STD2 | 40.6 | 37.7 | 49.9 | 27.8 | 39 | 9.1 | 23.3 |
| STD5 | 733.2 | 731.3 | 724 | 678.1 | 716.7 | 26 | 3.6 | |
| Nukleocapsid | STD2 | 1746.7 | 1790.8 | 1577.3 | 1664.8 | 1694.9 | 94.2 | 5.6 |
| STD5 | 15598.1 | 14735.5 | 18369.5 | 17408.5 | 16527.9 | 1657.7 | 10 |
Tabell 2: Intraanalysepresisjon: Prosentvariasjonskoeffisient (%CV) beregnet fra fire replikeringer av standard antistoffblandinger ved standard 2 (STD2) og standard 5 (STD5) med en enkelt analysegruppe i samme eksperiment. Verdier som er angitt for replikeringer og gjennomsnitt, representerer de observerte MFI-verdiene.
| Analytt | Eksempel | Bunke 1 | Bunke 2 | Bunke 3 | Ave | Sd | %CV |
| Innsamlingslager S1 | STD2 | 383.2 | 424.4 | 379.9 | 395.8 | 24.8 | 6.3 |
| STD5 | 5639.7 | 6062.5 | 6384.3 | 6028.8 | 373.4 | 6.2 | |
| Membran | STD2 | 39.1 | 58.5 | 59.1 | 52.2 | 11.4 | 21.8 |
| STD5 | 732.3 | 941.4 | 701.1 | 791.6 | 130.7 | 16.5 | |
| Nukleocapsid | STD2 | 1342.6 | 1621 | 1718.2 | 1560.6 | 195 | 12.5 |
| STD5 | 13543.9 | 14843.2 | 17883.4 | 15423.5 | 2227.2 | 14.4 |
Tabell 3: Interanalysepresisjon med standardprøver: Prosentvariasjonskoeffisient (%CV) beregnet fra tre forskjellige grupper med analyser, evaluert ved standard 2 og standard 5 i samme eksperiment. Verdier som er angitt for replikeringer og gjennomsnitt, representerer de observerte MFI-verdiene.
| IgG-PE | IgM-SB | IgA-PE | |||||
| Gj.snittlig MFI | %CV | Gj.snittlig MFI | %CV | Gj.snittlig MFI | %CV | ||
| Innsamlingslager S1 | Emne 1 | 8002.3 | 17.7 | 1949.5 | 1.3 | 2045.8 | 5.5 |
| Emne 2 | 19155.8 | 7.3 | 918.6 | 4.1 | 1684.5 | 3.9 | |
| Emne 3 | 17865.6 | 18.0 | 549.4 | 3.8 | 961.3 | 8.1 | |
| Emne 4 | 11901.1 | 2.6 | 1603 | 4.8 | 8736.4 | 5.5 | |
| Emne 5 | 9801.8 | 4.0 | 1014.1 | 3.0 | 2747.6 | 9.3 | |
| Nukleocapsid | Emne 1 | 15097.8 | 11.3 | 1049.7 | 9.9 | 5276.5 | 3.9 |
| Emne 2 | 15204.3 | 12.1 | 265.9 | 5.2 | 6761.3 | 11.9 | |
| Emne 3 | 18471.7 | 24.4 | 329.1 | 4.5 | 14308 | 2.9 | |
| Emne 4 | 16424.7 | 3.5 | 2418.1 | 0.1 | 4234.7 | 4.2 | |
| Emne 5 | 13344.9 | 3.6 | 225.6 | 10.0 | 13436.5 | 9.7 | |
| Membran | Emne 1 | 514.6 | 8.6 | 180.6 | 14.0 | 141.2 | 9.8 |
| Emne 2 | 196.8 | 5.2 | 57 | 20.7 | 55.5 | 13.0 | |
| Emne 3 | 553.7 | 12.9 | 54.5 | 21.2 | 191.2 | 18.6 | |
| Emne 4 | 377.9 | 3.2 | 68.1 | 22.1 | 62 | 2.3 | |
| Emne 5 | 325.4 | 8.2 | 11.4 | 91.6 | 74.6 | 20.8 |
Tabell 4: Interanalysepresisjon med menneskelige prøver: Gjennomsnittlig prosentvariasjonskoeffisient (%CV) beregnet fra tre grupper analyser testet med plasmaprøver (fortynnet 500 ganger) fra fem personer med SARS-CoV-2-infeksjoner.
| Innsamlingslager S1 | Membran | Nukleocapsid | |||||
| μg/ml | Gj.snittlig MFI | % maks. | Gj.snittlig MFI | % maks. | Gj.snittlig MFI | % maks. | |
| Igm | 0.5 | 186 | 13.2 | 32 | 25.2 | 132.7 | 13.6 |
| 1 | 304.2 | 21.6 | 45.8 | 36 | 194.4 | 19.9 | |
| 2 | 664.5 | 47.2 | 78.8 | 61.9 | 458.2 | 47 | |
| 4 | 1032.1 | 73.3 | 101.3 | 79.6 | 707.8 | 72.6 | |
| 8 | 1407.1 | 100 | 127.2 | 100 | 975 | 100 | |
| IgG | 0.5 | 809.7 | 4.9 | 27.5 | 15 | 1355.6 | 6.3 |
| 1 | 1696.9 | 10.2 | 40.6 | 22.2 | 2782.1 | 13 | |
| 2 | 4543.8 | 27.3 | 68.3 | 37.3 | 6661.2 | 31.2 | |
| 4 | 10003.5 | 60 | 110.7 | 60.5 | 12605.6 | 59 | |
| 8 | 16662.8 | 100 | 182.9 | 100 | 21360.6 | 100 | |
| IgA | 0.5 | 797.4 | 19.3 | 31.1 | 47.2 | 2056.5 | 16.1 |
| 1 | 1529.5 | 37 | 41.4 | 62.8 | 3869 | 30.4 | |
| 2 | 2261.3 | 54.7 | 48.6 | 73.3 | 6648.9 | 52.2 | |
| 4 | 2320.4 | 56.2 | 48.3 | 73.2 | 6548.1 | 51.4 | |
| 8 | 4132.2 | 100 | 65.9 | 100 | 12744.8 | 100 | |
Tabell 5: Sekundær optimalisering av antistoffkonsentrasjon: Det gjennomsnittlige MFI-signalet produsert fra forskjellige konsentrasjoner av sekundære antistoffer fra 0,5 μg/ml til 8 μg/ml. Verdien av hvert signal presenteres også som en prosentandel av signalet ved 8 μg/ml ("Max.") for å demonstrere relativ signalstørrelse.
| Innsamlingslager S1 | Membran | Nukleocapsid | |||||
| Inkubasjonstid (min.) | Gj.snittlig MFI | % maks. | Gj.snittlig MFI | % maks. | Gj.snittlig MFI | % maks. | |
| Igm | 15 | 1185 | 72.2 | 40.4 | 48.9 | 609.5 | 53.3 |
| 30 | 1416.6 | 86.3 | 58.4 | 70.7 | 894.2 | 78.2 | |
| 60 | 1324.8 | 80.7 | 73.6 | 89.1 | 945.6 | 82.7 | |
| 120 | 1641.2 | 100 | 82.6 | 100 | 1143.2 | 100 | |
| IgG | 15 | 12917.6 | 80.5 | 244.4 | 44.9 | 15429.8 | 80.8 |
| 30 | 14915.4 | 92.9 | 434.7 | 79.9 | 18797 | 98.5 | |
| 60 | 15340.3 | 95.6 | 421.4 | 77.5 | 18694.4 | 97.9 | |
| 120 | 16050.3 | 100 | 544 | 100 | 19085.8 | 100 | |
| IgA | 15 | 3141.9 | 78.2 | 75 | 66.8 | 9103 | 86.6 |
| 30 | 3569.1 | 88.8 | 83.9 | 74.8 | 9563.8 | 91 | |
| 60 | 3539.1 | 88 | 86 | 76.6 | 9555.7 | 90.9 | |
| 120 | 4020 | 100 | 112.2 | 100 | 10512.9 | 100 |
Tabell 6: Optimalisering av sekundær antistoffinkubasjonstid: Det gjennomsnittlige MFI-signalet produsert fra forskjellige inkubasjonstider for sekundære antistoffer fra 15 min til 120 min. Verdien av hvert signal er også representert som en prosentandel av signalet ved 120 min ("Max.") for å demonstrere relativ signalstørrelse.
Discussion
Verdsettelsen av en immunrespons på SARS-CoV-2-eksponering, sammen med RT-PCR-basert overvåking av infeksjonsstatus, har blitt godt beskrevet som en resept for å avklare utvinningsforløpet fra Covid-19, for å tjene som et middel til å identifisere rekonvalesensplasma med potensiell terapeutisk verdi, og å kartlegge infeksjonsrater på befolkningsskala basis10,11. Ulike eksempler på forståelse av serokonversjon hos mennesker inkluderer protein (antigen) matriser12, immunobloter13, raske immunokromatografiske konstruksjoner14, og enzymbundne immunosorbente analyser (ELISAer)15,16,17. Hver av disse nevnte teknikkene kan vurdere flere immunglobulin isotyper individuelt med mindre modifikasjoner. Disse prosedyrene er imidlertid ikke i stand til praktisk talt å bli gjenbrukt for å tillate parallell analyse av flere isotyper, som presentert i dette manuskriptet, og gjengir kostnads- og gjennomstrømningsfaktorer som begrensninger for administrasjonen på en befolkningsbasert skalatestingsstrategi. Flere av disse programmene gir også muligheten til å sette sammen nivåer av flere antigener parallelt enten som presentert eller i endrede formater, for eksempel en multiplex ELISA18,19. Til slutt gir immunobead-plattformen muligheten til å evaluere nivåer av flere antigener parallelt 20,21, men har vært begrenset til en enkelt epitop (dvs. immunoglobulin isotype) per analyse med mindre imidlertid det nylige instrumentet med 'dual-channel' analysefunksjoner brukes.
I denne rapporten er protokoller nummerert som etablerer pålitelig måling av flere epitoper i en immunobeadanalyse ved hjelp av instrumentet i 'dual-channel' modus i en casestudie av serokonversjon av Covid-19-vaksinerte individer. Metoden viste utmerket presisjon (%CV-verdier <20%) vanligvis ved hjelp av manuell analysedesign som kan forbedres med integrering av laboratorieautomatiske systemer. Analysefølsomhet og dynamisk område for alle utvalgte analytter og epitoper var egnet for rutinemessige evalueringer. Selv om mangelen på kommersielt tilgjengelige anti-antigen IgA og IgM immunoreagenser begrenset kvantisering til IgG-isotypen, utelukker en slik begrensning ikke evnen til å tilby semi-kvantitative vurderinger eller vurderinger i forhold til en bestemt prøve som en kalibrant22,23.
Den validerte immunobeadanalysen ble allokert for å undersøke serokonversjon i en kohort av individer immunisert med Covid-19-vaksinen. I motsetning til andre lignende plattformer tillater instrumentfamilien prospektering av serokonversjon hos hundrevis av individer per dag i en manuell arbeidsflyt og tusenvis per dag i en automatisert ordning. Samlet sett bekrefter disse funnene at "dual-channel" tilnærmingen har passende følsomhet for beskrivelsen av flere epitoper parallelt for den identiske analysen og er levedyktig i en multianalyttkontekst. En forskjell i følsomhet til kanal 1 og kanal 2, som utført med henholdsvis fycoerythrin og Super Bright 436 fluoroforer, kan garantere utformingen av et spesifikt eksperiment for å sikre at levedyktige analytiske resultater oppnås for et gitt eksperiment. Det vil si at reservasjonen av kanal 1 for epitoper eller analytter av lavere prevalens kan være nødvendig for å opprettholde et dynamisk område av analysen som inkluderer de observerte verdiene til ukjente. Utover denne vurderingen var analysedesign åpenbart og bør være lett tilgjengelig for laboratorier med begrensede analytiske evner. Dette hensynet bør absolutt veies når man vurderer kanal 1 til kanal 2-interferens, som vi nevnte for figur 5, der forstyrrelser fra høyere overflodsisotyper kan forårsake villedende analytiske feil for de som er i mye lavere overflod når de måles i et tokanalsformat. Dette potensialet for interferens med situasjoner med svært forskjellige analyttkonsentrasjoner kan utgjøre en betydelig begrensning i tilnærmingen hvis den ikke håndteres riktig i analysedesignfasen.
Til slutt ble det presentert en metode for raskt å måle antistofftitre fra de store immunglobulin-isotypene forbundet med en immunrespons på Covid-19-infeksjon eller vaksinasjon. Å bruke denne tilnærmingen på en langsgående måte for å vurdere serokonversjon kan gi innsikt som kan brukes bedre til å administrere og / eller overvåke sykdomsforløpet eller alternativt veilede potensielle Covid-19 boostervaksineprogrammer.
Disclosures
Dr. Borgia er oppfinneren av den serologiske testen som brukes i dette manuskriptet som er patentsøkt. Artikkelen presenteres på en beskrivende måte bare uten statistiske analyser presentert for å unngå potensielle skjevheter introdusert av forfatterkonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Rush Biomarker Development Core for bruken av deres fasiliteter, Rush Biorepository for emnepåmelding og biospecimen-behandling, og Walder Foundations Chicago Coronavirus Assessment Network (Chicago CAN) Initiative gir tall SCI16 (J.R.S. og J.A.B.) og 21-00147 (J.R.S. og J.A.B.) og en pris fra Swim Across America Foundation (J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well black side polystyrene microtiter plates | Thermo Fisher | 12-565-346 | |
| Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Prepared in house | ||
| Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Bovine Serum Albumin, heat shock fraction | MilliporeSigma | A-7888-50G | |
| Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0) | Prepared in house | ||
| COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag) | MyBioSource | MBS8574735 | |
| Disposable pipette tips | |||
| EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher | PIA35391 | |
| Goat Albumin, Fraction V Powder | MilliporeSigma | A2514-1G | |
| IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB205009 | |
| IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB204009 | |
| IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB403009 | |
| IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB202009 | |
| IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4 | Thermo Fisher | 62999842 | |
| Instrument Analyzer | Luminex Corp. | INTELLIFLEX-RUO | |
| Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Fisher | 13-698-794 | |
| MagPlex-C Microspheres, Region XXX | Luminex Corp. | MC10XXX-01 | |
| MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate) | MilliporeSigma | M2933 | |
| Microplate aluminum sealing tape | Thermo Fisher | 07-200-683 | |
| Polysorbate-20 | Thermo Fisher | BP337-500 | |
| Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2 | Thermo Fisher | 50-751-7328 | |
| Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag) | Sino Biologicals | 40588-V08B | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag) | Sino Biologicals | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb | Sino Biologicals | 40592-T62 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb | Sino Biologicals | 40588-R0004 | |
| SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb | ProSci | 10-516 | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher | PIA39269 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Water, LC/MS grade | Thermo Fisher | W-64 |
References
- Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls. Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084 (2012).
- Powell, R. L., et al. A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239. BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).
- Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation. PLoS One. 10 (2), 0117744 (2015).
- Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far. Pathogens. 9 (3), 231 (2020).
- Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures. Chemical Engineering Journal. 423, Lausanne, Switzerland. 130189 (2021).
- La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays. Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist. Reviews. 29, Suppl 1 49-52 (2008).
- Tarhoni, I., et al. Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition. Journal of Immunological Methods. 490, 112956 (2021).
- Deeks, J. J., et al. Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652 (2020).
- Mahalingam, S., et al. Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing. Heliyon. 7 (4), 06836 (2021).
- Ruano-Gallego, D., et al. A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported. Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).
- Shah, J., et al. IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays. BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325 (2021).
- Gambino, C. M., et al. Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG. Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901 (2020).
- Algaissi, A., et al. SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients. Scientific Reports. 10, 16561 (2020).
- Chiereghin, A., et al. Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Frontiers in Public Health. 8, 620222 (2020).
- Nicol, T., et al. Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech). Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511 (2020).
- Butt, J., et al. From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome. Viruses. 13 (5), 749 (2021).
- Byrum, J. R., et al. multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Dobano, C., et al. Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731 (2021).
- Schultz, J. S., et al. Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA. Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290 (2021).
- Beavis, K. G., et al. Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).
- Jung, J., et al. Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).
