Summary
Her præsenteres et TIRF-mikroskopibaseret in vitro-rekonstitutionsassay for samtidig at kvantificere og sammenligne dynamikken i to mikrotubulipopulationer. En metode er beskrevet til samtidig at se den kollektive aktivitet af flere mikrotubuli-associerede proteiner på tværbundne mikrotubuli bundter og enkelte mikrotubuli.
Abstract
Mikrotubuli er polymerer af αβ-tubulin heterodimerer, der organiserer sig i forskellige strukturer i celler. Mikrotubulibaserede arkitekturer og netværk indeholder ofte delmængder af mikrotubuli arrays, der adskiller sig i deres dynamiske egenskaber. For eksempel eksisterer stabile bundter af tværbundne mikrotubuli i opdeling af celler i nærheden af dynamiske ikke-tværbundne mikrotubuli. TIRF-mikroskopibaserede in vitro-rekonstitutionsundersøgelser muliggør samtidig visualisering af dynamikken i disse forskellige mikrotubuli-arrays. I dette assay samles et billeddannelseskammer med overfladeimmobiliserede mikrotubuli, som enten er til stede som enkeltfilamenter eller organiseret i tværbundne bundter. Introduktion af tubulin, nukleotider og proteinregulatorer muliggør direkte visualisering af associerede proteiner og af dynamiske egenskaber af enkelt- og tværbundne mikrotubuli. Desuden kan ændringer, der opstår, når dynamiske enkeltmikrotubuli organiseres i bundter, overvåges i realtid. Metoden beskrevet her giver mulighed for en systematisk evaluering af aktiviteten og lokaliseringen af individuelle proteiner samt synergistiske virkninger af proteinregulatorer på to forskellige mikrotubuli under identiske eksperimentelle betingelser, hvorved mekanistisk indsigt, der er utilgængelige ved andre metoder, giver.
Introduction
Mikrotubuli er biopolymerer, der danner strukturelle stilladser, der er afgørende for flere cellulære processer, lige fra intracellulær transport og organelpositionering til celledeling og forlængelse. For at udføre disse forskellige funktioner er individuelle mikrotubuli organiseret i mikron-størrelse arrays, såsom mitotiske spindler, ciliære axonæer, neuronale bundter, interfase arrays og plante kortikale arrays. Et allestedsnærværende arkitektonisk motiv, der findes i disse strukturer, er et bundt mikrotubuli, der er tværbundet langs deres længder1. Et spændende træk ved flere mikrotubuli-baserede strukturer er sameksistensen af bundtede mikrotubuli og ikke-tværbundne enkeltmikrotubuli i tæt rumlig nærhed. Disse mikrotubuli subpopulationer kan vise stærkt forskellige polymerisationsdynamikker fra hinanden efter behov for deres korrekte funktion2,3,4,5. For eksempel er der inden for den mitotiske spindel stabile tværbundne bundter og dynamiske enkeltmikrotubuli til stede inden for en mikronskalaregion i cellecentret6. At studere, hvordan de dynamiske egenskaber ved sameksisterende mikrotubulipopulationer specificeres, er derfor centralt for at forstå samlingen og funktionen af mikrotubulibaserede strukturer.
Mikrotubuli er dynamiske polymerer, der cykler mellem faser af polymerisation og depolymerisation og skifter mellem de to faser i begivenheder kendt som katastrofe og redning7. Dynamikken i cellulære mikrotubuli reguleres af utallige mikrotubuli associerede proteiner (MAPs), der modulerer hastigheden af mikrotubuli polymerisation og depolymerisering og frekvenserne af katastrofe- og redningshændelser. Det er udfordrende at undersøge aktiviteten af MAPs på rumligt proksimale arrays i celler på grund af begrænsningerne i rumlig opløsning i lysmikroskopi, især i områder med høj mikrotubuli densitet. Desuden hindrer tilstedeværelsen af flere MAPs i samme cellulære region fortolkninger af cellebiologiske undersøgelser. In vitro-rekonstitutionsassays, der udføres i forbindelse med TIRF-mikroskopi (Total Internal Reflection Fluorescence), omgår udfordringerne ved at undersøge mekanismer, hvormed specifikke delmængder af MAPs regulerer dynamikken i proksimale cellulære mikrotubuli arrays. Her undersøges dynamikken i mikrotubuli samlet in vitro i nærvær af en eller flere rekombinante MAPs under kontrollerede forhold8,9,10. Imidlertid udføres konventionelle rekonstitutionsassays typisk på enkelte mikrotubuli eller på en type array, hvilket forhindrer visualisering af sameksisterende populationer.
Her præsenterer vi in vitro-rekonstitutionsassays, der muliggør samtidig visualisering af to mikrotubulipopulationer under de samme løsningsbetingelser11. Vi beskriver en metode til samtidig at se den kollektive aktivitet af flere MAPs på enkelte mikrotubuli og på mikrotubuli bundter tværbundtet af det mitotiske spindel-associerede protein PRC1. Proteinet PRC1 binder fortrinsvis ved overlapningen mellem antiparallelle mikrotubuli og tværbinder dem9. Kort fortalt består denne protokol af følgende trin: (i) fremstilling af stamopløsninger og reagenser, (ii) rengøring og overfladebehandling af dæksedler, der anvendes til at skabe billeddannelseskammeret til mikroskopiforsøg, (iii) fremstilling af stabile mikrotubuli "frø", hvorfra polymerisation initieres under eksperimentet, (iv) specifikation af TIRF-mikroskopindstillinger for at visualisere mikrotubuli dynamik, (v) immobilisering af mikrotubuli frø og generering af tværbundne mikrotubuli bundter i billedkammeret og (vi) visualisering af mikrotubulidynamik i billeddannelseskammeret gennem TIRF-mikroskopi ved tilsætning af opløseligt tubulin, MAPs og nukleotider. Disse assays muliggør kvalitativ evaluering og kvantitativ undersøgelse af MAP-lokalisering og deres virkning på dynamikken i to mikrotubulipopulationer. Derudover letter de evalueringen af synergistiske virkninger af flere MAPs på disse mikrotubulipopulationer på tværs af en lang række eksperimentelle betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered reagenser
- Der fremstilles buffere og reagenser som beskrevet i tabel 1 og tabel 2. Under forsøget skal du holde alle opløsninger på is, medmindre andet er angivet.
| Opløsning | Komponenter | Anbefalet opbevaringsvarighed | Noter | ||
| 5X BRB80 | 400 mM K-RØR, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6,8 med KOH, filtersteriliser | op til 2 år | Opbevares ved 4 °C | ||
| 1X BRB80 | 80 mM K-RØR, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 | op til 2 år | Opbevares ved 4 °C | ||
| BRB80-DTT | 1X BRB80, 1 mM DTT | op til 2 dage | |||
| Assay Buffer | 80 mM K-RØR, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8, 5% saccharose (OR 1X BRB80, 5% saccharose, 2 mM MgCl2) | op til 1 år | Opbevares ved 4 °C | ||
| Master Buffer (MB) | Analysebuffer, 5mM TCEP | 1 uge | Forbered dig på eksperimentdagen; Adskil i to rør: MB-varm ved stuetemperatur og MB-kold på is; inkludere 1 mM DTT, hvis der anvendes fluorescerende farvestoffer | ||
| Master buffer med methylcellulose (MBMC) | 1X BRB80, 0,8% methylcellulose, 5 mM TCEP, 5 mM MgCl2 | 1 uge | Forbered dig på eksperimentdagen; inkludere 1 mM DTT, hvis der anvendes fluorescerende farvestoffer | ||
| Proteinfortyndingsbuffer (DB) | MB, 1 mg/ml Bovin Serum Albumin (BSA), 1 μM ATP | 1 dag, på is | Forbered dig på eksperimentdagen; inkludere 1 mM DTT, hvis der anvendes fluorescerende farvestoffer | ||
| Oxygen Scavenging Mix (OSM) | MB, 389 μg/ml katalase, 4,44 mg/ml glucoseoxidase, 15,9 mM 2-mercaptoethanol (BME) | 1 dag, på is | Forbered dig på eksperimentdagen | ||
| Oxygen Scavenging Final (OSF) | MB, 350 μg/ml katalase, 4 mg/ml glucoseoxidase, 14,3 mM BME, 15 mg/ml glucose | brug inden for 30 min | Forbered umiddelbart før brug ved at tilsætte 1 μL glucose til 9 μL OSM | ||
Tabel 1: Liste over buffere, der anvendes i denne protokol, og deres komponenter. Se kolonnen "Anbefalet lagervarighed" for at få vejledning i, hvor lang tid i forvejen hver buffer kan udarbejdes.
| Reagens | Opbevaring koncentration | Opløsningsmiddel til opbevaring | Opbevaringstemperatur | Arbejdskoncentration | Endelig koncentration | Anbefalet opbevaringsvarighed | Noter | |||||||||
| Neutravidin (NA) | 5 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 0,2 mg/ml | 0,2 mg/ml | op til 1 år | Bruges til at immobilisere mikrotubuli via en biotin-neutravidin-biotin-kobling; opbevares i små aliquots | |||||||||
| Kappa-kasein (KC) | 5 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 0,5 mg/ml | 0,5 mg/ml | op til 2 år | Bruges til at blokere billedkammerets overflade; Opbevares i små aliquots; På eksperimentdagen skal du sætte et lille volumen til side ved stuetemperatur | |||||||||
| Bovin Serum Albumin (BSA) | 50 mg/ml | 1X BRB80 | -20°C | 1 mg/ml (i DB) | NIELSEN | op til 2 år | opbevares i små aliquots | |||||||||
| Katalase | 3,5 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 350 μg/ml (i OSF) | 35 μg/ml | op til 2 år | komponent af iltrensningsblanding; opbevares i små aliquots | |||||||||
| Glucoseoxidase | 40 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 4 mg/ml (i OSF) | 0,4 mg/ml | op til 2 år | komponent af iltrensningsblanding; opbevares i små aliquots | |||||||||
| Tubulin | Frysetørret | NIELSEN | 4°C | 10 mg/ml | 2,12 mg/ml (i tubulinblanding) | op til 1 år | Når tubulin er i opløsning, skal du holde det koldt for at undgå polymerisation. | |||||||||
| Adenosintrifosfat (ATP) | 100 mM | ultrarent vand | -20°C | 10 mM | 1 mM | Svendborg, Svendborg | Forbered opløsningen i filtersteriliseret vand, juster pH til ~ 7,0 og frys i små alikvoter. | |||||||||
| Guanosintrifosfat (GTP) | 100 mM | ultrarent vand | -20°C | 10 mM | 1,29 mM (i tubulinblanding) | Svendborg, Svendborg | Forbered opløsningen i filtersteriliseret vand, juster pH til ~ 7,0 og frys i små alikvoter. | |||||||||
| Guanosin-5'-[(α,β)-methylethylen] triphosphat (GMPCPP) | 10 mM | ultrarent vand | -20°C | 10 μM | 0,5 μM | Svendborg, Svendborg | ||||||||||
| Dithiothreitol (DTT) | 1 m | sterilt vand | -20°C | 1 mM | NIELSEN | op til 2 år | ||||||||||
| Tris(2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) | 0,5 m | filtersteriliseret vand | Rumtemperatur | 5 mM | NIELSEN | op til 2 år | ||||||||||
| Methylcellulose | 1% | sterilt vand | Rumtemperatur | 0,8% (i MBMC) | 0,21% (i tubulinblanding) | op til 1 år | Opløs methylcellulose ved langsomt at tilsætte det til næsten kogende vand. Lad afkøle under omrøring kontinuerligt. | |||||||||
| Beta-mercaptoethanol (BME) | 143 mM | sterilt vand | Rumtemperatur | 14,3 mM (i OSF) | 1,43 mM | op til 5 år | 143 mM er en 1:100 fortynding af lager BME | |||||||||
| Glukose | 150 mg/ml | 1X BRB80 | -80°C | 15 mg/ml (i OSF) | 1,5 mg/ml | op til 2 år | Føj til OSM umiddelbart før brug | |||||||||
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylsyre (Trolox) | 10mM | 1X BRB80 | -80°C | 10 mM | 1 mM | op til 1 år | Opløses ikke helt. Tilsæt lidt NaOH, rør i ~ 4 timer, og filtrer steriliser før brug | |||||||||
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5.000 | pulver | NIELSEN | -20°C | 333 mg/ml (i 0,1 M natriumbicarbonat) |
324 mg/ml (i 0,1 M natriumbicarbonat) |
Svendborg, Svendborg | Forbered ~ 34 mg aliquots, markér hvert rør med en nøjagtig vægt af pulver. Før nitrogengas over det faste stof, forsegl rørene med parafilm, og opbevar det ved -20 °C i en beholder med tørremiddel. | |||||||||
| Biotin-PEG-SVA, MW 5.000 | pulver | NIELSEN | -20°C | 111 mg/ml (i 0,1 M natriumbicarbonat) |
3,24 mg/ml (i 0,1 M natriumbicarbonat) | Svendborg, Svendborg | Forbered ~ 3 mg aliquots, markér hvert rør med en nøjagtig vægt af pulver. Før nitrogengas over det faste stof, forsegl rørene med parafilm, og opbevar det ved -20 °C i en beholder med tørremiddel. | |||||||||
Tabel 2: Liste over reagenser, der anvendes i denne protokol. Inkluderet er de anbefalede opbevaringsbetingelser og koncentrationer, arbejdskoncentrationer af stamopløsninger, der blev anvendt under forsøget, og den endelige koncentration i billeddannelseskammeret. Yderligere noter er angivet i kolonnen yderst til højre.
2. Forbered Biotin-PEG-dias
BEMÆRK: Forbered billedbehandlingskamre så tæt på starten af et eksperiment som muligt og ikke mere end 2 uger i forvejen.
- Rengør dæksedler
- Anbring et lige stort antal på 24 x 60 mm og 18 x 18 mm #1,5 dæksler (figur 1F) i henholdsvis glidefarvningsglas og glidevaskestativer (figur 1A,B). Anbring glide-vaskestativerne, der indeholder 18 x 18 mm dæksler, i et 100 ml bægerglas.
- Skyl alle dæksler 5-6 gange i ultrarent vand (18,2 MΩ-cm resistivitet), og fjern overskydende væske efter hver skylning med en pipettespids fastgjort til et vakuumrør (figur 1C).
- Fyld bægerglas og diasfarvningsglas, der indeholder dæksedlerne, med ultrarent vand, forsegl med parafilm og sonikat i 10 minutter.
- Fyld to 150 ml bægerglas med 200-bevis ethanol. Brug en pincet til at dyppe hvert dækslip i det ene bægerglas fyldt med ethanol og derefter det andet.
- Brug en pincet til at overføre dæksler til glidetørringsstativet (figur 1D), tør dem under nitrogengasstrømmen og inkuber ved 37 °C, indtil de er helt tørre (~15 min.).
- Anbring de tørrede dæksler i et enkelt lag inde i plasmarenseren. Form vakuumforsegling, og indstil derefter plasmarenserens radiofrekvensniveau (RF) til ~ 8 MHz.
- Når plasmaet er genereret, skal du lade dæksedler stå i plasmarens i 5 minutter. Sluk for plasmarenseren, og slip støvsugeren langsomt.
- Når vakuumforseglingen er frigivet, skal du vende dækslipsene om og gentage plasmarensningen i 5 minutter for den anden side af dækslipsene.
- Alternativ til plasmarensning: I stedet for trin 2.1.2-2.1.3 dækker sonikat i en varm opløsning af 2% vaskemiddel (i ultrarent vand) i 10 minutter. Vask derefter dæksedler grundigt med ultrarent vand og sonikat i ultrarent vand 2-3 gange (10 minutter hver). Vask derefter i ethanol og tør som i trin 2.1.4-2.1.5. Spring trin 2.1.6-2.1.8 over.
- Biotin-PEG behandling
- Umiddelbart før brug opløses 400 μL 3-aminopropyltriethoxysilen i 40 ml acetone. Brug pincet til at flytte plasmarensede dæksedler ind i glide-vaskestativet og glidefarvningsglassene. Nedsænk dæksler i 3-aminopropyltriethoxysilen opløsning og inkuber i 5 min12,13.
- Vask alle dæksler 5-6 gange med ultrarent vand.
- Overfør dæksler til glidetørringsstativet, tør dem under en nitrogengasstrøm og inkuber ved 37 °C, indtil de er helt tørre (~ 20 minutter).
- Læg de tørrede dæksedler på sarte arbejdsservietter, og mærk hvert dækslip på et hjørne, f.eks. »p« på hvert 18 x 18 mm dækslip og »b« på hver 24 x 60 mm dækslips (se figur 2).
- På forsøgsdagen fremstilles en frisk 0,1 M natriumbicarbonatopløsning ved at opløse 0,84 mg NaHCO3 i 10 ml ultrarent vand.
- Aliquots af mPEG-Succinimidyl Valerate (PEG-SVA) og Biotin-PEG-SVA bringes til stuetemperatur umiddelbart før brug. Se bemærkningerne til aliquotpræparatet polyethylenglycol (PEG) i tabel 2.
BEMÆRK: Arbejd hurtigt, fordi hydrolysehalvingstiden for Succinimidyl Valerate (SVA) -moiety er ~ 30 minutter. - Tilsæt 102 μL 0,1 M NaHCO3 til 34 mg PEG-SVA, spin i en bænkmikrocentrifuge ved 2,656 x g i 20 s, og bland derefter ved pipettering op og ned. 3 mg Biotin-PEG-SVA opløses i 27 μL 0,1 M NaHCO3 ved pipettering op og ned. Juster fortyndingsvolumenerne i henhold til den nøjagtige vægt af PEG, der er noteret på rørene (se tabel 2).
- 100:1 w/w PEG:biotin-PEG-blanding fremstilles ved at kombinere 75 μL PEG-SVA-opløsning og 2,25 μL Biotin-PEG-SVA-opløsning til 20 dæksler, 100 μL og 3 μL til 30 dæksler eller 125 μL og 3,75 μL til 40 dæksler.
- Konstruer et hydreringskammer ved at placere våde papirhåndklæder under tipstativet i bunden af en tom 10 μL spidskasse (figur 1E). Dette forhindrer fordampning af PEG-løsningerne.
- Pipette 6 μL af 100:1 PEG-SVA:biotin-PEG-blanding på midten af et 24 x 60 mm dækslip på den mærkede side. Placer et andet 24 x 60 mm dækslips oven på det første dækslips, således at parret danner en X-form, hvor siderne er mærket 'b' mod hinanden. Placer parret på en tom spidsholder i hydreringskammeret, og gentag for de resterende 24 x 60 mm dæksler.
- Pipette 6 μL PEG-SVA på midten af et 18 x 18 mm dækslip på den mærkede side. Placer et andet 18 x 18 mm dækslips oven på det første coverlip, hvor siderne er mærket 'p' mod hinanden. Placer parret på en tom spidsholder i hydreringskammeret, og gentag for de resterende 18 x 18 mm dæksler.
- Luk hydreringskammeret og inkuber i 3 timer eller natten over.
- Adskil parrene af dæksedler og skyl i ultrarent vand.
- Tør dæksler med en nitrogenstrøm og læg dem i en 37 ° C inkubator for at tørre helt.
- For at konstruere billedkammeret skal du sætte tre strimler dobbeltsidet tape på et 24 x 60 mm dækslips på siden mærket 'b'. På den anden side af båndstrimlerne skal du fastgøre en 18 x 18 mm dækslips med siden mærket 'p' mod det større omslag. Dette danner to flowkamre til mikroskopiforsøg med behandlede overflader vendt mod hinanden (figur 2 og figur 1G).
Figur 1: Udstyr til dækslipsbehandling og klargøring af billedkammer. (A) glidefarvningsglas til 24 x 60 mm dækslips, (B) glidevaskestativer til 18 x 18 mm dæksler, (C) vakuumopsætning, (D) glidetørringsstativ, (E) hydreringskammer, (F) dækslips, (G) billedkammer, (H) glideholder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk til fremstilling af billedkamre ved hjælp af dobbeltsidet tape (grå) og PEG/Biotin-PEG-behandlede dæksedler. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Polymeriser mikrotubuli
- Forbered GMPCPP frø
BEMÆRK: Forbered GMPCPP-frø i et koldt rum, og hold alle reagenser, spidser og rør ved 4 ° C. GMPCPP-frø kan fremstilles på forhånd og opbevares ved -80 ° C i op til 1 år. Ultracentrifugerotor med fast vinkel, der indeholder 1 ml centrifugerør, anbringes i ultracentrifugen, og temperaturen indstilles til 4 °C.- Resuspend lyofiliseret tubulin (tabel 2) til ~10 mg/ml i 1X BRB80, umiddelbart før brug.
- Bland komponenter af GMPCPP-frø som beskrevet i tabel 3.
BEMÆRK: Opbevar alle tubulinkomponenter på is så meget som muligt for at minimere polymerisationen af opløseligt tubulin. - Klargør blandingen i en ultracentrifugerotor med fast vinkel ved 352.700 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Adskil supernatanten i 5 μL alikvoter, snap frys dem i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -80 °C.
- Polymeriser frø på dagen for eksperimentet
- Varm 1-2 ml BRB80-DTT (tabel 1) til 37 °C.
- 5 μL alikvote GMPCPP-frø (-80 °C) fra trin 3.1.4 anbringes på is og opløses straks i 20 μL varm BRB80-DTT. Drej ved 2.000 x g i 5 s ved stuetemperatur og tryk for at blande.
BEMÆRK: Indledende fortyndingsvolumen kan variere mellem 13 μL og 21 μL og bestemmes empirisk for hvert parti frø. Hvis frøene ikke polymeriserer, skal du foretage fejlfinding ved at supplere den indledende fortyndingsbuffer (trin 3.2.2) med 0,5 μM GMPCPP. - Beskyt mod lys og inkuber ved 37 °C i 30-45 min.
BEMÆRK: Længden af mikrotubuli afhænger af inkubationens varighed. For korte mikrotubuli kan inkubationstiden være så kort som 15 minutter. For lange mikrotubuli kan inkubationstiden være så lang som 2 timer. Biotinylerede mikrotubuli har tendens til at kræve længere inkubationstider end ikke-biotinylerede mikrotubuli. - Ultracentrifugerotor med fast vinkel, der indeholder 500 μL centrifugerør, anbringes i ultracentrifuge og forvarmes til 30 °C.
- Efter inkubation tilsættes 50 μL varm BRB80-DTT (trin 3.2.1) til de polymeriserede GMPCPP-frø og overføres blandingen til et 500 μL centrifugerør. Vask det tomme rør, der indeholdt GMPCPP-frøene, med yderligere 50 μL varmt BRB80-DTT, pipette op og ned, og tilsæt denne buffer til 500 μL centrifugerøret, der indeholder blandingen.
- Før centrifugerøret drejes, skal du markere centrifugerørets kant for at angive, hvor pelleten vil være (pelleten vil være for lille til at se). Spin i 10 minutter ved 244.900 x g ved 30 °C12.
- Rør forsigtigt supernatanten ud og kassér den. Resuspend pillen i 100 μL varm BRB80-DTT. Tryk for at blande.
- Centrifugering i 10 minutter ved 244.900 x g ved 30 °C, justering af mærkningen med rotoren til pellet på samme sted.
- Fjern supernatanten, og brug pillen igen i 16 μL varm BRB80-DTT. Overfør mikrotubuliopløsningen til et rent 0,6 ml mikrocentrifugerør. Beskyt mod lys og opbevar ved eller over stuetemperatur.
BEMÆRK: Efter polymerisation skal mikrotubuli opbevares ved eller over stuetemperatur. Hvis de bliver kolde, vil de depolymerisere. Inkuber ved 28 °C for ekstra stabilitet.
- Kontroller mikrotubuli via TIRF-mikroskopi
- Pipette en blanding af 4,5 μL BRB80-DTT og 1 μL mikrotubuliopløsning (trin 3.2.9) på et mikroskop dias. Dæk med et dæksel på 18 x 18 mm, og forsegl kanterne med enten klar neglelak eller en 1:1:1 blanding af petrolatum, lanolin og paraffin (valapforseglingsmiddel), som er fast ved stuetemperatur og flydende ved 95 °C.
- Placer TIRF-målet under dæksedlen (se trin 4 for anbefalede mikroskopindstillinger) og visualiser de nyligt polymeriserede mikrotubuli ved bølgelængde, der passer til det fluorescerende mærkede tubulin i Bright-blandingen (tabel 3), for at bestemme, hvilken fortynding af mikrotubuli der skal bruges i de kommende eksperimenter.
| Reagens | Lys blanding (μL) | Rækkefølge af tilføjelse | Lys blanding + biotin (μL) | Rækkefølge af tilføjelse |
| Fluorescerende tubulin, 10 mg/ml | 2 | 6 | 2 | 7 |
| Biotin-tubulin, 10 mg/ml | 0 | NIELSEN | 2 | 6 |
| Umærket tubulin, 10 mg/ml | 20 | 5 | 18 | 5 |
| GMPCPP, 10 mM | 30 | 4 | 30 | 4 |
| DTT, 0,2 M | 0.7 | 3 | 0.7 | 3 |
| 5X BRB80 | 26.4 | 2 | 26.4 | 2 |
| sterilt vand | 52.9 | 1 | 52.9 | 1 |
| Samlet volumen (μL) | 132 | 132 |
Tabel 3: GMPCPP frøblanding. Komponenter af GMPCPP mikrotubuli frø, herunder volumen og rækkefølge af tilsætning. Forbered 5 μL alikvoter og opbevar i op til 1 år ved -80 °C.
4. Mikroskopindstillinger
- Temperatur: Indstil mikroskopets temperatur til 28 °C for at se dynamiske mikrotubuli.
- Filtre: Brug den bedste kombination af filterkuber og emissionsfiltre, afhængigt af de fluorescerende kanaler, der skal afbildes. For at visualisere 488 nm, 560 nm og 647 nm bølgelængder i det samme eksperiment skal du bruge et 405/488/560/647 nm Laser Quad Band Set, kombineret med emissionsfiltre til de udpegede bølgelængder.
- Juster lasere: Sørg for, at de laserstråler, der blev brugt i eksperimentet, er justeret. Bestem laserintensiteten for eksperimentet empirisk, således at alle fluorescerende proteiner kan afbildes med det højest mulige signal-støj-forhold, men ikke gennemgår signifikant fotoblegning i løbet af eksperimentets forløb.
- Mål: Brug linsepapir til at rengøre et 100x mål med 70% ethanol. Før billeddannelse skal du tilføje en dråbe mikroskopnedsænkningsolie til målet.
- Konfigurer en billedbehandlingssekvens
- Til et forsøg med 647 nm fluorophore-mærkede biotinylerede mikrotubuli, 560 nm fluorophore-mærkede ikke-biotinylerede mikrotubuli og opløseligt tubulin, og GFP-mærket protein af interesse, billede i 20 minutter. Forestil dig 560 nm og 488 nm kanalerne hver 10. s, og 647 nm kanalen hver 30 s.
- For at tage et referencebillede af bundter før tilsætning af opløseligt tubulin og MAPs skal du oprette en sekvens med et billede hver i 560 nm og 647 nm bølgelængder.
5. Generer overflade-immobiliserede mikrotubuli bundter
BEMÆRK: I de følgende trin skal alle opløsninger flydes ind i et flowkammer ved at pipettere ind i den ene åbne side, mens du placerer et filterpapir mod den anden side. Beskyt billedkammeret mod lys for at reducere fotoblegelse af fluorescerende mærkede proteiner. Tape det forberedte billedkammer til en diasholder (figur 1G,H). Følg trinnene i tabel 4, som svarer til protokol steps 5.2-6.4.
- Forbered opløselig tubulinblanding i henhold til tabel 5 og opbevar den på is.
BEMÆRK: Opløseligt tubulin skal altid anbringes på is for at forhindre polymerisation. Forbered en frisk opløselig tubulinblanding ca. hver 2. time, eller når mikrotubuli ikke længere polymeriserer. - For at immobilisere mikrotubuli via en biotin-neutravidin-biotin-kobling, skal du først strømme i Neutravidin (NA) opløsning, indtil kammeret er fyldt (~ 7,5 μL) og inkubere i 5 minutter.
- Vask med 10 μL MB-kulde.
- Flow i 7,5 μL af det blokerende protein κ-kasein (KC) og inkuber i 2 minutter.
- Vask med 10 μL MB-varmt for at forberede kammeret til introduktion af mikrotubuli.
- Fortynd bestanden af biotinylerede mikrotubuli (ifølge observationer i trin 3.3.2) i 1X BRB80-DTT, og tilsæt 1 μL af denne fortynding til 9 μL MB-varm. Flyd blandingen ind i kammeret og inkuber i 10 minutter. Brug en højere koncentration af mikrotubuli til flere bundter.
- Vask ikke-immobiliserede mikrotubuli væk med 10 μL MB-varmt.
- Flow 7,5 μL varm KC ind i kammeret og inkuber i 2 minutter.
- Under inkubationen fremstilles en 2 nM opløsning af tværbindingsproteinet PRC1 i varm KC. Flow 10 μL af denne opløsning ind i flowkammeret og inkuber i 5 minutter.
BEMÆRK: Rekombinant PRC1 udtrykkes og renses fra bakterieceller som tidligere beskrevet13. - For at lave bundter skal du strømme 10 μL ikke-biotinylerede mikrotubuli ind i kammeret og inkubere i 10 min. PRC1 vil krydsbinde de ikke-biotinylerede og immobiliserede biotinylerede mikrotubuli15,16 (figur 3).
BEMÆRK: Se trin 6.1 for fremstilling af assayblandingen i inkubationstiden. - Vask kammeret to gange med 10 μL MB-varmt. De vedhæftede mikrotubuli er stabile i ca. 20 minutter fra dette punkt.
| Skridt | Reagens | Volumen (μL) | Inkubationstid (minutter) |
| 1 | Neutravidin | 7.5 | 5 |
| 2 | MB-kold | 10 | - |
| 3 | κ-kasein | 7.5 | 2 |
| 4 | MB-varm | 10 | - |
| 5 | Biotinyleret mikrotubuli (fortyndet i MB-warm) | 10 | 10 |
| 6 | MB-varm | 10 | - |
| 7 | Varm κ-kasein | 7.5 | 2 |
| 8 | 2 nM PRC1 fortyndet i κ-kasein | 10 | 5 |
| 9 | Ikke-biotinyleret mikrotubuli | 10 | 10 |
| 10 | MB-varm x 2 | 10 | - |
| 11 | Analyse blanding | 10 | - |
| Vedhæftede frø er stabile i omkring 20 minutter på dette tidspunkt | |||
Tabel 4: Analysetrin. Liste over reagenser, der er tilsat billedbehandlingskammeret, med angivelse af vaske- (-) eller inkubationstid.
| Reagens | Volumen (μL) |
| Genanvendt tubulin, 10 mg/ml | 10 |
| MB-kold | 10.3 |
| MBMC | 13.7 |
| BRB80-DTT | 3.4 |
| GTP, 10 mM | 6.7 |
| ATP, 10 mM (Hvis du bruger kinesiner) |
6.7 |
| Fluorescerende mærket tubulin, 10 mg/ml |
1 (Resuspend lyofiliseret mærket tubulin i koldt BRB80-DTT) |
Tabel 5: Opløselige tubulinblandingskomponenter. Bland i starten af eksperimentet og hold på is.
Figur 3: Skematisk tilsætning af assaykomponenter til at fremstille og afbilde fluorescerende mærkede bundter og enkelte mikrotubuli. Biotinylerede frø er vist i blå, ikke-biotinylerede frø og opløseligt tubulin i rødt, PRC1 i sort og protein af interesse for cyan. Trintal i figur svarer til tallene i tabel 4. Panel svarende til trin 9 viser et forudformet bundt (nederst til venstre); Trin 11 viser et nydannet bundt (øverst til venstre). Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Billede mikrotubuli dynamik
- I løbet af 10 minutters inkubationstid i trin 5.10 skal du forberede 10 μL assayblanding indeholdende proteiner af interesse, opløseligt tubulin, nukleotider, iltrensere14 og antioxidanter i henhold til tabel 6. Hold blandingen på is.
- Læg det forberedte billedkammer, tapet til diasholderen, på 100x TIRF-målet. Brug kanalerne 560 nm og 647 nm til at finde et synsfelt, der indeholder et optimalt antal og densitet af enkelte mikrotubuli og bundter.
BEMÆRK: Hvis både biotinylerede og ikke-biotinylerede mikrotubuli er mærket med den samme fluorofor, kan linjescanningsanalyser af fluorescensintensiteter skelne mellem enkelte mikrotubuli og bundter. - Når et synsfelt er identificeret, skal du tage et referencebillede.
- Flyd forsigtigt i analyseblandingen uden at forstyrre billedkammeret.
- Forsegl de åbne ender af kammeret med valapforseglingsmiddel.
- Start billedsekvensen som beskrevet i trin 4.5.1.
| Reagens | Volumen (μL) |
| Opløselig tubulinblanding | 4 |
| OSF | 1 |
| Trolox (hvis du bruger mikrotubuli mærket med en let fotoblegning fluorofor) | 1 |
| ATP, 10 mM (Hvis du bruger kinesiner) |
1 |
| PRC1 (eller crosslinker efter eget valg) | 1 |
| Proteiner af interesse | X |
| MB-kold | 2-X |
Tabel 6: Komponenter til analyseblandinger. Bland, flyd ind i billedkammer og billedmikrotubuli dynamik inden for 30 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det ovenfor beskrevne eksperiment blev udført under anvendelse af 647 nm fluoroformærkede biotinylerede mikrotubuli, 560 nm fluoroformærkede ikke-biotinylerede mikrotubuli og 560 nm fluorophore-mærket opløselig tubulinblanding. Mikrotubuli blev tværbundet af tværbindingsproteinet PRC1 (GFP-mærket). Efter at overflade-immobiliserede bundter og enkelte mikrotubuli blev genereret (trin 5.11), blev billeddannelseskammeret monteret på et TIRF 100X 1.49 NA oliemål og set i 560 nm og 647 nm fluorescenskanaler. Enkelte mikrotubuli blev identificeret ved deres fluorescenssignal i 647 nm-kanalen. Mikrotubuli med fluorescenssignaler i begge kanaler blev identificeret som præformede bundter (figur 4). Hvis der udføres forsøg med biotinylerede og ikke-biotinylerede mikrotubuli med samme fluorescerende etiket, vil detekterede fluorescensintensiteter for bundter være omkring to gange eller højere end for enkelte mikrotubuli. Baseret på andelen og densiteten af hver population kan koncentrationen af mikrotubulifrø i trin 5,6 og 5,10 optimeres.
Figur 4: Identifikation af enkelte mikrotubuli og tværbundne mikrotubuli i synsfeltet. Repræsentativt synsfelt, der viser 647 nm (venstre), 560 nm (i midten) og flettede (højre) kanaler. Enkelt mikrotubuli (gule pilespidser) og bundter (hvide pilespidser) er angivet i den fusionerede kanal. Skalabjælken repræsenterer 2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Dynamik i enkelte mikrotubuli og PRC1-tværbundne bundter. Repræsentativ video, der viser mikrotubuli dynamik, med 647 nm fluorophore-mærkede biotinylerede mikrotubuli frø (blå), 560 nm fluorophore-mærkede ikke-biotinylerede mikrotubuli frø og 560 nm fluorophore-mærket opløseligt tubulin (rød) og GFP-mærket PRC1 (grøn). Enkelt- og tværbundne mikrotubuli er angivet med henholdsvis hvide og gule pile. Filmen blev optaget over 10 minutter (61 billeder) og vist med en hastighed på 12 billeder / sekund. Analysebetingelser: 0,5 nM GFP-PRC1, 50 mM KCl og 37 °C. Skalalinje: 5 μm. Klik her for at downloade denne video.
Når en billedsekvens er erhvervet, skal du analysere videoen for at sikre, at mikrotubuli er dynamiske (Video 1). Juster assaykomponenter (tubulinvolumen i opløselig tubulinblanding, nukleotidlagre, proteinkoncentrationer) i henhold til observationer. Hvis mikrotubuli f.eks. ikke polymeriserer, øges koncentrationen af opløseligt tubulin og/eller GTP i opløselig tubulinblanding. Tilsvarende øges arbejdskoncentrationerne af fluorescerende mærkede MAP'er, hvis de ikke er synlige på mikrotubuli, og reducerer koncentrationerne, hvis deres baggrundsfluorescensintensitet i synsfeltet er sammenlignelig med deres intensitet på mikrotubuli. Når du visualiserer bevægelige motoriske proteiner, skal du øge ATP-koncentrationerne, hvis motorer ikke udviser bevægelighed på mikrotubuli. Juster laserintensiteten for de excitationskanaler, der svarer til mikrotubuli fluorescens, for at sikre, at forskelle i fluorescensintensitet mellem enkelte mikrotubuli og bundter kan fanges inden for detektorens dynamiske område.
Video 2: Forskelle i dynamikken i enkelte mikrotubuli og PRC1-tværbundne bundter i nærværelse af to MAPs: CLASP1 og Kif4A. Repræsentativ video, der viser mikrotubuli dynamik, med 647 nm fluorophore-mærkede biotinylerede mikrotubuli frø (blå) og 560 nm fluorophore-mærkede ikke-biotinylerede mikrotubuli frø og 560 nm fluorophore-mærket opløseligt tubulin (rød). Enkelt- og tværbundne mikrotubuli er angivet med henholdsvis hvide og gule pile. Filmen blev optaget over 20 minutter (121 billeder) og vist med en hastighed på 20 billeder / sekund. Analysebetingelser: 200 nM CLASP1-GFP, 0,5 nM PRC1 og 10 nM Kif4A. Vægtstang: 2 μm. Videoen er gengivet fra reference11. Klik her for at downloade denne video.
I det repræsentative eksempel, der vises i video 2, vises et synsfelt, der indeholder enkelte mikrotubuli og tværbundne bundter. Det konstateres, at under disse analysebetingelser (assayblanding indeholdende 0,5 nM PRC1, 50 mM KCl og MAPs af interesse: 200 nM GFP-mærket CLASP1, 10 nM Kinesin Kif4A) forlænges enkelte mikrotubuli i løbet af assayet, mens væksten af tværbundne mikrotubuli er standset.
Til kvantitativ analyse af mikrotubuli dynamik, åbne mikroskopi filer i FIJI software, og vælg enkelte mikrotubuli og bundter til analyse. Brug følgende kriterier til at udelukke enkelte mikrotubuli og bundter fra yderligere analyse: Udelukke mikrotubuli eller bundter (i) fundet i kanterne af synsfeltet, (ii) skjult af proteinaggregater eller (iii) hvis filamenter bevæger sig i z-retning ud af TIRF-området. Parametre for mikrotubulidynamik, såsom længde, væksthastighed, redningsfrekvens og katastrofefrekvens, kan opnås ved at konstruere og analysere kymografer for hvert enkelt mikrotubuli eller mikrotubuli par11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentet beskrevet her udvider signifikant omfanget og kompleksiteten af konventionelle mikrotubuli rekonstitutionsassays, som traditionelt udføres på enkelte mikrotubuli eller på en type array. Det nuværende assay giver en metode til samtidig at kvantificere og sammenligne den lovgivningsmæssige MAP-aktivitet på to populationer, nemlig enkelte mikrotubuli og tværbundne bundter. Endvidere giver dette assay mulighed for undersøgelse af to typer bundter: dem, der er præ-dannet af stabile frø før indledningen af dynamik, og dem, der er nydannede, når to voksende ender møder hinanden og bliver tværbundet (figur 3). Ud over konventionelle eksperimentelle variabler, såsom proteinkoncentrationer og bufferbetingelser, gør disse assays det desuden muligt at evaluere virkningerne af geometriske træk ved mikrotubuli arrays, såsom længder og vinkler mellem tilstødende filamenter i et bundt, der fremstår som vigtige determinanter for mikrotubulidynamik og MAP-aktivitet16.
For at udvide denne eksperimentelle metode til in vitro-rekonstitution af flere mikrotubulibaserede strukturer skal følgende nøglespørgsmål behandles: i) PRC1 fortrinsvis tværbindinger mikrotubuli, der er orienteret antiparallelt med hinanden. Mens sådanne bundter findes i cellecentret under mitose, er bundter af parallelle mikrotubuli et fælles træk i andre mikrotubulibaserede strukturer inden for neuronale axoner og den mitotiske spindel. Protokollen beskrevet ovenfor kan let tilpasses til at generere tværbundne parallelle mikrotubuli ved hjælp af rekombinante tværbindinger såsom Kinesin-1 og TRIM4610,17. ii) I disse rekonstitutionsassays kan forskelle i fluorescensintensitet anvendes til at skelne mellem enkelte mikrotubuli og par mikrotubuli11,15. Under de eksperimentelle forhold, der anvendes her, indikerer intensitetsanalyser, at de fleste bundter indeholder to tværbundne mikrotubuli, og linjescanningsanalyser giver information om deres relative positionering. Men når der er mere end to eller tre filamenter i et bundt, forhindrer den rumlige opløsning af standard TIRF-baserede billeddannelsessystemer identifikation af enderne og polariteten af individuelle mikrotubuli (~ 25 nm diameter)18. Selv om det er muligt at identificere plusenderne af tværbundne anti-parallelle mikrotubuli fra retningen af deres vækst, hindres det desuden af den rumlige opløsning af optisk mikroskopi at skelne mellem enderne af tværbundne parallelle mikrotubuli, der vokser i samme retning. En udvidelse af det her beskrevne eksperiment er at anvende polaritetsmærkede mikrotubuli eller mikrotubuli tipbindende proteiner til at placere individuelle mikrotubuli. For bundter med snesevis af mikrotubuli, der supplerer den høje tidsmæssige opløsning af TIRF-baserede assays med teknikker, der har høj rumlig opløsning, såsom Atomic Force Microscopy19, lover at give ny indsigt i dynamikken i individuelle mikrotubuli i et bundt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra NIH (nr. 1DP2GM126894-01) og af midler fra Pew Charitable Trusts og Smith Family Foundation til R.S. Forfatterne takker Dr. Shuo Jiang for hans bidrag til udvikling og optimering af protokollerne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18x18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24x60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 |
References
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L.
- Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
- Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
- Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
- Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
- Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
- Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
- Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
- Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).
