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Biochemistry

TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा विट्रो में क्रॉसलिंक्ड और एकल सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता का एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63377
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, एक TIRF माइक्रोस्कोपी आधारित इन विट्रो पुनर्गठन परख एक साथ मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है और दो सूक्ष्मनलिकाएं आबादी की गतिशीलता की तुलना. एक विधि को एक साथ क्रॉसलिंक किए गए सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों और एकल सूक्ष्मनलिकाएं पर कई सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन की सामूहिक गतिविधि को देखने के लिए वर्णित किया गया है।

Abstract

सूक्ष्मनलिकाएं απ-ट्यूबुलिन हेटरोडिमर के पॉलिमर हैं जो कोशिकाओं में अलग-अलग संरचनाओं में व्यवस्थित होते हैं। सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित आर्किटेक्चर और नेटवर्क में अक्सर सूक्ष्मनलिकाएं सरणियों के सबसेट होते हैं जो उनके गतिशील गुणों में भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, विभाजित कोशिकाओं में, क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं के स्थिर बंडल गतिशील गैर-क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं के करीब निकटता में सह-अस्तित्व में रहते हैं। TIRF-माइक्रोस्कोपी-आधारित इन विट्रो पुनर्गठन अध्ययन इन विभिन्न सूक्ष्मनलिकाएं सरणियों की गतिशीलता के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करते हैं। इस परख में, एक इमेजिंग कक्ष सतह-immobilized सूक्ष्मनलिकाएं, जो या तो एकल फिलामेंट्स के रूप में मौजूद हैं या crosslinked बंडलों में आयोजित कर रहे हैं के साथ इकट्ठा किया जाता है. ट्यूबुलिन, न्यूक्लियोटाइड्स और प्रोटीन नियामकों का परिचय संबंधित प्रोटीन के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन और एकल और क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं के गतिशील गुणों की अनुमति देता है। इसके अलावा, गतिशील एकल सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों में व्यवस्थित होने के रूप में होने वाले परिवर्तनों को वास्तविक समय में मॉनिटर किया जा सकता है। यहां वर्णित विधि व्यक्तिगत प्रोटीन की गतिविधि और स्थानीयकरण के व्यवस्थित मूल्यांकन के साथ-साथ समान प्रयोगात्मक परिस्थितियों में दो अलग-अलग सूक्ष्मनलिकाएं सबसेट पर प्रोटीन नियामकों के सहक्रियात्मक प्रभावों की अनुमति देती है, जिससे यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्रदान की जाती है जो अन्य तरीकों से दुर्गम हैं।

Introduction

सूक्ष्मनलिकाएं बायोपॉलिमर हैं जो कई सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक संरचनात्मक मचान बनाते हैं, जो इंट्रासेल्युलर परिवहन और ऑर्गेनेल पोजिशनिंग से लेकर सेल डिवीजन और बढ़ाव तक होते हैं। इन विविध कार्यों को निष्पादित करने के लिए, व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं माइक्रोन-आकार की सरणियों में व्यवस्थित की जाती हैं, जैसे कि माइटोटिक स्पिंडल, सिलियरी एक्सोनेम्स, न्यूरोनल बंडल, इंटरफेज सरणियां और प्लांट कॉर्टिकल सरणियां। इन संरचनाओं में पाया जाने वाला एक सर्वव्यापी वास्तुशिल्प आकृति सूक्ष्मनलिकाएं का एक बंडल है जो उनकी लंबाई के साथ क्रॉसलिंक किया गया है1। कई सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित संरचनाओं की एक पेचीदा विशेषता बंडल सूक्ष्मनलिकाएं और निकट स्थानिक निकटता में गैर-क्रॉसलिंक्ड एकल सूक्ष्मनलिकाएं का सह-अस्तित्व है। ये सूक्ष्मनलिकाएं उप-आबादी एक-दूसरे से बिल्कुल अलग पोलीमराइजेशन गतिशीलता प्रदर्शित कर सकती हैं, जैसा कि उनके उचित कार्य 2,3,4,5 के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, माइटोटिक स्पिंडल के भीतर, स्थिर क्रॉसलिंक्ड बंडल और गतिशील एकल सूक्ष्मनलिकाएं सेल सेंटर 6 पर एक माइक्रोन-स्केल क्षेत्र के भीतर मौजूद हैं। अध्ययन कैसे coexisting सूक्ष्मनलिकाएं आबादी के गतिशील गुणों को निर्दिष्ट कर रहे हैं, इसलिए, सूक्ष्मनलिकाएं आधारित संरचनाओं की विधानसभा और कार्य को समझने के लिए केंद्रीय है।

सूक्ष्मनलिकाएं गतिशील पॉलिमर हैं जो पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन के चरणों के बीच चक्र करती हैं, जो आपदा और बचाव 7 के रूप में जानी जाने वाली घटनाओं में दो चरणों के बीच स्विच करती हैं। सेलुलर सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता असंख्य सूक्ष्मनलिकाएं एसोसिएटेड प्रोटीन (एमएपी) द्वारा विनियमित की जाती हैं जो सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन और डीपोलीमराइजेशन की दरों और तबाही और बचाव की घटनाओं की आवृत्तियों को संशोधित करती हैं। प्रकाश माइक्रोस्कोपी में स्थानिक संकल्प की सीमाओं के कारण, कोशिकाओं में स्थानिक रूप से समीपस्थ सरणियों पर एमएपी की गतिविधि की जांच करना चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से उच्च सूक्ष्मनलिका घनत्व वाले क्षेत्रों में। इसके अलावा, एक ही सेलुलर क्षेत्र में कई एमएपी की उपस्थिति सेल जैविक अध्ययन की व्याख्याओं में बाधा डालती है। कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में प्रदर्शन इन विट्रो पुनर्गठन assays, तंत्र की जांच करने की चुनौतियों को दरकिनार करता है जिसके द्वारा एमएपी के विशिष्ट सबसेट समीपस्थ सेलुलर सूक्ष्मनलिकाएं सरणियों की गतिशीलता को विनियमित करते हैं। यहां, विट्रो में इकट्ठे हुए सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता की जांच नियंत्रित परिस्थितियों में एक या एक से अधिक पुनः संयोजक एमएपी की उपस्थिति में की जाती है8,9,10। हालांकि, पारंपरिक पुनर्गठन assays आमतौर पर एकल सूक्ष्मनलिकाएं या एक प्रकार की सरणी पर किया जाता है, जो सह-अस्तित्व वाली आबादी के विज़ुअलाइज़ेशन को पूर्वनिर्धारित करता है।

यहां, हम इन विट्रो पुनर्गठन assays में प्रस्तुत करते हैं जो एक ही समाधान की स्थिति के तहत दो सूक्ष्मनलिकाएं आबादी के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करते हैं11। हम एक साथ एकल सूक्ष्मनलिकाएं पर कई एमएपी की सामूहिक गतिविधि को देखने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और माइटोटिक स्पिंडल से जुड़े प्रोटीन पीआरसी 1 द्वारा क्रॉसलिंक किए गए सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों पर। प्रोटीन PRC1 अधिमानतः विरोधी समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं के बीच ओवरलैप पर बांधता है, उन्हें क्रॉसलिंकिंग 9। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: (i) स्टॉक समाधान और अभिकर्मकों की तैयारी, (ii) माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए इमेजिंग चैंबर बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले कवरलिप्स की सफाई और सतह उपचार, (iii) स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं "बीज" की तैयारी जिसमें से प्रयोग के दौरान पोलीमराइजेशन शुरू किया जाता है, (iv) सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता की कल्पना करने के लिए टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का विनिर्देशन, (v) सूक्ष्मनलिकाएं बीजों का स्थिरीकरण और क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों का उत्पादन इमेजिंग कक्ष में, और (vi) घुलनशील ट्यूबुलिन, एमएपी और न्यूक्लियोटाइड्स के अलावा, टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इमेजिंग चैंबर में सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता का विज़ुअलाइज़ेशन। ये assays गुणात्मक मूल्यांकन और MAP स्थानीयकरण के मात्रात्मक परीक्षा और दो सूक्ष्मनलिकाएं आबादी की गतिशीलता पर उनके प्रभाव को सक्षम करते हैं। इसके अतिरिक्त, वे प्रयोगात्मक स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला में इन सूक्ष्मनलिकाएं आबादी पर कई एमएपी के सहक्रियात्मक प्रभावों के मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. अभिकर्मकों को तैयार करें

  1. तालिका 1 और तालिका 2 में उल्लिखित के रूप में बफ़र्स और अभिकर्मक तैयार करें। प्रयोग के दौरान, बर्फ पर सभी समाधान रखें, जब तक कि अन्यथा नोट न किया गया हो।
घोल घटक अनुशंसित संग्रहण अवधि नोट्स
5X BRB80 400 mM K-पाइप, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, KOH के साथ पीएच 6.8, फ़िल्टर निष्फल 2 साल तक 4 °C पर स्टोर करें
1X BRB80 80 mM K-PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 2 साल तक 4 °C पर स्टोर करें
BRB80-DTT 1X BRB80, 1 mM DTT 2 दिनों तक
परख बफर 80 mM K-PIPES, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8, 5% सुक्रोज (या 1X BRB80, 5% सुक्रोज, 2 mM MgCl2) 1 वर्ष तक 4 °C पर स्टोर करें
मास्टर बफ़र (MB) परख बफर, 5mM TCEP 1 सप्ताह प्रयोग के दिन तैयार करें; दो ट्यूबों में अलग करें: कमरे के तापमान पर एमबी-गर्म और बर्फ पर एमबी-कोल्ड; फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करते हुए 1 mM DTT शामिल करें
MethylCellulose (MBMC) के साथ मास्टर बफर 1X BRB80, 0.8% मिथाइलसेल्यूलोज, 5 mM TCEP, 5 mM MgCl2 1 सप्ताह प्रयोग के दिन तैयार करें; फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करते हुए 1 mM DTT शामिल करें
प्रोटीन तनुकरण बफर (DB) MB, 1 mg/mL गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA), 1 μM एटीपी 1 दिन, बर्फ पर प्रयोग के दिन तैयार करें; फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करते हुए 1 mM DTT शामिल करें
ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग मिक्स (OSM) MB, 389 μg/mL catalase, 4.44 mg/mL glucose oxidase, 15.9 mM 2-mercaptoethanol (BME) 1 दिन, बर्फ पर प्रयोग के दिन तैयारी करें
ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग फाइनल (OSF) MB, 350 μg/mL catalase, 4mg/mL glucose oxidase, 14.3 mM BME, 15 mg/mL glucose 30 मिनट के भीतर उपयोग करें OSM के 9 μL में ग्लूकोज के 1 μL को जोड़कर उपयोग से तुरंत पहले तैयार करें

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल और उनके घटकों में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स की सूची. प्रत्येक बफ़र को कितनी दूर तक तैयार किया जा सकता है, इस पर मार्गदर्शन के लिए "अनुशंसित संग्रहण अवधि" स्तंभ देखें.

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) संग्रहण सांद्रता भंडारण विलायक भंडारण तापमान कार्यशील एकाग्रता अंतिम एकाग्रता अनुशंसित संग्रहण अवधि नोट्स
न्यूट्राविडिन (एनए) 5 mg/mL 1X BRB80 -80°C 0.2 mg/mL 0.2 mg/mL 1 वर्ष तक एक बायोटिन-न्यूट्राविडिन-बायोटिन लिंकेज के माध्यम से सूक्ष्मनलिकाएं को स्थिर करने के लिए उपयोग किया जाता है; छोटे ऐलीकोट में भंडार
कप्पा-केसीन (केसी) 5 mg/mL 1X BRB80 -80°C 0.5 mg/mL 0.5 mg/mL 2 साल तक इमेजिंग चैंबर सतह को अवरुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है; छोटे ऐलीकोट में स्टोर करें; प्रयोग के दिन, कमरे के तापमान पर एक छोटी मात्रा को अलग रखें
गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) 50 mg/mL 1X BRB80 -20°C 1 mg/mL (DB में) N/A 2 साल तक छोटे ऐलीकोट में भंडार
कैटालेज 3.5 mg/mL 1X BRB80 -80°C 350 μg/mL (OSF में) 35 μg/mL 2 साल तक ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग मिश्रण का घटक; छोटे ऐलीकोट में भंडार
ग्लूकोज ऑक्सीडेज 40 mg/mL 1X BRB80 -80°C 4 मिलीग्राम / एमएल (ओएसएफ में) 0.4 mg/mL 2 साल तक ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग मिश्रण का घटक; छोटे ऐलीकोट में भंडार
ट्यूबुलिन ल्योफिलित N/A 4°C 10 mg/mL 2.12 मिलीग्राम / एमएल (ट्यूबुलिन मिश्रण में) 1 वर्ष तक एक बार ट्यूबुलिन समाधान में है, तो पोलीमराइजेशन से बचने के लिए इसे ठंडा रखें।
एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) 100 mM अतिशुद्ध जल -20°C 10 mM 1 mM 6 महीने फ़िल्टर-निष्फल पानी में समाधान तैयार करें, पीएच को ~ 7.0 में समायोजित करें, और छोटे ऐलीकोट में फ्रीज करें।
Guanosine Triphosphate (GTP) 100 mM अतिशुद्ध जल -20°C 10 mM 1.29 mM (ट्यूबुलिन मिश्रण में) 6 महीने फ़िल्टर-निष्फल पानी में समाधान तैयार करें, पीएच को ~ 7.0 में समायोजित करें, और छोटे ऐलीकोट में फ्रीज करें।
Guanosine-5'-[(α,β)-मेथिलेनो] ट्राइफॉस्फेट (GMPCPP) 10 mM अतिशुद्ध जल -20°C 10 μM 0.5 μM 6 महीने
Dithiothreitol (DTT) 1 मीटर बाँझ जल -20°C 1 mM N/A 2 साल तक
Tris(2-carboxyethyl) फॉस्फीन (TCEP) 0.5 मीटर निस्यंदक-निष्फलित जल कमरे का तापमान 5 mM N/A 2 साल तक
मिथाइलसेल्यूलोज 1% बाँझ जल कमरे का तापमान 0.8% (MBMC में) 0.21% (ट्यूबुलिन मिश्रण में) 1 वर्ष तक धीरे-धीरे इसे उबलते पानी में जोड़कर मेथिलसेल्यूलोज को भंग करें। लगातार हिलाते हुए ठंडा होने दें।
बीटा-मर्केप्टोएथेनॉल (BME) 143 mM बाँझ जल कमरे का तापमान 14.3 mM (OSF में) 1.43 mM 5 साल तक 143 mM स्टॉक BME का एक 1:100 कमजोर पड़ने है
ग्लूकोज़ 150 mg/mL 1X BRB80 -80°C 15 मिलीग्राम / एमएल (ओएसएफ में) 1.5 mg/mL 2 साल तक उपयोग करने से ठीक पहले OSM में जोड़ें
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl क्रोमेन-2-कार्बोक्जिलिक एसिड (Trolox) 10 mM 1X BRB80 -80°C 10 mM 1 mM 1 वर्ष तक पूरी तरह से भंग नहीं होता है। कुछ NaOH जोड़ें, ~ 4 घंटे के लिए हलचल, और फिल्टर उपयोग से पहले निष्फल
एमपीईजी-Succinimidyl Valerate, मेगावाट 5,000 चूर्ण N/A -20°C 333 mg/mL
(0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट में)		 324 mg/mL
(0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट में)		 6 महीने तैयार ~ 34 मिलीग्राम ऐलीकोट, पाउडर के एक सटीक वजन के साथ प्रत्येक ट्यूब को चिह्नित. पैराफिल्म के साथ ठोस, सील ट्यूबों पर नाइट्रोजन गैस पास करें, और डेसिकेंट के साथ एक कंटेनर में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
बायोटिन-पीईजी-एसवीए, मेगावाट 5,000 मेगावाट चूर्ण N/A -20°C 111 mg/mL
(0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट में)		 3.24 मिलीग्राम / एमएल (0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट में) 6 महीने तैयार ~ 3 मिलीग्राम ऐलीकोट, पाउडर के एक सटीक वजन के साथ प्रत्येक ट्यूब को चिह्नित. पैराफिल्म के साथ ठोस, सील ट्यूबों पर नाइट्रोजन गैस पास करें, और डेसिकेंट के साथ एक कंटेनर में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

तालिका 2: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों की सूची। इसमें अनुशंसित भंडारण की स्थिति और सांद्रता, प्रयोग के दौरान उपयोग किए जाने वाले स्टॉक समाधानों की काम करने वाली सांद्रता, और इमेजिंग कक्ष में अंतिम एकाग्रता शामिल हैं। अतिरिक्त नोट्स दूर-दाएं कॉलम में दिए गए हैं।

2. तैयार Biotin-खूंटी स्लाइड

नोट: इमेजिंग कक्षों को यथासंभव एक प्रयोग की शुरुआत के करीब तैयार करें, और 2 सप्ताह से अधिक पहले नहीं।

  1. कवरलिप्स को साफ करें
    1. 24 x 60 मिमी और 18 x 18 मिमी # 1.5 coverslips (चित्रा 1F) की एक समान संख्या को स्लाइड-स्टेनिंग जार और स्लाइड-वॉशिंग रैक में क्रमशः रखें (चित्रा 1ए, बी)। स्लाइड-वॉशिंग रैक जिसमें 100 एमएल बीकर में 18 x 18 मिमी कवरस्लिप्स होते हैं।
    2. अल्ट्राप्योर पानी (18.2 MΩ-सेमी प्रतिरोधकता) में सभी कवरलिप्स को 5-6 बार कुल्ला करें और एक वैक्यूम ट्यूब (चित्रा 1 C) से जुड़े पिपेट टिप के साथ प्रत्येक कुल्ला करने के बाद अतिरिक्त तरल को हटा दें।
    3. बीकर्स और स्लाइड-स्टेनिंग जार भरें, जिसमें अल्ट्राप्योर पानी के साथ कवरलिप्स होते हैं, पैराफिल्म के साथ सील करें, और 10 मिनट के लिए sonicate करें।
    4. 200-प्रूफ इथेनॉल के साथ दो 150 एमएल बीकर भरें। चिमटी का उपयोग करते हुए, प्रत्येक कवरस्लिप को इथेनॉल से भरे एक बीकर में डुबोएं, और फिर दूसरे।
    5. चिमटी का उपयोग करते हुए, स्लाइड-सुखाने वाले रैक (चित्रा 1 डी) में कवरलिप्स को स्थानांतरित करें, उन्हें नाइट्रोजन गैस स्ट्रीम के तहत सुखाएं और पूरी तरह से सूखने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (~ 15 मिनट)।
    6. प्लाज्मा क्लीनर के अंदर एक ही परत में सूखे कवरलिप्स रखें। वैक्यूम सील प्रपत्र, और उसके बाद प्लाज्मा क्लीनर के रेडियो आवृत्ति (आरएफ) स्तर ~ 8 मेगाहर्ट्ज करने के लिए सेट करें।
    7. एक बार प्लाज्मा उत्पन्न होने के बाद, 5 मिनट के लिए प्लाज्मा क्लीनर में कवरलिप्स छोड़ दें। प्लाज्मा क्लीनर को बंद कर दें और वैक्यूम को धीरे-धीरे छोड़ दें।
    8. एक बार वैक्यूम सील जारी होने के बाद, कवरलिप्स को फ्लिप करें और कवरलिप्स के दूसरी तरफ के लिए 5 मिनट के लिए प्लाज्मा सफाई को दोहराएं।
    9. प्लाज्मा सफाई के लिए विकल्प: 2.1.2-2.1.3 चरणों के स्थान पर, sonicate 10 मिनट के लिए 2% डिटर्जेंट (अल्ट्राप्योर पानी में) के गर्म समाधान में कवर करता है। फिर, अल्ट्राप्योर पानी के साथ कवरलिप्स को अच्छी तरह से धोएं और अल्ट्राप्योर पानी में 2-3 बार (10 मिनट प्रत्येक) sonicate करें। इसके बाद, इथेनॉल में धोएं और चरणों 2.1.4-2.1.5 के रूप में सूखीं। 2.1.6-2.1.8 चरण छोड़ें।
  2. बायोटिन-पीईजी उपचार
    1. उपयोग करने से ठीक पहले, एसीटोन के 40 मिलीलीटर में 3-Aminopropyltriethoxysilane के 400 μL को भंग करें। चिमटी का उपयोग करते हुए, स्लाइड-वॉशिंग रैक और स्लाइड-स्टेनिंग जार में प्लाज्मा-साफ कवरलिप्स को स्थानांतरित करें। 3-Aminopropyltriethoxysilane समाधान में coverslips जलमग्न और 5 min12,13 के लिए इनक्यूबेट.
    2. अल्ट्राप्योर पानी के साथ सभी कवरलिप्स को 5-6 बार धोएं।
    3. स्लाइड-सुखाने वाले रैक में ट्रांसफर कवरलिप्स, उन्हें नाइट्रोजन गैस स्ट्रीम के तहत सुखाएं और पूरी तरह से सूखने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (~ 20 मिनट)।
    4. नाजुक कार्य पोंछे पर सूखे coverslips बिछाने और एक कोने पर प्रत्येक coverslip लेबल, उदाहरण के लिए, प्रत्येक 18 x 18 मिमी coverslip पर 'पी' और प्रत्येक 24 x 60 मिमी coverslip पर 'बी' ( चित्रा 2 देखें).
    5. प्रयोग के दिन, अल्ट्राप्योर पानी के 10 मिलीलीटर में NaHCO3 के 0.84 मिलीग्राम को भंग करके एक ताजा 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान तैयार करें।
    6. एमपीईजी-Succinimidyl Valerate (PEG-SVA) और Biotin-PEG-SVA के एलीकोट को कमरे के तापमान पर लाएं, उपयोग से तुरंत पहले। तालिका 2 में Polyethylene Glycol (PEG) एलीकोट तैयारी पर नोट्स देखें।
      नोट: जल्दी से काम करें क्योंकि Succinimidyl Valerate (SVA) moiety के हाइड्रोलिसिस आधे जीवन ~ 30 मिनट है।
    7. 0.1 M NaHCO3 के 102 μL को PEG-SVA के 34 मिलीग्राम में जोड़ें, 20 s के लिए 2,656 x g पर एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में स्पिन करें, और फिर ऊपर और नीचे पिपेटिंग करके मिश्रण करें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 0.1 M NaHCO3 के 27 μL में Biotin-PEG-SVA के 3 मिलीग्राम भंग. नलियों पर नोट किए गए PEG के सटीक वजन के अनुसार कमजोर पड़ने की मात्रा को समायोजित करें ( तालिका 2 देखें)।
    8. 100: 1 w / w PEG: biotin-PEG मिश्रण तैयार करें PEG-SVA समाधान के 75 μL और 20 coverslips के लिए Biotin-PEG-SVA समाधान के 2.25 μL, 100 μL और 30 coverslips के लिए 3 μL, या 125 μL और 40 coverslips के लिए 3.75 μL के संयोजन से।
    9. एक खाली 10 μL टिप बॉक्स (चित्रा 1E) के तल में टिप रैक के नीचे गीले कागज तौलिये रखकर एक जलयोजन कक्ष का निर्माण करें। यह पीईजी समाधानों के वाष्पीकरण को रोक देगा।
    10. पिपेट 6 μL के 100: 1 PEG-SVA: बायोटिन-पीईजी मिश्रण लेबल पक्ष पर एक 24 x 60 मिमी coverslip के केंद्र पर। पहले कवरस्लिप के शीर्ष पर एक और 24 x 60 मिमी कवरस्लिप रखें ताकि जोड़ी एक एक्स-आकार बनाए, जिसमें 'बी' लेबल वाले पक्ष एक-दूसरे के सामने हों। जलयोजन कक्ष में एक खाली टिप रैक पर जोड़ी रखें और शेष 24 x 60 मिमी coverslips के लिए दोहराएँ।
    11. एक 18 x 18 मिमी के केंद्र पर PEG-SVA के पिपेट 6 μL लेबल पक्ष पर कवरस्लिप. पहले कवरस्लिप के शीर्ष पर एक और 18 x 18 मिमी कवरस्लिप रखें, जिसमें 'पी' लेबल वाले पक्ष एक-दूसरे का सामना कर रहे हैं। जलयोजन कक्ष में एक खाली टिप रैक पर जोड़ी रखें और शेष 18 x 18 मिमी coverslips के लिए दोहराएँ।
    12. जलयोजन कक्ष को बंद करें और 3 घंटे या रात भर के लिए इनक्यूबेट करें।
    13. कवरलिप्स के जोड़े को अलग करें और अल्ट्राप्योर पानी में कुल्ला करें।
    14. एक नाइट्रोजन धारा के साथ सूखी कवरलिप्स और उन्हें पूरी तरह से सूखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    15. इमेजिंग चैंबर का निर्माण करने के लिए, 'बी' लेबल वाले पक्ष पर 24 x 60 मिमी कवरस्लिप पर डबल-साइडेड टेप की तीन स्ट्रिप्स चिपकाएं। टेप स्ट्रिप्स के दूसरी तरफ, एक 18 x 18 मिमी कवरस्लिप संलग्न करें, जिसमें इसके साइड लेबल वाले 'पी' को बड़े कवरस्लिप का सामना करना पड़ रहा है। यह माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए दो प्रवाह कक्ष बनाता है, जिसमें उपचारित सतहें एक दूसरे का सामना करती हैं (चित्रा 2 और चित्रा 1 जी)।

Figure 1
चित्रा 1: कवरस्लिप उपचार और इमेजिंग चैंबर तैयारी के लिए उपकरण( ए) 24 x 60 मिमी कवरस्लिप के लिए स्लाइड-स्टेनिंग जार, (बी) 18 x 18 मिमी कवरस्लिप के लिए स्लाइड-वॉशिंग रैक, (सी) वैक्यूम सेट-अप, (डी) स्लाइड-सुखाने वाले रैक, (ई) हाइड्रेशन चैंबर, (एफ) कवरस्लिप, (जी) इमेजिंग चैंबर, (एच) स्लाइड धारक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डबल-साइडेड टेप (ग्रे) और पीईजी / बायोटिन-पीईजी का उपयोग करके इमेजिंग कक्षों की तैयारी के लिए योजनाबद्ध कवरलिप्स का इलाज किया। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. सूक्ष्मनलिकाएं Polymerize

  1. GMPCPP बीज तैयार करें
    नोट: एक ठंडे कमरे में GMPCPP बीज तैयार करें, सभी अभिकर्मकों, युक्तियों और ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखते हुए GMPCPP बीज ों को पहले से तैयार किया जा सकता है और 1 वर्ष तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। स्थिर-कोण अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज रोटर रखें, जिसमें 1 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब होते हैं, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में और तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    1. उपयोग से ठीक पहले 1X BRB80 में lyophilized ट्यूबुलिन (तालिका 2) को ~ 10 मिलीग्राम / एमएल तक पुन: निलंबित करें।
    2. GMPCPP बीजों के मिश्रण घटकों के रूप में तालिका 3 में वर्णित है.
      नोट: घुलनशील ट्यूबुलिन के पोलीमराइजेशन को कम करने के लिए जितना संभव हो सके बर्फ पर सभी ट्यूबुलिन घटकों को रखें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 352,700 x g पर एक निश्चित कोण ultracentrifuge रोटर में मिश्रण स्पष्ट करें।
    4. supernatant को 5 μL ऐलीकोट में अलग करें, उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. प्रयोग के दिन बीज polymerize
    1. BRB80-DTT (तालिका 1) के 1-2 मिलीलीटर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. बर्फ पर चरण 3.1.4 से GMPCPP बीज (-80 °C) के 5 μL ऐलीकोट रखें और तुरंत गर्म BRB80-DTT के 20 μL में भंग हो जाएं। कमरे के तापमान पर 5 s के लिए 2,000 x g पर स्पिन करें और मिश्रण करने के लिए टैप करें।
      नोट: प्रारंभिक कमजोर पड़ने की मात्रा 13 μL और 21 μL के बीच भिन्न हो सकती है और बीज के प्रत्येक बैच के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जाती है। यदि बीज polymerize करने के लिए विफल, प्रारंभिक कमजोर पड़ने बफ़र (चरण 3.2.2) 0.5 μM GMPCPP के साथ पूरक द्वारा समस्या निवारण।
    3. प्रकाश से बचाने के लिए और 30-45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन।
      नोट: सूक्ष्मनलिकाएं की लंबाई इनक्यूबेशन की अवधि पर निर्भर करती है। लघु सूक्ष्मनलिकाएं के लिए, इनक्यूबेशन समय 15 मिनट जितना कम हो सकता है। लंबी सूक्ष्मनलिकाएं के लिए, इनक्यूबेशन समय 2 घंटे तक हो सकता है। बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं की तुलना में इनक्यूबेशन बार अधिक समय तक आवश्यकता होती हैं।
    4. स्थिर-कोण ultracentrifuge रोटर, जिसमें 500 μL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब होते हैं, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में और 30 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म रखें।
    5. इनक्यूबेशन बाद, पॉलिमराइज्ड GMPCPP बीजों में गर्म BRB80-DTT (चरण 3.2.1) के 50 μL जोड़ें और मिश्रण को 500 μL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। खाली ट्यूब है कि गर्म BRB80-DTT के एक और 50 μL के साथ GMPCPP बीज शामिल धोलें, पिपेट ऊपर और नीचे, और मिश्रण युक्त 500 μL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए इस बफर जोड़ें।
    6. कताई से पहले, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के रिम को चिह्नित करें ताकि यह संकेत मिल सके कि गोली कहां होगी (गोली देखने के लिए बहुत छोटी होगी)। 30 °C12 पर 244,900 x g पर 10 मिनट के लिए स्पिन करें।
    7. सावधानी से supernatant बाहर pipette और त्याग. गर्म BRB80-DTT के 100 μL में गोली resuspend. मिश्रण करने के लिए टैप करें।
    8. 30 डिग्री सेल्सियस पर 244,900 x g पर 10 मिनट के लिए स्पिन करें, रोटर के साथ एक ही स्थान पर गोली मारने के लिए अंकन को संरेखित करें।
    9. supernatant निकालें और गर्म BRB80-DTT के 16 μL में गोली resuspend. एक साफ 0.6 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए सूक्ष्मनलिकाएं समाधान हस्तांतरण। प्रकाश से बचाएं और कमरे के तापमान पर या उससे ऊपर रखें।
      नोट: पोलीमराइजेशन के बाद, सूक्ष्मनलिकाएं कमरे के तापमान पर या उससे ऊपर रखें। यदि वे ठंडे हो जाते हैं, तो वे depolymerize करेंगे। अतिरिक्त स्थिरता के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. TIRF माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सूक्ष्मनलिकाएं की जाँच करें
    1. पिपेट एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर BRB80-DTT के 4.5 μL और सूक्ष्मनलिकाएं समाधान (चरण 3.2.9) के 1 μL का मिश्रण है। एक 18 x 18 मिमी coverslip के साथ कवर और या तो स्पष्ट नेल पॉलिश या पेट्रोलाटम, लैनोलिन, और पैराफिन (valap सीलेंट) के एक 1: 1: 1 मिश्रण के साथ किनारों को सील, जो कमरे के तापमान पर ठोस है और 95 डिग्री सेल्सियस पर तरल है।
    2. कवरस्लिप के नीचे TIRF उद्देश्य की स्थिति (अनुशंसित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के लिए चरण 4 देखें) और उज्ज्वल मिश्रण (तालिका 3) में फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूबुलिन के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य पर नए पॉलिमराइज्ड सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना करें, यह निर्धारित करने के लिए कि आगामी प्रयोगों में उपयोग करने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं का क्या कमजोर पड़ना है।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) उज्ज्वल मिश्रण (μL) परिवर्धन क्रम उज्ज्वल मिश्रण + बायोटिन (μL) परिवर्धन क्रम
फ्लोरोसेंट ट्यूबुलिन, 10 मिलीग्राम / 2 6 2 7
बायोटिन-ट्यूबुलिन, 10 मिलीग्राम / 0 N/A 2 6
बिना लेबल वाले ट्यूबुलिन, 10 मिलीग्राम / 20 5 18 5
GMPCPP, 10 mM 30 4 30 4
डीटीटी, 0.2 मीटर 0.7 3 0.7 3
5X BRB80 26.4 2 26.4 2
बाँझ जल 52.9 1 52.9 1
कुल आयतन (μL) 132 132

तालिका 3: GMPCPP बीज मिश्रण. GMPCPP सूक्ष्मनलिकाएं बीज के घटक, मात्रा और इसके अलावा के क्रम सहित. 5 μL एलीकोट तैयार करें और -80 °C पर 1 वर्ष तक के लिए स्टोर करें।

4. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स

  1. तापमान: गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं देखने के लिए माइक्रोस्कोप तापमान को 28 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. फ़िल्टर: फ़िल्टर क्यूब्स और उत्सर्जन फ़िल्टर के सर्वोत्तम संयोजन का उपयोग करें, फ्लोरोसेंट चैनलों पर निर्भर करता है। एक ही प्रयोग में 488 एनएम, 560 एनएम और 647 एनएम तरंग दैर्ध्य की कल्पना करने के लिए, 405/488/560/647 एनएम लेजर क्वाड बैंड सेट का उपयोग करें, जो निर्दिष्ट तरंग दैर्ध्य के लिए उत्सर्जन फिल्टर के साथ युग्मित है।
  3. लेजर संरेखित करें: सुनिश्चित करें कि प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले लेजर बीम संरेखित हैं। प्रयोग के लिए लेजर तीव्रता का निर्धारण करें, जैसे कि सभी फ्लोरोसेंट प्रोटीन को उच्चतम संभव सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ चित्रित किया जा सकता है, लेकिन प्रयोग के समय के दौरान महत्वपूर्ण फोटोब्लीचिंग से नहीं गुजरना पड़ता है।
  4. उद्देश्य: 70% इथेनॉल के साथ 100x उद्देश्य को साफ करने के लिए लेंस पेपर का उपयोग करें। इमेजिंग से पहले, उद्देश्य के लिए माइक्रोस्कोप विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें।
  5. इमेजिंग अनुक्रम सेट अप करें
    1. 647 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल वाले बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं, 560 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं और घुलनशील ट्यूबुलिन, और जीएफपी-लेबल वाले ब्याज के प्रोटीन के साथ एक प्रयोग के लिए, 20 मिनट के लिए छवि। छवि 560 एनएम और 488 एनएम चैनल हर 10 सेकंड, और 647 एनएम चैनल हर 30 सेकंड।
    2. घुलनशील ट्यूबुलिन और एमएपी के अलावा से पहले बंडलों की एक संदर्भ छवि को कैप्चर करने के लिए, 560 एनएम और 647 एनएम तरंग दैर्ध्य में प्रत्येक छवि के साथ एक अनुक्रम स्थापित करें।

5. उत्पन्न सतह immobilized सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों

नोट:: निम्न चरणों के लिए, एक प्रवाह कक्ष में सभी समाधान प्रवाह कक्ष में एक खुली तरफ pipetting द्वारा, जबकि दूसरी तरफ के खिलाफ एक फ़िल्टर पेपर रख रहा है। फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन के फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए प्रकाश से इमेजिंग कक्ष की रक्षा करें। एक स्लाइड धारक (चित्रा 1 जी, एच) के लिए तैयार इमेजिंग कक्ष टेप करें। तालिका 4 में दिए गए चरणों का पालन करें, जो प्रोटोकॉल steps 5.2-6.4 के अनुरूप हैं।

  1. सारणी 5 के अनुसार घुलनशील ट्यूबुलिन मिश्रण तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: घुलनशील ट्यूबुलिन को हमेशा पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए। लगभग हर 2 घंटे में एक ताजा घुलनशील ट्यूबुलिन मिश्रण तैयार करें, या जब सूक्ष्मनलिकाएं अब पॉलिमराइज़ नहीं होती हैं।
  2. बायोटिन-न्यूट्राविडिन-बायोटिन लिंकेज के माध्यम से सूक्ष्मनलिकाएं को स्थिर करने के लिए, न्यूट्राविडिन (एनए) समाधान में पहला प्रवाह जब तक कि कक्ष (~ 7.5 μL) नहीं भर जाता है और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट नहीं किया जाता है।
  3. एमबी-कोल्ड के 10 μL के साथ धोएं।
  4. अवरुद्ध प्रोटीन के 7.5 μL में प्रवाह π-casein (केसी) और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
  5. सूक्ष्मनलिकाएं की शुरूआत के लिए कक्ष तैयार करने के लिए एमबी-वार्म के 10 μL के साथ धोएं।
  6. 1X BRB80-DTT में biotinylated सूक्ष्मनलिकाएं (चरण 3.3.2 में टिप्पणियों के अनुसार) के स्टॉक को पतला करें और एमबी-वार्म के 9 μL में इस कमजोर पड़ने का 1 μL जोड़ें। मिश्रण को कक्ष में प्रवाहित करें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अधिक बंडलों के लिए सूक्ष्मनलिकाएं की एक उच्च सांद्रता का उपयोग करें।
  7. एमबी-वार्म के 10 μL के साथ गैर-immobilized सूक्ष्मनलिकाएं धोएं।
  8. कक्ष में गर्म केसी के 7.5 μL प्रवाह और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  9. इनक्यूबेशन के दौरान, गर्म KC में क्रॉसलिंकर प्रोटीन PRC1 का 2 nM समाधान तैयार करें। प्रवाह कक्ष में इस समाधान के 10 μL प्रवाह और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: पुनः संयोजक PRC1 व्यक्त किया जाता है और पहले से वर्णित के रूप में जीवाणु कोशिकाओं से शुद्ध 13.
  10. बंडल बनाने के लिए, गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं के 10 μL को कक्ष में प्रवाहित करें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। PRC1 गैर-बायोटिनिलेटेड और स्थिर बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं 15,16 (चित्रा 3) को क्रॉसलिंक करेगा।
    नोट: इनक्यूबेशन समय के दौरान परख मिश्रण तैयार करने के लिए चरण 6.1 देखें।
  11. एमबी-वार्म के 10 μL के साथ कक्ष को दो बार धोएं। संलग्न सूक्ष्मनलिकाएं इस बिंदु से लगभग 20 मिनट के लिए स्थिर होती हैं।
क़दम अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन (μL) इनक्यूबेशन समय (मिनट)
1 न्यूट्राविडिन 7.5 5
2 MB-ठंडा 10 -
3 π-केसीन 7.5 2
4 MB-गर्म 10 -
5 बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं (एमबी-गर्म में पतला) 10 10
6 MB-गर्म 10 -
7 गर्म π-casein 7.5 2
8 2 nM PRC1 में पतला π-casein 10 5
9 गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं 10 10
10 MB-गर्म x 2 10 -
11 परख मिश्रण 10 -
संलग्न बीज इस बिंदु पर लगभग 20 मिनट के लिए स्थिर होते हैं

तालिका 4: परख कदम. इमेजिंग कक्ष में जोड़े गए अभिकर्मकों की सूची, धोने (-) या इनक्यूबेशन समय के संकेत के साथ।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन (μL)
पुनर्नवीनीकरण ट्यूबुलिन, 10 मिलीग्राम / 10
MB-कोल्ड 10.3
MBMC 13.7
BRB80-DTT 3.4
GTP, 10 mM 6.7
एटीपी, 10 mM
(यदि किनेसिन का उपयोग कर रहे हैं)		 6.7
फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूबुलिन,
10 mg/mL		 1

(ठंड BRB80-DTT में लेबल lyophilized लेबल ट्यूबुलिन Resuspend)

तालिका 5: घुलनशील ट्यूबुलिन मिश्रण घटकों. प्रयोग की शुरुआत में मिलाएं और बर्फ पर रखें।

Figure 3
चित्रा 3: परख घटकों के अलावा की योजनाबद्ध बनाने के लिए और छवि fluorescently लेबल बंडल और एकल सूक्ष्मनलिकाएं. बायोटिनिलेटेड बीज नीले, गैर-बायोटिनिलेटेड बीज और लाल रंग में घुलनशील ट्यूबुलिन, काले रंग में पीआरसी 1 और सियान में रुचि के प्रोटीन में दिखाए जाते हैं। आकृति में चरण संख्याएँ तालिका 4 में दिए गए लोगों के अनुरूप हैं। चरण 9 के अनुरूप पैनल एक पूर्व-गठित बंडल (निचले बाएं) को दिखाता है; चरण 11 एक नवगठित बंडल (ऊपरी बाएं) से पता चलता है। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. छवि सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता

  1. चरण 5.10 में 10 मिनट इनक्यूबेशन समय के दौरान, ब्याज, घुलनशील ट्यूबुलिन, न्यूक्लियोटाइड्स, ऑक्सीजन स्कैवेंजर 14, और तालिका 6 के अनुसार एंटीऑक्सिडेंट के प्रोटीन युक्त परख मिश्रण के 10 μL तैयार करें। मिश्रण को बर्फ पर रखें।
  2. 100x TIRF उद्देश्य पर, स्लाइड धारक के लिए टेप किए गए तैयार इमेजिंग कक्ष को लोड करें। 560 एनएम और 647 एनएम चैनलों का उपयोग करें दृश्य का एक क्षेत्र खोजने के लिए जिसमें एक इष्टतम संख्या और एकल सूक्ष्मनलिकाएं और बंडलों का घनत्व होता है।
    नोट: यदि बायोटिनिलेटेड और गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं दोनों को एक ही फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया जाता है, तो प्रतिदीप्ति तीव्रता के लाइन-स्कैन विश्लेषण एकल सूक्ष्मनलिकाएं और बंडलों के बीच अंतर कर सकते हैं।
  3. एक बार जब दृश्य का एक फ़ील्ड पहचान लिया जाता है, तो एक संदर्भ छवि लें।
  4. ध्यान से इमेजिंग कक्ष परेशान किए बिना परख मिश्रण में प्रवाह.
  5. Valap sealant के साथ कक्ष के खुले सिरों को सील करें।
  6. चरण 4.5.1 में वर्णित के रूप में इमेजिंग अनुक्रम प्रारंभ करें।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन (μL)
घुलनशील ट्यूबुलिन मिश्रण 4
ओएसएफ 1
ट्रॉलॉक्स (यदि सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग करके आसानी से फोटोब्लीचिंग फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया जाता है) 1
एटीपी, 10 mM
(यदि किनेसिन का उपयोग कर रहे हैं)		 1
PRC1 (या पसंद का क्रॉसलिंकर) 1
ब्याज के प्रोटीन X
MB-ठंडा 2-X

तालिका 6: परख मिश्रण घटकों. मिश्रण, इमेजिंग कक्ष में प्रवाह, और छवि सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता, 30 मिनट के भीतर।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रयोग 647 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल वाले बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं, 560 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं, और 560 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल घुलनशील ट्यूबुलिन मिश्रण का उपयोग करके किया गया था। सूक्ष्मनलिकाएं क्रॉसलिंकर प्रोटीन PRC1 (GFP-लेबल) द्वारा क्रॉसलिंक की गई थीं। सतह-immobilized बंडलों और एकल सूक्ष्मनलिकाएं उत्पन्न होने के बाद (चरण 5.11), इमेजिंग कक्ष को एक TIRF 100X 1.49 NA तेल उद्देश्य पर रखा गया था और 560 एनएम और 647 एनएम प्रतिदीप्ति चैनलों में देखा गया था। एकल सूक्ष्मनलिकाएं 647 एनएम चैनल में उनके प्रतिदीप्ति संकेत द्वारा पहचानी गई थीं। दोनों चैनलों में प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ सूक्ष्मनलिकाएं पूर्व-गठित बंडलों (चित्रा 4) के रूप में पहचानी गई थीं। यदि प्रयोगों को एक ही फ्लोरोसेंट लेबल के साथ बायोटिनिलेटेड और गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं के साथ किया जाता है, तो बंडलों के लिए पता लगाया गया प्रतिदीप्ति तीव्रता एकल सूक्ष्मनलिकाएं की तुलना में लगभग दो गुना या अधिक होगी। प्रत्येक आबादी के अनुपात और घनत्व के आधार पर, चरण 5.6 और 5.10 में सूक्ष्मनलिकाएं बीजों की एकाग्रता को अनुकूलित किया जा सकता है।

Figure 4
चित्रा 4: दृश्य के क्षेत्र में एकल सूक्ष्मनलिकाएं और क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं की पहचान। 647 एनएम (बाएं), 560 एनएम (केंद्र), और विलय (दाएं) चैनलों को दिखाने वाले दृश्य के प्रतिनिधि क्षेत्र। एकल सूक्ष्मनलिकाएं (पीले एरोहेड्स) और बंडल (सफेद एरोहेड्स) मर्ज किए गए चैनल में इंगित किए जाते हैं। स्केल बार 2 μm को दर्शाता है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: एकल सूक्ष्मनलिकाएं और PRC1-crosslinked बंडलों की गतिशीलता. 647 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल वाले बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं बीज (नीले), 560 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल वाले गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं बीज और 560 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल घुलनशील ट्यूबुलिन (लाल), और जीएफपी-लेबल वाले पीआरसी 1 (हरे) के साथ सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता दिखाते हुए प्रतिनिधि वीडियो। एकल और क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं क्रमशः सफेद और पीले तीर द्वारा इंगित की जाती हैं। फिल्म को 10 मिनट (61 फ्रेम) से अधिक रिकॉर्ड किया गया था और 12 फ्रेम / सेकंड की दर से प्रदर्शित किया गया था। परख शर्तों: 0.5 nM GFP-PRC1, 50 mM KCl और 37 °C. स्केल बार: 5 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इमेजिंग अनुक्रम का अधिग्रहण करने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए वीडियो का विश्लेषण करें कि सूक्ष्मनलिकाएं गतिशील हैं (वीडियो 1)। परख घटकों को समायोजित करें (घुलनशील ट्यूबुलिन मिश्रण, न्यूक्लियोटाइड स्टॉक, प्रोटीन सांद्रता में ट्यूबुलिन की मात्रा) टिप्पणियों के अनुसार। उदाहरण के लिए, यदि सूक्ष्मनलिकाएं पॉलिमराइज़ नहीं करती हैं, तो घुलनशील ट्यूबुलिन मिश्रण में घुलनशील ट्यूबुलिन और / या जीटीपी की एकाग्रता में वृद्धि होती है। इसी तरह, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एमएपी की काम करने वाली सांद्रता में वृद्धि होती है यदि वे सूक्ष्मनलिकाएं पर दिखाई नहीं देते हैं, और सांद्रता को कम करते हैं यदि दृश्य के क्षेत्र में उनकी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता सूक्ष्मनलिकाएं पर उनकी तीव्रता के बराबर है। गतिशील मोटर प्रोटीन की कल्पना करते समय, एटीपी सांद्रता में वृद्धि करें यदि मोटर्स सूक्ष्मनलिकाएं पर गतिशीलता प्रदर्शित नहीं करते हैं। सूक्ष्मनलिकाएं प्रतिदीप्ति के अनुरूप उत्तेजना चैनलों के लिए लेजर तीव्रता को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एकल सूक्ष्मनलिकाएं और बंडलों के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर को डिटेक्टर की गतिशील सीमा के भीतर कब्जा किया जा सकता है।

वीडियो 2: दो एमएपी की उपस्थिति में एकल सूक्ष्मनलिकाएं और पीआरसी 1-क्रॉसलिंक्ड बंडलों की गतिशीलता में अंतर: CLASP1 और Kif4A। 647 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल वाले बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं बीज (नीले) और 560 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल वाले गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं बीज और 560 एनएम फ्लोरोफोर-लेबल घुलनशील ट्यूबुलिन (लाल) के साथ सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता दिखाते हुए प्रतिनिधि वीडियो। एकल और क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं क्रमशः सफेद और पीले तीर द्वारा इंगित की जाती हैं। फिल्म को 20 मिनट (121 फ्रेम) से अधिक रिकॉर्ड किया गया था और 20 फ्रेम / सेकंड की दर से प्रदर्शित किया गया था। परख शर्तों: 200 nM CLASP1-GFP, 0.5 nM PRC1, और 10 nM Kif4A. स्केल बार: 2 μm. वीडियो संदर्भ11 से reproduced है. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2 में दिखाए गए प्रतिनिधि उदाहरण में, एकल सूक्ष्मनलिकाएं और क्रॉसलिंककिए गए बंडलों वाले दृश्य का एक क्षेत्र दिखाया गया है। यह पाया गया है कि इन परख शर्तों के तहत (परख मिश्रण जिसमें 0.5 nM PRC1, 50 mM KCl, और ब्याज के एमएपी शामिल हैं: 200 nM GFP-लेबल CLASP1, 10 nM Kinesin Kif4A), एकल सूक्ष्मनलिकाएं परख के दौरान लम्बी होती हैं, जबकि क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं का विकास रुक जाता है।

सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, फिजी सॉफ़्टवेयर में माइक्रोस्कोपी फ़ाइलें खोलें, और विश्लेषण के लिए एकल सूक्ष्मनलिकाएं और बंडल चुनें। आगे के विश्लेषण से एकल सूक्ष्मनलिकाएं और बंडलों को बाहर करने के लिए निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग करें: सूक्ष्मनलिकाएं या बंडलों को बाहर करें (i) दृश्य के क्षेत्र के किनारों पर पाया जाता है, (ii) प्रोटीन समुच्चय द्वारा अस्पष्ट, या (iii) जिनके फिलामेंट्स टीआईआरएफ रेंज से जेड-दिशा में आगे बढ़ते हैं। सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता के पैरामीटर, जैसे कि लंबाई, विकास दर, बचाव आवृत्ति, और तबाही आवृत्ति, प्रत्येक एकल सूक्ष्मनलिकाएं या सूक्ष्मनलिकाएं जोड़ी 11,15 के लिए काइमोग्राफ का निर्माण और विश्लेषण करके प्राप्त की जा सकती हैं।

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Discussion

यहां वर्णित प्रयोग पारंपरिक सूक्ष्मनलिकाएं पुनर्गठन assays के दायरे और जटिलता का काफी विस्तार करता है, जो पारंपरिक रूप से एकल सूक्ष्मनलिकाएं या एक प्रकार की सरणी पर किया जाता है। वर्तमान परख एक साथ मात्रा निर्धारित करने के लिए और दो आबादी पर नियामक एमएपी गतिविधि की तुलना करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, अर्थात्, एकल सूक्ष्मनलिकाएं और crosslinked बंडल. इसके अलावा, यह परख दो प्रकार के बंडलों की परीक्षा के लिए अनुमति देता है: जो गतिशीलता की दीक्षा से पहले स्थिर बीजों से पूर्व-गठित होते हैं, और जो नवगठित होते हैं जब दो बढ़ते अंत एक-दूसरे का सामना करते हैं और क्रॉसलिंक हो जाते हैं (चित्रा 3)। इसके अलावा, पारंपरिक प्रयोगात्मक चर के अलावा, जैसे प्रोटीन सांद्रता और बफर स्थितियां, ये assays सूक्ष्मनलिकाएं सरणियों की ज्यामितीय विशेषताओं के प्रभावों के मूल्यांकन को सक्षम करते हैं, जैसे कि एक बंडल में आसन्न फिलामेंट्स के बीच लंबाई और कोण, जो सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता और एमएपी गतिविधि 16 के महत्वपूर्ण निर्धारकों के रूप में उभर रहे हैं।

कई सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित संरचनाओं के इन विट्रो पुनर्गठन के लिए इस प्रयोगात्मक विधि का विस्तार करने के लिए, निम्नलिखित प्रमुख मुद्दों को संबोधित करने की आवश्यकता है: (i) PRC1 अधिमानतः क्रॉसलिंक्स सूक्ष्मनलिकाएं जो एक-दूसरे के समानांतर उन्मुख हैं। जबकि इस तरह के बंडल माइटोसिस के दौरान सेल केंद्र में पाए जाते हैं, समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं के बंडल न्यूरोनल अक्षतंतुओं और माइटोटिक स्पिंडल के भीतर अन्य सूक्ष्मनलिकाएं-आधारित संरचनाओं में एक आम विशेषता हैं। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से किनेसिन -1 और TRIM4610,17 जैसे पुनः संयोजक क्रॉसलिंकर्स का उपयोग करके क्रॉसलिंककिए गए समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। (ii) इन पुनर्गठन में, प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर का उपयोग एकल सूक्ष्मनलिकाएं और सूक्ष्मनलिकाएं 11,15 के जोड़े के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है। यहां उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक परिस्थितियों के तहत, तीव्रता विश्लेषण से संकेत मिलता है कि अधिकांश बंडलों में दो क्रॉसलिंक्ड सूक्ष्मनलिकाएं होती हैं, और लाइन स्कैन विश्लेषण उनके सापेक्ष स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। हालांकि, जब एक बंडल में दो या तीन से अधिक फिलामेंट्स होते हैं, तो मानक टीआईआरएफ-आधारित इमेजिंग सिस्टम का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं (~ 25 एनएम व्यास) 18 के सिरों और ध्रुवीयता की पहचान में बाधा डालता है। इसके अलावा, जबकि क्रॉसलिंक्ड एंटी-समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं के प्लस-एंड्स को उनके विकास की दिशा से पहचानना संभव है, एक ही दिशा में बढ़ने वाले क्रॉस-लिंक्ड समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं के सिरों को अलग करना ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन से बाधित होता है। यहां वर्णित प्रयोग का एक विस्तार अलग-अलग सूक्ष्मनलिकाएं की स्थिति के लिए ध्रुवीयता-चिह्नित सूक्ष्मनलिकाएं या सूक्ष्मनलिकाएं टिप-बाइंडिंग प्रोटीन का उपयोग करना है। सूक्ष्मनलिकाएं के दसियों के साथ बंडलों के लिए, टीआईआरएफ-आधारित assays के उच्च अस्थायी संकल्प को उन तकनीकों के साथ पूरक करते हैं जिनमें उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन होता है, जैसे कि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी 19, एक बंडल के भीतर व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता में नई अंतर्दृष्टि उत्पन्न करने का वादा करता है।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच (संख्या 1DP2GM126894-01) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और प्यू चैरिटेबल ट्रस्ट और स्मिथ फैमिली फाउंडेशन से आर.एस. लेखकों ने प्रोटोकॉल के विकास और अनुकूलन की दिशा में उनके योगदान के लिए डॉ शुओ जियांग को धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) Sigma Aldrich 238813
1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) Sigma Aldrich P6757
18x18 mm #1.5 coverslips  Electron Microscopy Sciences 63787
2-Mercaptoethanol (BME) Sigma Aldrich M-6250
24x60 mm #1.5 coverslips Electron Microscopy Sciences 63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band  Chroma TRF89901-NK
Acetone Sigma Aldrich 320110
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma Aldrich A7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) Thermo Fischer Scientific A2666
Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner Branson CPX2800H
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm Beckman-Coulter  343778
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm Beckman-Coulter  343776
Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Laysan Bio #Biotin-PEG-SVA-5000
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich 2905
Catalase Sigma Aldrich C40
Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V Corning 6670
Delicate Task Wipes Kimtech 34120
Dithiothreitol (DTT) GoldBio DTT10
Emission filter Chroma ET610/75m
Ethanol (200-proof) Decon Labs 2705
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Sigma Aldrich 3777
Glucose Oxidase Sigma Aldrich G2133
GMPCPP Jena Bioscience  NU-405
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma Aldrich G8877
Hellmanex III detergent  Sigma Aldrich Z805939
Immersion oil, Type A Fisher Scientific 77010
Kappa-casein Sigma Aldrich C0406
Lanolin Fisher Scientific S25376
Lens Cleaning Tissue ThorLabs MC-5
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M9272
Methylcellulose Sigma Aldrich M0512
Microfuge 16 Benchtop Centrifuge Beckman-Coulter  A46474
Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted Globe Scientific 1380-50W
mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000  Laysan Bio #NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge Beckman-Coulter  393315
Paraffin Fisher Scientific P31-500
PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers Ted Pella 5377-NM
Petrolatum, White Fisher Scientific 18-605-050
Plasma Cleaner, 115V Harrick Plasma PDC-001
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma Aldrich 221473
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath USA Scientific 2510-1101
Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes USA Scientific 2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM Thermo Fischer Scientific PI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil
TIRF microscope Nikon Eclipse Ti
TLA 120.1 rotor Beckman-Coulter  362224
TLA 120.2 rotor Beckman-Coulter  357656
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain Cytoskeleton T240
Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain Cytoskeleton T333P
Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain Cytoskeleton TL670M
Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain Cytoskeleton TL620M
VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion Vector Biolabs SP-1800-7
VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A VWR 97025-630

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References

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जैव रसायन अंक 180
TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा <em>विट्रो में</em> क्रॉसलिंक्ड और एकल सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता का एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन
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Mani, N., Marchan, M. F.,… More

Mani, N., Marchan, M. F., Subramanian, R. Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63377, doi:10.3791/63377 (2022).

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