Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En etikettfri segmenteringstilnærming for intravital avbildning av mammary tumormikromiljø

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

Den intravitale avbildningsmetoden som er beskrevet her, bruker kollagen andre harmoniske generasjon og endogen fluorescens fra den metabolske kofaktoren NAD (P)H til ikke-invasivt segmentere et umerket tumormikromiljø i tumor-, stromal- og vaskulære rom for grundig analyse av 4D intravitale bilder.

Abstract

Evnen til å visualisere komplekse og dynamiske fysiologiske interaksjoner mellom mange celletyper og den ekstracellulære matrisen (ECM) i et levende tumormikromiljø er et viktig skritt mot å forstå mekanismer som regulerer tumorprogresjon. Selv om dette kan oppnås gjennom dagens intravitale avbildningsteknikker, er det fortsatt utfordrende på grunn av vevets heterogene natur og behovet for romlig kontekst innenfor den eksperimentelle observasjonen. For dette formål har vi utviklet en intravital bildearbeidsflyt som kombinerer kollagen andre harmoniske generasjonsavbildning, endogen fluorescens fra den metabolske kofaktoren NAD (P)H, og fluorescens levetidsavbildningsmikroskopi (FLIM) som et middel til ikke-invasivt å dele opp tumormikromiljøet i grunnleggende domener av tumorreiret, den omkringliggende stroma eller ECM, og vaskulaturen. Denne ikke-invasive protokollen beskriver den trinnvise prosessen som spenner fra oppkjøp av tidsforløpbilder av mammary tumormodeller til etterbehandlingsanalyse og bildesegmentering. Den viktigste fordelen med denne arbeidsflyten er at den utnytter metabolske signaturer for å kontekstualisere det dynamisk skiftende levende tumormikromiljøet uten bruk av eksogene fluorescerende etiketter, noe som gjør det fordelaktig for humane pasientavledede xenograft (PDX) modeller og fremtidig klinisk bruk der ekstrinsiske fluoroforer ikke er lett anvendelige.

Introduction

Den ekstracellulære matrisen (ECM) i tumormikromiljøet er kjent for å bli dynamisk avsatt og ombygd av flere celletyper for ytterligere å lette sykdomsprogresjonen 1,2,3. Disse matriseendringene gir både mekaniske og biologiske signaler som endrer celleadferd og ofte resulterer i en kontinuerlig syklus av matriseoppussing4. Undersøkelse av det dynamiske, gjensidige samspillet mellom tumorceller og den ekstracellulære matrisen utføres ofte ved hjelp av tredimensjonal (3D) in vitrokultur eller mikrofluidiske systemer. Mens disse nedenfra-og-opp-tilnærmingene har demonstrert mekanismer for ECM-ombygging 5,6,7, økt spredning8, epitelial til mesenchymal overgang 9,10,11,12, og tumorcellemigrasjon og invasjon 7,13,14,15,16 , har deres fokus primært vært på noen få celletyper (f.eks. tumorceller eller fibroblaster) innenfor en homogen 3D-matrise sammenlignet med mangfoldet og heterogeniteten til interaksjoner som finnes i et fysiologisk vev. I tillegg til in vitro-systemer kan ex vivo tumor histologi også gi litt innsikt i disse cellecelle- og celle-ECM-interaksjonene17. Immunohistokjemi har fordelen av å kunne analysere flere celletyper med hensyn til den romlig heterogene sammensetningen og arkitekturen til ECM, men de statiske endepunktene i fast vev fanger ikke opp den dynamiske naturen til interaksjoner mellom celler og mikromiljøet. Intravital avbildning har åpnet døren for å forhøre ulike og dynamiske interaksjoner innenfor den fysiologiske konteksten til det opprinnelige tumormikromiljøet.

Evnen til intravital tumoravbildning utvikler seg raskt. Forbedringer i utformingen av bildevinduer og kirurgiske teknikker for å implantere vinduene har gjort det mulig med langvarig langsgående tumoravbildning på en rekke anatomiske steder (dvs. primærsvulst, lymfeknuter, metastatiske steder 18,19,20). Dessuten blir kapasiteten til optisk instrumentering til å visualisere og samle inn data i flere dimensjoner (dvs. spektral, romlig fluorescensintensitet og levetid), og med høy oppløsning og hastighet (videohastighet) allment tilgjengelig. Den forbedrede teknologien gir en mulighet til å utforske raske endringer i cellesignalering og fenotypisk dynamikk i et fysiologisk miljø. Til slutt tillater utvidelsen av optogenetiske verktøy og det brede spekteret av genetiske fluorescerende konstruksjoner tagging av spesifikke celletyper for å fange cellemigrasjon i tumormikromiljøet eller cellelinjesporing under utvikling eller sykdomsprogresjon 21,22. Bruken av disse verktøyene i kombinasjon med CRISPR/Cas9-teknologi gir forskerne mulighet til å generere unike dyremodeller i tide.

Mens alle disse fremskrittene gjør intravital avbildning til en stadig kraftigere metode for å utforske dynamiske og fysiologiske cellulære interaksjoner, er det fortsatt et viktig behov for å utvikle strategier som gir romlig, tidsmessig og strukturell kontekst på vevsnivå til disse biologiske interaksjonene. For tiden kompenserer mange intravitale avbildningsstudier for mangel på visuelle landemerker som blodkar ved å injisere fluorescerende fargestoffer i vaskulaturen eller bruke musemodeller som eksogent uttrykker fluorescerende proteiner for å avgrense fysiske egenskaper. Injiserbare fargestoffer og substrater som fluorescerende dextrans brukes i stor grad til å merke vaskulaturen i intravitale samlinger19, 23, 24. Denne tilnærmingen er imidlertid ikke uten begrensninger. For det første krever det ytterligere musemanipulasjoner, og verktøyet er begrenset til kortsiktige eksperimenter. For langsgående studier kan fluorescerende dextran være problematisk når vi observerer opphopning av dekstran i fagocytiske celler eller diffusjon i det omkringliggende vevet over tid25. Eksogen fluorescerende protein inkorporering i musemodellen har blitt presentert som et alternativ til fluorescerende dextrans, men presenterer begrensninger av seg selv. Tilgjengeligheten og mangfoldet av eksogene fluoroforer i musemodeller er fortsatt begrenset og dyrt å lage. I tillegg, i spesifikke modeller, for eksempel PDX-modeller, er genetiske manipulasjoner ikke ønskelige eller mulige. Det har også vist seg at tilstedeværelsen av fluorescerende eller bioluminescerende proteiner i celler er anerkjent som fremmed i musen, og innenfor immunkompetente musemodeller reduserer dette mengden metastase på grunn av responsen fra vertsimmunsystemet26,27. Til slutt opptar eksogene fluorescerende proteiner eller fluorescerende fargestoffer som brukes til romlig kontekst eller for å segmentere etterfølgende data ofte hovedområder i lysspekteret som ellers kunne brukes til å undersøke de fysiologiske interaksjonene av interesse.

Bruken av det iboende signalet fra ECM eller endogen fluorescens fra celler i vevet representerer et potensielt universelt etikettfritt middel for å segmentere intravitale data for mer dyptgående cellulær og romlig analyse. Andre harmoniske generasjon (SHG) har lenge vært brukt til å visualisere ECM28. Med den påfølgende utviklingen av viktige verktøy for å hjelpe til med karakteriseringen av fiberorganisasjon 29,30,31, er det mulig å karakterisere celleadferd i forhold til lokal ECM-struktur. I tillegg gir autofluorescence fra den endogene metabolitten, NAD (P)H, et annet etikettfritt verktøy for å dele opp tumormikromiljøet in vivo. NAD(P)H fluoresces sterkt i tumorceller og kan brukes til å diskriminere grensene til den voksende svulstreiret fra sin omkringliggende stroma 21,32. Til slutt er vaskulaturen en viktig fysiologisk struktur i tumormikromiljøet og stedet for nøkkelcellespesifikke interaksjoner 33,34,35. Eksitasjonen av røde blodlegemer (RBC) eller blodplasma har blitt brukt til å visualisere tumorvaskulaturen, og ved hjelp av to- eller trefotoneksitasjon (2P; 3P) har målingen av blodstrømshastigheter vist seg å være mulig36. Men mens større blodårer er lett identifiserbare ved deres endogene fluorescenssignaturer, krever identifisering av subtile, variable og mindre fluorescerende små blodkar mer kompetanse. Disse iboende vanskelighetene hindrer optimal bildesegmentering. Heldigvis kan disse kildene til endogen fluorescens (dvs. røde blodlegemer og blodplasma) også måles ved fluorescens levetidsavbildning37, som utnytter de unike fotofysiske egenskapene til vaskulaturen og representerer et nyttig tillegg til den voksende intravitale verktøykassen.

I denne protokollen beskrives en arbeidsflyt for segmentering av firedimensjonal (4D) intravital avbildning eksplisitt ved hjelp av iboende signaler som endogen fluorescens og SHG fra oppkjøp til analyse. Denne protokollen er spesielt relevant for langsgående studier gjennom et pattedyravbildningsvindu der eksogen fluorescens kanskje ikke er praktisk eller mulig, slik tilfellet er med PDX-modeller. Segmenteringsprinsippene som er skissert her, gjelder imidlertid bredt for intravitale brukere som undersøker tumorbiologi, vevsutvikling eller til og med normal vevsfysiologi. Den rapporterte pakken med analysetilnærminger vil tillate brukerne å skille cellulær oppførsel mellom regioner med justerte eller tilfeldige kollagenfiberkonfigurasjoner, sammenligne tall eller oppførsel av celler som bor i bestemte områder av tumormikromiljøet, og kartlegge vaskulaturen til tumormikromiljøet ved hjelp av bare etikettfritt eller iboende signal. Sammen skaper disse metodene et operativt rammeverk for å maksimere dybden av informasjon oppnådd fra 4D intravital avbildning av brystkjertelen samtidig som behovet for ekstra eksogene etiketter minimeres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle beskrevne eksperimenter ble godkjent av University of Wisconsin-Madison's Institutional Animal Care and Use Committee. Trivsel og smertebehandling i alle dyreforsøk er avgjørende. Dermed er det gjort alt for å sikre at dyret er komfortabelt og godt ivaretatt på hvert trinn i prosedyren.

1. Generering av pattedyr bildevinduet (MIW)

  1. For å konstruere pattedyrets bildevindu, lag en 14 mm ring fra kirurgisk rustfritt stål.
  2. Rengjør den bearbeidede vindusrammen med en varm oppløsning på 5% rengjøringsmiddel, skyll i 10 minutter under rennende deionisert vann (DI), suge i 100% etanol i 10 minutter, og tørk deretter under en varmelampe. Autoklaver den tørkede MIW-rammen og oppbevar den til senere bruk.
  3. Forbered MIW-dekselglasset på følgende måte: Bløtlegg det runde dekkglasset #1,5 12 mm i 100 % etanol i 10 minutter, tørk under en varmelampe, og fest deretter til METALL-MIW-rammen ved hjelp av cyanoakrylatlim. Herd limet over natten.
  4. Rengjør den monterte MIW av overflødig lim ved hjelp av en aceton gjennomvåt vattpinne, og rengjør ved å senke den ned i 70% etanol i 10 minutter. La det rensede vinduet tørke. Forbered MIW på forhånd og oppbevar den i en steril Petri-tallerken før kirurgisk implantasjon.

2. Kirurgisk implantasjon av MIW

  1. Autoklaver kirurgiske verktøy og desinfiser overflater med 70% etanol før du begynner operasjonen for vindusimplantasjon.
  2. Utfør kirurgi på en desinfisert bordplate ved hjelp av et varmeteppe dekket med et sterilt felt. Still inn varmeteppet slik at temperaturen målt på toppen av det sterile feltet er 40 °C.
  3. Bruk ekstra kald belysning for å forhindre tørking av vev. Bruk forstørrelsesglass for å lette den kirurgiske prosedyren. Bruk verneutstyr som består av en steril, engangs labfrakk, kirurgiske ermer, hansker, øyebeskyttelse og ansiktsmaske som anbefalt av de kirurgiske beste fremgangsmåtene.
  4. Bedøv musen ved hjelp av en anestesi fordampermaskin med en isofluraninnstilling på 2,0% og en oksygenstrømningshastighet på 2,0 l / min. Administrer smertestillende midler (10 mg/kg meloksikam) ved subkutan injeksjon.
    MERK: Gi ytterligere doser i løpet av de første 24 h, helst hver 8-12 h for de første 2 dagene etter operasjonen.
  5. Når du er bedøvet (bekreftet uten respons på tåklemming), påfør en fuktighetsgivende øyegel for å forhindre tørking av øynene. Bruk en depilatorisk krem for å fjerne pels på operasjonsstedet (4. inguinal brystkjertel) etterfulgt av skylling med steril vann-gjennomvåt gasbind.
  6. Forbered det depilerte kirurgiske stedet for kirurgi ved å desinfisere hudoverflaten med 3 vekslende betadin- og etanolskrubb.
  7. For å starte operasjonen, løft huden forsiktig over fjerde brystkjertel nummer 4 ved hjelp av tang. Når huden er trukket bort fra kroppsveggen, fjern en ~ 1 mm del av det dermale laget på spissen av tangene med kirurgisk mikrosaks. Hvis blødning oppstår, bruk forsiktig trykk med steril gasbind til blødningen stopper.
    MERK: Generelt har større svulster større potensial til å blø enn mindre svulster eller normalt vev.
  8. Løsne brystkjertelen fra det dermale laget med milde bevegelser av tangene ved kirurgisk åpning for å unngå å kutte den underliggende kjertelen.
  9. Lag et 10 mm snitt og slipp brystkjertelen fra det dermale laget i periferien slik at suturer kan plasseres uten å trenge inn i brystkjertelen. Tilsett PBS for å dekke den eksponerte kjertelen/svulsten og for å forhindre tørking.
  10. Lag en veskestreng sutur langs periferien av åpningen ved hjelp av 5-0 silke flettet sutur. Sett inn en kant av MIW slik at det dermale laget griper inn i mottaks hakket på MIW.
  11. Strekk epitelet forsiktig på motsatt side av MIW og skyv metallet MIW på plass slik at det dermale laget fullt ut engasjerer mottaksskåret rundt hele MIW-omkretsen. Legg veskestrengen stramt for å trekke det dermale laget inn i hakket og bind det av for å sikre MIW helt.
  12. Legg til et aktuelt antibiotika til det dermale laget ved MIW, og overvåk musen kontinuerlig til den har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal heftelse. Hus den MIW-implanterte musen separat på mykt sengetøy med en iglo plassert i buret, og la musen komme seg i 48 timer før avbildning.

3. Posisjonering og vedlikehold av mus på mikroskopstadiet for avbildning

  1. Sett opp varmekammeret på mikroskopstadiet. Bruk et tvungent luftsystem satt til 30 °C eller et annet lignende system. Bruk en objektiv varmeapparat for å unngå drift i z fokus. La systemet komme til likevekt i minst 1 time før avbildning.
    MERK: Bedøvede mus er ikke i stand til å opprettholde kroppstemperaturen riktig, og derfor er det nødvendig å ha et oppvarmet miljø for eventuelle tidsforløpanskaffelser . Den objektive varmeren bidrar til å bekjempe effekten av termisk ekspansjon, et fenomen som forårsaker drift i z fokus som objektiv linse og vevet som blir avbildet kommer til termisk likevekt.
  2. Når varmekammeret på mikroskopet har stabilisert seg ved 30 °C, bedøv mottakermusen med anestesimaskininnstillinger på 2 % isofluran og oksygenstrøm på 2 l/min.
  3. Etter at musen er bedøvet (bekreftet ved ingen respons på tåklemme), rengjør utsiden av MIW-glasset med en bomullsapplikator og glassrenser, legg til øyesalve for å forhindre tørking, og sett inn et halevenekateter om nødvendig.
  4. For å opprettholde riktig hydrering, gi en innledende injeksjon på 0,5 ml PBS sub-kutant eller 100 μL gjennom hale venekateteret. Gjenta hver 2.
  5. Når musen er riktig klargjort, setter du opp mikroskopet for avbildning. For å redusere fordampning under tidsforløpmålinger, bruk en vannbasert gel i stedet for vann til nedsenkningsmediet. Dette bør gjøres før du plasserer musen på scenen. Se materialtabellen for detaljer om de optiske komponentene.
  6. Legg musen på mikroskopstadiet, monter isofluranslangen og trykk kragen på MIW inn i et 14 mm mottakshull i sceneinnsatsen for å stabilisere bildene. Ta bildefeltet i fokus ved hjelp av mikroskopet okularer og bruk brightfield belysning for å observere vaskulaturen med blodstrøm.
  7. Kontroller stabiliteten til synsfeltet. Hvis pustebevegelsesartefakter er til stede, bruk forsiktig kompresjon på baksiden av kjertelen med en liten skumblokk og et cincture-lignende stykke tape. Når kompresjon er påført, kontroller at blodstrømmen opprettholdes gjennom hele synsfeltet.
  8. Juster isoflurannivåene regelmessig i trinn på 0,25 % i løpet av bildebehandlingsøkten for å opprettholde et riktig nivå av sedasjon ved å telle dyrerespirasjon manuelt.
  9. Oppretthold en hastighet på 36-40 respirasjoner per min (rpm) for å forbedre dyrets levetid og optisk avbildning. Lavere respirasjonshastigheter kan føre til at musen ikke overlever eksperimentet, mens respirasjonshastigheter over 60 rpm kan føre til dårlig sedasjon, noe som kan øke pusten og bevegelsesartefakter i bildedataene.

4. Sett opp for 4D, intensitetsbasert, etikettfri intravital avbildning av dynamisk celleatferd

  1. Når musen er bedøvet og sikkert plassert på det omvendte mikroskopstadiet, begynner du å finne interesseområder.
  2. Bruk en lyskilde rettet mot MIW, bruk mikroskopets okularer for å identifisere potensielle områder for undersøkelse. Legg til og lagre x, y-posisjonene i programvaren for å gå tilbake til disse posisjonene.
    MERK: De fine detaljene i svulsten vil ikke være lett synlige med denne typen belysning. Målet er ganske enkelt å identifisere regioner for videre undersøkelser. Fokuset er på å se vaskulatur og blodstrøm.
  3. Etter at flere stillinger er lagret i programvaren, forhåndsviser du de valgte synsfeltene ved hjelp av 890 nm eksitasjon og FAD / SHG-filterkuben. Bruk en maksimal oppholdstid på 4 μs med lavere effekt og høy PMT-innstilling. Målet er å forhåndsvise synsfeltene uten å overeksponere vevet til overdreven laserlys.
  4. Når riktige effektnivåer er angitt, konfigurerer du z-stakkene. Vær oppmerksom på utseendet på rikelig kollagenfibre (SHG) på 20-50 μm under glassoverflaten på MIW. Kollagen vil bli mindre utbredt når mikroskopseksjonene dypere inn i svulsten (figur 1B). Hulrom i SHG avslører plasseringen av tumormasser.
  5. Sett den øverste z-skive, under laget av ensomme celler der de første kollagenfibrene vises på ~ 50-100 μm. Sett den nederste z-skive på ~ 250 μm, hvor fibrene falmer ut og det dårlige signalet dominerer. Gjenta dette for alle x-y-posisjoner som er lagret.
  6. Når z-stack-området er satt, øker du oppholdstiden (opptil 8 μs) og optimaliserer strøm- og detektorinnstillingene. Optimaliser effektnivåene etter behov for å begeistre vevet for hvert eksperiment. Bruk av krefter opp til 90 mW ved 750 nm eller 70 mW ved 890 nm ved baksiden av målet er innenfor et akseptabelt område.
    MERK: Bildedybden, mengden spredning i vevet, objektive egenskaper og detektorfølsomhet vil alle ha betydelig innvirkning på mengden kraft som trengs for å få et bilde.
  7. Juster tidsintervallene i henhold til eksperimentelle mål. Start med 10 minutters intervaller mellom samlingspunkter for de fleste intravitale migreringsfilmer.
  8. Selv om 2P-eksitasjon er skånsom mot celler og vev, vær klar over tegn på fototoksisitet, som celleblebbing eller raskt økende autofluorescence og overdreven fotobleaching. Reduser laserkraften eller øk tidsforløpintervallene som forholdene tilsier.

5. Fluorescens levetidsavbildning (FLIM) av NAD (P)H

  1. Mens du bevarer x-y-posisjonene fra timelapse-oppkjøpene, setter du opp mikroskopet for å samle en FLIM-stabel. Sett inn et 440/80-filter i en filterholder foran GaAsP-detektoren, og sett GaAsP-detektorspenningen til 800 i programvaren. Slå av romlysene når detektorene er på.
  2. I programvaren bytter du fra galvanometerbasert intensitetsavbildning til FLIM-bildemodus.
  3. Hvis du vil identifisere og maskere vaskulaturen, setter du oppløsningen til 512 x 512 piksler. For å samle komplementær metabolsk informasjon, sett oppløsningen til 256 x 256 piksler for å øke den tidsmessige oppløsningen til levetidssignaturen. Sett oppholdstiden til 4 μs og still laseren til 750 nm.
  4. Start skanning av forhåndsvisning og begynn å justere lasereffekten. Juster lasereffekten til avlesningen for den konstante brøkdiskriminatoren (CFD) er mellom 1 x 105 og 1 x 106. Ikke overskrid 1 x 106 , da dette vil resultere i foton pileup og dårlige samlede resultater.
  5. Når effektnivået er stilt inn, stiller du inn integrasjonstiden mellom 90 s og 120 s og starter FLIM-kolleksjonen. Det vil skaffe fotoner fra synsfeltet for den tildelte tiden.
  6. Valgfritt: Når alle nødvendige samlinger er gjort og musen er fjernet fra scenen, samler du inn en instrumentresponsfunksjon (IRF). Mål IRF ved å forestille overflaten av kommersielt tilgjengelige ureakrystaller i en glassbunnsfat med de samme parametrene og satt opp som brukes til å bildele vevet.
    MERK: IRF står for eventuelle forsinkelser eller refleksjoner på grunn av det elektroniske eller optiske oppsettet. IRF er innviklet i alle FLIM-oppkjøp, og dekonvolvering fra dataene kan forbedre nøyaktigheten av beregnede fluorescensforfallskurver. Når det er sagt, kan de beregnede IRF-ene ofte med rimelighet gjenskape kvaliteten på fluorescensforfallskurvene fra målt IRF. Det er god praksis å måle IRF til det er fastslått at beregnet IRF vil gi tilsvarende anfall av forfallskurvene og tilstrekkelig tilnærme resultatene fra det målte IRF.

6. Analyse av NADH Lifetime-bilder

  1. Åpne FLIM-programvare og importer NAD(P)H levetidsbildet fra datasettet. Hvis du vil ha mer informasjon om hvordan du bruker programvaren på riktig måte, kan du se de fluorescerende livstidshåndbøkene (se Materialfortegnelse).
  2. For å begynne med, definer modellparametrene i programvaren. Klikk Alternativer > modell på menylinjen. Merk av i følgende bokser: Innstillinger > Multi-Exponential Decay, Fit Method > MLE, Spatial Binning > Square, Threshold > Peak, og merk av for Fix Shift Før beregning av bilde.
  3. Klikk Farge > A1 % på rullegardinmenyen på menylinjen. På høyre side av vinduet definerer du det som en trekomponenttilpasning. Angi hyllestørrelse > 3.
  4. Juster terskelverdien > ~10. Revaluer terskelnøyaktighet etter at forfallsmatrisen er beregnet for første gang.
  5. Fikse τ1 til 200 ps. Dette representerer den korte levetiden til røde blodlegemer. Prøv å finne verdien som best samsvarer med flere flekker i det større blodkaret, som kan ses i intensitetsbildet. Fikse τ2 til 1200 ps. Dette representerer den lange levetiden til røde blodlegemer.
    MERK: De innstilte verdiene er bare startpunktet. Verdiene må optimaliseres for å få frem vaskulaturen mer. I de fleste tilfeller, men ikke alltid, vil disse verdiene reduseres.
  6. Velg Forfallsmatrise under Beregn på menylinjen. Dette vil generere en innledende A1% levetid bilder med vaskulaturen har høye verdier. Bruk markøren (trådkors) til å holde markøren over vaskulaturen. Systematisk og én om gangen flyter (fjern merket for Korriger-boksen) τ1 og τ2. Registrer disse verdiene, da de vil bidra til å optimalisere de faste parametrene.
    MERK: Målet er ikke nødvendigvis å få de mest nøyaktige verdiene i bildet, men heller å maksimere forskjellen mellom vaskulaturen og vevet uten å dramatisk redusere området identifisert som vaskulatur.
  7. Når de aktuelle parameterne for τ1 og τ2 er identifisert, velger du Beregn > satsvis behandling på menylinjen. Kontroller at de fleste innstillingene er like mellom z-stykker.
  8. Sørg for å bekrefte at det ikke er noen innstilling som er grovt forskjellig fra de andre. I så fall justerer du skiftet først og prøver på nytt. Hvis problemet vedvarer, kan du montere på nytt ved hjelp av nye parametere. Feil skift kan være en stor årsak til støy i anfallene og kan økeA 1% verdier i de tilstøtende tumorområdene.
  9. Lagre filene i menyfanen, og eksporter deretter A1% filer. Last opp disse filene i ImageJ for maskering og segmentering.

7. Bildesegmentering av vaskulaturen

  1. Åpne ImageJ og importer A1% bildet som et tekstbilde. Gjenta dette for alle bildene i stakken.
  2. Når alle A1 % -bildene er åpnet, velger du Bilde >-stakk > Z-Project. Bruk Maksimal intensitetsprojeksjon , og lagre bildene. Se Supplerende data 1 for et representativt bilde.
  3. Gå til Plugins > segmentering. Velg den trenbare WEKA segmentering plugin38.
  4. Når WEKA-vinduet åpnes, bruker du standardinnstillingene og begynner å trene programvaren ved å opprette to klasser og sporingslinjer over vaskulaturen (høy A1% regioner) og ikke-vaskulatur (lav A1% regioner).
  5. Fortsett å legge til nye spor i de to klassene til programvaren konsekvent identifiserer de høye A1% regionene i vaskulaturen mens du eliminerer høyere områder av bakgrunnsstøy. Se Tilleggsmodell for representativ klassifiserermodell.
  6. Når det klassifiserte bildet er produsert, klikker du på Bilde > Type > 8 Bit. Terskel bildet og opprett en maske. Hvis det terskelede bildet fortsatt må ryddes opp ytterligere, bruker du funksjonen Analyser partikler .
  7. Juster størrelsen og sirkulariteten til mindre og sirkulære områder i det terskelede bildet utelates. En ren maske med bare vaskulaturen og svært liten bakgrunn oppnås.
  8. Klikk Rediger > merket område > Opprett merket område. Overfør utvalget til ROI manager ved å klikke på Analyser > Tools > ROI manager.
  9. Dupliser det klassifiserte bildet. Fortsett til behandle > binær. Hvis du vil utvide masken og definere avstanden fra vaskulaturen som skal inkluderes i bildesegmenteringen, velger du Dilate. Gjenta til masken er utvidet til ønsket område. Registrer dette interesseområdet (ROI) i ROI-lederen.
    MERK: Målet med dette trinnet er å kvantifisere mengden eller oppførselen innenfor en viss nærhet av blodkaret (for eksempel antall celler som er tilstede i X μm av blodkarene). Mengden utvidelse som kreves er helt bestemt av det vitenskapelige spørsmålet.
  10. Hvis du vil kvantifisere antall celler i de restriktive områdene, merker du vinduet (bilde/kanal) av interesse. Dette kan være et hvilket som helst vindu som deler samme synsfelt som den vaskulære masken. Bruk begge avkastningene ved hjelp av XOR-funksjonen fra rullegardinmenyen.
    MERK: Denne operasjonen vil måle elementene innen ønsket avstand fra vaskulaturen, unntatt selve vaskulaturen. Denne kombinerte avkastningenilnærmingen kan deretter brukes til å måle en rekke parametere, for eksempel intensitet, cellenummer eller overføring.

8. Bildesegmentering av svulstreiret

  1. Åpne NADH-bildet enten fra en skanning med høy oppløsning eller FLIM-samling i ImageJ.
    MERK: Dette kan gjøres på individuelle z-skiver, fulle stabler eller brukes på z-projeksjoner av noen få skiver.
  2. Gå til Plugins > segmentering. Velg den trenbare WEKA-segmenteringspluginen.
  3. Når WEKA-vinduet åpnes, bruker du standardinnstillingene og begynner å trene programvaren i to klasser av NADH-høye regioner og NADH-lave regioner. De NADH-høye regionene vil ha et veldig merkbart mønster av celler med kjerner, og programvaren vil lett identifisere den.
  4. Fortsett å veksle frem og tilbake med overlegget for å avgrense algoritmen med ekstra trening til den gjenkjenner alle regioner i svulsten som bestemt av øye og forkunnskaper om tumormorfologi. Dette er en iterativ prosess.
  5. Når algoritmen gjenkjenner alle regionene i svulsten, velger du Opprett resultat-knappen . Dette vil gi et nytt bilde. Dupliser dette bildet.
  6. Velg det første dupliserte bildet og konverter det til et 8-biters bilde ved å velge Bilde > Type > 8-biters. Terskel for dette bildet for å opprette en binær maske. Deretter oppretter du et valg og overfører det til ROI-lederen. Disse ROIene definerer stromaen.
  7. Velg det andre av det dupliserte bildet, og konverter det til et 8-biters bilde. Inverter dette bildet ved å velge Bilde > Rediger > Inverter, og terskel deretter dette bildet for å opprette en binær maske. Opprett nok en gang et valg og overfør det til ROI-lederen. Denne avkastningen vil definere svulstreiret.

9. Bildesegmentering etter fiberorganisasjon eller justering

  1. For å begynne med, åpne SHG-bildene, forbered enhver z-projeksjon og vurder behovet for forhåndsbehandling. For gode resultater kreves bilder av høy kvalitet med merkbare fibre og lite støy.
  2. Valgfritt: For forhåndsbehandling i ImageJ for å øke signal-til-støy (SNR) på SHG-kanalen, trekk bakgrunnen ved hjelp av en rullende kule subtraksjon. For de fleste programmer bruker du et rullende kuledeltrekk mellom 20 piksler og 50 piksler. Deretter jevner du ut bildet og lagrer det.
  3. Åpne OrientationJ-plugin-modulen og angi behandlingsparameterne. I OrientationJ -vinduet definerer du størrelsen på det lokale tensorvinduet. Hvis du vil ha et 20x bilde av denne fibertettheten, angir du 10 piksler til 15 piksler som utgangspunkt.
  4. Velg Kubikkspline som graderingsmodell, og merk av for Fargeundersøkelse. Definer fargeundersøkelsen. Angi både kulør og metning som sammenheng, og definer deretter lysstyrken som opprinnelig bilde, trykk Kjør.
  5. Utdatafilen for plugin-modulen er RGB-fargekart. Juster verdien av det lokale tensorvinduet til justerte områder, som bestemt av øyet, er riktig uthevet med blå og magenta fargetoner.
  6. Når utdatabildet er tilfredsstillende, deler du dette RGB-bildet i tre kanaler. Velg Bilde > farge > delte kanal.
  7. Hvis du vil forbedre utseendet på justerte områder med det formål å maskere, bruker du bildekalkulatoren ved å velge Behandle > bildekalkulator. Bruk denne operatoren til å trekke det grønne bildet fra det blå bildet. Hvis du vil ha en mer restriktiv maske, trekker du det grønne bildet fra det røde bildet. For tilfeldige områder trekker du den blå kanalen fra den grønne kanalen.
  8. Terskel for det resulterende bildet ved hjelp av Moments-algoritmen . I de fleste tilfeller bør dette ikke trenge ytterligere justeringer. Juster imidlertid om nødvendig. Dette vil gi et binært bilde.
  9. Når det binære bildet er laget, fyller du hullene ved å velge Prosess > binær > Fyll hull mellom fibre og rund ut maskens grenser ved hjelp av et medianfilter. Et medianfilter på 10 er et godt utgangspunkt, juster det for å passe godt til dataene. Kontroller masken manuelt for avtale, og fjern eventuelle ROIer som er feilaktige.
  10. Når masken er tilfredsstillende, oppretter du en markering ved å velge Rediger > markering > Opprett markering. Overfør dette valget til ROI-lederen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Installasjonen av MIW og grunnleggende eksperimentell planlegging er de første trinnene i denne prosessen. Denne spesielle MIW-designen og protokollen er mer egnet til langsgående studier19 og har blitt brukt med både oppreiste og inverterte mikroskoper. I dette tilfellet ble et invertert mikroskop brukt, da det har resultert i større bildestabilitet av brystkjertelen med færre pusteartefakter. I figur 1A gir vi dimensjonene til den stive MIW og en grafisk oversikt over implantasjonsprosessen.

Et typisk synsfelt i en etikettfri MMTV-PyMT39-mammarysvulst (figur 1B-E, figur 3A) er svært heterogen, bestående av kollagenfibre, mange stromale celler, masser av tumorceller og vaskulatur (figur 3A). Generelt er kollagenfibre mer rikelig nær vinduet og reduseres i overflod dypere inn i svulsten (Figur 1B-E) Organiseringen av fibrene rundt tumormassene kan også være ganske variert, ofte med regioner med mer tilfeldig organisering i samme synsfelt som regioner med høyere justering (figur 2D, H og figur 3I).

For å utvikle en analyserørledning som kan segmentere intravitale data i perivasculære regioner, svulst og stroma, fokuserte denne protokollen på å bruke signalet fra endogen NAD (P)H og SHG. Mens identifisering av svulsten og stroma kan være grei, kan identifisering av perivascular regioner i tumormikromiljøet være utfordrende. Vaskulaturen ligger ofte innenfor de smale båndene til redusert NAD(P)H-signal mellom de lyse NAD(P)H+ kreftcellemassene. Det er viktig å merke seg at ikke alle mørke grenser havner vaskulatur; Snarere er noen mørke områder ganske enkelt tumorfolder eller butting opp av tilstøtende tumorlober (gul pil, figur 2G). Videre, mens et erfarent øye kan trekke ut blodkarene med større diameter fra svulsten, da de har et særegent utseende, er dette skillet ikke alltid trivielt. Dette gjelder spesielt for fartøy med mindre diameter der deres utseende kan være mer subtilt og variabelt. I dette tilfellet kan bruken av fluorescenslevetiden til NAD(P)H hjelpe til med positiv identifisering av vaskulaturen (figur 2B,F). Fluorescenslevetid (FLIM) måler ikke overflod eller intensitet av fotoner på et sted, men tiden det tar for de spente molekylene å avgi en foton og forfall til deres bakketilstand. Røde blodlegemer (RBC) og blodplasma har vist seg å ha en karakteristisk kort og særegen fluorescenslevetid32,37 som kan utnyttes for identifisering og segmentering av kar i vev.

For å bestemme hvor godt fluorescenslevetiden til NAD (P)H identifiserer vaskulaturen intravitalt, ble en 100 μL bolus av en rhodaminmerket dextran injisert i halevenen etter å ha samlet FLIM-bildet. Sammenligninger av maksimalintensitetsprojeksjoner av NAD(P)H FLIM speiler tett de fartøyene som er merket med en fluorescerende merket dextran (figur 2I-J). Å gjenta denne tilnærmingen hos flere mus viste at det gjennomsnittlige maskeområdet fra FLIM-bildet over dekstranmasken var 78,6% ± 12,3% (figur 2L). Mens overlegget ikke var 100%, kartla denne teknikken nøyaktig hele det vaskulære nettverket. Forskjellene som observeres i de rapporterte områdene kan ofte tilskrives intravital drift eller registreringsproblemer, tynnere kardiametre på grunn av modelltilpasning, eller tap av fine fartøy på grunn av RBC-utelukkelse ved trykket fra den voksende massen. Viktigst, denne teknikken fungerer like bra i nærvær av både genetisk kodede fluoroforer som GFP eller etikettfrie tumormodeller (figur 2D, H), og gir dermed et veldig robust og bredt anvendelig middel for å identifisere vaskulaturen for bildesegmentering.

For å avgrense grensene for etikettfrie tumormasser ble NAD(P)H autofluorescence (figur 1C) brukt. Dette kan fanges opp enten ved å samle inn et NAD(P)H-bilde uavhengig av hverandre eller summere NAD(P)H FLIM-dataene for å generere et intensitetsbilde. Begge rutene vil tillate egnet segmentering av tumormikromiljøet. Som en generell observasjon fremkaller tofotoneksitasjon av NAD(P)H i kreftceller lys autofluorescens som produserer et bilde som viser skarpe individuelle celler med mørkere kjerner (figur 2E, G). Dette mønsteret kan brukes til å definere omfanget av den voksende massen. Mens enkel intensitetsbasert terring av NAD(P)H er mulig å definere grensen til tumorrommet, fungerer et trenbart segmenteringsverktøy ofte bedre (figur 3B, E). Noen andre vanlige avlesninger, som cellemigrasjon eller cellulær fremspringende analyse, kan dra nytte av genetisk kodet eksogen fluorescens i musemodellen eller implantasjon av fluorescerende merkede cellelinjer (figur 2A). I disse tilfellene kan oppgaven med å avgrense massegrensen oppnås med enkel terskeling av det fluorescerende proteinet. Noen ganger kan uttrykket av fluorofor bli ganske heterogent etter implantasjon. Dette bør ikke forårsake segmenteringsproblemer. Det har også ofte blitt observert at svulster skapt av fluorescerende allografter eller xenografts har mindre inndelte regioner av kollagenfibre enn svulster skapt av genetiske tumormodeller som MMTV-PyMT16.

Det stromale rommet omfatter regionene utenfor den voksende massen eller mellom voksende masser, og en maske for stroma oppnås ved å invertere svulsten ROI (Figur 3B-F). Det stromale rommet kan deretter videre deles inn i sub-ROIer basert på kollagenfiberarkitektur. Kollagenfibre er en betydelig funksjon i stroma og har et stort mangfold av fiberorganisasjoner, som er kjent for å modulere celleadferd 40,41. Ofte finnes det mange lokale (<100 μm) regioner med justerte eller tilfeldige fibre i bildet16. Derfor ble regioner med relativt justerte (røde / blå fargetoner) eller tilfeldige (grønne fargetoner) fiberorganisasjon (figur 3I) identifisert med OrientationJ-pluginet. Ved hjelp av Fargekartet OrientationJ-sammenheng kan masker basert på den lokale fiberorganisasjonen opprettes for segmenteringsformål (figur 3J). Disse maskene kan deretter legges over for å analysere differensial dynamisk stromal celleoppførsel (figur 3K) på grunn av effekten av spesifikk fiberorganisasjon (figur 3H, I).

Nå som ROIer for de forskjellige rommene i tumormikromiljøet er definert, kan de brukes på de enkelte rammene eller kanalene i den intravitale timelapse-filmen. På dette tidspunktet er det viktig å understreke at alle signalene vist i figur 3A er avledet helt fra endogene kilder. Dette bildet demonstrerer det rike potensialet til romlige og kontekstuelle signaler som kan komme fra rent endogene, allestedsnærværende og etikettfrie kilder. Her brukte vi MMTV-PyMT tumormodellen som et eksempel for å illustrere metodens applicabilty for å kvantifisere antall og egenskaper ved makrofager på bestemte steder i tumormikromiljøet (TME). En tidligere intravital studie42 har vist at celler som avgir høye nivåer av FAD autofluorescence (figur 3A, magentaceller, gule piler) flekker positivt med F4/80 antistoffer og representerer en populasjon av makrofager i TME. Ved å bruke denne arbeidsflyten til å segmentere bildet, er det mulig å effektivt og nøyaktig undersøke antallet, overvåke cellecelleinteraksjoner over tid, eller til og med observere de metabolske egenskapene til dette delsettet av makrofager (magenta) i forskjellige rom i TME (figur 3A, gule piler). For eksempel kan oppførselen til FAD-høye makrofager som spesifikt ligger i NAD (P) H-høy tumorreir karakteriseres (figur 3E). På samme måte kan oppførselen til makrofager med hensyn til den lokale organiseringen av fibrene i stromaområdet undersøkes. Noen nylige rapporter har indikert at makrofager og andre migrerende celler i stromaen reagerer på mekaniske signaler fra deres lokale mikromiljø 16,43,44. Ved hjelp av fiberjusteringsmaskene produsert av denne metoden, er det mulig å undersøke deres differensialatferd mellom regioner av tilfeldige og justerte kollagenorganisasjoner. Til slutt kan denne samme fokuserte analysen også brukes til å bestemme antall og oppførselen til makrofager lokalisert innenfor en definert nærhet til vaskulaturen. I figur 3G kan vaskulaturen ses i rødt, og makrofager kan igjen ses i magenta. En maske for vaskulaturen ved hjelp av NAD(P)H FLIM ble opprettet og deretter utvidet gjennom utvidelse på 10 piksler. Avstanden som ble valgt var vilkårlig for demonstrasjonsformål, men kan optimaliseres for de spesielle behovene til det enkelte eksperimentet. Viktig, selv om dette bildet er av en enkelt z-stykke, kan denne prosedyren lett ekstrapoleres til 3D-stabler for å observere oppførsel rundt hele volumet av fartøyet.

Figure 1
Figur 1: Grafisk abstraksjon av pattedyrvinduimplantasjon og den underliggende organiseringen av en MMTV-PyMT-svulst. (A) Dimensjonene til brystavbildningsvinduet og skjematisk for den generelle implantasjonsprosessen. (B-E) Dette er en montasje fra en umerket MMTV-PyMT tumorrepresentant som starter fra 50 μm under overflaten av MIW og fortsetter til en dybde på 80 μm. Dybdeverdiene angis under hvert bilde. Kollagenfibre (grå) er mer utbredt på overflaten av svulsten (NAD (P)H, blå) enn på større dybder. Skalalinje 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativt intravitalt bilde av en GFP merket og etikettfri PyMT-svulst og validering av NAD(P)H FLIM som markør for vaskulaturen. Et sammensatt bilde (A) av en typisk allograft av GFP-4T1 celler i pattedyrfettputen og en representativ mammarysvulst fra en MMTV-PyMT tumormodell (E). NAD(P)H FLIM kartlegger vaskulaturen i begge modellene (B, F). GFP fluorescens (C) og NAD(P)H autofluorescence (G) ble brukt til å identifisere svulsten. Kollagen ble visualisert av SHG (D,H). Et sammensatt bilde ved hjelp av NAD(P)H FLIM for å identifisere vaskulatur ble validert ved å sammenligne maksimal intensitet projeksjoner av intravital stack før og etter hale vene injeksjon av fluorescerende dextran (I, J, K). Kvantifiseringen av forholdet mellom området bestemt av NAD(P)H FLIM over området identifisert ved dekstran injeksjon i fire mus (farge identifiserer individuelle mus) og flere synsfelt (individuelle prikker i graf) er vist i (L). Skalastenger 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativ bildesegmentering ved hjelp av endogen fluorescens i etikettfri PyMT-svulst. Et sammensatt bilde (A) av en enkelt z-skive fra en typisk PyMT-mammarysvulst ble samlet inn ved hjelp av bare iboende signaler. SHG (grå) visualiserer kollagenfibrene i svulsten. Fluorescens livstidsavbildning av NAD(P)H autofluorescence (Tau (τ) gjennomsnitt) rapporterer cellenes metabolske signaturer (grønne til oransje fargetoner) og plasseringen av blodkar (rød). FAD autofluorescence (magenta) identifiserer makrofager. Ved hjelp av segmenteringsordningen som er skissert i denne protokollen, ble den etikettfrie svulsten segmentert i rom for tumorreiret (B, E), stroma (C, F) og vaskulatur (D, G) ved hjelp av bare SHG og NAD (P) H autofluorescence. Stroma- og kollagenfibrene (H) kan også klassifiseres i lokale regioner med justerte fibre ((vist i magenta/blå), J, K). Skalastenger 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende data 1: Representativt datasett for montert A1% fra NAD(P)H FLIM. Dette er en maksimal intensitetsprojeksjon av en montert A1% fra et typisk datasett. Det er en representant for kvaliteten på identifikasjonen som er mulig og et typisk bakgrunnsnivå før du bruker den trenbare klassifisereren. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsmodell: Representativ klassifiserer som brukes på montert A1% for identifisering av vaskulaturen. Dette er en prøveklassifiserermodell for bruk i den trenbare WEKA-segmenteringspluginen i ImageJ. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4D intravital avbildning er et kraftig verktøy for å undersøke dynamiske fysiologiske interaksjoner innenfor den romlige og tidsmessige konteksten til det opprinnelige tumormikromiljøet. Dette manuskriptet gir et veldig grunnleggende og tilpasningsdyktig operasjonelt rammeverk for å dele opp dynamiske celleinteraksjoner i tumormassen, det tilstøtende stromaet, eller i nærheten av det vaskulære nettverket ved hjelp av bare endogene signaler fra andre harmoniske generasjon eller NAD (P) H autofluorescence. Denne protokollen gir en omfattende, trinnvis metode fra implantasjon av bildevinduet til bildeanskaffelse, analyse og segmentering. Vi tror denne teknikken vil bidra til et nødvendig analyserammeverk for å segmentere og kvantifisere 4D intravitale data.

Denne protokollen ble utviklet for å være bredt kompatibel med mange intravitale musemodeller, inkludert umerkede PDX-modeller. PDX er en utrolig informativ modell45, men utgjør en utfordring for intravital avbildning fordi arten av PDX-modellen ikke er godt egnet for genetisk manipulering. Derfor ville det være ganske fordelaktig å ha en metode som kan visualisere og dele opp dynamiske interaksjoner i deres umerkede fysiologiske miljø ved hjelp av utelukkende endogene metabolitter som NAD (P)H og andre harmoniske generasjon (SHG). I tillegg til å være fordelaktig for PDX-modeller, kan denne flerdimensjonale tilnærmingen teoretisk brukes på enhver intravital studie i kreft eller normalt vev som trenger romlig og strukturell kontekst for å adressere et fysiologisk spørsmål. NAD(P)H autofluorescence og SHG fra kollagenfibre er allestedsnærværende for alle vev og representerer en universell og fri ressurs i intravitale samlinger. Denne FLIM-tilnærmingen er også robust, da den kan identifisere vaskulaturen i nærvær av fluorescens fra eksogene kilder som GFP. Denne tilnærmingen er også fordelaktig fordi SHG- og NAD(P)H-utslipp kan visualiseres i det blå spekteret, og dermed ligge i en bølgelengde som vanligvis ikke brukes i avbildningen av fluorescerende fusjonskonstruksjoner som ellers kan være nødvendig for studien.

Aspektet av denne tilnærmingen som er ny og har spesiell merverdi er den etikettfrie identifikasjonen av vaskulaturen. Mens andre tilnærminger kan fungere, gir bruken av fluorescenslevetiden til NAD (P)H lett en klar signatur uten behov for ytterligere merking. Dataene viser at de livstidsdefinerte karene speiler vaskulaturen merket fra hale vene injeksjon av fluorescerende dextran, gullstandarden for vaskulaturavbildning. Vår teknikk utmerker seg ved å visualisere mindre blodkar sammenlignet med enkel to-foton eller tre-foton eksitasjon, hvor større fartøy er lett visualisert, men mindre krever mer kompetanse for å identifisere. Livstidssignaturen er entydig for alle fartøy, uavhengig av størrelse. Videre kan dette ekstra NAD (P)H FLIM-oppkjøpet enkelt kombineres med andre markører for segmentering av tumormikromiljøet. Gjennom et enkelt FLIM-oppkjøp av NAD(P)H er kravene til å definere vaskulaturen, tumorreiret og stroma oppnåelige. FLIM-kolleksjonen kan innlemmes i den eksisterende eksperimentelle designen ved å samle et enkelt oppkjøp på slutten eller begynnelsen av en tidsserie eller blande samlingene gjennom hele 4D-oppkjøpet. Bestemmelse av riktig mengde FLIM-bilder vil avhenge av spesifikke eksperimentelle behov og begrensninger, for eksempel anskaffelsesintervaller, eksperimentell varighet eller bildestabilitet, men minst vil en FLIM-samling per 4D-serie være nødvendig for denne metoden.

Denne prosessen med å bruke NAD(P)H FLIM for identifisering av vaskulaturen krever matematisk tilpasning av FLIM-dataene til en eksponentiell funksjon av skjemaet.

Equation 1

med A1+A2+A3=1. Mens de fleste livstidsbilder av NAD (P)H rapportert i litteraturen er montert som en bi-eksponentiell, i dette programmet NAD (P)H ble montert som en tri-eksponentiell der τ1 og τ2 er satt til de rapporterte verdiene av RBCs og τ3 har lov til å flyte. Det viktigste er at målet ikke er å oppnå den mest nøyaktige levetidsverdien, men heller å gi et optimalt bilde for segmentering. Når τ1- og τ2-verdiene i utgangspunktet er fastsatt til de rapporterte verdiene til RBCs32,46 og matrisen beregnes, vil blodkarene skille seg ut med A1% verdier større enn 60% i blodkarene og A1% verdier generelt mindre enn 40% i den tilstøtende svulsten. Det neste trinnet er å prøve å maksimere A1% i blodårene mens du minimerer A1% i den tilstøtende svulsten. Dette er en iterativ prosess, og ved slutten av det vil A1% verdiene i blodkarene være større enn 90% med A1% verdiene av svulsten mindre enn 10%. Når A1% verdiene i blodårene er jevnt høye og bakgrunnen er jevnt lav, eksporter disse A1% filene til et trenbart segmenteringsverktøy. Dette vil raskt fjerne eventuell gjenværende støy og definere avkastningen for vaskulaturen.

Siden brystfettputen ligger utenfor kroppshulen, er operasjonen minimalt invasiv, og de beste resultatene oppnås ved å implantere MIW over denfjerde inguinale brystkjertelen. Tidspunktet for vindusimplantasjon og når eksperimentet skal utføres er kritisk. Det er best å tillate 24 - 48 timers helbredelse etter operasjonen før det fysiologiske tidspunktet som vil bli undersøkt. Mens selve prosedyren bare krever et lite snitt (≈ 10 mm) for å sette inn vinduet (figur 1A), vil helbredelsestiden etter operasjonen tillate betennelse og væsker som akkumuleres på grunn av implantasjonsprosessen å fjerne. Videre vil det også tillate svulsten å fortsette å vokse inn i vinduet. Begge faktorene vil forbedre den generelle bildekvaliteten ved å redusere tetthet/spredning og øke bildestabiliteten. Den neste tingen å vurdere er den planlagte totale varigheten av eksperimentet. Mens disse vinduene ble designet for langsgående studier, pådrar vinduets stive natur en tidsbegrensning på 2 til 3 uker. Etter den tiden har vinduet en tendens til å løsne fra det dermale laget, og dermed forurense og avslutte eksperimentet. Hvis en langsgående studie av brystkjertelen ikke er nødvendig, kan andre intravitale metoder som en terminal hudklaffprosedyre22 som eliminerer kirurgisk implantasjon av en MIW være et bedre alternativ. Hudklaffprosedyren gir bedre tilgang til hele kjertelen, da den ikke er begrenset av plasseringen og dimensjonene til MIW, og det kan gi større bildestabilitet når kjertelen trekkes bort fra kroppshulen. Uavhengig av den intravitale avbildningsmetoden, er segmenteringen av mikromiljøet ved hjelp av endogen fluorescens fortsatt bredt anvendelig for påfølgende bildeanalyse. Den siste tingen å vurdere er varigheten av det enkelte bildebehandlingseksperimentet. Det er ikke urimelig å skaffe seg filmer som varer 6-8 timer. Men under de lengre samlingene blir hydrering et problem, og nøye overvåking av musens helse er nødvendig.

En betydelig fordel med denne metoden er at de forskjellige bildene av endogen fluorescens som kreves for segmentering av tumormikromiljøet, kan samles relativt enkelt og uten ytterligere manipulasjoner til musen. Med filter/dikroisk kombinasjon rapportert her (Materialfortegnelse), kan både SHG- og NADH-bilder anskaffes med samme filter satt ved å bytte bølgelengder fra 890 nm til 750 nm. Selv om dette skaper en anskaffelsesforsinkelse, påvirker det ikke etterfølgende bildesegmentering. Det er også viktig å huske at denne metoden representerer bare et utgangspunkt for en segmenteringsteknikk ved hjelp av endogen fluorescens, og mer avanserte optiske konfigurasjoner kan tillate samtidige oppkjøp om nødvendig.

Det er begrensninger ved bruk av FLIM for å identifisere vaskulaturen. FLIM-tilnærmingen krever spesialisert elektronikk, instrumentering og ekspertise for å samle inn. Imidlertid blir alle disse kravene i økende grad integrert i moderne mikroskoper og mer tilgjengelig gjennom bruk av bildebehandlingskjerneanlegg. FLIM har blitt en moden teknologi og å skaffe seg gode data krever ikke mye trening. En annen begrensning er at FLIM-oppkjøp er tidkrevende. Mens bildefrekvensen for et bilde samlet med fluorescerende dextran er omtrent et sekund eller mindre, kan den gjennomsnittlige FLIM-samlingen variere fra 60 s til 120 s, noe som kan være forbudt hvis de fysiologiske tidspunktene er kortere enn det. FLIM identifikasjon av vaskulaturen er ikke ment å erstatte alle hale vene injisert fluorescerende dextran eller multifoton eksitasjon av vaskulaturen; Snarere er det enda en tilnærming i den voksende verktøykassen for intravital avbildning. Videre forventer vi at lengre oppkjøpstider vil bli dramatisk kortere i årene som kommer. Detektorene og elektronikken forbedrer seg raskt, reduserer detektorens dødtid, og krever dermed kortere anskaffelsesperioder for å fange opp samme antall fotoner. En annen grunn til å være optimistisk til kortere oppkjøpstider er fremveksten av maskinlæringsprogramvare eller bildegjenopprettingsalgoritme som CSBDeep47. Disse algoritmene kan potensielt trenes til å arbeide med kortere eksponeringstider, og dermed redusere antall fotoner som trengs for å nøyaktig identifisere strukturer for segmenteringsformål. Sammen kan dette raskt redusere tidsrammene som trengs for disse flerdimensjonale oppkjøpene.

Bruken av intravital avbildning vil bare bli viktigere når forskere prøver å avdekke de mange komplekse cellecelle- og cellematriseinteraksjonene som oppstår i det fysiologiske tumormikromiljøet. Det er derfor behov for fortsatt utvikling i anskaffelses-, segmenterings- og analysemulighetene. Mot dette formål er det viktig å ikke overse potensialet for endogen fluorescens for mikromiljøet segmentering. I denne protokollen ble det endogene signalet fra SHG og fluorescensmetabolitter, inkludert NAD(P)H-intensitet og FLIM, brukt til segmenteringsformål under intravital avbildning av pattedyret TME. Andre endogene metabolitter eller iboende egenskaper kan gi ytterligere signaler for å avsløre den dynamiske gjensidigheten av tumorceller og mikromiljøet. For eksempel kan FAD brukes til å overvåke bevegelsen av immunpopulasjoner42, 3P-generasjonen kan markere strukturelle egenskaper som plasmamembraner eller fett36, og elastinfluorescens kan brukes til å skille arterier fra årer46. Derfor vil endogen fluorescens fortsette å gi en rik flerdimensjonal plattform som bør brukes til det fulle når forskningsmiljøet fortsetter å bygge verktøykassen for intravital mikromiljøsegmentering og analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne NCI R01 CA216248, CA206458 og CA179556 tilskudd til finansiering av dette arbeidet. Vi vil også gjerne anerkjenne Dr. Kevin Eliceiri og hans bildegruppe for deres tekniske ekspertise i den tidlige utviklingen av vårt intravitale program. Vi takker også Dr. Ben Cox og andre medlemmer av Eliceiri Fabrication Group ved Morgridge Institute for Research for deres essensielle tekniske design i de tidlige fasene av MIW. Dr. Ellen Dobson assisterte med nyttige samtaler om ImageJ-verktøyet for trenbar WEKA-segmentering. I tillegg vil vi takke Dr. Melissa Skala og Dr. Alexa Barres-Heaton for rettidig bruk av mikroskopet deres. Til slutt vil vi takke Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, for alle gjennomtenkte diskusjoner og råd om vår musehåndtering og omsorg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Tags

Kreftforskning utgave 183
En etikettfri segmenteringstilnærming for intravital avbildning av mammary tumormikromiljø
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter