Summary
地熱泉からの重金属耐性微生物の単離は、バイオレメディエーションおよび環境モニタリングバイオシステムの開発にとってホットな話題である。この研究は、温泉から重金属耐性菌を単離し同定するための方法論的アプローチを提供する。
Abstract
地熱泉は、深い帯水層で起こる岩石と水の相互作用により、様々な金属イオンが豊富です。また、pHや温度の季節変動により、これらの極限環境内では元素組成の変動が周期的に観測され、微生物群集の環境に影響を与えています。火山の熱噴出孔で繁栄する極限環境微生物は、環境中に存在するいくつかの金属イオンを処理する耐性メカニズムを開発し、複雑な金属生物地球化学サイクルに参加しています。さらに、極限環境とその製品は市場で広範な足がかりを見つけており、これは特に彼らの酵素に当てはまります。この文脈において、それらの特性評価は、環境モニタリングおよびバイオレメディエーションのためのバイオシステムおよびバイオプロセスの開発に機能する。今日まで、極限環境微生物の実験室条件下での単離と培養は、依然としてバイオテクノロジーの可能性を十分に活用するためのボトルネックとなっています。この研究は、温泉からの好熱性微生物の単離のための合理化されたプロトコルと、次のステップによるそれらの遺伝子型および表現型の同定について記述している:(1)地熱地帯(「Pisciarelli」、イタリアのナポリのカンピ・フレグレイの火山地帯)からの微生物のサンプリング。(2)重金属耐性微生物の単離;(3)微生物分離株の同定;(4)分離株の表現型特性評価。この研究で説明されている方法論は、他の極端な環境からの微生物の単離にも一般的に適用される可能性がある。
Introduction
地球上の極限環境は、アイスランド、イタリア、アメリカ、ニュージーランド、日本、中央アフリカ、インドなど、過酷な条件(温度、pH、塩分濃度、圧力、重金属)に耐えることができる微生物の優れた供給源であり、最も認識され研究されている火山地域3,4,5,6,7,8,9です。.好熱剤は、45°Cから80°Cまでの過酷な環境で進化してきました10,11,12。好熱性微生物は、古細菌または細菌界に属するか、生物多様性、系統発生、および産業用途のための排他的な生体分子の生産の研究のための貯蔵庫である13、14、15、16。実際、過去数十年間、世界市場における継続的な産業需要は、いくつかのバイオテクノロジー分野での多様な用途のための極限環境およびサーモザイムの搾取を奨励してきた17,18,19。
生物がコンソーシアムで生息する温泉は、生物多様性の豊かな源泉であり、微生物生態学を研究するのに魅力的な生息地である20,21。さらに、これらの火山性金属が豊富な地域は、重金属22,23の存在に生き残り、適応するために耐性システムを進化させた微生物によって一般的に植民地化されているため、生物地球化学的サイクルに積極的に関与しています。今日、重金属は人間と環境にとって優先的な汚染物質と考えられています。重金属耐性微生物は、金属を形質転換し、生態系を再構築することによって、金属を可溶化および沈殿させることができる24,25。重金属耐性の分子メカニズムの理解は、新しいグリーンアプローチ26,27,28を開発する緊急性のためのホットな話題です。この文脈において、新しい耐性細菌の発見は、環境バイオレメディエーションのための新しい戦略を開発するための出発点を表す24,29。微生物学的手順を通じて熱水環境を探索し、重金属耐性を支える遺伝子の役割に関する知識を増やす努力に伴い、イタリアのカンピフレグレイの温泉地域で微生物スクリーニングが行われました。この重金属が豊富な環境は、季節性、降雨量、地下の地質学的動きに応じてpHと温度が変化する強力な熱水活動、噴気孔、沸騰プールを示しています30。この視点では、重金属に耐性のある細菌、例えば、Geobacillus stearothermophilus GF1631(単離物1として命名)およびAlicyclobacillus mali FL1832(単離物2として命名)をカンピフレグレイのピシアレッリ地域から単離するための適用が容易で効果的な方法を説明する。
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Protocol
1. 地熱地帯からの微生物のサンプリング
- 所望の温度とpHを有する場所を基準として使用してサンプリングする部位を選択する。デジタル熱電対プローブを介して物理パラメータを測定し、選択したプールまたは泥に挿入します。
- 20gの土壌サンプル(この場合は、Pisciarelli Solfataraの熱水サイトの泥から)を収集し、滅菌されたスプーンでそれらを拾う。選択した各サイトについて、少なくとも 2 つのサンプルを取得します。
- サンプルを50mL滅菌ポリプロピレンチューブに入れ、直ちに閉じる。
- デジタル熱電対プローブをサンプリングサイトに直接挿入して、pHと温度を測定します。使用後は、プローブをイオン交換水で丁寧にすすいでください。
2. 重金属耐性微生物の単離
メモ:手順2.1~2.7を滅菌した生体フードの下で実行します。
- 採取した各試料の2gを、HClまたはNaOHを添加してpHが4または7に調整された50mLの新しく調製したルリア・ベルタニ培地(LB)に接種する。
- サンプルをサンプリング部位の同じ温度で、±5°C(ピシアレリサンプルの場合は55°Cおよび60°C)で、温度制御されたオービタルシェーカーで180rpmの振とう速度で24時間インキュベートする。
- 増殖したサンプルをLB寒天(pH4またはpH7)上で200μLのプレートに、55°Cまたは60°Cで48時間静置条件下でインキュベートする。
- シングルコロニーを分離し、ストリークプレーティングサイクル(ステップ2.3および2.4)を少なくとも3回繰り返します。
- -80°C凍結細胞ストックを調製するために、培養物を一晩(ON)増殖させ、増殖した細胞に20%グリセロール(1mLの最終容量で)を加える。アセトンとドライアイスを混ぜて急速凍結してください。
- グリセロールストックから接種剤を調製するには、50 μLを50 mLのLB(pH 4またはpH 6)に接種し、180 rpm ONのオービタルシェーカーで55°Cまたは60°Cでインキュベートします。
- 増殖プロファイルを得るためには、前培養物(ステップ2.6から得られた)を10 mLのLB(pH4またはpH6)で0.1 OD 600 nmに希釈し、55°Cまたは60°Cで細胞を軌道振とう機で16 時間増殖させ、30分間隔でOD600 nm を測定する。
- ステップ2.7で得られたデータから、X軸に時間(分)、Y軸にOD600nm で成長曲線を構築します。
- ステップ2.7および2.8で説明したのと同じ増殖曲線を実現するが、培養液のpH(±1単位)を変化させ(例えば、pH4で増殖させたサンプルのpH3および5)、実験室条件に最適なpHを決定する。
3. 微生物分離株の同定
- ゲノムDNAの作製
- グリセロールストックからストリークした分離株を50mLのLB培地(pH4またはpH6)に接種し、55°Cまたは60°Cのオービタルシェーカーで180rpmのONで増殖させる。
- ON培養物を5000 x gで10分間遠心分離して収穫する。上清を捨てる。
- 使用直前に、20 mM Tris-HCl pH 8.0、2 mM EDTA、1.2% Triton X-100、およびリゾチーム(20 mg/mL)で構成される細菌溶解バッファー10 mLを調製します。
- ペレットを180μLの細菌溶解緩衝液に再懸濁する。37°Cで30分間インキュベートする。
- ゲノム DNA 精製キット (材料表) に示されているガイドラインに従って、ゲノム DNA を抽出します。
- 抽出したゲノムDNAとその純度をUV-Vis測定により定量する。純度については、OD 260/280 nmおよびOD 260/230 nmの比を決定する。
- 各サンプルの 200 ng を 0.8% アガロースゲルにロードし、サイズ分布を高分子マーカーと比較することにより、ゲノム DNA の完全性を評価します。
- 16S rRNA断片の調製、シーケンシング、および得られた配列(1000bp)と米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のヌクレオチドデータベースに存在するものとの比較分析を外部サービスに委託する33。
- 16S rRNAシーケンシングのデータを裏付けるために、消化された染色体DNAに対して自動リボタイピングも行う(外部サービス、 材料表)。
- リボタイピングデータだけでは正種同定ができない場合は、脂肪酸同定のためのMALDI-TOF MS 分析を依頼してください。
- 同定された属の系統解析を行うには、単離物の16S rRNA配列をBLASTn34で解析する。99%~97%の同一性を持つ配列は、CLUSTAL Omega35を使用して複数の配列アラインメントを構築するために使用する必要があります。ClustalW2 (Simple Phylogeny) のデフォルトオプションを使用して近傍結合ツリーを構築します。
4. 重金属および抗生物質感受性
- グリセロールストックから単離物を接種し(ステップ2.5を参照)、以前に決定した最適pHおよび温度条件下で200mLのLB中で増殖させる。
- 各前培養物を、増加する濃度の重金属を含む5mLのLB培地(適切なpHで)中で0.1OD 600 nm で希釈する。濃度は、重金属[As(V)、As(III)、Cd(II)、Co(III)、Cr(VI)、Cu(II)、Hg(II)、Ni(II)、V(V)]の場合は0.01〜120mM、抗生物質[アンピシリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、およびバンコマイシン]の場合は0.5〜1mg / mLの範囲で変化します。
- 重金属と抗生物質の治療を別々に行います。50 mLポリプロピレンチューブを使用し、各条件/処理ごとに55°Cまたは60°Cで180rpmの振とう速度で16時間、温度制御されたオービタルシェーカーで細胞を増殖させます。
- 微生物の増殖が起こらないチューブ内の濃度値を特定することによって、抗生物質または重金属の最小阻害濃度(MIC)を計算する、すなわち、16時間後に細胞増殖を完全に阻害する値を決定する。
- LB-agarプレートにMICと見なされる値で増殖させた培養物200 μLを(適切なpHおよび温度で)プレーティングし、ONインキュベーション後のコロニーの存在を確認することにより、濃度が細胞に対して阻害性であり、致死的ではないことを確認する。
注:LB寒天プレート上での培養は4°Cで数週間しか生存できないため、分離株をより長期間保存するために、グリセロールストックを調製し、-80°Cで保存した。 MIC決定のために、独立した培養物を用いて少なくとも3つの独立した複製が実施された。標準偏差は、3連の実験間で計算した。
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Representative Results
サンプリングサイト
このプロトコルは、温泉から重金属耐性菌を単離する方法を示すものである。本研究では、酸性・亜硫酸系地熱環境であるピシアレリ地域をサンプリングサイトとして用いた(図1)。この生態系は、火山活動に由来する攻撃的な硫黄流体の流れによって特徴付けられる。酸性 - 硫化地熱系の微生物群集は、高濃度の重金属の存在によって作られた極端な選択圧力にさらされることが実証されている。サンプルは、1年の2つの異なる期間(4月と9月)に、泡立つ泥プールに関して2,21の泥プール周辺から収集されました。泥溜まりでは、pH値の変動(4月~pH6、9月~pH5)が登録され、気温はいずれも約55°Cでした。しかし、他の年32では、泥プール(〜70°C)でもより高い温度が記録されました。
分離と識別
回収したサンプルをLB培地に接種し、以前に報告したように55°Cおよび60°Cで24時間インキュベートし、したがって、環境化学的物理的条件を模倣するように細胞サンプルの増殖のための実験室条件を設定する。細胞増殖を促進するために、単一コロニーをプレート上にストリークし、リッチ液体培地で数回(少なくとも3回)希釈した後に単離した。単離された株は、55°Cおよび60°Cでそれらの最適な生育温度を示した (図2)。新しい分離株を同定するために、ゲノムDNA調製を行い、外部サービスとして16S rRNAシーケンシングおよび脂肪酸質量分析分析を行った。報告されているように、脂肪酸の分析は、他のアプローチと組み合わせると細菌の正確な同定に役立つ強力な生物分析方法である36。16S rRNAの複数のアラインメントを用いて系統樹を構築し、最も近い近親者を同定した37。
重金属感受性試験
有毒な分子の共存は、ソルファタール環境を特徴付ける。特に、ピシアレッリの温泉は、As、Hg、Fe、Be、Ni、Co、Cu30、38と共存するCO2、H2S、NH4のレベルが高いことが特徴です。このため、単離された微生物の表現型特性評価を、表1に報告されているように、増加する濃度の重金属の存在下で実施した。興味深いことに、単離物1はAs(V)およびV(V)に対してより高い耐性を示した。ヒ素酸塩とバナジン酸塩の両方に対する高い耐性は、それらの化学構造に起因する可能性があります。実際、両方のイオンはリン酸イオンに似ており、V(V)とAs(V)がリン酸輸送システムを介して細胞に取り込まれる可能性があることが示唆されています。これらの分離株は、MIC値が比較的低かったが、Cd(II)に対しても耐性があることが判明した。この結果は、プールにCd(II)がないことによって説明できます。2つの微生物は同じ部位でサンプリングされたが、それらは異なる重金属耐性プロファイルを示した。しかし、それらは異なる期間にサンプリングされたため、微生物群集の組成を形成する主な駆動力としての重金属濃度の季節依存的な変動と重金属39に対するそれらの異なる耐性を指摘した。この比較データから、分離物1はAs(V)に対して強い耐性を持ち、分離物2はAs(III)に対して強い耐性を有することが示された。分子耐性のメカニズムを解明し、温泉の選択圧によって表現型がどのように影響を受けるかをよりよく理解するためには、さらなる遺伝子調査が必要である。
抗生物質耐性試験
極端な環境で進化した微生物株は、通常、異なる抗生物質に対する耐性を示す。重金属耐性と抗生物質との相関関係は周知である40。このため、我々は両方の分離株について抗生物質に対する耐性を試験した(表2)。分離物1は、低濃度が使用された場合でも、試験されたすべての抗生物質に対して高い感受性を示した。対照的に、単離物2は、クロラムフェニコールおよびテトラサイクリンを除いて、試験されたすべての抗生物質に対して耐性である。興味深いことに、アンピシリン、エリスロマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、およびバンコマイシンに対する決定されたMIC値は、他の抗生物質耐性細菌のものと同程度であり、バシトラシンおよびシプロフロキサシン41についてはさらに高かった。これらの魅力的なデータは、さらなる調査に値する。おそらく、ランダムな突然変異または水平遺伝子導入のために、微生物は抗生物質耐性を獲得しており、これはそのような極端な環境条件下で選択的利点を表す可能性がある。
図1.サンプリングサイト:ピシャレッリのソルファタリックエリア、カンピフレグレイ(ナポリ、イタリア)。サンプリングサイトは、ピシアレリ・フマロールの地熱地帯にある北緯40度49分45.3秒 - 東経14度08分49.9秒に位置しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.実験手順の概略図。 微生物は温泉でサンプリングされ、実験室で栽培され、ストリークとメッキを繰り返して単離され、16S rRNAシーケンシングで遺伝子型的に同定されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 金属イオン | 分離 1 | 分離 2 |
| (III)として | 1.9ミリオンメートル | 41ミリオン |
| (V)として | 117ミリオン | 11ミリオンメートル |
| 中枢樹脂 (II) | 0.9 ミリアンペア時 | 0.8 μM |
| コ (II) | 2ミリオンユーロ | 3ミリオン |
| コ (III) | 2.75 ミリアン ペア月間 | ナ |
| クロム (VI) | 0.25 ミリアン ペア時 | ナ |
| キュ(II) | 4.1 ミリオンメートル | 0.5ミリアンペア時 |
| Hg (II) | 20 μM | 17 μM |
| Ni (II) | 1.3ミリオンメートル | 30ミリオンメートル |
| V(V) | 128ミリオン | n.a |
表 1.MIC値は分離株の重金属イオンの方が好ましい。 MICは、16時間後に細胞増殖を完全に阻害する最小濃度値とみなされる。値は、3つの実験の平均として報告される。
| 抗生物質 | 分離 1 | 分離 2 |
| アンピシリン | n.d. | 20 μg/mL |
| バシトラシン | n.d. | 700 μg/mL |
| クロラムフェニコール | n.d. | <0.5 μg/mL |
| シプロフロキサシン | n.d. | >1ミリグラム/mL |
| エリスロマイシン | n.d. | 70 μg/mL |
| カナマイシン | n.d. | 80 μg/mL |
| ストレプトマイシン | n.d. | 70 μg/mL |
| テトラサイクリン | n.d. | <0.5 μg/mL |
| バンコマイシン | n.d. | 1 μg/mL |
表 2.分離株の抗生物質に対するMIC値。 MICは、16時間後に細胞増殖を完全に阻害する最小濃度と見なされる。値は、3つの実験の平均として報告される。
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Discussion
温泉には、同様に多様な代謝能力を持つ未開発の多様な微生物叢が含まれています12。重金属を毒性の低い化合物に効率的に変換できる微生物の単離戦略の開発10 は、世界中で関心が高まっている研究分野です。この論文は、有毒化学物質に抵抗する能力を持つ微生物のスクリーニングと単離のための合理化されたアプローチを記述することを目的としています。記載されている方法は、水、食物、土壌、堆積物などの多様な環境源から微生物を単離するために容易に改変することができる。しかしながら、この技術には微生物培養への依存に関連するいくつかの制限がある。したがって、このセットアップは、簡単に培養できない環境から細菌を単離するのには適していません。この問題を克服する1つの方法は、異なる細菌培地(すなわち、選択的培地または事前適応戦略)およびより長いインキュベーション時間42を使用することである。
それにもかかわらず、バイオレメディエーションに関心のある種の大部分は、本明細書に記載の条件下で増殖すると予想される。このプロトコルは、化学物質のための選択的寒天培地がこれまでのところ知られていないことを考慮すると、従来のめっき技術よりもいくつかの利点を有する。耐性微生物を同定するためのMICの使用は、新種または新株の特性評価への道を開く個々の分離株で利用されるべき迅速な戦略である。本研究は、このような環境微生物を選定し、汚染物質を不活性化し、無害な製品に変換することにより、効果的なバイオレメディエーションに貢献できる環境微生物を選択する方法の有用性を実証する。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 および GoodbyWaste: GetGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italyの支援を受けた。我々は、地熱地帯の特定と特徴付けについて、モニカ・ピオチ博士とアンジェラ・モルモン博士(Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italy)に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
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