Summary
Выделение устойчивых к тяжелым металлам микробов из геотермальных источников является актуальной темой для развития биоремедиации и биосистем мониторинга окружающей среды. Это исследование обеспечивает методологический подход к выделению и идентификации устойчивых к тяжелым металлам бактерий из горячих источников.
Abstract
Геотермальные источники богаты различными ионами металлов из-за взаимодействия между породой и водой, которое происходит в глубоком водоносном горизонте. Кроме того, из-за сезонных колебаний рН и температуры в этих экстремальных средах периодически наблюдаются колебания в элементном составе, влияющие на экологические микробные сообщества. Экстремофильные микроорганизмы, которые процветают в вулканических тепловых жерлах, разработали механизмы сопротивления для обработки нескольких ионов металлов, присутствующих в окружающей среде, тем самым принимая участие в сложных биогеохимических циклах металлов. Более того, экстремофилы и их продукты нашли широкую точку опоры на рынке, и это особенно верно для их ферментов. В этом контексте их характеристика является функциональной для развития биосистем и биопроцессов для мониторинга окружающей среды и биоремедиации. На сегодняшний день выделение и культивирование в лабораторных условиях экстремофильных микроорганизмов по-прежнему представляют собой узкое место для полного использования их биотехнологического потенциала. В этой работе описывается упрощенный протокол выделения термофильных микроорганизмов из горячих источников, а также их генотипическая и фенотипическая идентификация посредством следующих этапов: 1) отбор проб микроорганизмов с геотермальных участков ("Пишарелли", вулканический район Кампи Флегрей в Неаполе, Италия); 2) выделение микроорганизмов, устойчивых к тяжелым металлам; 3) идентификация микробных изолятов; (4) Фенотипическая характеристика изолятов. Методологии, описанные в настоящей работе, могут в целом применяться также для выделения микроорганизмов из других экстремальных сред.
Introduction
Экстремальные среды на нашей планете являются отличными источниками микроорганизмов, способных переносить суровые условия (т.е. температуру, рН, соленость, давление и тяжелые металлы)1,2, это Исландия, Италия, США, Новая Зеландия, Япония, Центральная Африка и Индия, наиболее признанные и изученные вулканические районы 3,4,5,6,7,8,9 . Термофилы эволюционировали в суровых условиях в диапазоне температур от 45 °C до 80 °C 10,11,12. Термофильные микроорганизмы, принадлежащие к архейному или бактериальному царству, являются резервуаром для изучения биоразнообразия, филогенеза и производства эксклюзивных биомолекул для промышленного применения 13,14,15,16. Действительно, в последние десятилетия постоянный промышленный спрос на мировом рынке способствовал использованию экстремофилов и термозимов для их диверсифицированного применения в нескольких биотехнологических областях 17,18,19.
Горячие источники, где организмы живут в консорциумах, являются богатыми источниками биоразнообразия, тем самым представляя собой привлекательную среду обитания для изучения микробной экологии20,21. Кроме того, эти богатые вулканическими металлами районы обычно колонизируются микроорганизмами, которые развили системы толерантности, чтобы выжить и адаптироваться к присутствию тяжелых металлов22,23 и поэтому активно участвуют в их биогеохимических циклах. В настоящее время тяжелые металлы считаются приоритетными загрязнителями для человека и окружающей среды. Устойчивые к тяжелым металлам микроорганизмы способны солюбилизировать и выбрасывать металлы, трансформируя их и реконструируя свои экосистемы24,25. Понимание молекулярных механизмов резистентности к тяжелым металлам является горячей темой для срочной разработки новых зеленых подходов 26,27,28. В этом контексте открытие новых толерантных бактерий представляет собой отправную точку для разработки новых стратегий биоремедиации окружающей среды24,29. В дополнение к усилиям по исследованию гидротермальной среды с помощью микробиологических процедур и расширению знаний о роли гена (генов), лежащего в основе толерантности к тяжелым металлам, микробный скрининг был проведен в районе горячих источников Кампи Флегрей в Италии. Эта богатая тяжелыми металлами среда демонстрирует мощную гидротермальную активность, фумароль и кипящие бассейны, переменные по рН и температуре в зависимости от сезонности, осадков и подземных геологических движений30. В этой перспективе мы описываем простой в применении и эффективный способ выделения бактерий, устойчивых к тяжелым металлам, например, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (названный изолятом 1) и Alicyclobacillus mali FL1832 (названный изолятом 2) из района Пишиарелли Кампи Флегрей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Отбор проб микроорганизмов с геотермальных объектов
- Выберите участок для отбора проб, используя в качестве критерия места с желаемой температурой и рН. Измерьте физические параметры с помощью цифрового термопарного зонда, вставив его в выбранные бассейны или грязи.
- Соберите 20 г образцов почв (в данном случае из грязи в гидротермальном участке Pisciarelli Solfatara), подбирая их стерилизованной ложкой. Возьмите не менее двух образцов для каждого выбранного участка.
- Поместите образцы в 50 мл стерильных полипропиленовых трубок и немедленно закройте.
- Измерьте pH и температуру с помощью цифрового термопарного зонда, непосредственно вставив его в место отбора проб. После использования тщательно промойте зонд деионизированной водой.
2. Выделение устойчивых к тяжелым металлам микроорганизмов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.1-2.7 под стерильным биологическим капотом.
- Инокулируют 2 г каждого собранного образца в 50 мл свежеприготовленной среды Лурия-Бертани (LB), в которой рН был скорректирован до 4 или 7 путем добавления HCl или NaOH.
- Инкубировать образцы при одинаковой температуре участка отбора проб и при ±5°С (55°С и 60°С для образцов Пишиарелли) в орбитальном шейкере с регулируемой температурой в течение 24 ч со скоростью встряхивания 180 об/мин.
- Пластину 200 мкл выращенных образцов на LB агаре (рН 4 или рН 7) инкубируют в статическом состоянии в течение 48 ч при 55 °С или 60 °С.
- Изолируйте одиночные колонии и повторите циклы покрытия полос (этапы 2.3 и 2.4) не менее трех раз.
- Для приготовления замороженных клеточных запасов при температуре -80 °C выращивают культуры в течение ночи (ON) и добавляют в выращенные клетки 20% глицерина (в конечном объеме 1 мл); используйте смесь ацетона и сухого льда для быстрой заморозки.
- Чтобы приготовить инокулят из глицерина, инокулируют 50 мкл в 50 мл LB (pH 4 или pH 6) и инкубируют при 55 °C или 60 °C в орбитальном шейкере при 180 об/мин ON.
- Для получения профиля роста разводят прекультуру (полученную со стадии 2.6) до 0,1 OD600 нм в 10 мл LB (рН 4 или рН 6), выращивают клетки при 55°С или 60°С в течение 16 ч в орбитальном шейкере и измеряют ОД600 нм с интервалом 30 мин.
- Постройте кривую роста на основе данных, полученных на шаге 2.7, со временем (min) по оси X и OD600 нм по оси Y.
- Реализовать ту же кривую роста, описанную на этапах 2,7 и 2,8, но варьируя рН (± 1 единицу) культуральной среды (например, рН 3 и 5 для образцов, выращенных при рН 4), чтобы определить оптимальный рН для лабораторных условий.
3. Идентификация микробных изолятов
- Получение геномной ДНК
- Инокулируют изолят, полученный из запаса глицерина, в 50 мл среды LB (рН 4 или рН 6) и растут в орбитальном шейкере при 55 °C или 60 °C при 180 об/мин ON.
- Собирают культуру ON центрифугированием в течение 10 мин при 5000 х г. Выбросьте супернатант.
- Непосредственно перед использованием подготовьте 10 мл буфера лизиса бактерий, состоящего из: 20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 2 мМ ЭДТА, 1,2% тритона X-100 и лизоцима (20 мг/мл).
- Повторно суспендировать гранулу в 180 мкл буфера лизиса бактерий. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C.
- Следуйте рекомендациям, указанным в наборе для очистки геномной ДНК (Таблица материалов) для извлечения геномной ДНК.
- Количественная оценка извлеченной геномной ДНК и ее чистоты с помощью измерения UV-Vis. Для чистоты определяют соотношения - OD 260/280 нм и OD 260/230 нм.
- Оцените целостность геномной ДНК, загрузив 200 нг каждого образца на 0,8% агарозный гель и сравнив распределение по размерам с высоковажным молекулярным маркером.
- Поручение внешней службе подготовки фрагментов рРНК 16S, секвенирования и сравнительного анализа полученной последовательности (1000 bp) с присутствующими в нуклеотидной базе данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI)33.
- Для подтверждения данных секвенирования 16S рРНК также выполняют автоматизированное риботипирование на переваренной хромосомной ДНК ( внешний сервис, Таблица материалов).
- В случае, когда идентификация вида не может быть определена только с помощью данных риботипирования, закажите анализ MALDI-TOF MS для идентификации жирных кислот.
- Чтобы выполнить филогенетический анализ идентифицированного рода, проанализируйте последовательность 16S рРНК изолята с BLASTn34. Последовательности с идентификаторами от 99% до 97% должны использоваться для построения выравнивания нескольких последовательностей с использованием CLUSTAL Omega35. Постройте дерево соединения соседей, используя параметр по умолчанию ClustalW2 (Простая филогения).
4. Восприимчивость к тяжелым металлам и антибиотикам
- Инокулируют изолят из глицерина (см. этап 2.5) и выращивают его в 200 мл LB при оптимальных рН и температурных условиях, определенных ранее.
- Разбавляют каждую прекультуру при 0,1OD 600 нм в 5 мл LB среды (при соответствующем рН), содержащей повышенные концентрации тяжелых металлов. Концентрации варьируются от 0,01-120 мМ для тяжелых металлов [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] или 0,5-1 мг/мл для антибиотиков [Ампициллин, Бацитрацин, Хлорамфеникол, Ципрофлоксацин, Эритромицин, Канамицин, Стрептомицин, Тетрациклин и Ванкомицин].
- Выполняйте лечение тяжелыми металлами и антибиотиками отдельно. Используйте полипропиленовую трубку объемом 50 мл и выращивайте ячейки в орбитальном шейкере с контролируемой температурой со скоростью встряхивания 180 об/мин при 55 °C или 60 °C в течение 16 ч для каждого состояния/обработки.
- Рассчитать минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) либо для антибиотиков, либо для тяжелых металлов, определив значения концентрации в пробирках, где не происходит роста микробов, т.е. определив значения, которые полностью ингибируют рост клеток через 16 ч.
- Проверьте, что концентрация является ингибирующей и не смертельной для клеток, покрыв 200 мкл культуры, выращенной при значении, которое считается MIC на пластинах LB-агара (при соответствующем рН и температуре) и проверив наличие колоний после инкубации ON.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку культура на агаровой пластине LB жизнеспособна при 4 °C только в течение нескольких недель, чтобы сохранить изоляты в течение более длительного времени, запасы глицерина были приготовлены и сохранены при -80 °C. Для определения ВПК было проведено не менее трех независимых реплик с использованием независимых культур. Стандартное отклонение было рассчитано среди тройных экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Место отбора проб
Этот протокол иллюстрирует метод выделения устойчивых к тяжелым металлам бактерий из горячего источника. В этом исследовании в качестве участка отбора проб использовался район Пишиарелли, кислотно-сульфидная геотермальная среда (рисунок 1).. Эта экосистема характеризуется потоком агрессивных сернистых флюидов, полученных в результате вулканической деятельности. Показано, что микробные сообщества в кислотно-сульфидных геотермальных системах подвергаются экстремальному селективному давлению, создаваемому присутствием высоких концентраций тяжелых металлов. Образцы были собраны в два разных периода года (апрель и сентябрь) из2,21 маргинального грязевого бассейна по отношению к пузырящемуся грязевому бассейну. В грязевом бассейне были зарегистрированы колебания значений pH (~ pH 6 в апреле и ~ pH 5 в сентябре), в то время как температура составляла ~ 55 ° C в обоих случаях. Тем не менее, более высокие температуры были также зарегистрированы в грязевом бассейне (~ 70 ° C) в другие годы32.
Изоляция и идентификация
Собранные образцы инокулировали в среде LB и инкубировали в течение 24 ч при 55 °C и 60 °C, как сообщалось ранее, тем самым устанавливая лабораторные условия для роста образцов клеток, чтобы имитировать химико-физические условия окружающей среды. Чтобы способствовать росту клеток, одиночные колонии размещали на пластине и выделяли после нескольких разведений (не менее 3) в богато-жидкой среде; изолированные штаммы показали оптимальную температуру роста при 55 °C и 60 °C (рисунок 2). Для идентификации новых изолятов был проведен препарат геномной ДНК и проведен анализ секвенирования 16S рРНК и масс-спектрометрии жирных кислот в качестве внешней услуги. Как сообщалось, анализ жирных кислот является мощным биоаналитическим методом, который помогает в точной идентификации бактерий в сочетании с другими подходами36. Множественные выравнивания 16S рРНК были использованы для построения филогенетического дерева для идентификации ближайших родственников37.
Испытание на восприимчивость к тяжелым металлам
Сосуществование токсичных молекул характеризует сольфатарные среды. В частности, горячие источники в Пишиарелли характеризуются высокими уровнями CO2, H2S, NH4 в сосуществовании с As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38. По этой причине фенотипическую характеристику выделенных микроорганизмов проводили в присутствии возрастающей концентрации тяжелых металлов, как указано в таблице 1. Интересно, что изолят 1 показал более высокую толерантность к As(V) и V(V). Высокая устойчивость как к арсенату, так и к ванадату может быть обусловлена их химическими структурами; фактически, оба иона похожи на фосфатные ионы, предполагая, что V(V) и As(V) могут быть поглощены клетками через фосфатные транспортные системы. Эти изоляты оказались также устойчивыми к Cd(II), хотя значение MIC было относительно низким. Такой результат можно объяснить отсутствием Cd(II) в пуле. Хотя два микроорганизма были отобраны в одном и том же месте, они показали разные профили устойчивости к тяжелым металлам. Однако они были отобраны в разные периоды, что указывает на зависящее от сезона изменение концентрации тяжелых металлов в качестве основной движущей силы, формирующей состав микробных сообществ и их дифференциальную устойчивость к тяжелым металлам39. Из этих сравнительных данных было показано, что изолят 1 имеет сильное сопротивление к As(V), в то время как изолят 2 для As(III). Необходимы дальнейшие генетические исследования, чтобы разгадать механизмы молекулярной резистентности и лучше понять, как фенотипы влияют на селективное давление горячих источников.
Тесты на устойчивость к антибиотикам
Микробные штаммы, эволюционировавшие в экстремальных условиях, обычно проявляют устойчивость к различным антибиотикам. Корреляция между устойчивостью к тяжелым металлам и антибиотиками хорошо известна40. По этой причине мы проверили устойчивость к антибиотикам для обоих изолятов (таблица 2). Изолят 1 показал высокую чувствительность ко всем испытуемым антибиотикам, даже когда использовались низкие концентрации. Напротив, изолят 2 устойчив ко всем протестированным антибиотикам, за исключением хлорамфеникола и тетрациклина. Интересно, что определенные значения MIC в отношении ампициллина, эритромицина, канамицина, стрептомицина и ванкомицина были сопоставимы с показателями других устойчивых к антибиотикам бактерий и еще выше для бацитрацина и ципрофлоксацина41. Эти интересные данные заслуживают дальнейшего изучения; вероятно, из-за случайных мутаций или горизонтального переноса генов микроорганизм приобрел устойчивость к антибиотикам, что могло бы представлять собой селективное преимущество в таких экстремальных условиях окружающей среды.
Рисунок 1. Место отбора проб: сольфатарный район Пишарелли, Кампи Флегрей (Неаполь, Италия).. Место отбора проб расположено на 40° 49' 45,3" северной широты - 14° 08' 49,9 в.д., в геотермальной зоне фумароле Пишарелли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Схематическое представление экспериментальной процедуры. Микроорганизмы отбираются в горячих источниках, культивируются в лаборатории, выделяются путем повторного растяжения и покрытия и генотипически идентифицируются при секвенировании 16S рРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Ионы металлов | Изолировать 1 | Изолировать 2 |
| Как (III) | 1,9 мМ | 41 мМ |
| Как (V) | 117 мМ | 11 мМ |
| Кд (II) | 0,9 мМ | 0,8 мкМ |
| Ко (II) | 2 мМ | 3 мМ |
| Ко (III) | 2,75 мМ | н.а. |
| Cr (VI) | 0.25 мМ | н.а. |
| Cu (II) | 4,1 мМ | 0,5 мМ |
| Hg (II) | 20 мкМ | 17 мкМ |
| Ni (II) | 1,3 мМ | 30 мМ |
| В (В) | 128 мМ | н.а |
Таблица 1. Значения MIC по отношению к ионам тяжелых металлов изолятов. МИК рассматриваются как минимальные значения концентрации, которые полностью ингибируют рост клеток через 16 ч; значения указываются как среднее значение трех экспериментов.
| Антибиотики | Изолировать 1 | Изолировать 2 |
| Ампициллин | н.д. | 20 мкг/мл |
| Бацитрацин | н.д. | 700 мкг/мл |
| Хлорамфеникол | н.д. | <0,5 мкг/мл |
| Ципрофлоксацин | н.д. | >1 мг/мл |
| Эритромицин | н.д. | 70 мкг/мл |
| Канамицин | н.д. | 80 мкг/мл |
| Стрептомицин | н.д. | 70 мкг/мл |
| Тетрациклин | н.д. | <0,5 мкг/мл |
| Ванкомицин | н.д. | 1 мкг/мл |
Таблица 2. Значения МИК по отношению к антибиотикам изолятов. МИК рассматриваются как минимальные концентрации, которые полностью ингибируют рост клеток через 16 ч; значения указываются как среднее значение трех экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Горячие источники содержат неиспользованное разнообразие микробиомов с одинаково разнообразными метаболическими способностями12. Разработка стратегий выделения микроорганизмов, которые могут эффективно превращать тяжелые металлы в менее токсичные соединения10 , представляет собой область исследований, представляющую растущий интерес во всем мире. Эта статья направлена на описание упрощенного подхода к скринингу и изоляции микробов, способных противостоять токсичным химическим веществам. Описанный способ может быть легко модифицирован для выделения микробов из различных источников окружающей среды, таких как вода, пища, почва или осадок. Тем не менее, есть некоторые ограничения в этом методе, связанные с зависимостью от микробного культивирования. Поэтому эта установка не подходит для выделения бактерий из среды, которую нелегко культивировать. Одним из способов преодоления этой проблемы является использование различных бактериальных сред (т.е. селективных сред или стратегий предварительной адаптации) и более длительного времени инкубации42.
Тем не менее, ожидается, что большинство видов, представляющих интерес для биоремедиации, будут расти в условиях, описанных в настоящем документе. Этот протокол имеет некоторые преимущества перед традиционными методами покрытия, учитывая, что селективные агаровые среды для химических веществ пока неизвестны. Использование MIC для идентификации устойчивых микробов является быстрой стратегией, которая будет использоваться на отдельных изолятах, что открывает путь к характеристике новых видов или новых штаммов. Данное исследование демонстрирует полезность такого метода для отбора микроорганизмов окружающей среды, которые могут способствовать эффективной биоремедиации путем инактивации загрязняющих веществ и превращения их в безвредные продукты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана ERA-NET Cofund MarTERA: «FLAshMoB: Функциональная амилоидная химера для морского биозондирования», PRIN 2017-PANACEA CUP: E69E19000530001 и GoodbyWaste: GetGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Италия. Мы благодарим д-ра Монику Пиочи и д-ра Анджелу Мормоне (Национальный институт геофизики и вулканологии, Сеционе ди Неаполь Оссерваторио Везувиано, Италия) за идентификацию и характеристику геотермального участка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , Springer. Dordrecht. (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , Elsevier, Academic Press. 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma'in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -M., Apostol, L. -C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , Springer. Cham. 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G.
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
