Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analisi della proteinuria, infiltrazione renale dei leucociti e deposizione renale di proteine in topi MRL/lpr inclini al lupus

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63506
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo per monitorare la progressione del lupus nei topi. Vengono presentate due procedure aggiuntive per caratterizzare la nefrite da lupus basate sull'infiltrazione cellulare e sulla deposizione di proteine nei reni.

Abstract

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune senza cura nota ed è caratterizzata da infiammazione persistente in molti organi, compresi i reni. In tali circostanze, il rene perde la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi, portando infine a insufficienza renale. Le donne, in particolare quelle in età fertile, vengono diagnosticate nove volte più spesso degli uomini. La malattia renale è la principale causa di mortalità nei pazienti affetti da LES. Il presente protocollo descrive un metodo rapido e semplice per misurare i livelli di proteine escrete nelle urine raccolte, monitorando la progressione del lupus nel tempo. Inoltre, viene fornito un approccio per isolare le cellule mononucleate renali basato sulla selezione delle dimensioni e della densità per studiare l'infiltrazione renale dei leucociti. Inoltre, è stato sviluppato un metodo immunoistochimico per caratterizzare la deposizione proteica nei glomeruli e l'infiltrazione dei leucociti nello spazio tubulointerstiziale. Insieme, questi metodi possono aiutare a studiare la progressione dell'infiammazione cronica associata ai reni dei topi MRL / LPR inclini al lupus.

Introduction

La funzione primaria del rene è l'eliminazione delle sostanze tossiche attraverso l'urina mantenendo l'omeostasi di acqua e sali1. Questa funzione è minacciata nei pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES), che porta alla cosiddetta nefrite da lupus (LN). La LN è una conseguenza del sistema immunitario che attacca il rene, portando a un'infiammazione renale persistente, perdendo quindi la sua capacità di pulire i rifiuti dal sangue e regolare le concentrazioni di sale e liquidi. Questo alla fine porterà a insufficienza renale, che può essere fatale. Durante il processo nefritico, le cellule B circolanti, le cellule T e i monociti vengono reclutati nel rene, secernendo chemochine, citochine e autoanticorpi che formano complessi immunitari. Ciò alla fine si traduce in danno alle cellule endoteliali, lesioni membranose, atrofia tubulare renale e fibrosi2.

MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) topi inclini al lupus sono un modello murino classico che presenta segni clinici simili al lupus che assomigliano al LES umano3. Questo modello è stato determinante per comprendere una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES, la nefrite da lupus (LN)4. Sia nel LES umano che in quello murino, la LN è caratterizzata da un'infiammazione graduale innescata dalla deposizione renale di immunocomplessi, seguita dall'attivazione del complemento, dal reclutamento di cellule infiammatorie e dalla perdita della funzionalità renale5. La deposizione di immunocomplessi è il primo passo per indurre la produzione di chemochine e citochine da parte delle cellule renali intrinseche, che espande la risposta infiammatoria reclutando cellule immunitarie6. L'attuale protocollo presenta diverse tecniche per seguire la progressione della malattia renale che analizzano l'infiltrazione cellulare e la deposizione di complessi immunitari.

L'urina raccolta ogni settimana consente il rilevamento e la visualizzazione del decorso temporale della proteinuria prima, durante e dopo l'insorgenza del lupus. La proteinuria come biomarcatore può determinare la progressione biologica dei LN. Altri vantaggi di questa tecnica sono che non è invasiva, economica e facile da implementare7. Quando il rene funziona perfettamente, il livello di proteinuria è costantemente basso; tuttavia, nei topi MRL/LPR, dopo 8-9 settimane di età, si osserva un graduale aumento del livello di proteinuria, che alla fine è abbastanza alto da causare insufficienza renale8. Strisce di reagenti multipli e reagenti colorimetrici sono disponibili in commercio per monitorare il problema. Tuttavia, il test di Bradford è economico e molto accurato nel determinare l'insorgenza della proteinuria e il decorso della nefrite da lupus. Questo test è rapido e il reagente non è influenzato dalla presenza di solventi, tamponi, agenti riducenti e agenti chelanti dei metalli che possono essere nel campione 9,10,11.

Un aspetto importante da considerare è l'infiltrazione cellulare nel rene. Questi infiltrati promuovono la patogenesi innescando la secrezione di fattori solubili come le citochine per peggiorare l'infiammazione12. Per capire meglio quali popolazioni cellulari sono presenti negli infiltrati, un metodo utile è quello di isolare i leucociti13. Qui, il rilevamento dell'infiltrazione renale delle cellule B viene utilizzato come esempio. La procedura inizia con un processo di digestione con desossiribonucleasi (DNasi) e collagenasi, seguito dalla separazione del gradiente di densità che rimuove detriti, globuli rossi e granulociti densi. La ragione per isolare le cellule B (CD19+) e le plasmacellule (CD138+) è che i reni lupus possono concentrare queste cellule14. Si suggerisce che la presenza di cellule B in piccoli aggregati nel rene possa indicare l'espansione clonale e, di conseguenza, la produzione di immunoglobuline (Ig). Le plasmacellule sono ben note per essere presenti anche in questi aggregati15. Una volta isolati i leucociti, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) può essere utilizzata per analizzare le cellule di interesse dopo la colorazione con diversi anticorpi coniugati a fluorescenza.

L'immunofluorescenza è uno dei metodi di rilevamento dell'immunoistochimica (IHC) che consente la visualizzazione fluorescente delle proteine in campioni di tessuto renale spessi 4 μm. Altri metodi di rilevazione IHC dipendono dalla natura degli analiti, dalla chimica di legame e da altri fattori16. L'immunofluorescenza è un metodo di identificazione rapida che espone l'antigene alla sua controparte anticorpo marcato con uno specifico fluorocromo (o un colorante fluorescente). Quando è eccitato, produce luce che un microscopio a fluorescenza può rilevare. Questa tecnica può essere utilizzata per osservare la deposizione di complemento C3 e IgG2a17. Un'eccessiva attivazione a cascata del complemento potrebbe essere associata a una risposta immunitaria incontrollata e alla perdita di funzione18. La deposizione immunitaria di autoanticorpi anti-DNA a doppio filamento (anti-dsDNA) nel rene è una delle principali preoccupazioni19, dove quelli con isotipo IgG2a sono stati associati a LN20. In particolare, gli anticorpi anti-dsDNA mostrano maggiore patogenicità e affinità con i materiali nucleari, formando immunocomplessi21. Quando IgG2a è presente, la cascata del complemento, incluso C3, viene attivata per eliminare gli immunocomplessi22. I marcatori C3 e IgG2a possono essere quantificati singolarmente o sovrapposti per stabilire la loro correlazione.

In particolare, la misurazione della creatinina sierica è un'altra tecnica affidabile che può essere utilizzata insieme all'ematuria microscopica e alle biopsie renali per diagnosticare LN23. Tuttavia, la presenza di proteinuria è un forte indicatore di danno glomerulare. In questo senso, il monitoraggio del livello di proteinuria durante il lupus può rilevare l'insorgenza della malattia e integrare altri metodi per diagnosticare il lupus. Inoltre, gli immunocomplessi depositati nei glomeruli possono indurre una risposta infiammatoria, attivare il sistema del complemento e reclutare più cellule infiammatorie. Un altro punto degno di nota di questo protocollo è l'infiltrazione delle cellule B nel rene. Questo, insieme alle cellule T infiltrate, amplifica le risposte immunitarie locali che innescano danni agli organi. È importante sottolineare che la classificazione dei LN non si basa solo sui cambiamenti morfologici glomerulari osservati al microscopio, ma anche sui depositi immunitari osservati con l'immunofluorescenza. Pertanto, in questo protocollo, vengono offerti metodi accurati ed economici per l'analisi della funzionalità renale in ambienti di laboratorio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Il presente protocollo è approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Virginia Tech. Poiché la malattia da lupus ha una maggiore incidenza nelle femmine, sono stati utilizzati solo topi MRL / lpr femmina. La raccolta del campione è iniziata a 4 settimane di età e terminata a 15 settimane. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e sono stati allevati e mantenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni seguendo le linee guida istituzionali.

1. Test della proteinuria

  1. Raccogli l'urina seguendo i passaggi seguenti.
    1. Sterilizzare il cappuccio spruzzando il 70% di etanolo. Posizionare un foglio di plastica sterile sulla superficie. Preparare punte, provette da 1,5 ml e una pipetta per raccogliere circa 20 μL di liquido.
      NOTA: Le punte e i tubi devono essere sterili e senza alcun pretrattamento.
    2. Prendi la gabbia e spruzza etanolo al 70% prima di metterlo all'interno del cappuccio.
    3. Tenere il mouse con una mano e usare l'altra mano per massaggiare delicatamente l'area ventrale dall'alto verso il basso.
    4. Utilizzare un tubo da 1,5 ml o una pipetta per raccogliere direttamente l'urina o, se il campione cade, raccoglierlo dal foglio di plastica. Usa guanti, lenzuola e punte freschi per ogni campione.
      NOTA: se questo non funziona, utilizzare un becher sterile per isolare il topo, quindi raccogliere l'urina dal becher dopo che il topo ha urinato.
    5. Rimetti il mouse nella gabbia. Estrarre un altro mouse e ripetere i passaggi 1.1.3-1.1.4.
      NOTA: Pulire sempre il foglio di plastica e il becher con etanolo al 70% dopo aver raccolto il campione per ciascun topo. Almeno cinque topi per gruppo sono necessari per la significatività statistica. I campioni di urina possono essere conservati a -80 °C fino all'uso fino a 12 mesi.
  2. Quantificare le proteine con il metodo Bradford24.
    1. Lasciare che i campioni di urina, l'albumina standard e il reagente Bradford raggiungano la temperatura ambiente (RT) tenendoli fuori dal congelatore per 10-20 minuti.
      NOTA: il reagente Bradford e lo standard di albumina sono inclusi in un kit disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali). La concentrazione iniziale dello standard di albumina è di 2 mg/ml. Le diluizioni seriali (1: 2 sei volte) devono essere fatte con acqua.
    2. Aggiungere il reagente Bradford a una piastra a 96 pozzetti (200 μL/pozzetto), non diluita.
    3. Pipettare 5 μL di campione di urina non diluita per pozzetto e utilizzare la punta per pipettare su e giù più volte per miscelare correttamente.
    4. Aggiungere gli standard (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dL) in duplicati. Lascia un paio di pozzi come spazi vuoti.
      NOTA: l'aggiunta di campioni e standard deve essere eseguita rapidamente.
    5. Lasciare riposare per 5-10 minuti a RT.
    6. Leggere la piastra a 595 nm in un lettore di piastre secondo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).

2. Isolamento delle cellule renali

  1. Eutanasia del topo con CO2 (portata: 30% -70% volume / min, per ottenere perdita di coscienza o morte) in una camera seguita da lussazione cervicale. Procedere con la dissezione per raccogliere entrambi i reni. Metti un rene e mezzo in un mezzo C10 ghiacciato. Mettere l'altra metà del rene nell'OCT (fase 3.1.1).
    NOTA: C10 è prodotto con RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10%, 1 mM di piruvato di sodio, 1% di aminoacidi non essenziali MEM 100x, 10 mM di HEPES, 55 μM di 2-mercaptoetanolo e 100 U / mL di penicillina-streptomicina (vedere Tabella dei materiali).
  2. Tagliare i reni in granulometria (1-2 mm3 pezzi) e digerire in 5 ml di tampone digestivo contenente 1 mg/ml di collagenasi e 0,2 mg/ml di DNasi I (vedi Tabella dei materiali) in terreno RPMI 1640 contenente 10 mmol/L di HEPES per 1 ora con agitazione continua e delicata a 37 °C.
    NOTA: Aggiungere 1 mL di tampone digestivo in un tubo sterile da 2 mL e utilizzare forbici sterili per tagliare il rene.
  3. Aggiungere 10 ml di 1x PBS ghiacciato contenente 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 10 minuti su ghiaccio. Quindi vortice la sospensione due volte.
  4. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 100 μM e lavare con 10 mL di HBSS-pieno.
    NOTA: HBSS-full contiene 5 mM di EDTA, 0,1% BSA e 10 mM di HEPES.
  5. Centrifugare a 350 x g per 10 minuti a RT.
  6. Preparare la soluzione SIP (Isotonic Percoll) al 30%, 37% e 70%.
    NOTA: Mescolare 1 volume in parte di 10x PBS e 9 parti di volume di Percoll per preparare SIP (vedere Tabella dei materiali); utilizzare HBSS-full per diluire SIP al 30%, 37% e 70% SIP.
  7. Risospendere le celle in 5 mL di SIP al 30% e caricare il 37% di 5 mL (in alto) e il 70% di 5 mL (in basso), facendo gradiente SIP, lentamente con una pipetta paster.
  8. Centrifugare con Up9 down0 (o freno 0) a 1000 x g per 30 minuti a RT.
  9. Raccogliere i leucociti dall'interfaccia 37%-70% e risospenderli in 5 ml di C10.
  10. Centrifugare a 350 x g per 10 minuti a 4 °C.
  11. Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di tampone FACS. Le cellule sono pronte per la colorazione FACS.
    NOTA: il tampone FACS contiene 1x PBS e 0,1% di albumina sierica bovina (BSA).
  12. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante (SN), lasciando circa 50 μL.
    NOTA: Per rimuovere il surnatante, versare con cautela o pipettare la soluzione lontano dal solido o utilizzare un aspiratore semiautomatico per aspirare il surnatante.
  13. Aggiungere 50 μL di blocco FcR (vedi Tabella dei materiali) per tubo (prediluito 1/50 in 1x PBS); Mescolare e incubare sul ghiaccio al buio per 10 min.
  14. Aggiungere 2 mL di tampone FACS al lavaggio.
  15. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare SN, lasciando circa 50 μL.
  16. Aggiungere 20 μL del colorante fluorescente appropriato (diluire 1/100 con 1x PBS, vedere Tabella dei materiali) e lasciare riposare per 15-30 minuti su ghiaccio.
  17. Aggiungere 50 μL di miscela di anticorpi 15 per tubo: CD138-BV711 (1/200 in 1x PBS) e CD45-AF700 (1/200 in1x PBS) (vedere Tabella dei materiali).
  18. Incubare su ghiaccio al buio per 15-30 minuti e aggiungere 3 ml di tampone FACS.
  19. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C e sottovuoto SN, lasciando circa 50 μL. Risospendere in 200 μL di 1x PBS. Questo è ora pronto per essere analizzato mediante citometria a flusso.

3. Colorazione immunofluorescente

  1. Eseguire la raccolta di campioni.
    1. Incorporare il mezzo rene nel piccolo criomold di plastica con il composto della temperatura di taglio ottimale (OCT) (vedere la tabella dei materiali).
    2. Aggiungere ghiaccio secco in una scatola di polistirene espanso (vedere Tabella dei materiali) e posizionare con cura il criomold sopra il ghiaccio secco. Assicurarsi che i criostampi siano posizionati in piano.
      NOTA: ci vogliono 3-4 minuti perché il composto OCT si solidifichi e diventi bianco.
    3. Estrarre il criomold e avvolgerlo in un foglio di alluminio. Conservare a -80 °C fino a ulteriore utilizzo.
      NOTA: Può essere conservato a -80 °C per almeno 1 anno.
  2. Eseguire il sezionamento e il fissaggio del campione.
    1. Tagliare i campioni in sezioni da 4 μm, attendere almeno 2-3 ore per asciugare, quindi fissare con acetone freddo (a 4 °C) per 10 minuti.
      NOTA: Fare attenzione quando si utilizza l'acetone, che richiede una cappa chimica specializzata.
    2. Dopo aver fissato i vetrini, asciugare all'aria per 0,5-1 h e conservarli per un breve periodo a -20 °C, o a lungo a -80 °C.
  3. Macchiare i campioni.
    1. Rifissare i vetrini in acetone freddo per 5-10 minuti.
    2. Lasciare che le sezioni si riscaldino fino a RT. Utilizzare una penna PAP (vedere Tabella dei materiali) attorno alla sezione e lasciarla asciugare.
      NOTA: è possibile utilizzare anche lo smalto per unghie. Questo passaggio impedisce alla diluizione degli anticorpi di galleggiare su tutto il vetrino.
    3. Posizionare i vetrini in 1x soluzione salina Tris-buffered (TBS) nel barattolo Coplin (vedi Tabella dei materiali) per 20 minuti, mettere il barattolo sullo shaker e agitare delicatamente.
    4. Versare 1x TBS e riempire il barattolo con 1x TBS, 5% BSA e 0.1% Tween 20. Incubare per 20 minuti sullo shaker, agitare delicatamente.
    5. Estrarre le diapositive e asciugare il fondo delle diapositive. Se necessario, agitare i vetrini asciutti. Aggiungere 100 μL di anticorpi coniugati25 C3-FITC (1/100) e IgG2a-PE (1/100) alla sezione (vedere Tabella dei materiali). Incubare a RT in camera umidificata per 1 ora.
    6. Lavare la sezione 3 volte in 1x TBS, 5% BSA e 0,1% Tween 20 per 10 minuti sullo shaker.
    7. Agitare i vetrini e montare la sezione con un reagente antisbiadimento (vedi Tabella dei materiali) e poi un coprivetrino.
    8. Conservare i vetrini a 4 °C fino alla visualizzazione al microscopio (ad es. microscopio confocale o microscopio a sistema di imaging). Quantifica le immagini utilizzando il software e sottrai i segnali di sfondo quando confronti l'intensità della fluorescenza tra le regioni.
    9. Per l'analisi delle immagini mediante il software ImageJ (vedere Tabella dei materiali), delineare la regione desiderata.
    10. Impostare i parametri standard facendo clic su Analizza, quindi su Imposta misure e area di misura per ottenere i risultati.
    11. Trasferire i dati ottenuti dalle finestre di misura in un foglio di calcolo.
      NOTA: è possibile selezionare una piccola area dall'immagine come sfondo; Non dovrebbe avere alcuna fluorescenza.
    12. Una volta fatto, fai clic su Analizza per misurare la regione e trasferire nuovamente i dati sul foglio di calcolo precedente.
    13. Ripetere i passaggi 3.3.11-3.3.12 per diverse regioni.
    14. Calcolare la fluorescenza media come Fluorescenza cellulare corretta (CCF) = Densità integrata - (Regione cellulare selezionata x Fluorescenza media di fondo).
    15. Calcola per ogni regione e analizza i dati utilizzando il software grafico e statistico (vedi Tabella dei materiali).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il protocollo utilizza diversi metodi per valutare i topi MRL / lpr per la nefrite da lupus. In primo luogo, viene descritta una procedura per studiare l'aumento dei livelli di proteinuria a causa della disfunzione renale nel tempo. Come mostrato in Figura 1, topi femmina sono stati trattati con sonda gastrica orale di 200 μL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) come gruppo di controllo e probiotico Lactobacillus reuteri come gruppo di trattamento, ad una concentrazione di 109 ufc / ml, due volte a settimana. Il trattamento è iniziato a 3 settimane e si è concluso a 15 settimane. Il gruppo di topi trattati con L. reuteri aveva una progressione della proteinuria più aggressiva rispetto al gruppo di controllo.

Figure 1
Figura 1: Rilevazione dei livelli di proteine nelle urine dei topi MRL/lpr nel tempo. n = 5 topi per gruppo. Le statistiche sono state eseguite con il semplice test di regressione lineare. *P < 0,05, **P < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La figura 2 mostra l'analisi FACS dei leucociti renali isolati. I topi sono stati trattati con vancomicina (2 g / L) o vancomicina più E. coli dsDNA (80 μg) in questo esperimento. La vancomicina è stata somministrata insieme all'acqua potabile durante il periodo di tempo indicato. Il sonda gastrico orale di DNA batterico è stato somministrato ai topi trattati con vancomicina una volta alla settimana per quattro settimane consecutive a 4, 5, 6 e 7 settimane di età. Ci si aspettava che il dsDNA di E. coli innescasse l'infiltrazione renale delle plasmacellule portando a una compromissione della funzionalità renale, ma non è stata trovata alcuna differenza significativa.

Figure 2
Figura 2: Analisi delle plasmacellule in leucociti renali isolati. (A) Strategia di gating sequenziale: cellule totali, cellule singole, cellule vive, cellule CD45+ e infine cellule CD138+. (B) Percentuale di plasmacellule dopo il trattamento con van (Vancomicina) o van + DNA (Vancomicina + E. coli dsDNA) per 3 settimane (n ≥ 5 topi per gruppo). Non è stata osservata alcuna significatività statistica ('ns'). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La Figura 3 mostra la colorazione con immunofluorescenza del complemento C3 e IgG2a su sezioni renali femminili MRL/lpr. In questo esperimento, l'effetto dei fattori ambientali è stato confrontato per quanto riguarda la deposizione renale di C3 e IgG2a. I topi interni sono stati allevati nella struttura animale per diverse generazioni e sono stati confrontati con topi acquistati di recente da un fornitore. L'analisi immunoistochimica non ha mostrato alcuna differenza tra le diverse strutture.

Figure 3
Figura 3: Rilevazione del complemento C3 e IgG2a nelle sezioni renali mediante colorazione con immunofluorescenza. (A) Immagini rappresentative di sezioni renali colorate con anti-C3-FITC (verde) e anti-IgG2a-PE (rosso). (B) Confronto della fluorescenza cellulare corretta (CCF) tra i due gruppi (n ≥ 5 topi per gruppo). Barra di scala = 100 μM. Non è stata osservata alcuna significatività statistica ('ns'). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La LN è una delle principali cause di mortalità nei pazienti affetti da LES e i fattori che aggravano la malattia rimangono poco chiari. L'applicazione di questo protocollo è quella di caratterizzare la funzione renale utilizzando molteplici metodi, tra cui la misurazione della proteinuria, l'analisi FACS di leucociti renali isolati e la colorazione con immunofluorescenza di sezioni renali congelate.

Un punto importante da considerare durante la raccolta dell'urina è che si deve essere coerenti con l'ora del giorno e il luogo di raccolta delle urine. I topi sono animali notturni, quindi i campioni più accurati vengono raccolti nel tardo pomeriggio prima che i topi inizino ad essere attivi. Un altro motivo per scegliere questa volta è che i topi MRL / lpr tendono a bere molta acqua durante la notte, portando a urina diluita. Pertanto, la raccolta nel momento sbagliato può aumentare la concentrazione di urina e / o le variazioni di volume. È anche importante raccogliere quanta più urina possibile per ottenere risultati accurati.

Il saggio di Bradford ci fornisce una stima di quanta proteina è presente. Non è specifico per nessuna proteina marcatrice del LES, ma abbastanza buono da dare un'idea della progressione della malattia26. Inoltre, questo metodo è conveniente rispetto ad altri. In particolare, il test di Bradford è sensibile al tempo; Pertanto, deve essere completato entro mezz'ora. I campioni tendono ad avere valori aumentati o alti risultati falsi se si aspetta troppo a lungo. Un altro vantaggio rispetto alle strisce reagenti commerciali per l'analisi delle urine è che fornisce numeri accurati piuttosto che un intervallo all'interno del campione di urina. Le strisce di punteggio possono dare risultati ambigui, in particolare nella gamma più alta 9,10,24.

Per l'isolamento dei leucociti renali, il primo passo chiave è eseguire la dissezione il più velocemente possibile. La vitalità delle cellule renali influisce notevolmente sul successo della successiva analisi FACS. Quando i reni vengono elaborati, ogni fase è sensibile al tempo e alla temperatura. Va notato che le concentrazioni e la temperatura della DNasi I e della collagenasi sono importanti per la massima efficienza, in quanto eliminano il DNA e consentono la disintegrazione dell'organo, rispettivamente27. Il secondo passo fondamentale è l'isolamento delle cellule, diviso in due importanti processi. Il primo è l'utilizzo del filtro che consente la rimozione dei detriti tissutali; il secondo processo che coinvolge Percoll è il passo più cruciale e richiede concentrazione e pazienza. Quando si esegue il gradiente di densità con Percoll, è importante mantenere interfacce chiare tra le diverse concentrazioni di SIP. Si consiglia di utilizzare una pipetta Pasteur poiché il flusso e la pressione possono essere controllati manualmente. Ulteriori fasi possono essere costruite meglio con l'erogazione lenta della soluzione SIP o addirittura goccia a goccia. Una volta stabilite le fasi, il tubo deve essere maneggiato delicatamente; In caso contrario, le fasi si mescoleranno immediatamente e i campioni andranno persi, poiché è impossibile separare nuovamente le fasi. Inoltre, è importante centrifugare il tubo senza interruzioni perché la rottura potrebbe essere troppo aggressiva, portando alla perdita di fasi separate. I leucociti vengono quindi recuperati dall'interfase tra il 30% e il 37% di SIP. Abbiamo analizzato una popolazione cellulare in questo esempio, le plasmacellule (CD45+ e CD138+). Tuttavia, questa tecnica non è limitata alle cellule B; Può essere utilizzato per altri tipi di cellule e colorazione intracellulare28.

Il terzo metodo è un potente strumento per visualizzare le localizzazioni intracellulari di determinate deposizioni proteiche. Una volta che i tessuti sono fissati con acetone, è importante eseguire un lavaggio adeguato, in modo che gli anticorpi si attacchino solo al bersaglio. Successivamente, il blocco con BSA riduce il legame non specifico e i falsi positivi. L'immunofluorescenza diretta è solitamente raccomandata, in quanto è più veloce dell'immunofluorescenza indiretta con un anticorpo secondario, che richiede tempo, soprattutto considerando le fasi extra di lavaggio e incubazione. Tuttavia, l'immunofluorescenza diretta limita la flessibilità della selezione degli anticorpi rispetto all'immunofluorescenza indiretta29. Pertanto, entrambi possono essere metodi preziosi a seconda dello scopo. Inoltre, va detto che i fattori di diluizione sono fondamentali durante la colorazione per IHC. Se la diluizione non è ben eseguita, sulle immagini al microscopio verrà visualizzato un aumento dello sfondo (non sufficiente diluizione anticorpale) o una debole colorazione (troppa dilatazione). È importante iniziare con diluizioni seriali dell'anticorpo per ottimizzare la concentrazione di anticorpi per un migliore rapporto target-background. Un altro passo da considerare è la quantità di tempo di incubazione con gli anticorpi. Più a lungo l'anticorpo è in contatto con il campione, più si può creare un legame non specifico.

I limiti dei metodi attuali sono i seguenti. Alcuni parametri clinici per LN, come il rapporto albumina/creatinina, non possono essere rivelati utilizzando questi metodi. Inoltre, alcuni campioni possono avere una scarsa solubilità acida che porta a una lettura ad alta concentrazione al di sopra della curva standard. Ciò richiede ulteriori diluizioni di campioni o l'aggiunta di tensioattivi per precipitare il colorante30. Inoltre, questo protocollo potrebbe non essere adatto se sono necessarie molte cellule dopo l'isolamento dei leucociti renali. L'attuale protocollo di isolamento delle cellule renali prevede diverse fasi di lavaggio, digestione e isolamento per massimizzare la rimozione di altre cellule, quindi anche se la purezza cellulare è elevata alla fine, il numero di cellule è solitamente basso. Inoltre, è una procedura lunga, quindi la vitalità cellulare può essere compromessa. Altri saggi pronti all'uso sono più adatti per l'uso clinico; Tuttavia, i metodi attuali possono fornire risultati accurati con un budget inferiore per i laboratori di ricerca.

In sintesi, tre diverse tecniche efficienti e accurate sono presentate in questo protocollo per caratterizzare la progressione LN. Combinando il metodo Bradford per il livello di proteinuria, l'analisi FACS per l'infiltrazione renale dei leucociti e l'analisi IHC per la deposizione renale di IgG2a e C3, è stato stabilito con successo un quadro chiaro della disfunzione renale nei topi MRL / lpr femminili come modello di LN umano.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano che non vi è conflitto di interessi.

Acknowledgments

Ringraziamo la Flow Cytometry Core Facility, il Laboratorio di Istopatologia, il Fralin Imaging Center presso il Virginia Polytechnic Institute e la State University per il supporto tecnico. Questo lavoro è supportato da vari NIH e sovvenzioni interne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris-Buffered Saline (TBS) Thermo Fisher Scientific J60764.K2
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023
Anti-Human/Mouse C3 Cedarlane CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711 Biolegend 142519
Anti-Mouse CD45 AF700 Biolegend 103127
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G
Collagenase D Sigma-Aldrich 11088882001
Confocal Microscope LSM 880 Zeiss LSM 880
Coplin jar Fisher Scientific 50-212-281
Cryomold Fisher Scientific NC9511236
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Percoll
DEPC-Treated water Thermo Fisher Scientific AM9906
DNase I Sigma-Aldrich D4527
dsDNA-EC InvivoGen tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid Fisher Scientific S311-500 EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system Thermo Fisher Scientific AMF5000
FACS Fusion Cell sorter BD Biosciences FACS Fusion
Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated R&D systems S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates Fisher Scientific 12-565-501
Graphpad prism GraphPad N/A
Hank’s Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175-079
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al. ATCC 23272
MEM non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) Jackson Lab 485
Nail enamel N/A N/A Any conventional store
O.C.T compound Tisse-Tek 4583
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Polysciences R-30
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 70011069
Pierce 20x TBS Buffer Thermo Fisher Scientific 28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit Thermo Fisher Scientific 23236 Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553141 FcR block
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070
SpectraMax M5 Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM Fisher Scientific 22363549
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Vancomycin Hydrochloride Goldbio V-200-1
Zombie Aqua Biolegend 423102 fluorescent dye for flow cytometry analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
  4. Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
  5. Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
  6. Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
  7. Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
  8. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
  9. Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
  10. Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).
  11. Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
  12. Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
  13. Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
  14. Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
  15. Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
  16. Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
  17. Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
  18. Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
  19. Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
  20. Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
  21. van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
  22. Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
  23. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  25. Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
  26. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  27. Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
  28. Park, J. G. -, et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
  29. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  30. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).

Tags

Immunologia e infezione Numero 184 LES nefrite da lupus rene infiltrazione renale cellule B disfunzionali deposizione di proteine
Analisi della proteinuria, infiltrazione renale dei leucociti e deposizione renale di proteine in topi MRL/lpr inclini al lupus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses … More

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice. J. Vis. Exp. (184), e63506, doi:10.3791/63506 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter