Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyser av proteinuri, njurinfiltration av leukocyter och njuravsättning av proteiner hos lupusbenägna MRL/lpr-möss

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63506
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för att spåra lupusprogression hos möss. Två ytterligare procedurer presenteras för att karakterisera lupusnefrit baserat på cellinfiltration och proteinavsättning i njurarna.

Abstract

Systemisk lupus erythematosus (SLE) är en autoimmun sjukdom utan känt botemedel och kännetecknas av ihållande inflammation i många organ, inklusive njurarna. Under sådana omständigheter förlorar njuren sin förmåga att rengöra avfall från blodet och reglera salt- och vätskekoncentrationer, vilket så småningom leder till njursvikt. Kvinnor, särskilt de i fertil ålder, diagnostiseras nio gånger oftare än män. Njursjukdom är den vanligaste dödsorsaken hos SLE-patienter. Detta protokoll beskriver en snabb och enkel metod för att mäta utsöndrade proteinnivåer i insamlad urin och spåra lupusprogression över tid. Dessutom tillhandahålls ett tillvägagångssätt för att isolera njurmononukleära celler baserat på storlek och densitetsval för att undersöka njurinfiltration av leukocyter. Vidare har en immunohistokemisk metod utvecklats för att karakterisera proteinavsättning i glomeruli- och leukocytinfiltrationen i tubulointerstitiella utrymmet. Tillsammans kan dessa metoder hjälpa till att undersöka utvecklingen av kronisk inflammation i samband med njurarna hos lupusbenägna MRL/lpr-möss.

Introduction

Njurens primära funktion är eliminering av giftiga ämnen genom urin samtidigt som homeostasen av vatten och salter bibehålls1. Denna funktion hotas hos patienter med systemisk lupus erythematosus (SLE), vilket leder till så kallad lupusnefrit (LN). LN är en följd av att immunsystemet attackerar njurarna, vilket leder till ihållande njurinflammation och därför förlorar sin förmåga att rengöra avfall från blodet och reglera salt- och vätskekoncentrationer. Detta kommer så småningom att leda till njursvikt, vilket kan vara dödligt. Under den nefritiska processen rekryteras cirkulerande B-celler, T-celler och monocyter till njurarna och utsöndrar kemokiner, cytokiner och immunkomplexbildande autoantikroppar. Detta resulterar i slutändan i endotelcellskador, membranskador, renal tubulär atrofi och fibros2.

MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) lupusbenägna möss är en klassisk musmodell som uppvisar lupusliknande kliniska tecken som liknar humant SLE3. Denna modell har varit avgörande för att förstå en av de främsta orsakerna till dödlighet hos SLE-patienter, lupusnefrit (LN)4. I både humant och mus-SLE kännetecknas LN av gradvis inflammation utlöst av njuravsättning av immunkomplex, följt av komplementaktivering, rekrytering av inflammatoriska celler och förlust av njurfunktion5. Immunkomplexavsättningen är det första steget för att inducera kemokin- och cytokinproduktion av inneboende njurceller, vilket utökar det inflammatoriska svaret genom att rekrytera immunceller6. Det aktuella protokollet presenterar flera tekniker för att följa njursjukdomsprogression som analyserar cellinfiltration och immunkomplexavsättning.

Urin som samlas in varje vecka möjliggör detektering och visualisering av proteinuriens tidsförlopp före, under och efter lupusdebut. Proteinuri som biomarkör kan bestämma den biologiska utvecklingen av LN. Andra fördelar med denna teknik är att den är icke-invasiv, kostnadseffektiv och lätt att implementera7. När njuren fungerar perfekt är proteinurinivån konsekvent låg; Hos MRL/lpr-möss observeras dock efter 8-9 veckors ålder en gradvis ökning av proteinurinivån, som så småningom är tillräckligt hög för att orsaka njursvikt8. Flera reagensremsor och kolorimetriska reagenser är kommersiellt tillgängliga för att övervaka problemet. Bradford-analysen är dock billig och mycket exakt för att bestämma uppkomsten av proteinuri och förloppet av lupusnefrit. Denna analys är snabb och reagenset påverkas inte av närvaron av lösningsmedel, buffertar, reduktionsmedel och metallkelaterande medel som kan finnas i ditt prov 9,10,11.

En viktig aspekt att tänka på är cellinfiltration i njuren. Dessa infiltrat främjar patogenes genom att utlösa utsöndringen av lösliga faktorer såsom cytokiner för att förvärra inflammation12. För att bättre förstå vilka cellpopulationer som finns i infiltraten är en användbar metod att isolera leukocyter13. Här används detektering av njurinfiltration av B-celler som ett exempel. Förfarandet börjar med en matsmältningsprocess med deoxiribonukleas (DNase) och kollagenas, följt av densitetsgradientseparation som tar bort skräp, röda blodkroppar och täta granulocyter. Anledningen till att isolera B-celler (CD19+) och plasmaceller (CD138+) är att lupusnjurar kan koncentrera dessa celler14. Det föreslås att närvaron av B-celler i små aggregat i njurarna kan indikera klonal expansion och följaktligen immunoglobulin (Ig) produktion. Plasmaceller är välkända för att vara närvarande i dessa aggregat också15. När leukocyter har isolerats kan fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) användas för att analysera cellerna av intresse vid färgning med olika fluorescenskonjugerade antikroppar.

Immunofluorescens är en av de immunhistokemiska (IHC) detektionsmetoderna som möjliggör fluorescerande visualisering av proteiner i 4 μm tjocka njurvävnadsprover. Andra IHC-detektionsmetoder beror på analyternas natur, bindningskemi och andra faktorer16. Immunofluorescens är en snabb identifieringsmetod som utsätter antigenet för dess motsvarighetsantikropp märkt med en specifik fluorokrom (eller ett fluorescerande färgämne). När den är upphetsad producerar den ljus som ett fluorescensmikroskop kan upptäcka. Denna teknik kan användas för att observera avsättningen av komplement C3 och IgG2a17. Överdriven komplementkaskadaktivering kan associeras med ett okontrollerat immunsvar och funktionsförlust18. Immunavsättning av anti-dubbelsträngade DNA (anti-dsDNA) autoantikroppar i njuren är ett stort problem19, där de med IgG2a-isotyp har associerats med LN20. Specifikt uppvisar anti-dsDNA-antikroppar mer patogenicitet och affinitet till kärnmaterial och bildar immunkomplex21. När IgG2a är närvarande aktiveras komplementkaskaden, inklusive C3, för att rensa immunkomplexen22. C3- och IgG2a-markörerna kan kvantifieras individuellt eller överlagras för att fastställa deras korrelation.

I synnerhet är serumkreatininmätning en annan pålitlig teknik som kan användas tillsammans med mikroskopisk hematuri och njurbiopsier för att diagnostisera LN23. Närvaron av proteinuri är emellertid en stark indikator på glomerulär skada. I den meningen kan övervakning av proteinurinivån under lupus upptäcka sjukdomsdebut och komplettera andra metoder för att diagnostisera lupus. Dessutom kan immunkomplex avsatta i glomeruli inducera ett inflammatoriskt svar, aktivera komplementsystemet och rekrytera mer inflammatoriska celler. En annan anmärkningsvärd punkt i detta protokoll är B-cellinfiltration i njurarna. Detta, tillsammans med de infiltrerade T-cellerna, förstärker lokala immunsvar som utlöser organskador. Viktigt är att klassificeringen av LN inte bara baseras på glomerulära morfologiska förändringar som ses i mikroskopi utan också immunavlagringar observerade med immunofluorescens. Därför erbjuds i detta protokoll exakta och kostnadseffektiva metoder för analys av njurfunktionen i laboratorieinställningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll är godkänt av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Virginia Tech. Eftersom lupussjukdom har en högre incidens hos kvinnor användes endast kvinnliga MRL/lpr-möss. Provtagningen påbörjades vid 4 veckors ålder och avslutades vid 15 veckor. Mössen erhölls från kommersiella källor (se materialförteckning) och föddes upp och hölls i en specifik patogenfri miljö enligt de institutionella riktlinjerna.

1. Proteinuritest

  1. Samla urin enligt stegen nedan.
    1. Sterilisera huven genom att spruta 70% etanol. Placera ett sterilt plastark på ytan. Förbered spetsar, 1,5 ml rör och en pipett för att samla cirka 20 μl av vätskan.
      OBS: Tips och rör måste vara sterila och utan förbehandling.
    2. Ta buret och spraya 70% etanol innan du sätter den inuti huven.
    3. Håll musen med ena handen och använd den andra handen för att massera det ventrala området från topp till botten försiktigt.
    4. Använd ett 1,5 ml rör eller pipett för att samla urinen direkt, eller om provet sjunker, samla det från plastarket. Använd färska handskar, lakan och spetsar för varje prov.
      OBS: Om detta inte fungerar, använd en steril bägare för att isolera musen och samla sedan urinen från bägaren efter att musen urinerat.
    5. Sätt tillbaka musen i buret. Ta ut en annan mus och upprepa steg 1.1.3-1.1.4.
      OBS: Rengör alltid plastark och bägaren med 70% etanol efter att ha samlat provet för varje mus. Minst fem möss per grupp är nödvändiga för statistisk signifikans. Urinprov kan förvaras vid -80 °C tills det används i upp till 12 månader.
  2. Kvantifiera proteinerna med Bradfordmetoden24.
    1. Låt urinprover, Albumin-standard och Bradford-reagenset komma till rumstemperatur (RT) genom att hålla dem utanför frysen i 10-20 minuter.
      OBS: Bradford-reagens och Albumin-standard ingår i ett kommersiellt tillgängligt kit (se materialförteckningen). Startkoncentrationen för albuminstandarden är 2 mg/ml. Seriella utspädningar (1:2 sex gånger) måste göras med vatten.
    2. Tillsätt Bradford-reagens till en 96-brunnsplatta (200 μl/brunn), outspädd.
    3. Pipettera över 5 μL outspädd urinprov per brunn och använd spetsen för att pipettera upp och ner flera gånger för att blanda ordentligt.
    4. Lägg till standarder (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg / dL) i dubbletter. Lämna ett par brunnar som ämnen.
      OBS: Tillägg av prover och standarder måste göras snabbt.
    5. Låt det stå i 5-10 min på RT.
    6. Läs plattan vid 595 nm i en plattläsare enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning).

2. Isolering av njurcellerna

  1. Avliva musen med CO2 (flödeshastighet: 30% -70% volym / min, för att uppnå medvetslöshet eller död) i en kammare följt av livmoderhalsförskjutning. Fortsätt med dissektion för att samla båda njurarna. Placera en och en halv njure i ett iskallt C10-medium. Sätt den andra halvan njure i OCT (steg 3.1.1).
    OBS: C10 är gjord med RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1 mM natriumpyruvat, 1% av 100x MEM icke-essentiella aminosyror, 10 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanol och 100 U / ml penicillin-streptomycin (se materialtabell).
  2. Skär njurarna i kornstorlek (1-2 mm3 stycken) och smält i 5 ml digestionsbuffert innehållande 1 mg/ml kollagenas och 0,2 mg/ml DNas I (se materialtabell) i RPMI 1640-medium innehållande 10 mmol/L HEPES i 1 timme med kontinuerlig försiktig skakning vid 37 °C.
    OBS: Tillsätt 1 ml matsmältningsbuffert i ett sterilt 2 ml rör och använd steril sax för att hugga njuren.
  3. Tillsätt 10 ml 1x iskall PBS innehållande 10 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och inkubera i 10 minuter på is. Virvla sedan suspensionen två gånger.
  4. Filtrera cellsuspensionen genom en 100 μM sil och tvätta med 10 ml HBSS-full.
    OBS: HBSS-full innehåller 5 mM EDTA, 0,1% BSA och 10 mM HEPES.
  5. Centrifugera vid 350 x g i 10 min vid RT.
  6. Förbered 30%, 37% och 70% Stock Isotonic Percoll (SIP) lösning.
    OBS: Blanda 1 delvolym på 10x PBS och 9 delar volym Percoll för att förbereda SIP (se materialtabell); använd HBSS-full för att späda SIP till 30%, 37% och 70% SIP.
  7. Återsuspendera celler i 5 ml 30% SIP och ladda 37% av 5 ml (överst) och 70% av 5 ml (botten), vilket gör SIP-gradient, långsamt med en pasterpipett.
  8. Centrifugera med Up9 down0 (eller broms 0) vid 1000 x g i 30 min vid RT.
  9. Samla leukocyter från 37% -70% gränssnittet och återsuspendera dem i 5 ml C10.
  10. Centrifugera vid 350 x g i 10 minuter vid 4 °C.
  11. Återsuspendera cellpelleten i 3 ml FACS-buffert. Cellerna är redo för FACS-färgning.
    OBS: FACS-buffert innehåller 1x PBS och 0,1% Bovint serumalbumin (BSA).
  12. Centrifugera vid 350 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten (SN) och lämna ca 50 μl.
    OBS: För att ta bort supernatanten, häll eller pipettera försiktigt lösningen bort från det fasta ämnet eller använd ett halvautomatiskt vakuum för att aspirera supernatanten.
  13. Tillsätt 50 μL FcR-block (se materialtabell) per rör (förspätt 1/50 i 1x PBS); Blanda och inkubera på is i mörkret i 10 min.
  14. Tillsätt 2 ml FACS-buffert för att tvätta.
  15. Centrifugera vid 350 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera SN och lämna ca 50 μl.
  16. Tillsätt 20 μl av lämpligt fluorescerande färgämne (späd 1/100 med 1x PBS, se Materialförteckning) och låt det stå i 15-30 min på is.
  17. Tillsätt 50 μl antikropp 15 blandning per rör: CD138-BV711 (1/200 i 1x PBS) och CD45-AF700 (1/200 i1x PBS) (se Materialförteckning).
  18. Inkubera på is i mörkret i 15-30 min och tillsätt 3 ml FACS-buffert.
  19. Centrifugera vid 350 x g i 5 min vid 4 °C och vakuum SN, lämna ca 50 μl. Återsuspendera i 200 μl 1x PBS. Detta är nu redo att analyseras med flödescytometri.

3. Immunofluorescerande färgning

  1. Utför provsamlingen.
    1. Bädda in den halva njuren i det lilla plastkryomröret med föreningen Optimal skärtemperatur (OCT) (se materialtabell).
    2. Tillsätt torris i en polystyrenskumlåda (se Materialförteckning) och lägg försiktigt kryomröret ovanpå torrisen. Se till att kryomolderna placeras platt.
      OBS: Det tar 3-4 minuter för OCT-föreningen att stelna och bli vit.
    3. Ta ut kryomolden och linda in den i aluminiumfolie. Förvara den vid -80 °C tills den används vidare.
      OBS: Detta kan förvaras vid -80 °C i minst 1 år.
  2. Utför sektionering och fixering av provet.
    1. Skär proverna i 4 μm sektioner, vänta i minst 2-3 timmar för att torka och fixera sedan med kall aceton (vid 4 ° C) i 10 min.
      OBS: Var försiktig när du använder aceton, vilket kräver en specialiserad kemisk huva.
    2. Efter fixering av objektglasen, lufttorka i 0,5-1 h och förvara dem under en kort tid vid -20 ° C eller under lång tid vid -80 ° C.
  3. Fläcka proverna.
    1. Fixa om bilderna i kall aceton i 5-10 min.
    2. Låt sektionerna värmas upp till RT. Använd en PAP-penna (se Materialförteckning) runt sektionen och låt den torka.
      OBS: Nagelemalj kan också användas. Detta steg förhindrar att antikroppsutspädning flyter över hela bilden.
    3. Placera bilderna i 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS) i Coplin-burken (se materialtabell) i 20 minuter, lägg burken på shakern och skaka försiktigt.
    4. Häll av 1x TBS och fyll burken med 1x TBS, 5% BSA och 0.1% Tween 20. Inkubera i 20 minuter på skakaren, skaka försiktigt.
    5. Ta ut bilderna och torka botten av bilderna torra. Skaka vid behov bilderna torra. Tillsätt 100 μl konjugerade antikroppar25 C3-FITC (1/100) och IgG2a-PE (1/100) i avsnittet (se materialförteckning). Inkubera vid RT i en fuktad kammare i 1 h.
    6. Tvätta sektionen 3 gånger i 1x TBS, 5% BSA och 0,1% Tween 20 i 10 min på shakern.
    7. Skaka torrt glaskronorna och montera sektionen med ett antifade-reagens (se Materialförteckning) och sedan en täckglas.
    8. Förvara bilderna vid 4 °C tills de visas under mikroskopet (t.ex. konfokalmikroskop eller bildsystemmikroskop). Kvantifiera bilder med hjälp av programvara och subtrahera bakgrundssignaler när man jämför fluorescensintensiteten mellan regioner.
    9. För bildanalys med ImageJ-programvaran (se Materialförteckning), skissera önskad region.
    10. Ställ in standardparametrar genom att klicka på Analysera och sedan Ställ in mätningar och mätområde för att få resultaten.
    11. Överför data som erhållits från mätfönstren till ett kalkylblad.
      OBS: Ett litet område kan väljas från bilden som bakgrund; det borde inte ha någon fluorescens.
    12. När du är klar klickar du på Analysera för att mäta regionen och överföra data igen till föregående kalkylblad.
    13. Upprepa steg 3.3.11–3.3.12 för flera regioner.
    14. Beräkna medelfluorescensen som korrigerad cellfluorescens (CCF) = Integrerad densitet - (Vald cellregion x Genomsnittlig bakgrundsfluorescens).
    15. Beräkna för varje region och analysera data med hjälp av graf- och statistikprogramvaran (se Materialförteckning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet använder flera metoder för att bedöma MRL/lpr-möss för lupusnefrit. Först beskrivs ett förfarande för att studera ökade proteinurinivåer på grund av njursvikt över tid. Som visas i figur 1, honmöss behandlades med oral sondmatning av 200 μl fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) som kontrollgrupp och probiotiska Lactobacillus reuteri som behandlingsgrupp, i en koncentration av 109 cfu/ml, två gånger i veckan. Behandlingen började vid 3 veckors ålder och slutade vid 15 veckors ålder. Mössgruppen som behandlades med L. reuteri hade en mer aggressiv proteinuriprogression än kontrollgruppen.

Figure 1
Figur 1: Detektion av proteinnivåer i urinen hos MRL/lpr-möss över tid. n = 5 möss per grupp. Statistiken utfördes med det enkla linjära regressionstestet. *P < 0,05, **P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 visar FACS-analysen av de isolerade njurleukocyterna. Mössen behandlades med vankomycin (2 g/L) eller vankomycin plus E. coli dsDNA (80 μg) i detta experiment. Vankomycin gavs tillsammans med dricksvattnet under den angivna tidsperioden. Oral sondmatning av bakteriellt DNA administrerades till de vankomycinbehandlade mössen en gång i veckan under fyra på varandra följande veckor vid 4, 5, 6 och 7 veckors ålder. E. coli dsDNA förväntades utlösa njurinfiltration av plasmaceller som ledde till nedsatt njurfunktion, men ingen signifikant skillnad hittades.

Figure 2
Figur 2: Analys av plasmaceller i isolerade njurleukocyter. (A) Sekventiell gatingstrategi: totalt antal celler, enstaka celler, levande celler, CD45 + -celler och slutligen CD138 + -celler. B) Procentandel plasmaceller efter behandling med van (Vancomycin) eller van + DNA (Vancomycin + E. coli dsDNA) i 3 veckor (n ≥ 5 möss per grupp). Ingen statistisk signifikans ('ns') observerades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 visar immunofluorescensfärgning av komplement C3 och IgG2a på kvinnliga MRL/lpr-njursektioner. I detta experiment jämfördes effekten av miljöfaktorer avseende njuravsättningen av C3 och IgG2a. Egna möss föddes upp i djuranläggningen i flera generationer, och de jämfördes med nyligen köpta möss från en leverantör. Den immunohistokemiska analysen visade ingen skillnad mellan olika anläggningar.

Figure 3
Figur 3: Detektion av komplement C3 och IgG2a i njursektioner via immunofluorescensfärgning. (A) Representativa bilder av njursektioner färgade med anti-C3-FITC (grön) och anti-IgG2a-PE (röd). B) Jämförelse av korrigerad cellfluorescens (CCF) mellan de två grupperna (n ≥ 5 möss per grupp). Skalstreck = 100 μM. Ingen statistisk signifikans ('ns') observerades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LN är en ledande dödsorsak hos SLE-patienter, och faktorer som förvärrar sjukdomen är fortfarande oklara. Tillämpningen av detta protokoll är att karakterisera njurfunktionen med hjälp av flera metoder, inklusive mätning av proteinuri, FACS-analys av isolerade njurleukocyter och immunofluorescensfärgning av frysta njursektioner.

En viktig punkt att tänka på när man samlar urin är att man måste vara konsekvent med tiden på dagen och platsen för urinuppsamling. Möss är nattliga djur, så de mest exakta proverna samlas in sent på eftermiddagen innan möss börjar vara aktiva. En annan anledning till att välja den här tiden är att MRL/lpr-möss tenderar att dricka mycket vatten på natten, vilket leder till utspädd urin. Således kan insamling vid fel tidpunkt öka urinens koncentration och / eller volymvariationer. Det är också viktigt att samla så mycket urin som möjligt för att få exakta resultat.

Bradford-analysen ger oss en uppskattning av hur mycket protein som finns. Det är inte specifikt för några SLE-markörproteiner men tillräckligt bra för att ge en uppfattning om sjukdomsprogression26. Dessutom är denna metod kostnadseffektiv jämfört med andra. Noterbart är att Bradford-analysen är tidskänslig; Därför måste det slutföras inom en halvtimme. Prover tenderar att ha ökade värden eller höga falska resultat om man väntar för länge. En annan fördel jämfört med de kommersiella reagensremsorna för urinanalys är att det ger exakta siffror snarare än ett intervall inom urinprovet. Poängremsor kan ge tvetydiga resultat, särskilt i det högre intervallet 9,10,24.

För isolering av njurleukocyter är det första nyckelsteget att utföra dissektion så snabbt som möjligt. Njurcellernas livskraft påverkar i hög grad framgången för efterföljande FACS-analys. När njurarna bearbetas är varje steg tids- och temperaturkänsligt. Det måste noteras att DNase I och kollagenaskoncentrationer och temperatur är viktiga för maximal effektivitet, eftersom de eliminerar DNA och tillåter sönderdelning av organet respektive27. Det andra nyckelsteget är att isolera celler, uppdelade i två viktiga processer. Den första använder silen som möjliggör avlägsnande av vävnadsskräp; den andra processen som involverar Percoll är det viktigaste steget och kräver fokus och tålamod. När du gör densitetsgradienten med Percoll är det viktigt att upprätthålla tydliga gränssnitt mellan olika koncentrationer av SIP. Det rekommenderas att använda en Pasteur-pipett eftersom flödet och trycket kan styras manuellt. Ytterligare faser kan byggas bättre med den långsamma doseringen av SIP-lösningen eller till och med droppe för droppe. När faser har fastställts måste röret hanteras försiktigt; Annars kommer faserna att blandas omedelbart och prover kommer att gå vilse, eftersom det är omöjligt att separera faserna igen. Dessutom är det viktigt att centrifugera röret utan paus eftersom brytning kan vara för aggressiv, vilket leder till förlust av separata faser. Leukocyterna återvinns sedan från interfas mellan 30% och 37% SIP. Vi analyserade en cellpopulation i det här exemplet, plasmaceller (CD45+ och CD138+). Denna teknik är dock inte begränsad till B-celler; Den kan användas för andra celltyper och intracellulär färgning28.

Den tredje metoden är ett kraftfullt verktyg för att visualisera intracellulära lokaliseringar av givna proteinavsättningar. När vävnaderna har fixerats med aceton är det viktigt att utföra tillräcklig tvättning, så att antikroppar bara fäster vid målet. Därefter minskar blockering med BSA ospecifik bindning och falska positiva resultat. Direkt immunofluorescens rekommenderas vanligtvis, eftersom det är snabbare än indirekt immunofluorescens med en sekundär antikropp, vilket är tidskrävande, särskilt med tanke på de extra tvätt- och inkubationsstegen. Direkt immunofluorescens begränsar emellertid flexibiliteten hos antikroppsval jämfört med indirekt immunofluorescens29. Därför kan båda vara värdefulla metoder beroende på syftet. Dessutom måste det nämnas att utspädningsfaktorer är nyckeln vid färgning för IHC. Om utspädningen inte är väl utförd kommer ökad bakgrund (inte tillräckligt med antikroppsutspädning) eller svag färgning (för mycket dilatation) att visas på mikroskopibilderna. Det är viktigt att börja med seriella utspädningar av antikroppen för att optimera antikroppskoncentrationen för ett bättre mål-till-bakgrundsförhållande. Ett annat steg att tänka på är mängden inkubationstid med antikropparna. Ju längre antikroppen är i kontakt med provet, desto mer ospecifik bindning kan skapas.

Begränsningarna för de nuvarande metoderna är följande. Vissa kliniska parametrar för LN, såsom albumin/kreatininförhållandet, kan inte avslöjas med hjälp av dessa metoder. Dessutom kan vissa prover ha dålig syralöslighet vilket leder till en hög koncentrationsavläsning över standardkurvan. Detta kräver ytterligare utspädningar av prover eller tillsats av ytaktiva ämnen för att fälla ut färgämnet30. Dessutom kanske detta protokoll inte är lämpligt om många celler behövs efter njurleukocytisolering. Det nuvarande njurcellsisoleringsprotokollet involverar flera tvättsteg, matsmältning och isoleringssteg för att maximera avlägsnandet av andra celler, så även om cellrenheten är hög i slutet är cellantalet vanligtvis lågt. Dessutom är det ett långt förfarande, så cellviabiliteten kan äventyras. Andra färdiga analyser är mer lämpade för klinisk användning; De nuvarande metoderna kan dock ge korrekta resultat med en mindre budget för forskningslaboratorier.

Sammanfattningsvis presenteras tre olika effektiva och exakta tekniker i detta protokoll för att karakterisera LN-progressionen. Genom att kombinera Bradford-metoden för proteinurinivån, FACS-analys för njurinfiltration av leukocyterna och IHC-analys för njuravsättning av IgG2a och C3, etableras framgångsrikt en tydlig bild av nedsatt njurfunktion hos kvinnliga MRL/lpr-möss som en modell av humant LN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tackar Flow Cytometry Core Facility, Histopathology Laboratory, Fralin Imaging Center vid Virginia Polytechnic Institute och State University för teknisk support. Detta arbete stöds av olika NIH och interna bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris-Buffered Saline (TBS) Thermo Fisher Scientific J60764.K2
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023
Anti-Human/Mouse C3 Cedarlane CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711 Biolegend 142519
Anti-Mouse CD45 AF700 Biolegend 103127
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G
Collagenase D Sigma-Aldrich 11088882001
Confocal Microscope LSM 880 Zeiss LSM 880
Coplin jar Fisher Scientific 50-212-281
Cryomold Fisher Scientific NC9511236
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Percoll
DEPC-Treated water Thermo Fisher Scientific AM9906
DNase I Sigma-Aldrich D4527
dsDNA-EC InvivoGen tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid Fisher Scientific S311-500 EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system Thermo Fisher Scientific AMF5000
FACS Fusion Cell sorter BD Biosciences FACS Fusion
Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated R&D systems S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates Fisher Scientific 12-565-501
Graphpad prism GraphPad N/A
Hank’s Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175-079
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al. ATCC 23272
MEM non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) Jackson Lab 485
Nail enamel N/A N/A Any conventional store
O.C.T compound Tisse-Tek 4583
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Polysciences R-30
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 70011069
Pierce 20x TBS Buffer Thermo Fisher Scientific 28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit Thermo Fisher Scientific 23236 Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553141 FcR block
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070
SpectraMax M5 Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM Fisher Scientific 22363549
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Vancomycin Hydrochloride Goldbio V-200-1
Zombie Aqua Biolegend 423102 fluorescent dye for flow cytometry analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
  4. Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
  5. Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
  6. Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
  7. Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
  8. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
  9. Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
  10. Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).
  11. Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
  12. Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
  13. Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
  14. Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
  15. Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
  16. Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
  17. Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
  18. Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
  19. Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
  20. Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
  21. van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
  22. Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
  23. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  25. Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
  26. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  27. Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
  28. Park, J. G. -, et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
  29. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  30. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 184 SLE lupusnefrit njure njurinfiltration dysfunktionella B-celler proteinavsättning
Analyser av proteinuri, njurinfiltration av leukocyter och njuravsättning av proteiner hos lupusbenägna MRL/lpr-möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses … More

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice. J. Vis. Exp. (184), e63506, doi:10.3791/63506 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter