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Biology

दो उपकला कोशिका लाइनों में दो अंतर्जात आयन चैनलों के उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक अध्ययन के लिए झिल्ली क्षमता की एक प्रतिदीप्ति-आधारित परख

Published: June 22, 2022 doi: 10.3791/63528
Automatic Translation
1,3, 3, 2,4,5, 1,3,5
1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Cell Biology, Hospital for Sick Children, 3Department of Physiology, University of Toronto, 4Department of Paediatrics, University of Toronto, 5Department of Biochemistry, University of Toronto

Summary

यह प्रोटोकॉल झिल्ली क्षमता में परिवर्तन को मापकर इलेक्ट्रोजेनिक झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यह परख उपकला कोशिका लाइनों में अंतर्जात रूप से व्यक्त कई आयन चैनलों के कार्यात्मक रीडआउट के लिए एक मंच प्रदान करती है।

Abstract

प्रतिदीप्ति-आधारित अध्ययन संस्कृति में कोशिकाओं के उच्च-थ्रूपुट प्लेट रीडर परख के लिए उपयुक्त हैं। उन्हें आमतौर पर एचईके -293 कोशिकाओं जैसे कोशिकाओं में पुनः संयोजक आयन चैनल प्रोटीन को लक्षित करने वाले दवा खोज अभियानों के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, छोटे अणु हस्तक्षेप के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए ऊतक-प्रासंगिक सेल लाइनों के उपयोग पर जोर बढ़ रहा है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल उपकला कोशिका लाइनों में अंतर्जात रूप से व्यक्त आयन चैनलों के अध्ययन के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित झिल्ली संभावित परख के अनुकूलन का वर्णन करता है। झिल्ली संभावित परख दो सामान्य रूप से अध्ययन किए गए उपकला कोशिका लाइनों, काको -2 और कालू -3 में सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) की क्लोराइड चैनल गतिविधि के लिए एक उच्च-थ्रूपुट परख का विवरण देती है। इसके अलावा, यह पेपर एक ही उपकला कोशिका लाइनों में उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में उपकला सोडियम चैनल (ईएनसी) की गतिविधि को मापने के लिए इस प्रणाली के एक नए अनुप्रयोग का वर्णन करता है। साथ में, ये प्रतिदीप्ति-आधारित परख छोटे अणु मॉड्यूलेटर का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और लचीला मंच प्रदान करते हैं, जो एक प्रासंगिक सेलुलर संदर्भ में दो उपकला चैनलों को लक्षित करते हैं।

Introduction

पुनः संयोजक चैनल प्रोटीन के प्रतिदीप्ति-आधारित, उच्च-थ्रूपुट गतिविधि परख छोटे-अणु मॉड्यूलेटर की पहचान करने में अत्यधिक प्रभावी रहे हैं जिनमें भविष्य के उपचार 1,2,3,4 बनने की क्षमता है। आयन चैनल मॉड्यूलेटर के लिए छोटे अणु पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग का एक सामान्य तरीका झिल्ली क्षमता में परिवर्तन को मापने के माध्यम से है। आमतौर पर, इन स्क्रीन को पुनः संयोजक चैनलों का उपयोग करके आयोजित किया जाता है जो एचईके -293 कोशिकाओं 5,6,7 जैसे सेल लाइनों में विषम रूप से व्यक्त किए जाते हैं।

हालांकि, प्रासंगिक सेल प्रकारों में "हिट्स" के सत्यापन की आवश्यकता है। हम प्रस्ताव करते हैं कि प्रासंगिक सेल लाइनों में एक माध्यमिक स्क्रीन जो अंतर्जात रूप से रुचि के चैनलों को व्यक्त करती है, वांछनीय है। इस तरह की एक माध्यमिक स्क्रीन उन मॉड्यूलेटर की पहचान करेगी जो अंतिम सत्यापन परख में प्रभावी होने की संभावना है जो कम सुलभ प्राथमिक मानव ऊतकों पर भरोसा करते हैं।

परख प्रणालियों की भी आवश्यकता है जिनके पास एक ही ऊतक प्रकार में कई आयन चैनल लक्ष्यों की गतिविधि की रिपोर्ट करने का लचीलापन है। उदाहरण के लिए, वास्तविक प्रकाशित साहित्य है जो इस अवधारणा का समर्थन करता है कि सीएफटीआर और ईएनएसी कार्यात्मक रूप से 8,9,10 बातचीत करते हैं। यद्यपि कई अच्छी तरह से अध्ययन किए गए उपकला कोशिका लाइनों को सीएफटीआर और ईएनएसी दोनों को व्यक्त करने के लिए जाना जाता है, आज तक, उच्च-थ्रूपुट तरीके से दोनों का अध्ययन करने के लिए परख स्थितियों का वर्णन नहीं किया गया है।

यह प्रतिदीप्ति-आधारित झिल्ली संभावित परख बहुमुखी है, क्योंकि यह आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांचकी आवश्यकता को दरकिनार करते हुए सीएफटीआर और ईएनएसी के कार्य को मापने के लिए एक बहिर्जात रासायनिक जांच को नियोजित करता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, सीएफटीआर और ईएनएसी दोनों की चैनल गतिविधि को मापने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण चरणों को उजागर करने के लिए उदाहरण के रूप में दो आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले उपकला कोशिका लाइनों का अध्ययन किया जाता है।

Protocol

1. सेल प्लेटिंग और भेदभाव

  1. ईएमईएम में कल्चर कालू -3 और कैको -2 कोशिकाओं में टी -75 फ्लास्क में 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप) होता है।
  2. एक बार जब कोशिकाएं 80-100% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो टी -75 फ्लास्क से माध्यम को अलग करें।
  3. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोएं।
  4. सेल मोनोलेयर में 2 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड 0.25% ट्रिप्सिन / 0.1% ईडीटीए जोड़ें और टी -75 फ्लास्क को लगभग 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि कोशिकाएं कल्चरिंग फ्लास्क की सतह से उठा सकें और एकल-सेल निलंबन में अलग हो सकें।
  5. एक बार जब कोशिकाओं को फ्लास्क की सतह से उठा लिया जाता है, तो कुल 10 एमएल सेल निलंबन के लिए 8 एमएल कल्चर माध्यम (चरण 1.1) के साथ प्रतिक्रिया को बेअसर करें।
    नोट: यांत्रिक रूप से सेल क्लंप को 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ एकल-सेल निलंबन में अलग करें।
  6. कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट (~ 140,000-150,000 कोशिकाओं / कुएं) या 384-वेल प्लेट (~ 45,000-50,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) पर 30-40% कंफ्लुएंसी पर प्लेट करें।
    1. एक पूर्ण 96-वेल प्लेट को प्लेट करने के लिए, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कल्चर माध्यम के 18.5 एमएल में सेल सस्पेंशन के 1.5 एमएल जोड़ें। मिश्रण के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 200 μL जोड़ें।
    2. एक पूर्ण 384-वेल प्लेट को प्लेट करने के लिए, 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कल्चर माध्यम के 17 एमएल में सेल सस्पेंशन के 1 एमएल जोड़ें। मिश्रण के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 50 μL जोड़ें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं का कोई झुरमुट नहीं है, और एकल कोशिकाओं को प्रत्येक कुएं में समान रूप से वितरित किया जाता है।
  7. प्लेटिंग के बाद हर 2 दिनों में माध्यम बदलें। यदि कोशिकाएं विभिन्न कुओं के बीच एक ही समय में सामंजस्य तक नहीं पहुंचती हैं, तो प्लेट को त्याग दें और चरण 1.5 दोहराएं।
  8. एक बार बीज होने के बाद, 3-5 दिनों के भीतर कोशिकाओं को 100% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने की प्रतीक्षा करें। कार्यात्मक अध्ययन से 24 घंटे पहले माध्यम बदलें।

2. सीएफटीआर कार्यात्मक परख बफर समाधान तैयार करना

  1. तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों के साथ सोडियम मुक्त, क्लोराइड मुक्त बफर समाधान तैयार करें।
  2. अभिकर्मकों को ऊतक संवर्धन ग्रेड, डबल-डिस्टिल्ड एच2 ओ (डीडीएच2ओ) में जोड़ें। कमरे के तापमान पर रात भर हिलाकर अभिकर्मकों को घुलने दें (वाष्पीकरण से बचने के लिए एक बंद कंटेनर में)।
  3. एक बार समाधान स्थिर होने के बाद, पीएच को मापें। यदि समाधान का पीएच 7.4 से अधिक है, तो पीएच को 7.4 तक समायोजित करने के लिए 1 एम एन-मिथाइल-डी-ग्लूकामाइन (एनएमडीजी) समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें।
    नोट: एचसीएल के साथ समाधान के पीएच को समायोजित न करें क्योंकि समाधान क्लोराइड मुक्त होना चाहिए।
  4. समाधान को एक और 30 मिनट के लिए मिश्रण करने दें और समाधान की परासरणता को मापें।
    1. बफर समाधान की परासरणता को 300 ± 5 mOsm / kg की शारीरिक सीमा तक कम करें।
  5. फ़िल्टर करें और बाँझ बोतलों में बफर समाधान स्टोर करें।
    नोट: समाधान 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यदि 6 महीने से अधिक समय तक संग्रहीत किया जाता है, तो उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर पीएच और परासरण की जांच करें।

3. सीएफटीआर कार्यात्मक परख

  1. सोडियम-मुक्त, क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान (0.5 मिलीग्राम डाई / 1 एमएल बफर समाधान) में झिल्ली संभावित डाई को घोलें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    नोट: झिल्ली संभावित डाई पाउडर को प्रकाश में उजागर करने से बचें।
  2. कालू -3 या कैको -2 सेल मोनोलेयर से कल्चर माध्यम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में डाई युक्त घोल जोड़ें (96-वेल प्लेट के लिए 195 μL प्रति कुआं, 384-वेल प्लेट के लिए 95 μL प्रति कुआं)।
    नोट: 384-वेल प्लेटों के प्रति कुएं में 112 μL तक जोड़ा जा सकता है।
  3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 35 मिनट के लिए डाई लोड करने की अनुमति दें।
  4. डाई समाधान से भरी कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में ले जाएं। प्लेट के नीचे से प्रतिदीप्ति माप लें, उत्तेजना = 530 ± 5 एनएम, उत्सर्जन = 560 ± 5 एनएम
  5. 30 सेकंड के अंतराल पर 5 मिनट के लिए निरंतर बेसलाइन रीडिंग लेने से शुरू करें।
  6. 1 μM forskolin (1x) की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक कुएं में forskolin या DMSO के कम सांद्रता वाले घोल के 5 μL जोड़ें। 15 सेकंड के अंतराल पर माप के साथ 20 मिनट के लिए उत्तेजना रीडिंग लें।
    1. 96-वेल प्लेट प्रारूप के लिए, सोडियम-मुक्त, क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान के 48 μL में 1 mM forskolin (1,000x) स्टॉक समाधान या DMSO के 2 μL को पतला करके फोर्सकोलिन का कम सांद्रता (40 μM forskolin (1:25 तनुकरण)) समाधान तैयार करें।
      नोट: कम सांद्रता वाले 40 μM forskolin के बाद 1 μM forskoलिन की अंतिम एकाग्रता के लिए अगले चरण में एक दूसरा कमजोर पड़ने (1:40 कमजोर पड़ने) होता है।
    2. 384-वेल प्लेट प्रारूप के लिए, सोडियम-मुक्त, क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान के 49 μL में 1 mM (1,000x) forskolin स्टॉक समाधान या DMSO के 1 μL को पतला करके कम सांद्रता (20 μM forskolin (1:50 कमजोर पड़ना)) समाधान तैयार करें।
      नोट: कम सांद्रता वाले 20 μM forskolin के बाद 1 μM forskoलिन की अंतिम एकाग्रता के लिए अगले चरण में एक दूसरा कमजोर पड़ने (1:20 कमजोर पड़ने) होता है।
  7. 10 μM CFTRInh172 की अंतिम सांद्रता के लिए CFTRInh172 के कम सांद्रता वाले घोल के 5 μL जोड़ें। 30 सेकंड के अंतराल पर माप के साथ 15 मिनट के लिए निषेध रीडिंग लें।
    1. 96-वेल प्लेट प्रारूप के लिए, 48 μL सोडियम-मुक्त, क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान में 10 mM CFTRInh172 (1,000x) स्टॉक समाधान के 2 μL को पतला करके CFTRInh172 (1,000x) कम सांद्रता (400 μM CFTRInh172 (1:25 तनुकरण)) समाधान तैयार करें।
      नोट: कम सांद्रता 400 μM CFTRInh172 के बाद 10 μM CFTRInh172 की अंतिम एकाग्रता के लिए अगले चरण में एक दूसरा कमजोर पड़ने (1:40 कमजोर पड़ना) होता है।
    2. 384-वेल प्लेट प्रारूप के लिए, सोडियम-मुक्त, क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान के 49 μL में 10 mM CFTRInh172 (1,000x) स्टॉक समाधान के 1 μL को पतला करके CFTRInh172 (1,50x) कम सांद्रता (200 μM CFTRInh172 (1:50 तनुकरण)) समाधान तैयार करें।
      नोट: कम सांद्रता वाले 200 μM CFTRInh172 के बाद 10 μM CFTRInh172 की अंतिम एकाग्रता के लिए अगले चरण में एक दूसरा कमजोर पड़ने (1:20 कमजोर पड़ना) होता है।
  8. प्रत्येक कुएं के प्रतिदीप्ति तीव्रता माप की मात्रा निर्धारित करें, और अलग-अलग कुओं वाले कॉलम प्रारूप में स्प्रेडशीट के रूप में मूल्यों को निर्यात करें। फोर्स्कोलिन-प्रेरित परिवर्तनों की गणना करने के लिए, 96- या 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं से आरएफयू (सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयां) माप को बेसलाइन रीडिंग के अंतिम प्रतिदीप्ति तीव्रता माप से विभाजित करें और उन्हें प्लॉट करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, सीएफटीआरआई फ़ंक्शन 12 की विशिष्टता की बेहतर पुष्टि करने के लिए सीएफटीआरआईएनएच 172-मध्यस्थता निषेध प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करें, क्योंकि फोर्स्कोलिन के साथ तीव्र उपचार के परिणामस्वरूप एसएलसी 26 ए 912 जैसे अन्य क्लोराइड चैनलों की गतिविधि के माध्यम से झिल्ली विध्रुवण हो सकता है।
  9. फोर्स्कोलिन उत्तेजना के दौरान बेसलाइन से अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता माप के रूप में चरम प्रतिक्रियाओं को मापें। सीएफटीआर प्रतिक्रिया को मापने के लिए वक्र के नीचे इस माप या क्षेत्र का उपयोग करें।

4. ईएनएसी कार्यात्मक परख बफर समाधान तैयार करना।

  1. तालिका 2 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों के साथ उच्च सोडियम, क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान तैयार करें।
  2. एक बार समाधान स्थिर होने के बाद, पीएच को मापें। यदि समाधान का पीएच 7.4 से नीचे है, तो पीएच को 7.4 में समायोजित करने के लिए 1 एन एनएओएच समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें।
    नोट: एचसीएल के साथ समाधान के पीएच को समायोजित न करें क्योंकि समाधान क्लोराइड मुक्त होना चाहिए।
  3. बफर समाधान की परासरणता को 300 ± 5 mOsm / kg की शारीरिक सीमा तक कम करें।
  4. 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ बोतलों में बफर समाधान को छानकर स्टोर करें।
    नोट: यदि भंडारण 6 महीने से अधिक है, तो उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर पीएच और परासरण की जांच करें।

5. ईएनएसी कार्यात्मक परख

  1. उच्च सोडियम, क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान (0.5 मिलीग्राम डाई / 1 एमएल बफर समाधान) में झिल्ली संभावित डाई को घोलें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    नोट: झिल्ली संभावित डाई पाउडर को प्रकाश में उजागर करने से बचें।
  2. कालू -3 या कैको -2 सेल मोनोलेयर से कल्चर माध्यम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में डाई युक्त घोल जोड़ें (96-वेल प्लेटों के लिए 195 μL प्रति कुआं, 384-वेल प्लेटों के लिए 95 μL प्रति कुआं)।
    नोट: डाई समाधान को प्रकाश में उजागर करने से बचें।
  3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 35 मिनट के लिए डाई लोड करने की अनुमति दें।
  4. डाई समाधान से भरी कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में ले जाएं। प्लेट के नीचे से प्रतिदीप्ति माप पढ़ें, उत्तेजना = 530 ± 5 एनएम, उत्सर्जन = 560 ± 5 एनएम।
  5. 30 सेकंड के अंतराल पर 5 मिनट के लिए निरंतर बेसलाइन रीडिंग लेने से शुरू करें।
  6. ईएनएसी फ़ंक्शन को रोकने के लिए, 10 μM amiloride की अंतिम एकाग्रता के लिए उच्च सोडियम, शून्य क्लोराइड बफर समाधान में घुलने वाले कम-सांद्रता समाधान एमिलोराइड या कम सांद्रता वाले समाधान DMSO के 5 μL जोड़ें।
    1. 96-वेल प्लेट प्रारूप के लिए, उच्च सोडियम, क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान के 48 μL में 10 mM amiloride (1,000x) स्टॉक समाधान के 2 μL को पतला करके एमिलोराइड का कम-सांद्रता (400 μM amiloride (1:25 तनुकरण)) समाधान तैयार करें।
      नोट: कम सांद्रता वाले 400 μM amiloride के बाद 10 μM Amiloride की अंतिम एकाग्रता के लिए अगले चरण में एक दूसरा कमजोर पड़ने (1:40 कमजोर पड़ना) होता है।
    2. 384-वेल प्लेट प्रारूप के लिए, उच्च सोडियम, क्लोराइड-मुक्त बफर समाधान के 49 μL में 10 mM Amiloride (1,000x) स्टॉक समाधान के 1 μL को जोड़कर एमिलोराइड का कम-सांद्रता (200 μM amiloride (1:50 तनुकरण)) समाधान तैयार करें।
      नोट: कम सांद्रता वाले 200 μM amiloride के बाद 10 μM Amiloride की अंतिम एकाग्रता के लिए अगले चरण में एक दूसरा कमजोर पड़ने (1:20 कमजोर पड़ना) होता है।
  7. 45 सेकंड के अंतराल पर माप के साथ 60 मिनट के लिए निषेध रीडिंग लें।
  8. डेटा विश्लेषण के लिए चरण 3.7 दोहराएँ।
  9. एमिलोराइड जोड़ने के लगभग 15-20 मिनट बाद, बेसलाइन से पठार के बिंदु तक प्रतिशत अवरोध के रूप में एमिलोराइड प्रतिक्रिया को मापें। ईएनएसी प्रतिक्रिया को मापने के लिए इस अंतर का उपयोग करें।

Representative Results

सीएफटीआरआई चैनल गतिविधि को मापने के लिए, अच्छी तरह से विभेदित, पालन की गई कोशिकाओं को एक शून्य-क्लोराइड बाह्य कोशिकीय समाधान में इनक्यूबेट किया जाता है जिसमें झिल्ली क्षमता-संवेदनशील डाई होती है। सीएफटीआर फ़ंक्शन को लगातार फोर्स्कोलिन उत्तेजना के बाद झिल्ली विध्रुवण के रूप में पाया जाता है। क्लोराइड एफ्लक्स को वाहन नियंत्रण की तुलना में प्रतिदीप्ति में तेज वृद्धि के रूप में पाया जाता है। प्रतिदीप्ति संकेत सीएफटीआरआई अवरोधक (सीएफटीआरआईएनएच 172) के अतिरिक्त तक बना रहता है, जिससे प्रतिदीप्ति तीव्रता में तेजी से गिरावट आती है, जैसा कि कैको -2 कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) में देखा गया है, और कैको -2 और कालू -3 कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) दोनों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। फोर्स्कोलिन या डीएमएसओ (वाहन) के बाद प्रतिदीप्ति में अधिकतम परिवर्तन में अंतर के रूप में सीएफटीआर गतिविधि का आकलन। अलग-अलग बिंदु औसत फोर्स्कोलिन उत्तेजना (काले बिंदु) या डीएमएसओ नियंत्रण (ग्रे पॉइंट) से ± 3 मानक विचलन के बीच थे, जो 0.586 के जेड ' कारक के अनुरूप थे। इस उत्कृष्ट स्कोर ने इस परख की प्रजनन क्षमता का संकेत दिया (चित्रा 1 सी)। यदि बेसलाइन में मामूली बहाव होता है, तो अवरोधक जोड़ के बिंदु तक सक्रियण के बाद पूरे ट्रेस में बेसलाइन का विश्लेषण करके बहाव के प्रभाव को कम किया जा सकता है। प्रतिक्रिया को वक्र के नीचे के क्षेत्र के रूप में परिमाणित किया जा सकता है, जिसमें निचली सीमा को विस्तारित रेखा द्वारा परिभाषित किया गया है।

ईएनएसी गतिविधि को 96-वेल प्लेटों में उगाए गए कंफ्लुएंट वायुमार्ग और कोलोनिक उपकला कोशिकाओं में भी मापा जा सकता है। सीएफटीआरआई चैनल गतिविधि के लिए परख के विपरीत, इन कोशिकाओं को एक उच्च सोडियम युक्त समाधान में डुबोया जाता है, जिससे ईएनएसी के माध्यम से सोडियम अवशोषण सक्षम होता है। एमिलोराइड के तीव्र जोड़ के साथ, सोडियम अपटेक अवरुद्ध हो जाता है, और कोशिकाएं सापेक्ष झिल्ली हाइपरपोलराइजेशन का अनुभव करती हैं। यह कैको -2 कोशिकाओं में कम (10 μM) (चित्रा 2A) और उच्च सांद्रता (50 μM) एमिलोराइड (चित्रा 2A, B) और कैलु -3 कोशिकाओं में एमिलोराइड (50 μM) की उच्च सांद्रता के साथ दिखाया गया है (चित्रा 2B)। ईएनएसी परख को 384-वेल प्लेट प्रारूप में विस्तारित किया गया था और ईएनएसी निषेध में महान प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन किया गया था। इसी तरह, अलग-अलग बिंदु औसत एमिलोराइड निषेध (काले बिंदु) या डीएमएसओ नियंत्रण (ग्रे पॉइंट) से ± 3 मानक विचलन के बीच थे। कालू -3 कोशिकाओं में ईएनएसी प्रतिक्रिया ने एमिलोराइड (50 μM) (चित्रा 2 सी) का उपयोग करके तीव्र उपचार के साथ 0.629 के जेड ' कारक की सूचना दी, जो इंगित करता है कि ये पैरामीटर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग का समर्थन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: सीएफटीआर चैनल माप काको -2 और कालू -3 कोशिकाओं में झिल्ली विध्रुवण में परिवर्तन के रूप में। (ए) काको -2 कोशिकाओं में फोर्स्कोलिन (1 μM) और DMSO नियंत्रण के साथ सीएफटीआर उत्तेजना का प्रतिनिधि ट्रेस। (बी) काको -2 और कालू -3 कोशिकाओं में फोर्सकोलिन उत्तेजना का बॉक्स और मूंछ प्लॉट (*** पी < 0.0001, एन > 3 जैविक प्रतिकृतियां, एन > 3 तकनीकी प्रतिकृतियां)। जैविक प्रतिकृतियां स्वतंत्र सेल लाइन मार्ग हैं; तकनीकी प्रतिकृतियां मल्टीवेल प्लेटों के स्वतंत्र कुओं को संदर्भित करती हैं। बॉक्स प्लॉट औसत मूल्य को दर्शाता है; सीमाएं आईक्यूआर को दर्शाती हैं, जिसमें मूंछें न्यूनतम और मैक्सिमा मूल्यों को परिभाषित करती हैं। (सी) कैको -2 कोशिकाओं में डीएमएसओ नियंत्रण की तुलना में फोर्स्कोलिन उत्तेजना के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सीएफटीआर प्रतिक्रिया का ब्लैंड-अल्टमैन प्लॉट। काले बिंदु फोर्सकोलिन उत्तेजना के जवाब में प्रतिदीप्ति में अधिकतम पूर्ण परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं। ग्रे बिंदु डीएमएसओ नियंत्रण के जवाब में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: सीएफटीआर = सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड; आईक्यूआर = इंटरक्वार्टाइल रेंज; एफएसके = फोर्सकोलिन; त्रिभुज /F0 = प्रतिदीप्ति में परिवर्तन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: काको -2 और कालू -3 कोशिकाओं में झिल्ली हाइपरपोलराइजेशन के माध्यम से ईएनएसी निषेध माप। (ए) काको -2 कोशिकाओं में डीएमएसओ नियंत्रण के सापेक्ष एमिलोराइड (10 μM) के साथ ENAC निषेध का प्रतिनिधि ट्रेस। (बी) काको -2 और कालू -3 कोशिकाओं में एमिलोराइड निषेध का बॉक्स और मूंछ प्लॉट (*** पी < 0.0001, एन > 3 जैविक प्रतिकृतियां, एन > 3 तकनीकी प्रतिकृतियां)। (सी) कैलु -3 कोशिकाओं में डीएमएसओ नियंत्रण की तुलना में एमिलोराइड निषेध के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ईएनएसी प्रतिक्रिया का ब्लैंड-अल्टमैन प्लॉट। काले बिंदु एमिलोराइड निषेध के जवाब में प्रतिदीप्ति में अधिकतम पूर्ण परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं। ग्रे बिंदु डीएमएसओ नियंत्रण के जवाब में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: ईएनएसी = उपकला सोडियम चैनल; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड; आमिल। = एमिलोराइड; त्रिभुज /F0 = प्रतिदीप्ति में परिवर्तन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नाम एकाग्रता
एनएमडीजी (एन-मिथाइल-डी-ग्लूकामाइन) 150 mM
ग्लूकोनिक एसिड लैक्टोन 150 mM
पोटेशियम ग्लूकोनेट 3 mM
HEPES 10 mM

तालिका 1: शून्य सोडियम और क्लोराइड के साथ सीएफटीआर कार्यात्मक परख के लिए अभिकर्मक और उनकी संबंधित सांद्रता। संक्षिप्त नाम: सीएफटीआर = सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक।

नाम एकाग्रता
सोडियम ग्लूकोनेट 150 mM
पोटेशियम ग्लूकोनेट 3 mM
HEPES 10 mM

तालिका 2: उच्च सोडियम, शून्य क्लोराइड के साथ ईएनएसी कार्यात्मक परख बफर के लिए अभिकर्मक और उनकी संबंधित सांद्रता। संक्षिप्त नाम: ईएनएसी = उपकला सोडियम (एनए) चैनल।

Discussion

यहां, हमने उपकला कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइन, काको -2, और मानव उपकला फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन, कालू -3 में सीएफटीआर और ईएनएसी गतिविधि को मापने के लिए प्रतिदीप्ति-आधारित तरीकों का वर्णन किया है। उपकला कोशिका लाइनों में इन झिल्ली संभावित परखों का उपयोग छोटे अणु मॉड्यूलेटर यौगिकों की प्रभावकारिता की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है, जो पहले हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों में पहचाने जाते थे, प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न उपकला संस्कृतियों में अंतिम इन विट्रो सत्यापन से पहले।

यह पुष्टि करना अनिवार्य है कि उपरोक्त माप उचित रूप से रुचि के चैनल के लिए जिम्मेदार हैं। उदाहरण के लिए, सीएफटीआर को दिए गए माप को सीएफटीआर प्रोटीन अभिव्यक्ति और क्लोराइड के इलेक्ट्रोकेमिकल ड्राइविंग बल पर निर्भरता दिखानी चाहिए, जिसे फोर्सकोलिन और अवरोधक सीएफटीआरआईएनएच -172 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसी तरह, 10 μM amiloride के कारण झिल्ली संभावित परिवर्तनों को ENAC के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, अगर वे ENAC प्रोटीन अभिव्यक्ति और एक आंतरिक सोडियम ड्राइविंग बल पर निर्भर हैं। यद्यपि हमने ईएनएसी 2 के सभी तीन सबयूनिट्स के साथ अभिकर्मक के बाद एमडीसीके कोशिकाओं में ईएनएसी के इन गुणों की पुष्टि की है, हमने अभी तक औपचारिक रूप से पुष्टि नहीं की है कि कैको -2 और कैलू -3 कोशिकाओं में मापा गया एमिलोराइड प्रतिक्रिया ईएनएसी द्वारा प्रदान की जाती है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि एमिलोराइड ईएनएसी13 के अलावा सोडियम-प्रोटॉन एक्सचेंजर एनएचई 3 के कार्य को संशोधित कर सकता है। संभावित रूप से, इस परख में देखा गया एमिलोराइड-प्रेरित हाइपरपोलराइजेशन आंशिक रूप से अन्य चैनलों पर इंट्रासेल्युलर अम्लीकरण के अप्रत्यक्ष प्रभावों को प्रतिबिंबित कर सकता है। यह पुष्टि करने के लिए कि इस झिल्ली संभावित-संवेदनशील डाई का उपयोग करके मापा गया एमिलोराइड-प्रेरित हाइपरपोलराइजेशन उपरोक्त सेल लाइनों और अधिक जटिल सेल सिस्टम, जैसे आईपीएससी-व्युत्पन्न ऊतकों में ईएनएसी द्वारा प्रदान किया जाता है, हम पुष्टि कर रहे हैं कि यह गतिविधि इन लाइनों में एक बाध्य ईएनएसी सबयूनिट (बीटा) को खटखटाकर खो जाती है।

इन परखों की सफलता के लिए कई कारकों पर ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, उपकला संस्कृतियों को सुसंगत और अच्छी तरह से विभेदित किया जाना चाहिए। सीएफटीआर और ईएनएसी फ़ंक्शन के माप के लिए, लगभग 145,000 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में प्रति कुएं या 384-वेल प्लेटों में 45,000 कोशिकाओं को प्रति कुएं चढ़ाया जाना चाहिए। एक बार जब उपकला कोशिकाएं कंफ्लुएंसी (चढ़ाना से 3-4 दिनों के भीतर) तक पहुंच जाती हैं, तो भेदभाव के 2-5 दिनों की अनुमति दें। यह समय पहले इम्यूनोब्लॉटिंग14 द्वारा अधिकतम सीएफटीआर प्रोटीन अभिव्यक्ति के आधार पर निर्धारित किया गया था। इसी तरह, दोनों सेल लाइनों, कालू -3 और काको -2 में कार्यात्मक ईएनएसी अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम समय निर्धारित किया गया था।

नॉनकॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर या सेल अतिवृद्धि तकनीकी प्रतिकृति में कम प्रजनन क्षमता की ओर ले जाती है। ऐसे मामलों में जहां अलग-अलग कुओं में कोशिकाएं एक ही समय में कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंचती हैं, इन प्लेटों को छोड़ दिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, अस्थिर बेसलाइन रीडिंग या उत्तेजना प्रतिक्रियाओं की कमी खराब सेल गुणवत्ता का संकेत हो सकती है, जिसे विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। सीएफटीआर एक्टिवेटर, फोर्सकोलिन, या ईएनएसी अवरोधक, एमिलोराइड के लिए कम प्रतिक्रियाएं, संभावित रूप से अत्यधिकपारित कोशिकाओं के उपयोग को प्रतिबिंबित कर सकती हैं। हालांकि कालू -3 और कैको -2 कोशिकाओं के लिए कोई समस्या नहीं है, अन्य कोशिकाएं या ऊतक प्लेटों का अच्छी तरह से पालन नहीं कर सकते हैं और कुओं की प्रीकोटिंग की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों में, कोलेजन कोटिंग16 का उपयोग करके 2 डी कोलेंजियोसाइट संस्कृतियों को प्लेटों से जोड़ा गया था। वैकल्पिक रूप से, पॉली-एल-लाइसिन 2 का उपयोग करके2 डी आंतों के ऊतकों का पालन बढ़ाया गया था।

इसके अलावा, प्रतिदीप्ति-आधारित परख का उपयोग करके छोटे अणुओं द्वारा आयन चैनलों के मॉड्यूलेशन का परीक्षण करने में, यह महत्वपूर्ण है कि छोटे अणुओं के फ्लोरोसेंट गुणों द्वारा प्रदत्त संभावित कलाकृतियों को संबोधित किया जाए। कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, झिल्ली संभावित परख को पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधियों का उपयोग करके आगे मान्य किया जा सकता है, जैसे कि यूसिंग अध्ययन17।

यह पुष्टि करने के बाद कि झिल्ली संभावित-संवेदनशील रंगों द्वारा पता लगाई गई प्रतिक्रिया विशेष रूप से रुचि के चैनल द्वारा प्रदान की जाती है, इन परखों में उनके प्रासंगिक सेलुलर संदर्भ में उपकला आयन चैनलों के आशाजनक मॉड्यूलेटर को मान्य करने की जबरदस्त क्षमता है। यह मंच हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों में उच्च-थ्रूपुट मॉड्यूलेटर स्क्रीन और मुश्किल-से-पहुंच वाले प्राथमिक ऊतकों में समय लेने वाली, बायोइलेक्ट्रिक माप के बीच की खाई को पाट सकता है।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक सीएफटीआर और ईएनएसी को मापने वाले झिल्ली संभावित परख के संचालन में उनकी मदद के लिए बीमार बच्चों के अस्पताल में क्रिस्टोफर फ्लैड और एसपीएआरसी बायोसेंटर को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम सीएफ कनाडा और सिक किड्स फाउंडेशन द्वारा प्रदान किए गए धन के साथ सीएफआईटी कार्यक्रम द्वारा समर्थित था। इस काम को जीनोम कनाडा और ओंटारियो जीनोमिक्स इंस्टीट्यूट (ओजीआई -148) के माध्यम से कनाडा सरकार द्वारा वित्त पोषित किया गया था। इस अध्ययन को ओंटारियो सरकार द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एसएक्स को कैनेडियन एसोसिएशन ऑफ गैस्ट्रोएंटरोलॉजी (सीएजी) पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amiloride Spectrum Chemical TCI-A2599-5G Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
CFTRInh-172 CF Foundation Therapeutics Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
EMEM, 1xs Wisent 320-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-450
FLIPR Membrane Potential Dye Molecular Devices R8042 Stored at 4 °C
Forskolin Sigma-Aldrich F3917 Dissolved in DMSO and stored at -20 °C
Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) Sigma-Aldrich G4750 Stored at room temperature
HEPES Bioshop HEP001.5 Stored at room temperature
Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) ATCC HTB-55
Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) ATCC HTB-37
N-Methyl-D-glucamine (NMDG Sigma-Aldrich M2004 Stored at room temperature
Penicillin-Streptomycin Solution Wisent 450-200-EL
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Wisent 311-010-CL
Potassium Gluconate Sigma-Aldrich P1847 Stored at room temperature
Sodium Gluconate Sigma-Aldrich G9005 Stored at room temperature

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References

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इस महीने JoVE में अंक 184
दो उपकला कोशिका लाइनों में दो अंतर्जात आयन चैनलों के उच्च-थ्रूपुट कार्यात्मक अध्ययन के लिए झिल्ली क्षमता की एक प्रतिदीप्ति-आधारित परख
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Xia, S., Di Paola, M., Jones, N. L., Bear, C. E. A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63528, doi:10.3791/63528 (2022).

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