Summary
Bu protokol, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçerek elektrojenik membran proteinlerinin incelenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu tahlil, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen çoklu iyon kanallarının fonksiyonel olarak okunması için bir platform sağlar.
Abstract
Floresan bazlı çalışmalar, kültürdeki hücrelerin yüksek verimli plaka okuyucu testleri için uygundur. HEK-293 hücreleri gibi hücrelerde aşırı eksprese edilen rekombinant iyon kanalı proteinlerini hedef alan ilaç keşif kampanyaları için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, küçük molekül müdahalelerinin etkilerini incelemek için dokuyla ilgili hücre hatlarının kullanımına giderek daha fazla vurgu yapılmaktadır. Aşağıdaki protokol, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen iyon kanallarının incelenmesi için floresan bazlı bir membran potansiyel testinin adaptasyonunu açıklamaktadır. Membran potansiyel testi, yaygın olarak çalışılan iki epitel hücre hattında, Caco-2 ve Calu-3'te Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü'nün (CFTR) klorür kanal aktivitesi için yüksek verimli bir testi detaylandırır. Ek olarak, bu makalede, Epitel Sodyum Kanalı'nın (ENaC) aktivitesini aynı epitel hücre hatlarında yüksek verimli bir formatta ölçmek için bu sistemin yeni bir uygulaması açıklanmaktadır. Birlikte, bu floresan bazlı analizler, ilgili hücresel bağlamda iki epitel kanalını hedef alan küçük molekül modülatörlerini incelemek için sağlam ve esnek bir platform sağlar.
Introduction
Rekombinant kanal proteinlerinin floresan bazlı, yüksek verimli aktivite analizleri, gelecekteki tedaviler olma potansiyeline sahip küçük moleküllü modülatörlerin tanımlanmasında oldukça etkili olmuştur 1,2,3,4. İyon kanalı modülatörleri için küçük molekül kütüphanelerini taramanın yaygın bir yöntemi, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçmektir. Tipik olarak, bu ekranlar HEK-293 hücreleri 5,6,7 gibi hücre hatlarında heterolog olarak eksprese edilen rekombinant kanallar kullanılarak gerçekleştirilir.
Bununla birlikte, ilgili hücre türlerinde "isabetlerin" doğrulanmasına ihtiyaç vardır. İlgili hücre hatlarında, ilgili kanalları endojen olarak ifade eden ikincil bir ekranın arzu edilmesini öneriyoruz. Böyle bir ikincil ekran, daha az erişilebilir birincil insan dokularına dayanan nihai doğrulama testlerinde etkili olma olasılığı en yüksek modülatörleri tanımlayacaktır.
Aynı doku tipinde birden fazla iyon kanalı hedefinin aktivitesini bildirme esnekliğine sahip tahlil sistemlerine de ihtiyaç vardır. Örneğin, CFTR ve ENaC'nin işlevsel olarak 8,9,10 etkileşime girdiği kavramını destekleyen önemli yayınlanmış literatür vardır. Birkaç iyi çalışılmış epitel hücre hattının hem CFTR hem de ENaC'yi ifade ettiği bilinmesine rağmen, bugüne kadar, her ikisini de yüksek verimli bir şekilde incelemek için tahlil koşulları tanımlanmamıştır.
Bu floresan bazlı membran potansiyel testi, CFTR ve ENaC'nin işlevini ölçmek için eksojen bir kimyasal prob kullandığı ve genetik olarak kodlanmış problara olan ihtiyacı atladığı için çok yönlüdür11. İlkenin kanıtı olarak, yaygın olarak kullanılan iki epitel hücre hattı, hem CFTR hem de ENaC'nin kanal aktivitesini ölçmek için gerekli kritik adımları vurgulamak için örnek olarak incelenmiştir.
Protocol
1. Hücre kaplama ve farklılaşma
- EMEM'deki kültür Calu-3 ve Caco-2 hücreleri, bir T-75 şişesinde% 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin (kalem / strep) içerir.
- Hücreler% 80-100 akıcılığa ulaştığında, ortamı T-75 şişesinden aspire edin.
- Hücreleri bir kez 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın.
- Hücre tek katmanına 2 mL önceden ısıtılmış% 0.25 Tripsin /% 0.1 EDTA ekleyin ve hücrelerin kültür şişesi yüzeyinden kalkmasına ve tek hücreli bir süspansiyona ayrışmasına izin vermek için T-75 şişesini yaklaşık 5 dakika boyunca 37 ° C'ye yerleştirin.
- Hücreler şişe yüzeyinden kaldırıldıktan sonra, toplam 10 mL hücre süspansiyonu için 8 mL kültür ortamı (adım 1.1) ile reaksiyonu nötralize edin.
NOT: Hücre kümelerini mekanik olarak 10 mL serolojik pipet ile tek hücreli bir süspansiyona ayırın. - Hücreleri 96 delikli bir plakaya (~ 140.000-150.000 hücre / kuyu) veya 384 delikli bir plakaya (~ 45.000-50.000 hücre / kuyu) % 30-40 akıcılıkta plakalayın.
- Tam bir 96 delikli plakayı plakalamak için, 50 mL'lik bir konik tüpte 18,5 mL kültür ortamına 1,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırdıktan sonra, her bir oyuğa 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
- Tam bir 384 delikli plakayı plakalamak için, 50 mL'lik bir konik tüpte 17 mL kültür ortamına 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırdıktan sonra, her bir oyuğa 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
NOT: Hücre kümeleri olmadığından ve tek hücrelerin her bir kuyucuğa eşit olarak dağıtıldığından emin olun.
- Kaplamadan sonra ortamı her 2 günde bir değiştirin. Hücreler farklı kuyucuklar arasında aynı anda akıcılığa ulaşmazsa, plakayı atın ve adım 1.5'i tekrarlayın.
- Tohumlandıktan sonra, hücrelerin 3-5 gün içinde% 100 akıcılığa ulaşmasını bekleyin. Fonksiyonel etütlerden 24 saat önce ortamı değiştirin.
2. CFTR fonksiyonel tahlil tampon çözeltisi hazırlama
- Sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisini Tablo 1'de listelenen reaktiflerle hazırlayın.
- Reaktifleri doku kültürü derecesine, çift damıtılmışH2O'ya (ddH2O) ekleyin. Reaktiflerin oda sıcaklığında gece boyunca karıştırarak (buharlaşmayı önlemek için kapalı bir kapta) çözünmesine izin verin.
- Çözelti stabil hale geldiğinde, pH'ı ölçün. Çözeltinin pH'ı 7.4'ü aşarsa, pH'ı 7.4'e ayarlamak için damla damla 1 M N-metil-D-glukamin (NMDG) çözeltisi ekleyin.
NOT: Çözeltinin pH'ını HCl ile ayarlamayın, çünkü çözelti klorürsüz kalmalıdır. - Çözeltinin 30 dakika daha karışmasına izin verin ve çözeltinin ozmolaritesini ölçün.
- Tampon çözeltisinin ozmolaritesini 300 ± 5 mOsm/kg'lık bir fizyolojik aralığa düşürün.
- Tampon çözeltisini filtreleyin ve steril şişelerde saklayın.
NOT: Çözelti 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir. 6 aydan daha uzun süre saklanırsa, kullanmadan önce oda sıcaklığında pH ve ozmolariteyi kontrol edin.
3. CFTR fonksiyonel tahlil
- Membran potansiyel boyasını sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisinde (0,5 mg boya/1 mL tampon çözeltisi) çözün ve 37 °C'ye ısıtın.
NOT: Membran potansiyel boya tozunu ışığa maruz bırakmaktan kaçının. - Kültür ortamını Calu-3 veya Caco-2 hücre monokatmanlarından çıkarın ve boya içeren çözeltiyi her bir kuyucuğa ekleyin (96 delikli bir plaka için kuyu başına 195 μL, 384 delikli bir plaka için kuyu başına 95 μL).
NOT: 384 delikli plakaların kuyucuğu başına 112 μL'ye kadar eklenebilir. - Hücrelerin boyayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 35 dakika boyunca yüklemesine izin verin.
- Boya çözeltisi ile yüklenen hücreleri floresan plaka okuyucusuna taşıyın. Uyarma = 530 ± 5 nm, emisyon = 560 ± 5 nm ile plakanın altından floresan ölçümleri alın
- 30 s aralıklarla 5 dakika boyunca sürekli taban çizgisi okumaları yaparak başlayın.
- 1 μM forskolin'in (1x) nihai konsantrasyonu için her bir kuyucuğa 5 μL düşük konsantrasyonlu bir forskolin veya DMSO çözeltisi ekleyin. 15 s aralıklarla ölçümlerle 20 dakika boyunca bir stimülasyon okuması yapın.
- 96 delikli plaka formatı için, düşük konsantrasyonlu (40 μM forskolin (1:25 seyreltme)) forskolin çözeltisini, 2 μL 1 mM forskolin (1.000x) stok çözeltisi veya DMSO'yu 48 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde seyrelterek hazırlayın.
NOT: Düşük konsantrasyonlu 40 μM forskolin'i, 1 μM forskolin'in son konsantrasyonu için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:40 seyreltme) izler. - 384 delikli plaka formatı için, düşük konsantrasyonlu (20 μM forskolin (1:50 seyreltme)) çözeltiyi, 1 μL 1 mM (1.000x) forskolin stok çözeltisi veya DMSO'yu 49 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde seyrelterek hazırlayın.
NOT: Düşük konsantrasyonlu 20 μM forskolin'i, 1 μM forskolin'in son konsantrasyonu için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:20 seyreltme) izler.
- 96 delikli plaka formatı için, düşük konsantrasyonlu (40 μM forskolin (1:25 seyreltme)) forskolin çözeltisini, 2 μL 1 mM forskolin (1.000x) stok çözeltisi veya DMSO'yu 48 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde seyrelterek hazırlayın.
- 10 μM CFTRInh172'lik son konsantrasyon için 5 μL düşük konsantrasyonlu CFTRInh172 çözeltisi ekleyin. 30 s aralıklarla ölçümlerle 15 dakika boyunca bir inhibisyon okuması yapın.
- 96 delikli plaka formatı için, CFTRInh172 düşük konsantrasyonlu (400 μM CFTRInh172 (1:25 seyreltme)) çözeltisini, 48 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stok çözeltisinin 2 μL'sini seyrelterek hazırlayın.
NOT: Düşük konsantrasyonlu 400 μM CFTRInh172'yi, 10 μM CFTRInh172'lik son konsantrasyon için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:40 seyreltme) izler. - 384 delikli plaka formatı için, CFTRInh172 düşük konsantrasyonlu (200 μM CFTRInh172 (1:50 seyreltme)) çözeltisini, 49 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde 1 μL 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stok çözeltisi içinde seyrelterek hazırlayın.
NOT: Düşük konsantrasyonlu 200 μM CFTRInh172'yi, 10 μM CFTRInh172'lik son konsantrasyon için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:20 seyreltme) izler.
- 96 delikli plaka formatı için, CFTRInh172 düşük konsantrasyonlu (400 μM CFTRInh172 (1:25 seyreltme)) çözeltisini, 48 μL sodyum içermeyen, klorür içermeyen tampon çözeltisi içinde 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stok çözeltisinin 2 μL'sini seyrelterek hazırlayın.
- Her bir kuyunun floresan yoğunluğu ölçümlerini ölçün ve değerleri ayrı ayrı kuyucukları içeren sütun biçiminde bir elektronik tablo olarak dışa aktarın. Forskolin kaynaklı değişiklikleri hesaplamak için, RFU (Bağıl Floresan Birimleri) ölçümlerini 96 veya 384 delikli plakanın her bir kuyucuğundan, taban çizgisi okumasının son floresan yoğunluğu ölçümüne bölün ve bunları çizin.
- Alternatif olarak, CFTR fonksiyon 12'nin özgüllüğünü daha iyi doğrulamak için CFTRInh172 aracılı inhibisyon yanıtını nicelleştirin, çünkü forskolin ile akut tedavi, SLC26A912 gibi diğer klorür kanallarının aktivitesi yoluyla membran depolarizasyonuna neden olabilir.
- Forskolin stimülasyonu sırasında başlangıçtan itibaren maksimum floresan yoğunluğu ölçümü olarak tepe tepkilerini ölçün. CFTR yanıtını ölçmek için eğrinin altındaki bu ölçümü veya alanı kullanın.
4. ENaC fonksiyonel tahlil tampon çözeltisi hazırlama
- Yüksek sodyumlu, klorürsüz tampon çözeltisini Tablo 2'de listelenen reaktiflerle hazırlayın.
- Çözelti stabil hale geldiğinde, pH'ı ölçün. Çözeltinin pH'ı 7.4'ün altındaysa, pH'ı 7.4'e ayarlamak için damla damla 1 N NaOH çözeltisi ekleyin.
NOT: Çözeltinin pH'ını HCl ile ayarlamayın, çünkü çözelti klorürsüz kalmalıdır. - Tampon çözeltisinin ozmolaritesini 300 ± 5 mOsm/kg'lık bir fizyolojik aralığa düşürün.
- Tampon çözeltisini filtreleyin ve 4 ° C'de steril şişelerde 6 aya kadar saklayın.
NOT: Depolama 6 aydan uzunsa, kullanmadan önce oda sıcaklığında pH ve ozmolariteyi kontrol edin.
5. ENaC fonksiyonel tahlil
- Membran potansiyel boyasını yüksek sodyumlu, klorürsüz tampon çözeltisinde (0,5 mg boya/1 mL tampon çözeltisi) çözün ve 37 °C'ye ısıtın.
NOT: Membran potansiyel boya tozunu ışığa maruz bırakmaktan kaçının. - Kültür ortamını Calu-3 veya Caco-2 hücreli tek katmanlardan çıkarın ve boya içeren çözeltiyi her bir kuyucuğa ekleyin (96 delikli plakalar için kuyucuk başına 195 μL, 384 delikli plakalar için kuyu başına 95 μL).
NOT: Boya çözeltisini ışığa maruz bırakmaktan kaçının. - Hücrelerin 37 ° C'de 35 dakika ve % 5 CO2'de boya yüklemesine izin verin.
- Boya çözeltisi ile yüklenen hücreleri floresan plaka okuyucusuna taşıyın. Floresan ölçümlerini plakanın altından okuyun, uyarma = 530 ± 5 nm, emisyon = 560 ± 5 nm.
- 30 s aralıklarla 5 dakika boyunca sürekli taban çizgisi okumaları yaparak başlayın.
- ENaC fonksiyonunu inhibe etmek için, 10 μM amiloridin nihai konsantrasyonu için yüksek sodyum, sıfır klorür tampon çözeltisi içinde çözünmüş 5 μL düşük konsantrasyonlu çözelti amilorid veya düşük konsantrasyonlu çözelti DMSO ekleyin.
- 96 delikli plaka formatı için, 48 μL yüksek sodyumlu, klorürsüz tampon çözeltisi içinde 2 μL 10 mM amilorid (1.000x) stok çözeltisini seyrelterek düşük konsantrasyonlu (400 μM amilorid (1:25 seyreltme)) amilorid çözeltisini hazırlayın.
NOT: Düşük konsantrasyonlu 400 μM amilorid, 10 μM amiloridin son konsantrasyonu için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:40 seyreltme) ile takip edilir. - 384 delikli plaka formatı için, 49 μL yüksek sodyumlu, klorürsüz tampon çözeltisine 1 μL 10 mM amilorid (1.000x) stok çözeltisi ekleyerek düşük konsantrasyonlu (200 μM amilorid (1:50 seyreltme)) amilorid çözeltisini hazırlayın.
NOT: Düşük konsantrasyonlu 200 μM amilorid, 10 μM amiloridin son konsantrasyonu için bir sonraki adımda ikinci bir seyreltme (1:20 seyreltme) ile takip edilir.
- 96 delikli plaka formatı için, 48 μL yüksek sodyumlu, klorürsüz tampon çözeltisi içinde 2 μL 10 mM amilorid (1.000x) stok çözeltisini seyrelterek düşük konsantrasyonlu (400 μM amilorid (1:25 seyreltme)) amilorid çözeltisini hazırlayın.
- 45 s aralıklarla ölçümlerle 60 dakika boyunca bir inhibisyon okuması yapın.
- Veri analizi için adım 3.7'yi yineleyin.
- Amilorid yanıtını, amilorid ilavesinden yaklaşık 15-20 dakika sonra, başlangıçtan plato noktasına kadar yüzde inhibisyon olarak ölçün. ENaC yanıtını ölçmek için bu farkı kullanın.
Representative Results
CFTR kanal aktivitesini ölçmek için, iyi farklılaşmış, yapışmış hücreler, membran potansiyeline duyarlı boyayı içeren sıfır klorürlü bir hücre dışı çözelti içinde inkübe edilir. CFTR fonksiyonu, forskolin stimülasyonundan sonra membran depolarizasyonu olarak sürekli olarak tespit edilir. Klorür efflux, araç kontrolüne kıyasla floresanda keskin bir artış olarak algılanır. Floresan sinyali, CFTR inhibitörü (CFTRInh172) eklenene kadar sürdürülür, bu da Caco-2 hücrelerinde görüldüğü gibi floresan yoğunluğunda hızlı bir düşüşe yol açar (Şekil 1A) ve hem Caco-2 hem de Calu-3 hücrelerinde tekrarlanabilir (Şekil 1B). CFTR aktivitesinin forskolin veya DMSO (araç) sonrası floresandaki maksimum değişimdeki fark olarak değerlendirilmesi. Bireysel noktalar, ortalama forskolin stimülasyonundan (siyah noktalar) veya DMSO kontrolünden (gri noktalar) ± 3 standart sapma arasında değişiyordu ve bu da 0.586'lık bir Z' faktörüne karşılık geliyordu. Bu mükemmel puan, bu tahlilin tekrarlanabilirliğini göstermiştir (Şekil 1C). Taban çizgisinde küçük bir sürüklenme olması durumunda, sürüklenmenin etkisi, inhibitör ekleme noktasına kadar aktivasyondan sonra iz boyunca taban çizgisini tahmin ederek en aza indirilebilir. Yanıt, eğrinin altındaki alan olarak ölçülebilir ve alt sınır tahmin edilen çizgi tarafından tanımlanır.
ENaC aktivitesi ayrıca 96 kuyucuklu plakalarda yetiştirilen konfluent hava yolu ve kolonik epitel hücrelerinde de ölçülebilir. CFTR kanal aktivitesi testinin aksine, bu hücreler ENaC yoluyla sodyum emilimini sağlayan yüksek sodyum içeren bir çözeltiye batırılır. Akut amilorid ilavesi ile sodyum alımı bloke edilir ve hücreler göreceli membran hiperpolarizasyonu yaşarlar. Bu, hem düşük (10 μM) (Şekil 2A) hem de yüksek konsantrasyonlarda (50 μM) amilorid (Şekil 2A, B) ve yüksek konsantrasyonda amilorid (50 μM) içeren Calu-3 hücrelerinde Caco-2 hücrelerinde gösterilmiştir (Şekil 2B). ENaC testi 384 delikli bir plaka formatına genişletildi ve ENaC inhibisyonunda büyük tekrarlanabilirlik gösterdi. Benzer şekilde, bireysel noktalar ortalama amilorid inhibisyonundan (siyah noktalar) veya DMSO kontrolünden (gri noktalar) ± 3 standart sapma arasında değişiyordu. Calu-3 hücrelerindeki ENaC yanıtı, amilorid (50 μM) kullanılarak akut tedavi ile 0.629'luk bir Z' faktörü bildirmiştir (Şekil 2C), bu parametrelerin yüksek verimli taramayı desteklediğini göstermektedir.
Şekil 1: Caco-2 ve Calu-3 hücrelerinde membran depolarizasyonundaki değişiklikler olarak CFTR kanal ölçümü. (A) Caco-2 hücrelerinde forskolin (1 μM) ve DMSO kontrolü ile CFTR stimülasyonunun temsili izi. (B) Caco-2 ve Calu-3 hücrelerinde forskolin stimülasyonunun kutu ve bıyık grafiği (**** P < 0.0001, n > 3 biyolojik replika, n > 3 teknik replika). Biyolojik replikalar bağımsız hücre hattı pasajlarıdır; Teknik kopyalar, çok kuyulu plakaların bağımsız kuyularını ifade eder. Kutu grafiği medyan değeri gösterir; sınırlar IQR'yi tasvir eder, bıyıklar minima ve maxima değerlerini tanımlar. (C) Caco-2 hücrelerinde DMSO kontrolüne kıyasla forskolin stimülasyonu ile tekrarlanabilir CFTR yanıtının Bland-Altman grafiği. Siyah noktalar, forskolin stimülasyonuna yanıt olarak floresandaki maksimum mutlak değişiklikleri temsil eder. Gri noktalar, DMSO kontrolüne yanıt olarak floresandaki değişiklikleri temsil eder. Kısaltmalar: CFTR = Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü; DMSO = dimetil sülfoksit; IQR = çeyrekler arası aralık; Fsk = forskolin; ΔF/F0 = floresandaki değişim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Caco-2 ve Calu-3 hücrelerinde membran hiperpolarizasyonu yoluyla ENaC inhibisyon ölçümleri. (A) Caco-2 hücrelerinde DMSO kontrolüne göre amilorid (10 μM) ile ENaC inhibisyonunun temsili izi. (B) Caco-2 ve Calu-3 hücrelerinde amilorid inhibisyonunun kutu ve bıyık grafiği (**** P < 0.0001, n > 3 biyolojik replika, n > 3 teknik replika). (C) Calu-3 hücrelerinde DMSO kontrolüne kıyasla amilorid inhibisyonu ile tekrarlanabilir ENaC yanıtının Bland-Altman grafiği. Siyah noktalar, amilorid inhibisyonuna yanıt olarak floresandaki maksimum mutlak değişiklikleri temsil eder. Gri noktalar, DMSO kontrolüne yanıt olarak floresandaki değişiklikleri temsil eder. Kısaltmalar: ENaC = epitelyal sodyum kanalı; DMSO = dimetil sülfoksit; Amil. = amilorid; ΔF/F0 = floresandaki değişim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Ad | Konsantrasyon |
| NMDG (N-Metil-D-glukamin) | 150 mM |
| Glukonik Asit Lakton | 150 mM |
| Potasyum Glukonat | 3 mM |
| HEPES | 10 mM |
Tablo 1: Sıfır sodyum ve klorür ile CFTR fonksiyonel testi için reaktifler ve bunlara karşılık gelen konsantrasyonlar. Kısaltma: CFTR = Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü.
| Ad | Konsantrasyon |
| Sodyum Glukonat | 150 mM |
| Potasyum Glukonat | 3 mM |
| HEPES | 10 mM |
Tablo 2: Yüksek sodyumlu, sıfır klorürlü ENaC fonksiyonel tahlil tamponu için reaktifler ve bunlara karşılık gelen konsantrasyonlar. Kısaltma: ENaC = Epitelyal sodyum (Na) Kanalı.
Discussion
Burada, epitelyal kolorektal kanser hücre hattı, Caco-2 ve insan epitelyal akciğer kanseri hücre hattı Calu-3'te CFTR ve ENaC aktivitesini ölçmek için floresan bazlı yöntemleri tanımladık. Epitel hücre hatlarındaki bu membran potansiyel testleri, daha önce heterolog ekspresyon sistemlerinde tanımlanan küçük molekül modülatör bileşiklerinin, primer hasta kaynaklı epitel kültürlerinde nihai in vitro validasyondan önce etkinliğini doğrulamak için kullanılabilir.
Yukarıdaki ölçümlerin ilgili kanala uygun şekilde atfedildiğini doğrulamak zorunludur. Örneğin, CFTR'ye atfedilen ölçüm, CFTR protein ekspresyonuna ve forskolin ve CFTRInh-172 inhibitörü tarafından modüle edilen klorürün elektrokimyasal itici gücüne bağımlılık göstermelidir. Benzer şekilde, 10 μM amiloridin neden olduğu membran potansiyel değişiklikleri, ENaC protein ekspresyonuna ve içe doğru bir sodyum itici gücüne bağlıysa, ENaC'ye bağlanabilir. ENaC'nin bu özelliklerini, ENaC 2'nin üç alt birimi ile transfeksiyonu takiben MDCK hücrelerinde doğrulamamıza rağmen,Caco-2 ve Calu-3 hücrelerinde ölçülen amilorid yanıtının ENaC tarafından verildiğini henüz resmi olarak doğrulamadık. Bu özellikle önemlidir, çünkü amilorid, ENaC 13'e ek olarak sodyum-proton eşanjörüNHE3'ün işlevini modüle edebilir. Muhtemelen, bu tahlilde gözlenen amilorid kaynaklı hiperpolarizasyon, hücre içi asitleşmenin diğer kanallar üzerindeki dolaylı etkilerini kısmen yansıtabilir. Bu membran potansiyeline duyarlı boya kullanılarak ölçülen amilorid kaynaklı hiperpolarizasyonun, yukarıdaki hücre hatlarında ve iPSC türevli dokular gibi daha karmaşık hücre sistemlerinde ENaC tarafından verildiğini doğrulamak için, bu aktivitenin bu hatlarda zorunlu bir ENaC alt birimini (beta) nakavt ederek kaybolduğunu doğruluyoruz.
Bu testlerin başarısı birkaç faktöre dikkat etmeyi gerektirir. İlk olarak, epitel kültürleri akıcı ve iyi ayırt edilmelidir. CFTR ve ENaC fonksiyonunun ölçümü için, 96 delikli plakalarda kuyu başına yaklaşık 145.000 hücre veya 384 delikli plakalarda kuyu başına 45.000 hücre kaplanmalıdır. Epitel hücreleri birleşime ulaştığında (kaplamadan sonraki 3-4 gün içinde), 2-5 gün farklılaşmaya izin verin. Bu zamanlama daha önce immünoblotlama14 ile maksimal CFTR protein ekspresyonuna dayanarak belirlendi. Benzer şekilde, her iki hücre hattında, Calu-3 ve Caco-2'de fonksiyonel ENaC ekspresyonu için optimal zamanlama belirlendi.
Akıcı olmayan tek katmanlar veya hücre aşırı büyümesi, teknik kopyalar arasında düşük tekrarlanabilirliğe yol açar. Bireysel kuyucuklardaki hücrelerin aynı anda akıcılığa ulaşmadığı durumlarda, bu plakalar atılmalıdır. Ek olarak, kararsız taban çizgisi okumaları veya stimülasyon yanıtlarının eksikliği, analizden çıkarılması gereken düşük hücre kalitesinin bir göstergesi olabilir. CFTR aktivatör, forskolin veya ENaC inhibitörü amiloride verilen yanıtların azalması, aşırı geçişli hücrelerin kullanımını potansiyel olarak yansıtabilir15. Calu-3 ve Caco-2 hücreleri için bir sorun olmasa da, diğer hücreler veya dokular plakalara iyi yapışmayabilir ve kuyucukların önceden kaplanmasını gerektirebilir. Örneğin, önceki çalışmalarda, 2D kolanjiyosit kültürleri, kollajen kaplama16 kullanılarak plakalara tutturulmuştur. Alternatif olarak, 2D bağırsak dokularının aderansı Poly-L-Lysine2 kullanılarak arttırılmıştır.
Ayrıca, iyon kanallarının floresan bazlı bir tahlil kullanılarak küçük moleküller tarafından modülasyonunun test edilmesinde, küçük moleküllerin floresan özelliklerinin sağladığı potansiyel artefaktların ele alınması kritik öneme sahiptir. Fonksiyonel yanıtların özgüllüğünü doğrulamak için, membran potansiyel tahlilleri, Ussing çalışmaları17 gibi geleneksel elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak daha da doğrulanabilir.
Membran potansiyeline duyarlı boyalar tarafından tespit edilen yanıtın özellikle ilgili kanal tarafından verildiğini doğruladıktan sonra, bu analizler epitel iyon kanallarının umut verici modülatörlerini ilgili hücresel bağlamlarında doğrulamak için muazzam bir potansiyele sahiptir. Bu platform, heterolog ekspresyon sistemlerindeki yüksek verimli modülatör ekranlar ile erişilmesi zor birincil dokulardaki zaman alıcı, biyoelektrik ölçümler arasındaki boşluğu doldurabilir.
Disclosures
Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, CFTR ve ENaC'yi ölçen membran potansiyel tahlillerinin yürütülmesindeki yardımları için Hasta Çocuklar Hastanesi'ndeki Christopher Fladd ve SPARC BioCentre'a teşekkür eder. Bu çalışma, CF Kanada ve Hasta Çocuklar Vakfı tarafından sağlanan finansmanla CFIT Programı tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma Kanada Hükümeti tarafından Genome Canada ve Ontario Genomics Institute (OGI-148) aracılığıyla finanse edildi. Bu çalışma Ontario Hükümeti tarafından finanse edilmiştir. S.X., Kanada Gastroenteroloji Derneği (CAG) Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
| EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
| FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
| HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
| Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
| Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
| Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |
References
- Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
- Xia, S., et al. High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids. Cells. 10 (12), 3419 (2021).
- Jiang, J. X., et al. A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).
- Hu, J., et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology. Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- Chen, M. X., et al. Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels. Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).
- Maitra, R., Sivashanmugam, P., Warner, K. A rapid membrane potential assay to monitor CFTR function and inhibition. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1132-1137 (2013).
- Mall, M. A. ENaC inhibition in cystic fibrosis: potential role in the new era of CFTR modulator therapies. European Respiratory Journal. 56 (6), 2000946 (2020).
- Moore, P. J., Tarran, R. The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Merkert, S., et al. High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).
- Bertrand, C. A., et al. The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).
- Frelin, C., et al. Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger. Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).
- Di Paola, M., et al. SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells. mBio. 8 (6), 02073 (2017).
- Schiavi, S. C., et al. Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells. American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).
- Ogawa, M., et al. Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 12 (1), 6504 (2021).
- Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool. Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).
