Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.
Abstract
Op fluorescentie gebaseerde studies zijn geschikt voor high-throughput plaatlezertests van cellen in cultuur. Ze zijn vaak gebruikt voor campagnes voor het ontdekken van geneesmiddelen gericht op recombinante ionkanaaleiwitten die overexpressie hebben in cellen zoals HEK-293-cellen. Er wordt echter steeds meer nadruk gelegd op het gebruik van weefselrelevante cellijnen voor het bestuderen van de effecten van interventies met kleine moleculen. Het volgende protocol beschrijft de aanpassing van een op fluorescentie gebaseerde membraanpotentiaaltest voor de studie van ionkanalen die endogeen tot expressie komen in epitheelcellijnen. De membraanpotentiaaltest beschrijft een high-throughput assay voor chloridekanaalactiviteit van de Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in twee vaak bestudeerde epitheelcellijnen, Caco-2 en Calu-3. Daarnaast beschrijft dit artikel een nieuwe toepassing van dit systeem om de activiteit van het epitheliale natriumkanaal (ENaC) te meten in een high-throughput-formaat in dezelfde epitheelcellijnen. Samen bieden deze op fluorescentie gebaseerde assays een robuust en flexibel platform voor het bestuderen van kleine molecuulmodulatoren, gericht op twee epitheelkanalen in een relevante cellulaire context.
Introduction
Op fluorescentie gebaseerde, high-throughput activiteitstests van recombinante kanaaleiwitten zijn zeer effectief geweest bij het identificeren van kleinmolecuulmodulatoren die het potentieel hebben om toekomstige therapieënte worden 1,2,3,4. Een veelgebruikte methode voor het screenen van kleine molecuulbibliotheken op ionkanaalmodulatoren is het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Meestal worden deze schermen uitgevoerd met behulp van recombinante kanalen die heterologe worden uitgedrukt in cellijnen zoals HEK-293-cellen 5,6,7.
Er is echter behoefte aan validatie van "hits" in relevante celtypen. We stellen voor dat een secundair scherm in relevante cellijnen die endogeen de kanalen van interesse uitdrukken, wenselijk is. Een dergelijk secundair scherm zal de modulatoren identificeren die het meest waarschijnlijk effectief zijn in uiteindelijke validatietests die afhankelijk zijn van minder toegankelijke primaire menselijke weefsels.
Er is ook behoefte aan testsystemen die de flexibiliteit hebben om de activiteit van meerdere ionkanaaldoelen in hetzelfde weefseltype te rapporteren. Er is bijvoorbeeld inhoudelijk gepubliceerde literatuur die het concept ondersteunt dat CFTR en ENaC functioneel interageren 8,9,10. Hoewel van verschillende goed bestudeerde epitheelcellijnen bekend is dat ze zowel CFTR als ENaC tot expressie brengen, zijn tot op heden de testomstandigheden voor het bestuderen van beide op een high-throughput manier niet beschreven.
Deze op fluorescentie gebaseerde membraanpotentiaaltest is veelzijdig, omdat het een exogene chemische sonde gebruikt om de functie van CFTR en ENaC te meten, waardoor de behoefte aan genetisch gecodeerde sondes wordt omzeild11. Als proof of principle worden twee veelgebruikte epitheelcellijnen bestudeerd als voorbeelden om de kritieke stappen te benadrukken die nodig zijn voor het meten van kanaalactiviteit van zowel CFTR als ENaC.
Protocol
1. Celplating en differentiatie
- Kweek Calu-3- en Caco-2-cellen in EMEM met 20% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen/streptokokken) in een T-75-kolf.
- Zodra de cellen 80-100% confluentie bereiken, zuigt u het medium uit de T-75-kolf.
- Was de cellen eenmaal voorzichtig met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 2 ml voorverwarmd 0,25% trypsine/0,1% EDTA toe aan de monolaag van de cel en plaats de T-75-kolf gedurende ongeveer 5 minuten op 37 °C om de cellen van het oppervlak van de kolf te laten optillen en te dissociëren tot een eencellige suspensie.
- Zodra de cellen van het kolfoppervlak zijn opgetild, neutraliseert u de reactie met 8 ml kweekmedium (stap 1.1) voor een totaal van 10 ml celsuspensie.
OPMERKING: Koppel celklonters mechanisch in een eencellige suspensie met een serologische pipet van 10 ml. - Plaats de cellen op een 96-well plaat (~140.000-150.000 cellen/put) of een 384-well plaat (~45.000-50.000 cellen/put) bij 30-40% confluentie.
- Om één volledige plaat met 96 putten te plaatsen, voegt u 1,5 ml van de celsuspensie toe aan 18,5 ml van het kweekmedium in een conische buis van 50 ml. Voeg na het mengen 200 μL van de celsuspensie toe aan elk putje.
- Om een volledige plaat met 384 putten te plaatsen, voegt u 1 ml van de celsuspensie toe aan 17 ml van het kweekmedium in een conische buis van 50 ml. Voeg na het mengen 50 μL van de celsuspensie toe aan elk putje.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen klonten cellen zijn en dat afzonderlijke cellen gelijkmatig over elke put zijn verdeeld.
- Vervang het medium om de 2 dagen na het plateren. Als de cellen niet tegelijkertijd confluentie bereiken tussen verschillende putten, gooit u de plaat weg en herhaalt u stap 1.5.
- Eenmaal gezaaid, wacht tot de cellen binnen 3-5 dagen 100% confluentie bereiken. Verander het medium 24 uur voorafgaand aan de functionele studies.
2. Voorbereiding van de functionele assaybufferoplossing van CFTR
- Bereid de natriumvrije, chloridevrije bufferoplossing met de in tabel 1 vermelde reagentia.
- Voeg de reagentia toe aan weefselkweekkwaliteit, dubbel gedestilleerd H 2 O (ddH2O). Laat de reagentia oplossen (in een gesloten container om verdamping te voorkomen) door een nacht bij kamertemperatuur te roeren.
- Zodra de oplossing stabiel is, meet u de pH. Als de pH van de oplossing hoger is dan 7,4, voeg dan druppelsgewijs 1 M N-methyl-D-glucamine (NMDG)-oplossing toe om de pH op 7,4 te zetten.
OPMERKING: Pas de pH van de oplossing niet aan met HCl omdat de oplossing chloridevrij moet blijven. - Laat de oplossing nog 30 minuten mengen en meet de osmolariteit van de oplossing.
- Verminder de osmolariteit van de bufferoplossing tot een fysiologisch bereik van 300 ± 5 mOsm/kg.
- Filtreer en bewaar de bufferoplossing in steriele flessen.
OPMERKING: De oplossing kan tot 6 maanden bij 4 °C worden bewaard. Als u langer dan 6 maanden wordt bewaard, controleert u de pH en osmolariteit bij kamertemperatuur voor gebruik.
3. CFTR functionele assay
- Los de membraanpotentiaalkleurstof op in de natriumvrije, chloridevrije bufferoplossing (0,5 mg kleurstof/1 ml bufferoplossing) en verwarm deze tot 37 °C.
OPMERKING: Vermijd blootstelling van het membraanpotentiaal kleurstofpoeder aan licht. - Verwijder het kweekmedium uit Calu-3 of Caco-2 cel monolagen en voeg de kleurstofhoudende oplossing toe aan elke put (195 μL per put voor een 96-well plaat, 95 μL per put voor een 384-well plaat).
OPMERKING: Er kan maximaal 112 μL worden toegevoegd per put van 384-putplaten. - Laat de cellen de kleurstof gedurende 35 minuten laden bij 37 °C en 5% CO2.
- Verplaats de cellen, geladen met kleurstofoplossing, naar de fluorescentieplaatlezer. Neem fluorescentiemetingen vanaf de onderkant van de plaat, met excitatie = 530 ± 5 nm, emissie = 560 ± 5 nm
- Begin met het nemen van continue basislijnmetingen gedurende 5 minuten met intervallen van 30 s.
- Voeg 5 μL van een lage-concentratie oplossing van forskoline of DMSO toe aan elke put voor een uiteindelijke concentratie van 1 μM forskoline (1x). Neem een stimulatiemeting gedurende 20 minuten met metingen met intervallen van 15 s.
- Bereid voor het 96-well plaatformaat de lage concentratie (40 μM forskoline (1:25 verdunning)) oplossing van forskoline door 2 μL 1 mM forskoline (1.000x) stamoplossing of DMSO te verdunnen in 48 μL natriumvrije, chloridevrije bufferoplossing.
OPMERKING: De lage concentratie 40 μM forskoline wordt gevolgd door een tweede verdunning (1:40 verdunning) in de volgende stap voor een uiteindelijke concentratie van 1 μM forskolin. - Bereid voor het 384-well plaatformaat de oplossing met lage concentratie (20 μM forskoline (1:50 verdunning)) door 1 μL 1 mM (1.000x) forskoline-stamoplossing of DMSO te verdunnen in 49 μL natriumvrije, chloridevrije bufferoplossing.
OPMERKING: De lage concentratie 20 μM forskoline wordt gevolgd door een tweede verdunning (1:20 verdunning) in de volgende stap voor een uiteindelijke concentratie van 1 μM forskoline.
- Bereid voor het 96-well plaatformaat de lage concentratie (40 μM forskoline (1:25 verdunning)) oplossing van forskoline door 2 μL 1 mM forskoline (1.000x) stamoplossing of DMSO te verdunnen in 48 μL natriumvrije, chloridevrije bufferoplossing.
- Voeg 5 μL lage-concentratieoplossing van CFTRInh172 toe voor een eindconcentratie van 10 μM CFTRInh172. Neem een remmingsmeting gedurende 15 minuten met metingen met intervallen van 30 s.
- Bereid voor het 96-well plaatformaat de CFTRInh172-oplossing met lage concentratie (400 μM CFTRInh172 (1:25 verdunning)) door 2 μL van een 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stamoplossing te verdunnen in 48 μL natriumvrije, chloridevrije bufferoplossing.
OPMERKING: De lage concentratie 400 μM CFTRInh172 wordt gevolgd door een tweede verdunning (1:40 verdunning) in de volgende stap voor een uiteindelijke concentratie van 10 μM CFTRInh172. - Bereid voor het plaatformaat met 384 putten de CFTRInh172-oplossing met lage concentratie (200 μM CFTRInh172 (1:50 verdunning)) door 1 μL 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stamoplossing te verdunnen in 49 μL natriumvrije, chloridevrije bufferoplossing.
OPMERKING: De lage concentratie 200 μM CFTRInh172 wordt gevolgd door een tweede verdunning (1:20 verdunning) in de volgende stap voor een eindconcentratie van 10 μM CFTRInh172.
- Bereid voor het 96-well plaatformaat de CFTRInh172-oplossing met lage concentratie (400 μM CFTRInh172 (1:25 verdunning)) door 2 μL van een 10 mM CFTRInh172 (1.000x) stamoplossing te verdunnen in 48 μL natriumvrije, chloridevrije bufferoplossing.
- Kwantificeer de fluorescentie-intensiteitsmetingen van elke put en exporteer de waarden als een spreadsheet in kolomindeling met afzonderlijke putjes. Om forskoline-geïnduceerde veranderingen te berekenen, deelt u de RFU-metingen (Relative Fluorescence Units) van elke put van de 96- of 384-putplaat door de laatste fluorescentie-intensiteitsmeting van de basislijnmeting en plot u ze.
- Als alternatief, kwantificeer CFTRInh172-gemedieerde remmingsrespons om de specificiteit van CFTR-functie 12 beter te bevestigen, omdat acute behandeling met forskoline kan leiden tot membraandepolarisatie door de activiteit van andere chloridekanalen, zoals SLC26A912.
- Meet de piekresponsen als de maximale fluorescentie-intensiteitsmeting vanaf baseline tijdens forskolinestimulatie. Gebruik deze meting of dit gebied onder de curve om de CFTR-respons te kwantificeren.
4. Voorbereiding van de functionele assaybufferoplossing van ENaC
- Bereid de natriumrijke, chloridevrije bufferoplossing met de in tabel 2 vermelde reagentia.
- Zodra de oplossing stabiel is, meet u de pH. Als de pH van de oplossing lager is dan 7,4, voeg dan druppelsgewijs 1 N NaOH-oplossing toe om de pH op 7,4 te zetten.
OPMERKING: Pas de pH van de oplossing niet aan met HCl omdat de oplossing chloridevrij moet blijven. - Verminder de osmolariteit van de bufferoplossing tot een fysiologisch bereik van 300 ± 5 mOsm/kg.
- Filtreer en bewaar de bufferoplossing in steriele flessen bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.
OPMERKING: Als de opslag langer dan 6 maanden duurt, controleer dan voor gebruik de pH en osmolariteit bij kamertemperatuur.
5. ENaC functionele assay
- Los de membraanpotentiaalkleurstof op in de natriumrijke, chloridevrije bufferoplossing (0,5 mg kleurstof/1 ml bufferoplossing) en verwarm deze tot 37 °C.
OPMERKING: Vermijd blootstelling van het membraanpotentiaal kleurstofpoeder aan licht. - Verwijder het kweekmedium uit Calu-3 of Caco-2 cel monolagen en voeg de kleurstofbevattende oplossing toe aan elke put (195 μL per put voor 96-well platen, 95 μL per put voor 384-well platen).
OPMERKING: Stel de kleurstofoplossing niet bloot aan licht. - Laat de cellen kleurstof gedurende 35 minuten laden bij 37 °C en 5% CO2.
- Verplaats de cellen, geladen met kleurstofoplossing, naar de fluorescentieplaatlezer. Fluorescentiemetingen aflezen vanaf de onderkant van de plaat, met excitatie = 530 ± 5 nm, emissie = 560 ± 5 nm.
- Begin met het nemen van continue basislijnmetingen gedurende 5 minuten met intervallen van 30 s.
- Om de ENaC-functie te remmen, voegt u 5 μL amiloride met een lage concentratie oplossing of DMSO met een lage concentratie toe, opgelost in de natriumvrije chloridebufferoplossing met een hoog natriumgehalte voor een eindconcentratie van 10 μM amiloride.
- Bereid voor het 96-well plaatformaat de lage concentratie (400 μM amiloride (1:25 verdunning)) oplossing van amiloride door 2 μL 10 mM amiloride (1.000x) stamoplossing te verdunnen in 48 μL natriumrijke, chloridevrije bufferoplossing.
OPMERKING: De lage concentratie 400 μM amiloride wordt gevolgd door een tweede verdunning (1:40 verdunning) in de volgende stap voor een uiteindelijke concentratie van 10 μM amiloride. - Bereid voor het plaatformaat met 384 putten de lage-concentratie (200 μM amiloride (1:50 verdunning)) oplossing van amiloride door 1 μL 10 mM amiloride (1.000x) stamoplossing toe te voegen in 49 μL natriumrijke, chloridevrije bufferoplossing.
OPMERKING: De lage concentratie 200 μM amiloride wordt gevolgd door een tweede verdunning (1:20 verdunning) in de volgende stap voor een uiteindelijke concentratie van 10 μM amiloride.
- Bereid voor het 96-well plaatformaat de lage concentratie (400 μM amiloride (1:25 verdunning)) oplossing van amiloride door 2 μL 10 mM amiloride (1.000x) stamoplossing te verdunnen in 48 μL natriumrijke, chloridevrije bufferoplossing.
- Neem een remmingsmeting gedurende 60 minuten met metingen met intervallen van 45 s.
- Herhaal stap 3.7 voor gegevensanalyse.
- Meet de amiloriderespons als de procentuele remming vanaf baseline tot het punt van het plateau, ongeveer 15-20 minuten na toevoeging van amiloride. Gebruik dit verschil om de ENaC-respons te kwantificeren.
Representative Results
Om de CFTR-kanaalactiviteit te meten, worden goed gedifferentieerde, aangehechte cellen geïncubeerd in een extracellulaire oplossing zonder chloride die de membraanpotentiaalgevoelige kleurstof bevat. CFTR-functie wordt consequent gedetecteerd als membraandepolarisatie na forskolinestimulatie. Chloride-efflux wordt gedetecteerd als een sterke toename van fluorescentie in vergelijking met de voertuigbesturing. Het fluorescentiesignaal wordt gehandhaafd tot de toevoeging van CFTR-remmer (CFTRInh172), wat leidt tot een snelle afname van de fluorescentie-intensiteit, zoals te zien in Caco-2-cellen (figuur 1A), en is reproduceerbaar in zowel Caco-2- als Calu-3-cellen (figuur 1B). De beoordeling van CFTR-activiteit als het verschil in de maximale verandering in fluorescentie na forskoline of het DMSO (medium). Individuele punten varieerden tussen ± 3 standaardafwijkingen van de gemiddelde forskolinestimulatie (zwarte punten) of DMSO-controle (grijze punten), die overeenkwamen met een Z'-factor van 0,586. Deze uitstekende score gaf de reproduceerbaarheid van deze test aan (figuur 1C). In het geval dat er een kleine afwijking in de basislijn is, kan de impact van de drift worden geminimaliseerd door de basislijn te extrapoleren over het hele spoor na activering tot het punt van toevoeging van de remmer. De respons kan worden gekwantificeerd als het gebied onder de curve, waarbij de ondergrens wordt gedefinieerd door de geëxtrapoleerde lijn.
ENaC-activiteit kan ook worden gemeten in confluente luchtweg- en colonepitheelcellen die zijn gekweekt in 96-putplaten. In tegenstelling tot de test voor CFTR-kanaalactiviteit, worden deze cellen ondergedompeld in een natriumrijke oplossing, waardoor natriumabsorptie via ENaC mogelijk is. Met de acute toevoeging van amiloride wordt de natriumopname geblokkeerd en ervaren cellen relatieve membraanhyperpolarisatie. Dit wordt getoond in Caco-2-cellen bij zowel lage (10 μM) (figuur 2A) als hoge concentraties (50 μM) amiloride (figuur 2A,B) en in Calu-3-cellen met een hoge concentratie amiloride (50 μM) (figuur 2B). De ENaC-test werd uitgebreid tot een plaatformaat met 384 putten en toonde een grote reproduceerbaarheid in ENaC-remming. Evenzo varieerden de afzonderlijke punten tussen ± 3 standaardafwijkingen van de gemiddelde amilorideremming (zwarte punten) of DMSO-controle (grijze punten). De ENaC-respons in Calu-3-cellen rapporteerde een Z'-factor van 0,629 bij acute behandeling met amiloride (50 μM) (figuur 2C), wat aangeeft dat deze parameters screening met hoge doorvoer ondersteunen.
Figuur 1: CFTR-kanaalmeting als veranderingen in membraandepolarisatie in Caco-2- en Calu-3-cellen. (A) Representatief spoor van CFTR-stimulatie met forskoline (1 μM) en DMSO-controle in Caco-2-cellen. (B) Box en whisker plot van forskoline stimulatie in Caco-2 en Calu-3 cellen (**** P < 0,0001, n > 3 biologische replicaten, n > 3 technische replicaties). Biologische replicaties zijn onafhankelijke cellijnpassages; Technische replicaties verwijzen naar onafhankelijke putten van de multiwell-platen. Box plot geeft de mediaanwaarde weer; grenzen geven IQR weer, waarbij de snorharen de minima- en maximawaarden definiëren. (C) Bland-Altman plot van reproduceerbare CFTR-respons met forskolinestimulatie in vergelijking met DMSO-controle in Caco-2-cellen. Zwarte punten vertegenwoordigen maximale absolute veranderingen in fluorescentie als reactie op forskolinestimulatie. Grijze punten vertegenwoordigen veranderingen in fluorescentie als reactie op DMSO-controle. Afkortingen: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; DMSO = dimethylsulfoxide; IQR = interkwartielbereik; Fsk = forskoline; ΔF/F0 = verandering in fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: ENaC-remmingsmetingen door membraanhyperpolarisatie in Caco-2- en Calu-3-cellen. (A) Representatief spoor van ENaC-remming met amiloride (10 μM) ten opzichte van DMSO-controle in Caco-2-cellen. (B) Box en whisker plot van amiloride remming in Caco-2 en Calu-3 cellen (**** P < 0,0001, n > 3 biologische replicaten, n > 3 technische replicaties). (C) Bland-Altman plot van reproduceerbare ENaC-respons met amiloride-remming in vergelijking met DMSO-controle in Calu-3-cellen. Zwarte punten vertegenwoordigen maximale absolute veranderingen in fluorescentie als reactie op amiloride-remming. Grijze punten vertegenwoordigen veranderingen in fluorescentie als reactie op DMSO-controle. Afkortingen: ENaC = epitheliale natriumkanaal; DMSO = dimethylsulfoxide; Amil. = amiloride; ΔF/F0 = verandering in fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam | Concentratie |
| NMDG (N-Methyl-D-glucamine) | 150 mM |
| Gluconzuur Lacton | 150 mM |
| Kaliumgluconaat | 3 mM |
| HEPES | 10 mM |
Tabel 1: Reagentia en hun overeenkomstige concentraties voor cftr functionele assay met nul natrium en chloride. Afkorting: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.
| Naam | Concentratie |
| Natriumgluconaat | 150 mM |
| Kaliumgluconaat | 3 mM |
| HEPES | 10 mM |
Tabel 2: Reagentia en hun overeenkomstige concentraties voor ENaC functionele testbuffer met hoog natriumgehalte, nulchloride. Afkorting: ENaC = Epitheelnatrium (Na) Kanaal.
Discussion
Hier hebben we fluorescentie-gebaseerde methoden beschreven voor het meten van CFTR- en ENaC-activiteit in de epitheliale colorectale kankercellijn, Caco-2, en de menselijke epitheliale longkankercellijn, Calu-3. Deze membraanpotentiaaltests in epitheelcellijnen kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van modulatorverbindingen met kleine moleculen, eerder geïdentificeerd in heterologe expressiesystemen, te bevestigen, voorafgaand aan de uiteindelijke in vitro validatie in primaire van de patiënt afgeleide epitheelculturen.
Het is noodzakelijk om te bevestigen dat de bovenstaande metingen op de juiste manier worden toegeschreven aan het kanaal van belang. De meting toegeschreven aan CFTR moet bijvoorbeeld afhankelijkheid aantonen van CFTR-eiwitexpressie en de elektrochemische drijvende kracht van chloride, die wordt gemoduleerd door forskoline en de remmer CFTRInh-172. Evenzo kunnen de membraanpotentiaalveranderingen veroorzaakt door 10 μM amiloride worden toegeschreven aan ENaC, als ze afhankelijk zijn van ENaC-eiwitexpressie en een inwaartse natriumdrijvende kracht. Hoewel we deze eigenschappen van ENaC in MDCK-cellen na transfectie met alle drie de subeenheden van ENaC 2 hebben bevestigd, hebben we nog niet formeel bevestigd dat de amiloriderespons gemeten in Caco-2- en Calu-3-cellen wordt verleend door ENaC. Dit is vooral belangrijk, omdat amiloride de functie van de natrium-protonenwisselaar NHE3 naast ENaC13 kan moduleren. Het is denkbaar dat de amiloride-geïnduceerde hyperpolarisatie die in deze test wordt waargenomen, gedeeltelijk de indirecte effecten van intracellulaire verzuring op andere kanalen zou kunnen weerspiegelen. Om te bevestigen dat de amiloride-geïnduceerde hyperpolarisatie gemeten met behulp van deze membraanpotentiaalgevoelige kleurstof wordt verleend door ENaC in de bovenstaande cellijnen en meer complexe celsystemen, zoals iPSC-afgeleide weefsels, bevestigen we dat deze activiteit verloren gaat door een obligate ENaC-subeenheid (bèta) in deze lijnen uit te schakelen.
Het succes van deze testen vereist aandacht voor verschillende factoren. Ten eerste moeten de epitheelculturen samenvloeiend en goed gedifferentieerd zijn. Voor de meting van de CFTR- en ENaC-functie moeten ongeveer 145.000 cellen per put worden geplateerd in 96-putplaten of 45.000 cellen per put in 384-putplaten. Zodra de epitheelcellen confluentie bereiken (binnen 3-4 dagen na plating), laat 2-5 dagen differentiatie toe. Deze timing werd eerder bepaald op basis van maximale CFTR-eiwitexpressie door immunoblotting14. Evenzo werd de optimale timing bepaald voor functionele ENaC-expressie in beide cellijnen, Calu-3 en Caco-2.
Niet-confluente monolagen of celovergroei leidt tot een lage reproduceerbaarheid over technische replicaties. In gevallen waarin cellen in individuele putten niet tegelijkertijd samenvloeiing bereiken, moeten deze platen worden weggegooid. Bovendien kunnen onstabiele basislijnmetingen of gebrek aan stimulatieresponsen een indicatie zijn van slechte celkwaliteit, die van analyse moet worden uitgesloten. Verminderde reacties op de CFTR-activator, forskoline of de ENaC-remmer, amiloride, kunnen mogelijk het gebruik van overmatig gepasseerde cellenweerspiegelen 15. Hoewel dit geen probleem is voor Calu-3- en Caco-2-cellen, hechten andere cellen of weefsels mogelijk niet goed aan de platen en moeten de putten mogelijk vooraf worden gecoat. In eerdere studies werden bijvoorbeeld 2D-cholangiocytenculturen aan de platen bevestigd met behulp van collageencoating16. Als alternatief werd de hechting van 2D-darmweefsels verhoogd met behulp van Poly-L-Lysine2.
Verder is het bij het testen van de modulatie van ionkanalen door kleine moleculen met behulp van een op fluorescentie gebaseerde test van cruciaal belang dat potentiële artefacten die worden verleend door fluorescerende eigenschappen van de kleine moleculen worden aangepakt. Om de specificiteit van functionele responsen te bevestigen, kunnen membraanpotentiaaltests verder worden gevalideerd met behulp van conventionele elektrofysiologische methoden, zoals Ussing-studies17.
Na bevestiging dat de respons gedetecteerd door membraanpotentiaalgevoelige kleurstoffen specifiek wordt verleend door het kanaal van belang, hebben deze testen een enorm potentieel om veelbelovende modulatoren van epitheliale ionkanalen in hun relevante cellulaire context te valideren. Dit platform kan de kloof overbruggen tussen high-throughput modulatorschermen in heterologe expressiesystemen en tijdrovende, bio-elektrische metingen in moeilijk toegankelijke primaire weefsels.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen Christopher Fladd en SPARC BioCentre in het Hospital for Sick Children bedanken voor hun hulp bij het uitvoeren van de membraanpotentiaaltests die CFTR en ENaC meten. Dit werk werd ondersteund door het CFIT-programma met financiering van CF Canada en de Sick Kids Foundation. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese overheid via Genome Canada en het Ontario Genomics Institute (OGI-148). Deze studie werd gefinancierd door de regering van Ontario. S.X. werd ondersteund door de Canadian Association of Gastroenterology (CAG) Ph.D. Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
| EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
| FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
| HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
| Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
| Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
| Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |
References
- Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. NPJ Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
- Xia, S., et al. High-throughput functional analysis of CFTR and other apically localized proteins in iPSC-derived human intestinal organoids. Cells. 10 (12), 3419 (2021).
- Jiang, J. X., et al. A new platform for high-throughput therapy testing on iPSC-derived lung progenitor cells from cystic fibrosis patients. Stem Cell Reports. 16 (11), 2825-2837 (2021).
- Hu, J., et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: a vehicle for biopharmaceutical manufacturing, structural biology, and electrophysiology. Cells, Tissues, Organs. 205 (1), 1-8 (2018).
- Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (23), 9776-9795 (2014).
- Chen, M. X., et al. Validation and optimization of novel high-throughput assays for human epithelial sodium channels. Journal of Biomolecular Screening. 20 (2), 242-253 (2015).
- Maitra, R., Sivashanmugam, P., Warner, K. A rapid membrane potential assay to monitor CFTR function and inhibition. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1132-1137 (2013).
- Mall, M. A. ENaC inhibition in cystic fibrosis: potential role in the new era of CFTR modulator therapies. European Respiratory Journal. 56 (6), 2000946 (2020).
- Moore, P. J., Tarran, R. The epithelial sodium channel (ENaC) as a therapeutic target for cystic fibrosis lung disease. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 22 (8), 687-701 (2018).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Merkert, S., et al. High-throughput screening for modulators of CFTR activity based on genetically engineered cystic fibrosis disease-specific iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1389-1403 (2019).
- Bertrand, C. A., et al. The CFTR trafficking mutation F508del inhibits the constitutive activity of SLC26A9. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), 912-925 (2017).
- Frelin, C., et al. Amiloride and its analogs as tools to inhibit Na+ transport via the Na+ channel the Na+/H+ antiport and the Na+/Ca2+ exchanger. Biochimie. 70 (9), 1285-1290 (1988).
- Di Paola, M., et al. SLC6A14 is a genetic modifier of cystic fibrosis that regulates Pseudomonas aeruginosa attachment to human bronchial epithelial cells. mBio. 8 (6), 02073 (2017).
- Schiavi, S. C., et al. Biosynthetic and growth abnormalities are associated with high-level expression of CFTR in heterologous cells. American Journal of Physiology. 270, 341-351 (1996).
- Ogawa, M., et al. Generation of functional ciliated cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 12 (1), 6504 (2021).
- Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool. Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).
