Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von elektrogenen Membranproteinen durch Messung von Änderungen des Membranpotentials. Dieser Assay bietet eine Plattform für die funktionelle Auslesung mehrerer Ionenkanäle, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden.
Abstract
Fluoreszenzbasierte Studien eignen sich für Hochdurchsatz-Plate-Reader-Assays von Zellen in Kultur. Sie werden häufig für Wirkstoffforschungskampagnen eingesetzt, die auf rekombinante Ionenkanalproteine abzielen, die in Zellen wie HEK-293-Zellen überexprimiert werden. Es wird jedoch zunehmend Wert auf die Verwendung geweberelevanter Zelllinien gelegt, um die Auswirkungen von niedermolekularen Interventionen zu untersuchen. Das folgende Protokoll beschreibt die Adaption eines fluoreszenzbasierten Membranpotential-Assays für die Untersuchung von Ionenkanälen, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden. Der Membranpotential-Assay beschreibt einen Hochdurchsatz-Assay für die Chloridkanalaktivität des Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulators (CFTR) in zwei häufig untersuchten Epithelzelllinien, Caco-2 und Calu-3. Darüber hinaus beschreibt diese Arbeit eine neuartige Anwendung dieses Systems zur Messung der Aktivität des epithelialen Natriumkanals (ENaC) in einem Hochdurchsatzformat in denselben Epithelzelllinien. Zusammen bieten diese fluoreszenzbasierten Assays eine robuste und flexible Plattform für die Untersuchung von niedermolekularen Modulatoren, die auf zwei Epithelkanäle in einem relevanten zellulären Kontext abzielen.
Introduction
Fluoreszenzbasierte Hochdurchsatz-Aktivitätsassays von rekombinanten Kanalproteinen haben sich als hochwirksam bei der Identifizierung von niedermolekularen Modulatoren erwiesen, die das Potenzial haben, zukünftige Therapien zu werden 1,2,3,4. Eine gängige Methode zum Screening von Kleinmolekülbibliotheken auf Ionenkanalmodulatoren ist die Messung von Änderungen des Membranpotentials. Typischerweise werden diese Screenings unter Verwendung rekombinanter Kanäle durchgeführt, die heterolog in Zelllinien wie HEK-293-Zellen 5,6,7 exprimiert werden.
Es besteht jedoch Bedarf an der Validierung von "Treffern" in relevanten Zelltypen. Wir schlagen vor, dass ein sekundäres Screening in relevanten Zelllinien, die die interessierenden Kanäle endogen exprimieren, wünschenswert ist. Ein solches sekundäres Screening identifiziert diejenigen Modulatoren, die in abschließenden Validierungsassays, die auf weniger zugänglichem primärem menschlichem Gewebe beruhen, am wahrscheinlichsten wirksam sind.
Es besteht auch ein Bedarf an Assay-Systemen, die flexibel genug sind, um die Aktivität mehrerer Ionenkanalziele im selben Gewebetyp zu melden. Zum Beispiel gibt es substanzielle veröffentlichte Literatur, die das Konzept unterstützt, dass CFTR und ENaC funktionell interagieren 8,9,10. Obwohl mehrere gut untersuchte Epithelzelllinien bekannt sind, die sowohl CFTR als auch ENaC exprimieren, wurden die Assay-Bedingungen für die Untersuchung beider im Hochdurchsatz bisher nicht beschrieben.
Dieser fluoreszenzbasierte Membranpotential-Assay ist vielseitig einsetzbar, da er eine exogene chemische Sonde verwendet, um die Funktion von CFTR und ENaC zu messen, wodurch die Notwendigkeit genetisch kodierter Sondenumgangen wird 11. Als Beweis für das Prinzip werden zwei häufig verwendete Epithelzelllinien als Beispiele untersucht, um die kritischen Schritte aufzuzeigen, die für die Messung der Kanalaktivität sowohl von CFTR als auch von ENaC erforderlich sind.
Protocol
1. Zellplattierung und Differenzierung
- Kultivieren Sie Calu-3- und Caco-2-Zellen in EMEM, die 20 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen/Streptokokken) enthalten, in einem T-75-Kolben.
- Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80-100% erreicht haben, saugen Sie das Medium aus dem T-75-Kolben an.
- Waschen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Geben Sie 2 ml vorgewärmtes 0,25 % Trypsin/0,1 % EDTA in die Zellmonoschicht und stellen Sie den T-75-Kolben für ca. 5 Minuten bei 37 °C auf, damit sich die Zellen von der Oberfläche des Kultivierungskolbens abheben und in eine Einzelzellsuspension dissoziieren können.
- Sobald die Zellen von der Kolbenoberfläche abgehoben wurden, neutralisieren Sie die Reaktion mit 8 ml Nährmedium (Schritt 1.1), so dass insgesamt 10 ml Zellsuspension erhalten werden.
HINWEIS: Zellklumpen mit einer serologischen 10-ml-Pipette mechanisch zu einer Einzelzellsuspension dissoziieren. - Legen Sie die Zellen auf eine 96-Well-Platte (~140.000-150.000 Zellen/Well) oder eine 384-Well-Platte (~45.000-50.000 Zellen/Well) bei 30-40% Konfluenz.
- Um eine volle 96-Well-Platte zu plattieren, geben Sie 1,5 ml der Zellsuspension zu 18,5 ml des Nährmediums in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Geben Sie nach dem Mischen 200 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung.
- Um eine volle 384-Well-Platte zu plattieren, geben Sie 1 ml der Zellsuspension zu 17 ml des Nährmediums in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Geben Sie nach dem Mischen 50 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung.
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass keine Zellklumpen vorhanden sind und die einzelnen Zellen gleichmäßig über jede Vertiefung verteilt sind.
- Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage nach dem Plattieren. Wenn die Zellen nicht gleichzeitig die Konfluenz zwischen verschiedenen Vertiefungen erreichen, entsorgen Sie die Platte und wiederholen Sie Schritt 1.5.
- Warten Sie nach der Aussaat, bis die Zellen innerhalb von 3-5 Tagen eine 100%ige Konfluenz erreicht haben. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden vor den funktionellen Studien.
2. Herstellung der CFTR-Pufferlösung für funktionelle Assays
- Bereiten Sie die natrium- und chloridfreie Pufferlösung mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien vor.
- Fügen Sie die Reagenzien zu doppelt destilliertemH2O(ddH2O) in Gewebekulturqualität hinzu. Lassen Sie die Reagenzien auflösen (in einem geschlossenen Behälter, um eine Verdunstung zu vermeiden), indem Sie über Nacht bei Raumtemperatur umrühren.
- Sobald die Lösung stabil ist, messen Sie den pH-Wert. Wenn der pH-Wert der Lösung 7,4 überschreitet, fügen Sie 1 M N-Methyl-D-glucamin (NMDG)-Lösung tropfenweise hinzu, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.
Anmerkungen: Stellen Sie den pH-Wert der Lösung nicht mit HCl ein, da die Lösung chloridfrei bleiben muss. - Lassen Sie die Lösung weitere 30 Minuten mischen und messen Sie die Osmolarität der Lösung.
- Reduzieren Sie die Osmolarität der Pufferlösung auf einen physiologischen Bereich von 300 ± 5 mOsm/kg.
- Filtern und lagern Sie die Pufferlösung in sterilen Flaschen.
HINWEIS: Die Lösung kann bei 4 °C bis zu 6 Monate gelagert werden. Bei einer Lagerung von mehr als 6 Monaten ist vor der Verwendung der pH-Wert und die Osmolarität bei Raumtemperatur zu überprüfen.
3. CFTR-Funktionsassay
- Lösen Sie den Membranpotentialfarbstoff in der natriumfreien, chloridfreien Pufferlösung (0,5 mg Farbstoff/1 ml Pufferlösung) auf und erwärmen Sie ihn auf 37 °C.
Anmerkungen: Vermeiden Sie es, das Membranpotenzial-Farbstoffpulver Licht auszusetzen. - Entfernen Sie das Nährmedium von Calu-3- oder Caco-2-Zellmonolagen und geben Sie die farbstoffhaltige Lösung in jede Vertiefung (195 μl pro Well für eine 96-Well-Platte, 95 μl pro Well für eine 384-Well-Platte).
HINWEIS: Bis zu 112 μl können pro Well von 384-Well-Platten hinzugefügt werden. - Lassen Sie die Zellen den Farbstoff 35 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 beladen.
- Bewegen Sie die mit Farbstofflösung beladenen Zellen zum Fluoreszenzplattenleser. Führen Sie Fluoreszenzmessungen von der Unterseite der Platte durch, mit Anregung = 530 ± 5 nm, Emission = 560 ± 5 nm
- Beginnen Sie mit kontinuierlichen Basismessungen für 5 Minuten in Intervallen von 30 s.
- Geben Sie 5 μl einer niedrig konzentrierten Lösung von Forskolin oder DMSO in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von 1 μM Forskolin (1x) zu erreichen. Führen Sie 20 Minuten lang eine Stimulationsmessung mit Messungen in Intervallen von 15 s durch.
- Für das 96-Well-Plattenformat wird die niedrig konzentrierte (40 μM Forskolin (1:25 Verdünnung)) Lösung von Forskolin hergestellt, indem 2 μl 1 mM Forskolin (1.000x) Stammlösung oder DMSO in 48 μl natriumfreier, chloridfreier Pufferlösung verdünnt werden.
HINWEIS: Auf das niedrig konzentrierte 40 μM Forskolin folgt im nächsten Schritt eine zweite Verdünnung (1:40 Verdünnung) für eine Endkonzentration von 1 μM Forskolin. - Für das 384-Well-Plattenformat bereiten Sie die niedrig konzentrierte (20 μM Forskolin (1:50 Verdünnung)) Lösung vor, indem Sie 1 μl 1 mM (1.000x) Forskolin-Stammlösung oder DMSO in 49 μl natriumfreier, chloridfreier Pufferlösung verdünnen.
HINWEIS: Auf das niedrig konzentrierte 20 μM Forskolin folgt im nächsten Schritt eine zweite Verdünnung (1:20 Verdünnung) für eine Endkonzentration von 1 μM Forskolin.
- Für das 96-Well-Plattenformat wird die niedrig konzentrierte (40 μM Forskolin (1:25 Verdünnung)) Lösung von Forskolin hergestellt, indem 2 μl 1 mM Forskolin (1.000x) Stammlösung oder DMSO in 48 μl natriumfreier, chloridfreier Pufferlösung verdünnt werden.
- Fügen Sie 5 μl niedrig konzentrierte Lösung von CFTRInh172 hinzu, um eine Endkonzentration von 10 μM CFTRInh172 zu erhalten. Nehmen Sie eine Hemmungsmessung für 15 Minuten mit Messungen in Intervallen von 30 s vor.
- Für das 96-Well-Plattenformat bereiten Sie die CFTRInh172-Lösung mit niedriger Konzentration (400 μM CFTRInh172 (1:25 Verdünnung)) vor, indem Sie 2 μl einer 10 mM CFTRInh172 (1.000x) Stammlösung in 48 μl natriumfreier, chloridfreier Pufferlösung verdünnen.
HINWEIS: Auf das niedrig konzentrierte 400 μM CFTRInh172 folgt im nächsten Schritt eine zweite Verdünnung (1:40 Verdünnung) für eine Endkonzentration von 10 μM CFTRInh172. - Für das 384-Well-Plattenformat bereiten Sie die CFTRInh172-Lösung mit niedriger Konzentration (200 μM CFTRInh172 (1:50 Verdünnung)) vor, indem Sie 1 μl der 10 mM CFTRInh172 (1.000x) Stammlösung in 49 μl natriumfreier, chloridfreier Pufferlösung verdünnen.
HINWEIS: Auf das niedrig konzentrierte 200 μM CFTRInh172 folgt im nächsten Schritt eine zweite Verdünnung (1:20 Verdünnung) für eine Endkonzentration von 10 μM CFTRInh172.
- Für das 96-Well-Plattenformat bereiten Sie die CFTRInh172-Lösung mit niedriger Konzentration (400 μM CFTRInh172 (1:25 Verdünnung)) vor, indem Sie 2 μl einer 10 mM CFTRInh172 (1.000x) Stammlösung in 48 μl natriumfreier, chloridfreier Pufferlösung verdünnen.
- Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensitätsmessungen der einzelnen Wells und exportieren Sie die Werte als Tabelle im Spaltenformat, die einzelne Wells enthält. Um die Forskolin-induzierten Änderungen zu berechnen, dividieren Sie die RFU-Messungen (Relative Fluorescence Units) aus jedem Well der 96- oder 384-Well-Platte durch die letzte Fluoreszenzintensitätsmessung des Baseline-Messwerts und zeichnen Sie sie auf.
- Alternativ kann die CFTRInh172-vermittelte Inhibitionsantwort quantifiziert werden, um die Spezifität der CFTR-Funktionbesser zu bestätigen 12, da eine akute Behandlung mit Forskolin durch die Aktivität anderer Chloridkanäle, wie z. B. SLC26A912, zu einer Depolarisation der Membran führen kann.
- Messen Sie die Peak-Antworten als maximale Fluoreszenzintensitätsmessung vom Ausgangswert während der Forskolin-Stimulation. Verwenden Sie diese Messung oder diesen Bereich unter der Kurve, um die CFTR-Antwort zu quantifizieren.
4. Herstellung der ENaC-Funktionsassay-Pufferlösung
- Die chloridfreie Pufferlösung mit hohem Natriumgehalt wird mit den in Tabelle 2 aufgeführten Reagenzien hergestellt.
- Sobald die Lösung stabil ist, messen Sie den pH-Wert. Wenn der pH-Wert der Lösung unter 7,4 liegt, fügen Sie 1 N NaOH-Lösung tropfenweise hinzu, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.
Anmerkungen: Stellen Sie den pH-Wert der Lösung nicht mit HCl ein, da die Lösung chloridfrei bleiben muss. - Reduzieren Sie die Osmolarität der Pufferlösung auf einen physiologischen Bereich von 300 ± 5 mOsm/kg.
- Filtrieren und lagern Sie die Pufferlösung in sterilen Flaschen bei 4 °C bis zu 6 Monate.
Anmerkungen: Wenn die Lagerung länger als 6 Monate dauert, überprüfen Sie vor Gebrauch den pH-Wert und die Osmolarität bei Raumtemperatur.
5. ENaC-Funktionsassay
- Lösen Sie den Membranpotentialfarbstoff in der natriumreichen, chloridfreien Pufferlösung (0,5 mg Farbstoff/1 ml Pufferlösung) auf und erwärmen Sie ihn auf 37 °C.
Anmerkungen: Vermeiden Sie es, das Membranpotenzial-Farbstoffpulver Licht auszusetzen. - Entfernen Sie das Nährmedium aus Calu-3- oder Caco-2-Zellmonolagen und geben Sie die farbstoffhaltige Lösung in jede Vertiefung (195 μl pro Vertiefung für 96-Well-Platten, 95 μl pro Well für 384-Well-Platten).
Anmerkungen: Vermeiden Sie es, die Farbstofflösung Licht auszusetzen. - Lassen Sie die Zellen 35 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 beladen.
- Bewegen Sie die mit Farbstofflösung beladenen Zellen zum Fluoreszenzplattenleser. Lesen Sie Fluoreszenzmessungen von der Unterseite der Platte ab, mit Anregung = 530 ± 5 nm, Emission = 560 ± 5 nm.
- Beginnen Sie mit kontinuierlichen Basismessungen für 5 Minuten in Intervallen von 30 s.
- Um die ENaC-Funktion zu hemmen, fügen Sie 5 μl niedrig konzentrierte Lösung Amilorid oder niedrig konzentrierte Lösung DMSO hinzu, die in der chloridfreien Pufferlösung mit hohem Natriumgehalt gelöst ist, um eine Endkonzentration von 10 μM Amilorid zu erreichen.
- Für das 96-Well-Plattenformat wird die niedrig konzentrierte (400 μM Amilorid (1:25 Verdünnung)) Lösung von Amilorid hergestellt, indem 2 μl 10 mM Amilorid (1.000x) Stammlösung in 48 μl chloridfreier Pufferlösung mit hohem Natriumgehalt verdünnt werden.
HINWEIS: Dem niedrig konzentrierten 400 μM Amilorid folgt im nächsten Schritt eine zweite Verdünnung (1:40 Verdünnung) für eine Endkonzentration von 10 μM Amilorid. - Für das 384-Well-Plattenformat wird die niedrig konzentrierte (200 μM Amilorid (1:50 Verdünnung)) Amiloridlösung hergestellt, indem 1 μl 10 mM Amilorid (1.000x) Stammlösung in 49 μl chloridfreie Pufferlösung mit hohem Natriumgehalt gegeben wird.
HINWEIS: Dem niedrig konzentrierten 200 μM Amilorid folgt im nächsten Schritt eine zweite Verdünnung (1:20 Verdünnung) für eine Endkonzentration von 10 μM Amilorid.
- Für das 96-Well-Plattenformat wird die niedrig konzentrierte (400 μM Amilorid (1:25 Verdünnung)) Lösung von Amilorid hergestellt, indem 2 μl 10 mM Amilorid (1.000x) Stammlösung in 48 μl chloridfreier Pufferlösung mit hohem Natriumgehalt verdünnt werden.
- Nehmen Sie 60 Minuten lang eine Hemmungsmessung mit Messungen in Intervallen von 45 s vor.
- Wiederholen Sie Schritt 3.7 für die Datenanalyse.
- Messen Sie die Amiloridantwort als prozentuale Hemmung vom Ausgangswert bis zum Punkt des Plateaus, etwa 15-20 Minuten nach der Zugabe von Amilorid. Verwenden Sie diese Differenz, um die ENaC-Antwort zu quantifizieren.
Representative Results
Um die Aktivität des CFTR-Kanals zu messen, werden gut differenzierte, adhäsierte Zellen in einer chloridfreien extrazellulären Lösung inkubiert, die den membranpotentialempfindlichen Farbstoff enthält. Die CFTR-Funktion wird konsequent als Membrandepolarisation nach Forskolin-Stimulation nachgewiesen. Der Chloridausfluss wird als starker Anstieg der Fluoreszenz im Vergleich zur Fahrzeugsteuerung detektiert. Das Fluoreszenzsignal wird bis zur Zugabe von CFTR-Inhibitor (CFTRInh172) aufrechterhalten, was zu einer schnellen Abnahme der Fluoreszenzintensität führt, wie sie in Caco-2-Zellen beobachtet wird (Abbildung 1A), und ist sowohl in Caco-2- als auch in Calu-3-Zellen reproduzierbar (Abbildung 1B). Die Bewertung der CFTR-Aktivität als Differenz in der maximalen Fluoreszenzänderung nach Forskolin oder dem DMSO (Vehikel). Die einzelnen Punkte lagen zwischen ± 3 Standardabweichungen von der mittleren Forskolin-Stimulation (schwarze Punkte) oder der DMSO-Kontrolle (graue Punkte), was einem Z'-Faktor von 0,586 entsprach. Dieses hervorragende Ergebnis deutet auf die Reproduzierbarkeit dieses Assays hin (Abbildung 1C). Falls es eine geringfügige Drift in der Baseline gibt, können die Auswirkungen der Drift minimiert werden, indem die Baseline über die gesamte Kurve nach der Aktivierung bis zum Punkt der Inhibitorzugabe extrapoliert wird. Die Antwortvariable kann als Fläche unter der Kurve quantifiziert werden, wobei die untere Grenze durch die extrapolierte Linie definiert wird.
Die ENaC-Aktivität kann auch in konfluenten Atemwegs- und Dickdarmepithelzellen gemessen werden, die in 96-Well-Platten gezüchtet wurden. Im Gegensatz zum Test auf CFTR-Kanalaktivität werden diese Zellen in eine natriumhaltige Lösung getaucht, die eine Natriumabsorption durch ENaC ermöglicht. Durch die akute Zugabe von Amilorid wird die Natriumaufnahme blockiert und die Zellen erfahren eine relative Hyperpolarisation der Membran. Dies zeigt sich in Caco-2-Zellen sowohl bei niedrigen (10 μM) (Abbildung 2A) als auch bei hohen Konzentrationen (50 μM) von Amilorid (Abbildung 2A,B) und in Calu-3-Zellen mit einer hohen Konzentration von Amilorid (50 μM) (Abbildung 2B). Der ENaC-Assay wurde auf ein 384-Well-Plattenformat erweitert und zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit bei der ENaC-Inhibition. Ebenso lagen die einzelnen Punkte zwischen ± 3 Standardabweichungen von der mittleren Amilorid-Hemmung (schwarze Punkte) bzw. DMSO-Kontrolle (graue Punkte). Die ENaC-Antwort in Calu-3-Zellen ergab einen Z'-Faktor von 0,629 bei einer Akutbehandlung mit Amilorid (50 μM) (Abbildung 2C), was darauf hindeutet, dass diese Parameter ein Hochdurchsatz-Screening unterstützen.
Abbildung 1: CFTR-Kanalmessung als Änderungen der Membrandepolarisation in Caco-2- und Calu-3-Zellen. (A) Repräsentative Spur der CFTR-Stimulation mit Forskolin (1 μM) und DMSO-Kontrolle in Caco-2-Zellen. (B) Box-and-Whisker-Diagramm der Forskolin-Stimulation in Caco-2- und Calu-3-Zellen (**** P < 0,0001, n > 3 biologischen Replikaten, n > 3 technischen Replikaten). Biologische Replikate sind unabhängige Zelllinienpassagen; Technische Replikate beziehen sich auf unabhängige Wells der Multiwell-Platten. Boxplot stellt den Medianwert dar. Die Grenzen stellen den IQR dar, wobei die Whisker die Minima- und Maxima-Werte definieren. (C) Bland-Altman-Diagramm der reproduzierbaren CFTR-Antwort mit Forskolin-Stimulation im Vergleich zur DMSO-Kontrolle in Caco-2-Zellen. Schwarze Punkte stellen maximale absolute Änderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf die Forskolin-Stimulation dar. Graupunkte stellen Änderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf die DMSO-Kontrolle dar. Abkürzungen: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; DMSO = Dimethylsulfoxid; IQR = Interquartilsabstand; Fsk = forskolin; ΔF/F0 = Änderung der Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: ENaC-Inhibitionsmessungen durch Membranhyperpolarisation in Caco-2- und Calu-3-Zellen. (A) Repräsentative Spur der ENaC-Inhibition mit Amilorid (10 μM) im Vergleich zur DMSO-Kontrolle in Caco-2-Zellen. (B) Box-and-Whisker-Diagramm der Amilorid-Hemmung in Caco-2- und Calu-3-Zellen (**** P < 0,0001, n > 3 biologische Replikate, n > 3 technische Replikate). (C) Bland-Altman-Diagramm der reproduzierbaren ENaC-Antwort mit Amilorid-Inhibition im Vergleich zur DMSO-Kontrolle in Calu-3-Zellen. Schwarzpunkte stellen maximale absolute Änderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf die Hemmung von Amilorid dar. Graupunkte stellen Änderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf die DMSO-Kontrolle dar. Abkürzungen: ENaC = epithelialer Natriumkanal; DMSO = Dimethylsulfoxid; Amil. = Amilorid; ΔF/F0 = Änderung der Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Name | Konzentration |
| NMDG (N-Methyl-D-glucamin) | 150 mM |
| Gluconsäure-Lacton | 150 mM |
| Kaliumgluconat | 3 mM |
| HEPES | 10 mM |
Tabelle 1: Reagenzien und ihre entsprechenden Konzentrationen für den CFTR-Funktionsassay ohne Natrium und Chlorid. Abkürzung: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.
| Name | Konzentration |
| Natriumgluconat | 150 mM |
| Kaliumgluconat | 3 mM |
| HEPES | 10 mM |
Tabelle 2: Reagenzien und ihre entsprechenden Konzentrationen für ENaC-Funktionsassay-Puffer mit hohem Natriumgehalt, chloridfrei. Abkürzung: ENaC = Epithelial sodium (Na) Channel.
Discussion
In dieser Arbeit haben wir fluoreszenzbasierte Methoden zur Messung der CFTR- und ENaC-Aktivität in der epithelialen Darmkrebszelllinie Caco-2 und der humanen epithelialen Lungenkrebszelllinie Calu-3 beschrieben. Diese Membranpotential-Assays in Epithelzelllinien können verwendet werden, um die Wirksamkeit von niedermolekularen Modulatorverbindungen, die zuvor in heterologen Expressionssystemen identifiziert wurden, vor der endgültigen In-vitro-Validierung in primären Epithelkulturen von Patienten zu bestätigen.
Es muss unbedingt bestätigt werden, dass die oben genannten Messungen dem interessierenden Kanal angemessen zugeordnet werden. Zum Beispiel sollte die Messung, die CFTR zugeschrieben wird, eine Abhängigkeit von der CFTR-Proteinexpression und der elektrochemischen Antriebskraft von Chlorid zeigen, die durch Forskolin und den Inhibitor CFTRInh-172 moduliert wird. In ähnlicher Weise können die durch 10 μM Amiloride verursachten Membranpotentialänderungen auf ENaC zurückgeführt werden, wenn sie von der ENaC-Proteinexpression und einer nach innen gerichteten Natriumantriebskraft abhängen. Obwohl wir diese Eigenschaften von ENaC in MDCK-Zellen nach Transfektion mit allen drei Untereinheiten von ENaC 2 bestätigt haben, haben wir noch nicht formal bestätigt, dass die in Caco-2- und Calu-3-Zellen gemessene Amiloridantwort durch ENaC vermittelt wird. Dies ist besonders wichtig, da Amilorid neben ENaC13 auch die Funktion des Natrium-Proton-Austauschers NHE3 modulieren kann. Es ist denkbar, dass die in diesem Assay beobachtete Amilorid-induzierte Hyperpolarisation teilweise die indirekten Effekte der intrazellulären Ansäuerung auf andere Kanäle widerspiegelt. Um zu bestätigen, dass die Amilorid-induzierte Hyperpolarisation, die mit diesem membranpotentialsensitiven Farbstoff gemessen wurde, durch ENaC in den oben genannten Zelllinien und komplexeren Zellsystemen, wie z.B. aus iPSC-abgeleiteten Geweben, übertragen wird, bestätigen wir, dass diese Aktivität verloren geht, indem eine obligate ENaC-Untereinheit (beta) in diesen Linien ausgeschaltet wird.
Der Erfolg dieser Assays erfordert die Beachtung mehrerer Faktoren. Zunächst müssen die Epithelkulturen konfluent und gut differenziert sein. Für die Messung der CFTR- und ENaC-Funktion sollten ca. 145.000 Zellen pro Well in 96-Well-Platten oder 45.000 Zellen pro Well in 384-Well-Platten plattiert werden. Sobald die Epithelzellen die Konfluenz erreicht haben (innerhalb von 3-4 Tagen nach der Beschichtung), warten Sie 2-5 Tage der Differenzierung. Dieser Zeitpunkt wurde zuvor anhand der maximalen CFTR-Proteinexpression durch Immunoblotting14 bestimmt. In ähnlicher Weise wurde das optimale Timing für die funktionelle ENaC-Expression in beiden Zelllinien, Calu-3 und Caco-2, bestimmt.
Nichtkonfluente Monoschichten oder Zellüberwucherung führen zu einer geringen Reproduzierbarkeit über technische Replikate hinweg. In Fällen, in denen Zellen in einzelnen Vertiefungen nicht gleichzeitig Konfluenz erreichen, sollten diese Platten verworfen werden. Darüber hinaus können instabile Ausgangswerte oder fehlende Stimulationsreaktionen ein Hinweis auf eine schlechte Zellqualität sein, die von der Analyse ausgeschlossen werden muss. Ein vermindertes Ansprechen auf den CFTR-Aktivator Forskolin oder den ENaC-Inhibitor Amilorid könnte möglicherweise auf die Verwendung von übermäßig passageierten Zellen zurückzuführensein 15. Obwohl dies für Calu-3- und Caco-2-Zellen kein Problem darstellt, haften andere Zellen oder Gewebe möglicherweise nicht gut an den Platten und erfordern möglicherweise eine Vorbeschichtung der Wells. In früheren Studien wurden beispielsweise 2D-Cholangiozytenkulturen mit einer Kollagenbeschichtung auf die Platten aufgebracht16. Alternativ wurde die Adhärenz von 2D-Darmgewebe mit Poly-L-Lysin2 erhöht.
Darüber hinaus ist es bei der Prüfung der Modulation von Ionenkanälen durch kleine Moleküle mit einem fluoreszenzbasierten Assay von entscheidender Bedeutung, dass potenzielle Artefakte, die durch die Fluoreszenzeigenschaften der kleinen Moleküle entstehen, berücksichtigt werden. Um die Spezifität funktioneller Antworten zu bestätigen, können Membranpotential-Assays mit konventionellen elektrophysiologischen Methoden, wie z.B. Ussing-Studien17, weiter validiert werden.
Nachdem bestätigt wurde, dass die von membranpotentialsensitiven Farbstoffen detektierte Antwort spezifisch durch den zu untersuchenden Kanal vermittelt wird, haben diese Assays ein enormes Potenzial, vielversprechende Modulatoren von epithelialen Ionenkanälen in ihrem relevanten zellulären Kontext zu validieren. Diese Plattform kann die Lücke zwischen Hochdurchsatz-Modulator-Screens in heterologen Expressionssystemen und zeitaufwändigen, bioelektrischen Messungen in schwer zugänglichen Primärgeweben schließen.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Christopher Fladd und dem SPARC BioCentre am Hospital for Sick Children für ihre Hilfe bei der Durchführung der Membranpotential-Assays zur Messung von CFTR und ENaC. Diese Arbeit wurde durch das CFIT-Programm mit Mitteln von CF Canada und der Sick Kids Foundation unterstützt. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Regierung über Genome Canada und das Ontario Genomics Institute (OGI-148) finanziert. Diese Studie wurde von der Regierung von Ontario finanziert. S.X. wurde durch das Ph.D.-Stipendium der Canadian Association of Gastroenterology (CAG) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiloride | Spectrum Chemical | TCI-A2599-5G | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| CFTRInh-172 | CF Foundation Therapeutics | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C | |
| EMEM, 1xs | Wisent | 320-005-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-450 | |
| FLIPR Membrane Potential Dye | Molecular Devices | R8042 | Stored at 4 °C |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F3917 | Dissolved in DMSO and stored at -20 °C |
| Gluconic acid lactone or (D-(+)-Gluconic acid δ-lactone) | Sigma-Aldrich | G4750 | Stored at room temperature |
| HEPES | Bioshop | HEP001.5 | Stored at room temperature |
| Human Bronchial Adenocarcinoma Cell Line (Calu-3) | ATCC | HTB-55 | |
| Human Epithelial Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (Caco-2) | ATCC | HTB-37 | |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | Stored at room temperature |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-200-EL | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | Stored at room temperature |
| Sodium Gluconate | Sigma-Aldrich | G9005 | Stored at room temperature |
References
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