Summary
在这里，我们提出了一种方案，在低强度的蓝光和紫光照射下，用黄素单核苷酸（FMN）光解过程中产生的活性氧灭活致病菌。FMN光解被证明是一种简单而安全的卫生过程方法。
Abstract
核黄素-5'-磷酸（或黄素单核苷酸;FMN）对可见光敏感。各种化合物，包括活性氧（ROS），可以在用可见光照射时通过FMN光解产生。FMN光解产生的ROS对微生物有害，包括金黄色葡萄球菌（S. aureus）等致病菌。本文提出了一种在可见光照射下通过涉及FMN的光化学反应使金黄色葡萄球菌失活的方案。FMN光解过程中产生的超氧自由基阴离子（）通过硝基蓝四唑（
NBT）还原进行评估。归因于反应性物种的金黄色葡萄球菌的微生物活力用于确定该过程的有效性。细菌灭活率与FMN浓度成正比。紫光比蓝光照射更有效地灭活金黄色葡萄球菌，而红光或绿光不驱动FMN光解。本文展示了FMN光解作为一种简单安全的卫生过程方法。
Introduction
核黄素-5′-磷酸（FMN）是通过核黄素侧链的核黄素5′-位置磷酸化形成的，并且是许多细胞过程产生能量所必需的所有黄素蛋白。它还对人体的某些功能起着维生素的作用1。FMN在水中的溶解度大约是核黄素2的200倍。
细菌的抗菌光动力灭活（aPDI）是控制对细菌3，4耐药性的有效方法，因为它不依赖于细菌耐药性的模式。临床上，aPDI用于治疗软组织感染，以减少由于多重耐药细菌5，6，7，8，9引起的院内皮肤感染。aPDI还通过产生活性氧（ROS）产生细胞死亡。ROS，如超氧自由基（）、单线态氧、羟基自由基（
•OH）和过氧自由基，是自由基或含有活性氧10，11，12的分子，通常具有活性13。与ROS引起的DNA损伤类似，膜过氧化和内皮细胞破坏也是细胞中ROS引起的不良生化反应12。
aPDI用于病原菌涉及在化合物存在下使用可见光或紫外光源灭活微生物，例如甲基氯化亚砜14、PEI-c e6共轭物15、卟啉16、二氧化钛17、甲苯胺蓝O 18和氧化锌纳米颗粒19。甲苯胺蓝O和亚甲蓝是吩噻嗪染料，亚甲蓝具有毒性。氧化锌纳米颗粒和紫外线照射与不利的健康和环境影响有关。因此，在可见光照射下通过光解开发可靠、安全、简单的光敏剂值得进一步研究。
微量营养素核黄素或FMN无毒，确实用于食品制造或喂养20。FMN和核黄素都对光照射高度敏感2。在紫外1，2，21，22，23和蓝光照射10，24下，这两种化合物达到激发态。通过光解产生的活化核黄素或FMN被提升到其三重态，同时产生ROS2，25。Kumar等人报告说，被紫外光激活的核黄素选择性地导致病原微生物中DNA的鸟嘌呤部分损伤增加26。在紫外光照射下，光动力激活的核黄素被证明可以促进双链DNA中8-OH-dG的产生，8-OH-dG是氧化应激的生物标志物27。据报道，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在核黄素或FMN光解过程中被ROS灭活10，24，28。作者先前的一项研究表明，涉及核黄素和FMN的光解反应减少了结晶紫，一种三芳基甲烷染料和产生抗菌剂，并消除了结晶紫28的大部分抗菌能力。当黄素腺嘌呤二核苷酸或FMN被蓝光照射时，产生的ROS在HeLa细胞中产生细胞凋亡，以便在体外中毒29。在核黄素存在下使用光化学处理，Cui等人通过抑制淋巴细胞的增殖和细胞因子产生来灭活淋巴细胞30。
核黄素的光解用于紫外线10，24灭活血液病原体，但在紫外线照射下血液成分会受损30。另据报道，暴露于紫外线的血小板逐渐增强其膜上激活标志物P-选择素和LIMP-CD63的性能。需要研究紫外线和高强度照射的细胞毒性，在涉及可见光的FMN光反应期间简单且安全的光敏剂将非常有用。
波长较短的光具有更多的能量，并且更有可能对细胞造成严重损害。然而，在合适的光敏剂存在下，用低强度紫光照射可以抑制病原微生物。因此，当用紫光照射时，FMN的光敏化和产生对于研究非常重要，以确定FMN光 解的ROS增加细菌灭活的途径。
抗菌控制是一个常见问题，新抗生素的开发通常需要数十年时间。用紫光照射后，以FMN介导的光灭活可以消灭环境致病菌。本研究提出了一种有效的体 外 抗菌方案，使用紫光驱动FMN光解，从而产生 aPDI。 金黄色葡萄球菌 的微生物活力用于确定FMN诱导的aPDI的可行性。
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Protocol
1. 光解系统设置
- 如图 1 所示，在不透明的塑料杯（8厘米×7厘米）的内侧安装六个发光二极管（LED）（DC 12 V），以建立光解系统31。
- 将反应物（见下文）添加到玻璃试管（直径13 mm，高度100 mm）中，并将试管固定在杯子顶部，如图 1所示。将实验装置放置在稳定温度为25±3°C的房间中。
- 通过红外测温仪在整个光解反应过程中监测和记录测试单元的温度。
注意： 图2 显示了使用校准的紫外-可见光谱仪记录的蓝色，绿色，红色和紫色光的发射光谱。对应于蓝色吸光度最大值的波长， 绿色， 红色， 和紫色 LED 灯在研究中使用的分别为 465、529、632 和 405 nm.LED芯片可以在辐照实验期间加热设备。因此，每个实验中的整个光反应系统被放置在温度保持在25±3°C的房间中。
2.光波长对FMN光解的影响（图3）
- 在 100 mM 磷酸钾缓冲液 （PB） （pH 7.8） 中制备 0.1 mM FMN 溶液。将 FMN 样品（每个 3 mL）暴露在强度为 10 W/m 2 的蓝色、绿色、红色或紫光下 5 分钟。将 3 mL FMN 溶液置于黑暗中作为对照。
- 使用紫外/可见分光光度计记录250-750nm范围内辐照FMN样品的吸光度。
3.硝基蓝四唑（NBT）还原法检测 （图4）。
注意：这里使用的NBT还原方法从核黄素光反应的测定中略有修改。NBT还原法用于评估FMN光解产生的水平 。光化学激发的FMN首先被L-蛋氨酸还原成半醌，然后向氧提供电子，产生 31。生成的 NBT还原为formazan，其在560nm32处具有特征吸光度。
- 将 109.3 mg L-蛋氨酸加入 73.3 mL PB （100 mM;pH 7.8） 中。涡旋溶液以溶解L-蛋氨酸。
- L-蛋氨酸完全溶解后，向溶液中加入10mgNBT粉末和1.53mL0.117mM FMN。对于每 1 mL 的反应溶液（即 FMN、L-蛋氨酸和 NBT 的混合物），FMN、蛋氨酸和 NBT 的最终浓度分别为 2.4 x 10-6 M、1.0 x 10-2 M 和 1.6 x 10-4 M。
- 将反应溶液（1mL）暴露于10W/ m 2 的蓝色或紫色LED光照射下1-5分钟。
- 检测
由光化学反应产生的物质（来自560nm处的吸光度），其减少NBT并产生甲马赞。
4. FMN光解后的 金黄色葡萄球菌 活力（图5）
- 将 金黄色葡萄球菌菌落 （BCRC 10451） 从培养板转移到 15 mL 螺旋盖试管中采集的 10 mL 溶原肉汤中。在37°C的摇床中培养16小时。
- 将 0.5 mL 培养物转移到 1.5 mL 离心管中。将灭菌水加入离心管中，将培养物稀释至600nm处的0.5光密度（OD600）（~6 x 107 CFU/mL）。
- 将0.5mL培养物转移到1.5mL离心管中，以14，000× g 离心10分钟，倒出上清液以获得细胞沉淀。
- 将 1 mL FMN 缓冲溶液（30、60 和 120 μM FMN 以 PB 为单位）加入到步骤 4.3 中获得的细胞沉淀中，并涡旋。对于辐照对照，单独添加 1 mL PB。
- 将单独含有30μM FMN和PB的活细菌细胞溶液的每种1mL转移到玻璃管中，并用10W / m2 的紫光照射它们30分钟。
- 将单独含有 30、60 和 120 μM FMN 和 PB 的活细菌细胞溶液各转移 1 mL 到玻璃管中，并用 20 W/m2 的蓝光照射它们 120 分钟。用含有 120 μM FMN 的 1 mL 活细菌细胞溶液设置另一个玻璃管，并用 20 W/m2 的蓝光照射 60 分钟。
- 按照步骤4.5和4.6中的说明设置试管，并用厚铝箔覆盖它们。这些管子用作暗控。
- 在30-120分钟的照射期间，将辐照室（以及黑暗对照）保持在9±1°C的冷藏室中。
注意：LED灯释放的热量不容忽视，因为放置在杯子内的LED芯片可以在辐照实验期间加热光反应系统。因此，实验在保持在9±1°C的冷藏室中进行。 - 照射后，将0.2 mL从每种反应溶液转移到卢里亚琼脂（LA）平板上。用L形玻璃棒将细菌散布在板上，并在37°C下孵育过夜。
- 计算过夜生长后 金黄色葡萄球菌 的活菌数和灭活率。
注意： 金黄色葡萄球菌 的灭活率计算为减少百分比，等于[1 -I / D]×100%，其中 I 和 D 分别表示辐照样品和暗对照中的CFU数量。减少百分比定义为失活率的负值。
5.金黄色葡萄球菌的检测（图6）
- 按照步骤4中的说明制备 金黄色葡萄球菌 样品。
- 用灭菌水将样品的细菌密度稀释至600nm处的0.5光密度（OD600，~6 x 106 CFU/mL）。将 0.5 mL 培养物转移到 1.5 mL 离心管中。以14，000× g 离心10分钟，倒出上清液以获得细胞沉淀。
- 将 0.1093 g L-蛋氨酸、0.1 g NBT 和 25 mL FMN（400、240 或 120 μM）加入 75 mL PB 中。对于每施用 1 mL 的反应物，FMN、蛋氨酸和 NBT 的最终浓度分别为 100（60 或 30）x 10-6 M、7.3 x 10-3 M 和 1.2 x 10-3 M。
- 将1mL每种反应物溶液（即具有不同的FMN浓度）添加到步骤5.2中获得的细胞沉淀中。用紫色光以10W/ m 2 照射溶液10分钟。
- 将混合物以14，000× g 离心10分钟，然后倒出上清液。将沉淀重悬于 1 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 中以提取还原的 NBT。从560nm处的吸光度检测产生的 物质。
6. 统计分析
- 将数据表示为三个独立测试的平均±标准偏差 （SD）。
- 应用同方差双样本 t 检验来评估两个测量值是否不同。 < 0.05 的 p 值被认为具有统计显著性。
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Representative Results
光波长对FMN的影响
使用蓝色、绿色、红色和紫色 LED 照射的 0.1 mM FMN 的吸光度光谱如图 3 所示。FMN有两个峰（372 nm和444 nm）用于暗控制。绿光和红光没有影响，因为光谱的变化微不足道。另一方面，在蓝光和紫光以10 W/ m 2 照射5分钟后，FMN在444nm处的吸光度分别降低了约19%和34%，表明用蓝色/紫色光照射增加了FMN光解。
检测 
来自使用蓝色或紫色光照射的 FMN
NBT还原用于确定32的形成。FMN对可见光和紫外线高度敏感，即使在短时间的辐射下也是如此。由FMN光解过程中的中间光化学反应形成。图4显示，FMN对NBT还原的光化学作用取决于辐照时间，如FMN以时间依赖性方式暴露于蓝色或紫色光照射形成。然而，蓝光和紫光的平均光解效应相似，如图4所示。
FMN光解对 金黄色葡萄球菌 活力的影响
测定FMN暴露于紫色或蓝光照射对金黄色葡萄球菌活力的影响。使用蓝色或紫色光照射的FMN光解导致金黄色葡萄球菌显着失活。FMN的浓度越大，暴露于20 W/ m 2的蓝光照射120分钟的金黄色葡萄球菌的失活率就越高，如图5A所示。在20 W / m2蓝光照射下，分别使用0，30，60和120μM FMN使金黄色葡萄球菌的灭活率达到26%，39%，43%和97%。如图5A所示，使用蓝光照射60μM FMN以20W / m 2持续120分钟（能量剂量，14.4J / cm 2）或120μM FMN在20W/ m 2下照射60分钟（能量剂量， 7.2 焦耳/厘米2）。另一方面，如图5B所示，在紫光照射下，在10 W/ m 2的紫光照射下，没有和用30μM FMN分别实现了53%和96%的灭活率30分钟（能量剂量为1.8J / cm2）。因此，暴露于蓝色或紫色光照射的FMN通过增加细菌灭活对金黄色葡萄球菌的活力有更大的影响。用紫光照射处理的FMN在金黄色葡萄球菌失活中更有效。
检测 在 FMN 处理的紫光照射下的金黄色葡萄球菌中
使用NBT还原法测定在紫光照射下FMN处理的金黄色葡萄球菌的产生。560nm处的吸光度值用于评估生产程度。FMN对金黄色葡萄球菌生成的光化学作用与FMN浓度成正比（图6）。未经FMN处理的金黄色葡萄球菌的560nm吸光度值分别在10W / m2紫光照射下和黑暗中分别为0.31和0.07（图6）。这表明未经处理的金黄色葡萄球菌在紫光照射后几乎没有产生。用100μM FMN处理的金黄色葡萄球菌的560nm吸光度值分别在10W / m2紫光照射下10分钟和黑暗中分别为1.36和0.08。因此，在紫色照射下，FMN处理的金黄色葡萄球菌对NBT减少的光化学作用增加，并且大量产生。
图 1：光反应系统的示意图。 请单击此处查看此图的大图。
图 2：本研究中蓝色、绿色、红色和紫色 LED 灯的发射光谱。 蓝色、绿色、红色和紫色光的发射最大值分别为465、529、632和405 nm，半高（W1/2）处的光谱宽度分别为26、31、14和12 nm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：用各种波长的 LED 在 10 W/m2 下处理 FMN 的吸光度光谱 5 分钟。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：NBT 还原以确定蓝色和紫色光照射在 10 W/m2 下照射 1-5 分钟对 FMN 光解的影响。 请点击此处查看此图的大图。
图5：FMN光解对金黄色葡萄球菌活力的影响。百分比减少定义为用（A）FMN在蓝光照射下以20W /m 2处理120分钟和（B）在紫光照射下以10W/ m 2处理30分钟的金黄色葡萄球菌灭活率的负值。请注意，使用60μM FMN在20W /m 2蓝光照射下120分钟或120μM FMN在20W / m2蓝光照射下60分钟（A）时，金黄色葡萄球菌的灭活率没有显着差异（p = 0.20）。结果表示为平均值± SD，其中n = 3。*p < 0.05;**p < 0.01;p < 0.0001。请点击此处查看此图的大图。
图6：FMN浓度对 在10 W/ m 2下接受紫光照射10分钟的金黄色葡萄球菌生成的影响。总体而言，在没有FMN的情况下，金黄色葡萄球菌的产生很少，尽管相对于暗对照（PB（暗））照射的紫光照射在照射样品（PB（紫光））中略有增加。结果表示为平均值± SD，其中n = 3。* p < 0.05;** p < 0.01; p < 0.0001。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
光敏剂增加化合物的光化学反应以产生ROS。病原微生物可以在光敏剂存在下通过光照射灭活。本研究确定了由于外源性光敏剂 FMN 的紫光照射产生的 ROS 引起的 金黄色葡萄球菌 的 aPDI。
如图3所示，对于FMN，使用紫光或蓝光照射5分钟后，444nm处的吸光度显着降低，并且在绿光或红光照射下FMN吸光度没有显着变化。NBT还原用于确定通过电荷转移过程10，33的形成。作者之前的一项研究在蓝光、绿光或红光照射下使用 FMN 来确定使用 NBT 还原的形成。蓝光照射产生大量的光解效率，而绿光和红光的光解效率不到蓝光的3%10.这些结果表明，当FMN暴露于蓝色或紫色光照射时会产生电荷转移过程，并且受到绿光或红光照射时没有显着变化。
作者34 之前的一项研究表明，FMN光解的机制可以用初级FMN光解反应来描述（公式1）：
(1),
其中 1FMN* 和 3FMN* 分别是激发 FMN 的单重态和三重态。这些光致FMN的光解反应机理可能是由三重态-三重态湮灭或三重态-基态淬灭过程引发的35，36，37，38。FMN 的基态 （FMN0） 是一个电子供体，它向 3FMN* 提供电子并生成半还原 （FMN•-） 和半氧化 （FMN•+） 形式，如公式 2 所示
(2)
FMN的光降解途径是由光敏作用引起的。FMN通过光解反应被提升到电子激发态FMN•，然后，当FMN•失去电子时，中性FMN被还原，如下式3-8所示：
(3)
(4)
(5),
其中FMN•+ 是一种自由基阳离子物种。
FMN•- 与O2 （3Σg-）的相互作用产生反应性超氧自由基， 其次是氢过氧自由基HOO•，它在质子之间的 反应中产生，最终导致FMN0的降解：
(6)
(7)
(8),
其中FMN•- 是一个自由基阴离子。
在本研究中，在没有FMN的情况下，金黄色葡萄球菌在10 W/ m 2的紫光照射下失活率为53%，在20 W / m2的蓝光照射下为26%，持续120分钟，这表明蓝光照射比紫光使细菌失活更少（图5）。早些时候已经报道，在没有外源性光敏剂的情况下，波长超过430nm的照射不会使金黄色葡萄球菌细胞失活，尽管金黄色葡萄球菌中的卟啉在405±5nm处具有最大吸光度，并且在照射39后引起细菌灭活。
本文作者之前的一项研究表明，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌被DNA切割失活，DNA切割是由核黄素或FMN10，24，40的光解形成的诱导的。在20 W / m 2蓝光照射（能量剂量为14.4 J /cm 2）下使用120μM FMN持续120分钟和在10 W / m 2紫光照射（能量剂量为1.8 J / cm 2）下使用30μM FMN30分钟，金黄色葡萄球菌的失活率分别为97%和96%（图5）。因此，与蓝光相比，紫光照射在使金黄色葡萄球菌失活方面更有效，因为与蓝光相比，低能量剂量的紫光可以在较低的FMN浓度和较短的照明时间下使金黄色葡萄球菌失活。虽然紫光实现的FMN光解程度高于蓝光（图3），但在蓝光和紫光照射下，FMN对NBT还原的平均光解作用相似（图4）。
大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性细菌。使用FMN 10，24时，通过蓝光照射核黄素或FMN光解通过ROS10，24，41灭活大肠杆菌，灭活率为96%。另一方面，金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，在紫光照射下通过FMN光解有效地灭活，如图5所示（图5）。因此，在蓝光或紫光照射下的FMN光解反应会产生ROS，并使革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌失活。
然而，在没有FMN的情况下，暴露于紫光照射的金黄色葡萄球菌很少产生（图6）;因此，与存在外源性光敏剂（如FMN）的效果相比，内源性光敏剂在紫光照射下仅略微降低金黄色葡萄球菌的活力。在相同条件下，暴露于紫光照射的FMN会降低金黄色葡萄球菌的活力，导致96%的灭活率，远高于单独使用内源性细胞内光敏剂的灭活率。在紫光照射下，经FMN处理的金黄色葡萄球菌的产生显着增加，如图6所示。这些结果表明，当暴露于紫光照射时，FMN会导致细菌灭活水平升高。
FMN在使用UV 1，2，21，22，23，蓝色10，24和紫光31照射时可以达到光激发态;然而，必须考虑由紫外线辐射和高强度短波长照射引起的细胞毒性42。另一方面，波长较长的红色和绿色辐射在FMN光解10期间不会产生大量的ROS。因此，ROS诱导的金黄色葡萄球菌aPDI需要用具有中间波长的紫光照射FMN。紫光在半高处的光谱宽度（W1/2）必须较窄，以避免与紫外线吸收重叠并抑制由于紫外线辐射引起的风险31。微量营养素FMN是无害的，是人体必需的维生素。使用适当的光敏剂，如FMN，低能量紫光照射可以抑制致病菌，提供安全有效的卫生过程手段。除了FMN对金黄色葡萄球菌的光解反应外，其他问题值得进一步研究，例如FMN对微生物的光毒性，这是由应激引起的，可以使用RNA-seq技术和qPCR进行研究。
通过紫光照射的FMN光解导致光化学氧化，从而产生ROS，从而增强致病菌 的 失活。紫光的使用被认为是FMN光分解的关键步骤。当前技术的局限性在于紫光的波长间隔必须非常窄，以避免由于紫外线照射而产生的风险。目前的方法具有未来医疗应用的潜力，例如通过插入光纤将紫光引导到感染区域来治疗表面皮肤以及深层皮下组织或肌肉的感染。因此，使用FMN进行光化学处理是确保有效卫生实践的安全简单方法。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢黄德华博士和谢宗哲先生对实验的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue, green and red LED lights | Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan | DC 12 V 5050 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 190186 | |
| Infrared thermometer | Raytek Co. Santa Cruz, CA | MT4 | |
| LB broth | Difco Co., NJ | ||
| L-Methionine | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 1.05707 | |
| NBT | Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada | ||
| Power supply | China tech Co., New Taipei City, Taiwan | YP30-3-2 | |
| Riboflavin 5′-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R7774 | |
| RNase | New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA | ||
| Solar power meter | Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan | TM-207 | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus | Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan | 10451 | |
| UV-Vis optical spectrometer | Ocean Optics, Dunedin, FL | USB4000 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan | U-2900 | |
| Violet LED | Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China |
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