Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Инактивация патогенов посредством фотолиза рибофлавина-5'-фосфата в видимом свете

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Здесь представлен протокол инактивации патогенных бактерий реактивными формами кислорода, образующимися при фотолизе мононуклеотида флавина (FMN) при облучении синим и фиолетовым светом низкой интенсивности. Фотолиз FMN является простым и безопасным методом для санитарных процессов.

Abstract

Рибофлавин-5'-фосфат (или флавин мононуклеотид; FMN) чувствителен к видимому свету. Различные соединения, включая активные формы кислорода (АФК), могут быть получены в результате фотолиза FMN при облучении видимым светом. АФК, образующиеся в результате фотолиза FMN, вредны для микроорганизмов, включая патогенные бактерии, такие как золотистый стафилококк (S. aureus). В данной статье представлен протокол деактивации S. aureus, например, посредством фотохимических реакций с участием FMN при облучении видимым светом. Супероксидный радикальный анион (Equation 1), образующийся во время фотолиза FMN, оценивается путем восстановления нитро-синего тетразолия (NBT). Микробная жизнеспособность S. aureus, которая приписывается реактивным Equation 1 видам, была использована для определения эффективности процесса. Скорость бактериальной инактивации пропорциональна концентрации FMN. Фиолетовый свет более эффективен в инактивации S. aureus , чем облучение синим светом, в то время как красный или зеленый свет не стимулирует фотолиз FMN. В данной статье показан фотолиз FMN как простой и безопасный метод санитарных процессов.

Introduction

Рибофлавин-5'-фосфат (FMN) образуется фосфорилированием в рибофлавине 5'-положении рибитильной боковой цепи и требуется всем флавопротеинам для многочисленных клеточных процессов для генерации энергии. Он также играет роль витамина для некоторых функций в организме человека1. FMN примерно в 200 раз более растворим в воде, чем рибофлавин2.

Антибактериальная фотодинамическая инактивация (aPDI) бактерий является эффективным способом контроля устойчивости к бактериям 3,4, поскольку она не зависит от режима бактериальной резистентности. Клинически aPDI используется для лечения инфекций мягких тканей с целью уменьшения инфекции внутрибольничной кожи из-за мультирезистентных бактерий 5,6,7,8,9. aPDI также производит гибель клеток, генерируя активные формы кислорода (АФК). АФК, такие как супероксидные радикалы (Equation 1), синглетный кислород, гидроксильные радикалы (•OH) и пероксиловые радикалы, представляют собой свободные радикалы или молекулы, которые содержат реакционноспособный кислород 10,11,12 и обычно являются реакционноспособными 13. Подобно повреждению ДНК, вызванному АФК, перекисное окисление мембраны и разрушение эндотелиальных клеток также являются неблагоприятными биохимическими реакциями, которые приписываются АФК в клетках12.

Использование aPDI для патогенных бактерий включает видимый или ультрафиолетовый источник света для инактивации микроорганизмов в присутствии химических соединений, таких как хлорид метилтиониния14, конъюгат PEI-ce6 15, порфирин16, диоксид титана17, толуидиновый синий O18 и наночастицы оксида цинка19. Толуидиновый синий O и метиленовый синий являются фенотиазиновыми красителями, а метиленовый синий обладает токсичными свойствами. Наночастицы оксида цинка и УФ-облучение связаны с неблагоприятным воздействием на здоровье и окружающую среду. Таким образом, использование надежного, безопасного и простого фотосенсибилизатора посредством фотолиза при видимом облучении заслуживает дальнейшего изучения.

Микроэлемент, рибофлавин или FMN, не токсичен и действительно используется для производства пищевых продуктов или кормления20. Как FMN, так и рибофлавин очень чувствительны к световому облучению2. ПриУФ-излучении 1,2,21,22,23 и облучении синим светом10,24 эти два соединения достигают возбужденного состояния. Активированный рибофлавин или FMN, который производится фотолизом, переходит в триплетное состояние, и АФК генерируются одновременно 2,25. Kumar et al. сообщили, что рибофлавин, активированный ультрафиолетовым светом, избирательно вызывает повышенное повреждение гуанинового фрагмента ДНК у патогенных микроорганизмов26. При облучении ультрафиолетовым светом фотодинамически активированный рибофлавин, как показано, способствует генерации 8-OH-dG, который является биомаркером окислительного стресса, в двухцепочечной ДНК27. Сообщается, что S. aureus и E. coli деактивируются АФК при фотолизе рибофлавина или FMN 10,24,28. Предыдущее исследование авторов показало, что фотолитические реакции с участием рибофлавина и FMN уменьшают кристаллический фиолетовый, триарилметанный краситель и антибактериальное средство, которое Equation 1генерирует, и устраняют большую часть антимикробной способности кристаллической фиалки28. Когда флавинадениндинуклеотид или FMN облучают синим светом, полученные АФК продуцируют апоптоз в клетках HeLa для их отравления in vitro29. Используя фотохимическую обработку в присутствии рибофлавина, Cui et al. инактивировали лимфоциты путем ингибирования их пролиферации и выработки цитокинов30.

Фотолиз рибофлавина применяют для инактивации возбудителя крови УФ10,24, но компоненты крови могут быть нарушены при УФ-облучении30. Также сообщается, что тромбоциты, подвергшиеся воздействию ультрафиолета, постепенно повышают эффективность маркеров активации P-селектина и LIMP-CD63 на их мембранах. Необходимо исследовать цитотоксичность УФ-излучения и высокоинтенсивного облучения, и фотосенсибилизатор, который является несложным и безопасным во время фотореакции FMN с участием видимого света, будет очень полезен.

Свет более коротких длин волн имеет больше энергии и гораздо чаще вызывает серьезные повреждения клеток. Однако при наличии подходящего фотосенсибилизатора облучение низкоинтенсивным фиолетовым светом может подавлять патогенные микроорганизмы. Таким образом, фотосенсибилизация и генерация Equation 1 FMN при облучении фиолетовым светом важны для изучения, чтобы определить путь, по которому АФК от фотолиза FMN увеличивает инактивацию бактерий.

Борьба с противомикробными препаратами является общей проблемой, и разработка новых антибиотиков часто занимает десятилетия. После облучения фиолетовым светом фотоинактивация, опосредованная FMN, может уничтожить патогенные бактерии окружающей среды. В этом исследовании представлен эффективный антимикробный протокол in vitro с использованием фиолетового света для стимулирования фотолиза FMN и, таким образом, генерации Equation 1 для aPDI. Микробная жизнеспособность S. aureus используется для определения осуществимости FMN-индуцированного aPDI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Настройка системы фотолиза

  1. Установите шесть светодиодов (LED) (DC 12 В) на внутреннюю часть непрозрачного пластикового стаканчика (8 см х 7 см), как показано на рисунке 1 , чтобы установить систему фотолиза31.
  2. Добавьте реагенты (см. ниже) в стеклянные пробирки (диаметром 13 мм и высотой 100 мм) и закрепите трубки в верхней части чашки, как показано на рисунке 1. Поместите экспериментальную установку в помещение с постоянной температурой 25 ± 3 °C.
  3. Контролируйте и регистрируйте температуру испытательных блоков на протяжении всех фотолитических реакций с помощью инфракрасного термометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны спектры излучения для синего, зеленого, красного и фиолетового огней, записанные с помощью калиброванного оптического спектрометра UV-Vis. Длины волн, соответствующие максимуму поглощения для синих, зеленых, красных и фиолетовых светодиодных фонарей, используемых в исследовании, составляют 465, 529, 632 и 405 нм соответственно. Светодиодные чипы могут нагревать аппарат во время экспериментов по облучению. Поэтому вся система фотореакции в каждом эксперименте помещалась в помещение, где температура поддерживалась постоянной на уровне 25 ± 3 °C.

2. Влияние длины волны света на фотолиз FMN (рисунок 3)

  1. Приготовьте раствор FMN 0,1 мМ в буфере фосфата калия (ПБ) 100 мМ (рН 7,8). Подвергайте образцы FMN (по 3 мл каждый) синему, зеленому, красному или фиолетовому свету с интенсивностью 10 Вт/м2 в течение 5 мин. Держите 3 мл раствора FMN в темноте в качестве контроля.
  2. Регистрируйте поглощение облученных образцов FMN в диапазоне 250-750 нм с помощью УФ/видимого спектрофотометра.

3. Метод восстановления нитро-голубого тетразолия (NBT) для обнаружения Equation 1 (рисунок 4).

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод восстановления NBT, используемый здесь, был немного модифицирован по сравнению с анализом фотореакции рибофлавина. Метод восстановления NBT используется для оценки уровня генерируемого Equation 1 фотолиза FMN. Фотохимически возбужденный FMN сначала восстанавливается L-метионином в полухинон, который затем отдает электрон кислороду, давая начало Equation 131. As-generated Equation 1 снижает NBT до формазана, который имеет характерную абсорбцию при 560 нм32.

  1. Добавьте 109,3 мг L-метионина к 73,3 мл ПБ (100 мМ; рН 7,8). Вихрь раствора для растворения L-метионина.
  2. После того, как L-метионин полностью растворится, добавьте в раствор 10 мг порошка NBT и 1,53 мл 0,117 мМ FMN. На каждый 1 мл применяемого реакционного раствора (т.е. смеси FMN, L-метионина и NBT) конечные концентрации FMN, метионина и NBT составляют соответственно 2,4 х 10-6 М, 1,0 х 10-2 М и 1,6 х 10-4 М.
  3. Подвергают реакционный раствор (1 мл) облучению синим или фиолетовым светодиодом при 10 Вт/м2 в течение 1-5 мин.
  4. Equation 1 Обнаруживают виды (от поглощения при 560 нм), образующиеся в результате фотохимической реакции, которая снижает NBT и производит формазан.

4. Жизнеспособность S. aureus после фотолиза FMN (рисунок 5)

  1. Передайте колонию S. aureus (BCRC 10451) из культивируемой пластины в 10 мл бульона Lysogeny, взятого в пробирке с винтовой крышкой 15 мл. Культивировать в шейкере при 37 °C в течение 16 ч.
  2. Перенесите 0,5 мл культуры в центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте стерилизованную воду в центрифужную трубку, чтобы разбавить культуру до оптической плотности 0,5 при 600 нм (OD600) (~6 x 107 КОЕ/мл).
  3. Переложите 0,5 мл культуры в центрифужную трубку объемом 1,5 мл, центрифугу при 14 000 х г в течение 10 мин и декантирование супернатанта для получения ячейки гранулы.
  4. Добавьте 1 мл FMN-буферного раствора (30, 60 и 120 мкМ FMN в ПБ) к гранулам клеток, полученным на стадии 4.3, и вихревые. Для облученного контроля добавьте только 1 мл ПБ.
  5. Переложите по 1 мл жизнеспособных растворов бактериальных клеток, содержащих только 30 мкМ FMN и PB, в стеклянные трубки и облучите их фиолетовым светом при 10 Вт/м2 в течение 30 мин.
  6. Переложите по 1 мл жизнеспособных растворов бактериальных клеток, содержащих 30, 60 и 120 мкМ FMN и PB, в стеклянные трубки и облучите их синим светом при 20 Вт/м2 в течение 120 мин. Установите еще одну стеклянную трубку с 1 мл жизнеспособного раствора бактериальных клеток, содержащего 120 мкМ FMN, и облучите его синим светом при 20 Вт/м2 в течение 60 мин.
  7. Установите пробирки, как описано в шагах 4.5 и 4.6, и покройте их толстой алюминиевой фольгой. Эти трубки служат темными регуляторами.
  8. Держите камеру облучения (а также темные органы управления) в холодном помещении при температуре 9 ± 1 °C в течение 30-120 мин облучения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тепло, выделяемое светодиодными лампами, нельзя игнорировать, так как светодиодные чипы, размещенные внутри чашки, могут нагревать систему фотореакции во время экспериментов по облучению. Поэтому эксперименты проводились в холодном помещении при температуре 9 ± 1 °C.
  9. После облучения перенесите 0,2 мл из каждого реакционного раствора на пластину лурия-агара (LA). Распределите бактерии по пластине С помощью L-образного стеклянного стержня и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
  10. Рассчитайте количество жизнеспособных пластин и скорость инактивации S. aureus после ночного роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость инактивации S. aureus рассчитывается как процентное снижение, которое равно [1 -I/D] ×100%, где I и D обозначают, соответственно, количество КОЕ в облученном образце и темный контроль. Процентное снижение определяется как отрицательное значение коэффициента инактивации.

5. Обнаружение Equation 1 в S. aureus (рисунок 6)

  1. Подготовьте образцы S. aureus , как описано в шаге 4.
  2. Разбавить бактериальную плотность образцов стерилизованной водой до оптической плотности 0,5 при 600 нм (OD600, ~6 x 106 КОЕ/мл). Перенесите 0,5 мл культуры в центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 14 000 х г в течение 10 мин и декантирование супернатанта для получения ячейки гранулы.
  3. Добавьте 0,1093 г L-метионина, 0,1 г NBT и 25 мл FMN (400, 240 или 120 мкМ) к 75 мл ПБ. На каждый 1 мл применяемого реагента конечные концентрации FMN, метионина и NBT составляют соответственно 100 (60 или 30) х 10-6 М, 7,3 х 10-3 М и 1,2 х 10-3 М.
  4. Добавляют 1 мл каждого раствора реагента (т.е. с изменяющимися концентрациями FMN) к гранулам клеток, полученным на стадии 5.2. Облучают растворы фиолетовым светом при 10 Вт/м2 в течение 10 мин.
  5. Центрифугируйте смесь при 14 000 х г в течение 10 мин и декантируйте супернатант. Повторно суспендируют гранулу в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) для извлечения восстановленного NBT. Обнаружение полученных Equation 1 видов по поглощению при 560 нм.

6. Статистический анализ

  1. Выражайте данные как среднее ± стандартное отклонение (SD) трех независимых тестов.
  2. Примените гомоскедастический t-тест с двумя образцами, чтобы оценить, отличаются ли два измерения. p-значения < 0,05 считаются статистически значимыми.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Влияние длины волны света на FMN
Спектры поглощения 0,1 мМ FMN, которые облучаются с помощью синих, зеленых, красных и фиолетовых светодиодов, показаны на рисунке 3. Есть два пика для FMN (372 нм и 444 нм) для управления темным. Зеленый и красный свет не имеют никакого эффекта, потому что изменения в спектрах незначительны. С другой стороны, соответствующее поглощение FMN при 444 нм снижается примерно на 19% и 34% соответственно после облучения синим и фиолетовым светом при 10 Вт/м2 в течение 5 мин, что позволяет предположить, что облучение синим/фиолетовым светом увеличивает фотолиз FMN.

Equation 10 Обнаружение от FMN, который облучается с помощью синего или фиолетового света
Снижение NBT было использовано для определения образования Equation 132. FMN очень чувствителен к видимому и ультрафиолетовому свету даже в течение коротких периодов излучения. Equation 1 образуется из промежуточных фотохимических реакций при фотолизе FMN. На рисунке 4 показано, что фотохимическое влияние FMN на снижение NBT зависит от времени облучения, так как Equation 1 образуется из FMN, подвергшегося облучению синим или фиолетовым светом в зависимости от времени. Однако средний фотолитический эффект синего и фиолетового света аналогичен тому, как показано на рисунке 4.

Влияние фотолиза FMN на жизнеспособность S. aureus
Определено влияние FMN, подвергшегося облучению фиолетовым или синим светом, на жизнеспособность S. aureus . Фотолиз FMN с использованием облучения синим или фиолетовым светом приводит к значительной инактивации S. aureus. Чем больше концентрация FMN, тем выше скорость инактивации S. aureus , который подвергается облучению синим светом при 20 Вт/м2 в течение 120 мин, как показано на рисунке 5A. Скорость инактивации 26%, 39%, 43% и 97% была достигнута для S. aureus с использованием 0, 30, 60 и 120 мкМ FMN, соответственно, при облучении синим светом 20 Вт/м2 в течение 120 мин. Как показано на рисунке 5А, нет существенной разницы (p-значение = 0,20) в скорости инактивации для S. aureus с использованием облучения синим светом либо 60 мкМ FMN при 20 Вт/м2 в течение 120 мин (энергетическая доза, 14,4 Дж/см2), либо 120 мкМ FMN при 20 Вт/м2 в течение 60 мин (энергетическая доза, 7,2 Дж/см2). С другой стороны, как показано на фиг.5В, скорости инактивации 53% и 96% были достигнуты для S. aureus без и с 30 мкМ FMN, соответственно, при облучении фиолетовым светом при 10 Вт/м2 в течение 30 мин (энергетическая доза 1,8 Дж/см2). Поэтому FMN, подвергшийся облучению синим или фиолетовым светом, оказывает большее влияние на жизнеспособность S. aureus за счет увеличения бактериальной инактивации. FMN, обработанный облучением фиолетовым светом, более эффективен при инактивации S. aureus .

Equation 10 Обнаружение при FMN-обработанном S. aureus при облучении фиолетовым светом
Получение Equation 1 в FMN-обработанном S. aureus при облучении фиолетовым светом определяли с помощью метода восстановления NBT. Значение поглощения при 560 нм использовалось для оценки степени Equation 1 производства. Фотохимическое влияние FMN на Equation 1 генерацию в S. aureus пропорционально концентрации FMN (рисунок 6). Значения поглощения 560 нм для S. aureus без лечения FMN составляют 0,31 и 0,07 при облучении фиолетовым светом 10 Вт/м2 в течение 10 мин и в темноте соответственно (рисунок 6). Это говорит о том, что мало Equation 1 что было получено в необработанном S. aureus после облучения фиолетовым светом. Соответствующие значения поглощения 560 нм для S. aureus , обработанного 100 мкМ FMN, составляют 1,36 и 0,08 при облучении фиолетовым светом 10 Вт/м2 в течение 10 мин и в темноте соответственно. Таким образом, фотохимическое воздействие на снижение NBT у обработанных FMN S. aureus усиливается при фиолетовом облучении, так как Equation 1 производится обильно.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение системы фотореакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Спектры излучения синих, зеленых, красных и фиолетовых светодиодных фонарей в этом исследовании. Максимумы излучения для синего, зеленого, красного и фиолетового огней составляют 465, 529, 632 и 405 нм соответственно, а спектральная ширина на половинной высоте (W1/2) составляет 26, 31, 14 и 12 нм соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Спектры поглощения FMN, обработанные светодиодами различной длины волны при 10 Вт/м2 в течение 5 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Снижение NBT для определения эффекта облучения синим и фиолетовым светом при 10 Вт/м2 в течение 1-5 мин на фотолизе FMN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Влияние фотолиза FMN на жизнеспособность S. aureus . Процентное снижение определяется как отрицательное значение скорости инактивации для S. aureus , обработанного (A) FMN при облучении синим светом при 20 Вт/м2 в течение 120 мин и (B) FMN при облучении фиолетовым светом при 10 Вт/м2 в течение 30 мин. Концентрации FMN и время облучения указаны в верхней части рисунка. Обратите внимание, что нет существенной разницы (p = 0,20) в скорости инактивации для S. aureus с использованием 60 мкМ FMN при 20 Вт/м2 облучения синим светом в течение 120 мин или 120 мкМ FMN при 20 Вт/м2 облучения синим светом в течение 60 мин (А). Результаты выражаются как среднее ± SD, где n = 3. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Влияние концентрации FMN на Equation 10 генерацию в S. aureus, подвергшихся облучению фиолетовым светом при 10 Вт/м2 в течение 10 мин. В целом, в S. aureus в отсутствие FMN мало что образуется, хотя облучение фиолетовым Equation 1 светом несколько Equation 1 увеличивается в облученном образце (PB (фиолетовый свет)) по сравнению с темным контролем (PB (Dark)). Результаты выражаются как среднее ± SD, где n = 3. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Фотосенсибилизатор увеличивает фотохимическую реакцию химических соединений с образованием АФК. Патогенные микроорганизмы могут быть инактивированы легким облучением в присутствии фотосенсибилизаторов. Это исследование определяет aPDI S. aureus за счет АФК, генерируемого облучением фиолетовым светом экзогенного фотосенсибилизатора FMN.

Как показано на рисунке 3, для FMN поглощение при 444 нм значительно снижается после 5 мин облучения с использованием фиолетового или синего света и нет существенного изменения поглощения FMN при облучении зеленым или красным светом. Редуктор NBT используется для определения образования через процесс передачи заряда Equation 110,33. Предыдущее исследование авторов использовало FMN при облучении синим, зеленым или красным светом для определения формирования Equation 1 с использованием снижения NBT. Облучение синим светом производит огромное количествоEquation 1, тогда как фотолитическая эффективность зеленого и красного света составляет менее 3% от той, которая достигается синим светом10. Эти результаты показывают, что процесс передачи заряда возникает, когда FMN подвергается облучению синим или фиолетовым светом, и что при облучении зеленым или красным светом нет существенных изменений.

Предыдущее исследование авторов34 показало, что механизм фотолиза FMN может быть описан с помощью первичных фотолитических реакций FMN (уравнение 1):

Equation 2 (1),

где 1FMN* и 3FMN* — синглетное и триплетное состояния возбужденного FMN соответственно. Механизмы фотолитической реакции для этих фотоиндуцированных FMN, возможно, инициируются триплет-триплетной аннигиляцией или процессом гашения триплет-основного состояния 35,36,37,38. Основное состояние FMN (FMN0) является донором электронов, который обеспечивает электрон до 3FMN* и генерирует полуредуцированные (FMN•-) и полуокисленные (FMN•+) формы, как показано в уравнении 2

Equation 3 (2)

Пути фотодеградации для FMN являются результатом фотосенсибилизации. FMN переводится в электронно-возбужденное состояние, FMN•, посредством фотолитической реакции, а затем нейтральный FMN уменьшается, когда FMN• теряет электрон, как показано в уравнениях 3-8 ниже:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

где FMN•+ — радикальный катионный вид.

Взаимодействие FMN•- с O2 (3Σg-) производит реакционноспособный супероксидный радикал, Equation 1за которым следует гидропероксиловый радикал HOO•, который образуется в реакции между Equation 1 протоном и в конечном итоге приводит к деградации FMN0:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

где FMN•- является радикальным анионом.

В настоящем исследовании при отсутствии FMN скорость инактивации в случае S. aureus составляет 53% при облучении фиолетовым светом при 10 Вт/м2 в течение 30 мин и 26% при облучении синим светом при 20 Вт/м2 в течение 120 мин, что позволяет предположить, что облучение синим светом дезактивирует меньше бактерий, чем фиолетовый свет (рисунок 5). Ранее сообщалось, что облучение на длинах волн более 430 нм без экзогенного фотосенсибилизатора не инактивирует клетки S. aureus , хотя порфирины в S. aureus имеют максимальное поглощение при 405 ± 5 нм и вызывают бактериальную инактивацию после облучения39.

Предыдущее исследование настоящих авторов показало, что E. coli и S. aureus деактивируются расщеплением ДНК, которое индуцируется образованием посредством фотолиза рибофлавина или FMN 10,24,40. Соответствующие скорости инактивации для S. aureus составляют 97% и 96% соответственно, при использовании 120 мкМ FMN при облучении синим светом20 Вт/м2 (энергетическая доза 14,4 Дж/см2) в течение 120 мин и 30 мкМ FMN при облучении фиолетовым светом 10 Вт/м2 (энергетическая доза 1,8 Дж/см2) в течение 30 мин (рисунок 5). Поэтому облучение фиолетовым светом более эффективно дезактивирует S. aureus, поскольку низкоэнергетические дозы фиолетового света могут деактивировать S. aureus при наличии более низких концентраций FMN и более коротких периодов освещения по сравнению с синим светом. Хотя степень фотолиза FMN, достигаемая фиолетовым светом, выше по сравнению с синим светом (рисунок 3), средние фотолитические эффекты FMN на снижение NBT при облучении синим и фиолетовым светом аналогичны (рисунок 4).

Кишечная палочка является распространенной грамотрицательной бактерией. Фотолиз рибофлавина или FMN путем облучения синим светом инактивирует Кишечную палочку через ROS 10,24,41 со скоростью инактивации 96% при использовании FMN10,24. S. aureus, с другой стороны, является грамположительной бактерией, которая эффективно инактивируется фотолизом FMN при облучении фиолетовым светом, как показано здесь (рисунок 5). Поэтому фотолитическая реакция FMN при облучении синим или фиолетовым светом может продуцировать АФК и инактивировать как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии.

В отсутствие FMN, однако, мало Equation 1 что образуется в S. aureus , который подвергается облучению фиолетовым светом (рисунок 6); поэтому эндогенные фотосенсибилизаторы лишь незначительно снижают жизнеспособность S. aureus при облучении фиолетовым светом по сравнению с эффектом в присутствии экзогенного фотосенсибилизатора, такого как FMN. В тех же условиях FMN, который подвергается облучению фиолетовым светом, снижает жизнеспособность S. aureus , что приводит к 96% скорости инактивации, что намного выше, чем для эндогенных внутриклеточных фотосенсибилизаторов в одиночку. Производство Equation 1 s . aureus , обработанного FMN, при облучении фиолетовым светом значительно увеличилось, как показано на рисунке 6. Эти результаты показывают, что FMN при воздействии облучения фиолетовым светом вызывает повышенный уровень бактериальной инактивации.

FMN может достигать фотовозбужденного состояния при облучении с использованием УФ 1,2,21,22,23, синего10,24 и фиолетового света31; однако цитотоксичность, вызванная УФ-излучением и высокоинтенсивным коротковолновым облучением, должна рассматриватьсякак 42. С другой стороны, красные и зеленые излучения с более длинными волнами не производят значительных количеств АФК во время фотолиза FMN10. Поэтому АФК-индуцированная aPDI S. aureus требует облучения FMN фиолетовым светом, который имеет промежуточную длину волны. Спектральная ширина на половинной высоте (Вт1/2) для фиолетового света должна быть узкой, чтобы избежать любого перекрытия с поглощением УФ-излучения и ингибировать риск из-за ультрафиолетового излучения31. Микроэлемент, FMN, как таковой безвреден, являясь важным витамином для человеческого организма. Используя соответствующий фотосенсибилизатор, такой как FMN, низкоэнергетическое ультрафиолетовое световое облучение может подавлять патогенные бактерии, обеспечивая безопасное и эффективное средство санитарного процесса. В дополнение к фотолитической реакции FMN на S. aureus, другие вопросы заслуживают дальнейшего изучения, такие как фототоксичность FMN на микробах, возникающая из-за стресса, вызванного Equation 1 , который может быть изучен с использованием метода RNA-seq наряду с qPCR.

Фотолиз FMN посредством облучения фиолетовым светом приводит к фотохимическому окислению, при котором генерируется АФК и, в свою очередь, усиливает инактивацию патогенных бактерий. Использование фиолетового света считается критическим шагом в фоторазложении FMN. Ограничением современного метода является то, что интервал длин волн фиолетового света должен быть довольно узким, чтобы избежать риска из-за ультрафиолетового облучения. Текущий метод имеет потенциал для будущих медицинских применений, таких как лечение инфекции поверхностной кожи вместе с глубокими подкожными тканями или мышцами путем введения оптического волокна для направления фиолетового света на инфицированные области. Поэтому фотохимическая обработка с использованием FMN является безопасным и простым способом обеспечения эффективной гигиены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарны доктору Так-Ва Вонгу и г-ну Цзун-Дже Се за их поддержку в экспериментах.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jian, H. L., Cheng, C. W., Chen, L. Y., Liang, J. Y. The photochemistry of riboflavin. MC-Transaction on Biotechnology. 3, 1-11 (2011).
  2. Lin, Y., Eitenmiller, R. R., Landen, W. O. Riboflavin. Vitamin analysis for the health and food sciences. , CRC Press. 329-360 (2008).
  3. Xie, L. J., Wang, R. L., Wang, D., Liu, L., Cheng, L. Visible-light-mediated oxidative demethylation of N(6)-methyl adenines. Chemical Communications. 53 (77), 10734-10737 (2017).
  4. Tim, M. Strategies to optimize photosensitizers for photodynamic inactivation of bacteria. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 150, 2-10 (2015).
  5. Maisch, T., et al. Photodynamic inactivation of multi-resistant bacteria (PIB) - a new approach to treat superficial infections in the 21st century. Journal of the German Society of Dermatology. 9 (5), 360-366 (2011).
  6. Hamblin, M. R. Antimicrobial photodynamic inactivation: a bright new technique to kill resistant microbes. Current Opinion in Microbiology. 33, 67-73 (2016).
  7. Del Rosso, J. Q. Oral Doxycycline in the management of acne vulgaris: Current perspectives on clinical use and recent findings with a new double-scored small tablet formulation. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 8 (5), 19-26 (2015).
  8. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dematologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  9. Yuann, J. M. P., et al. Effects of free radicals from doxycycline hyclate and minocycline hydrochloride under blue light irradiation on the deactivation of Staphylococcus aureus, including a methicillin-resistant strain. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 226, 112370 (2022).
  10. Liang, J. Y., Cheng, C. W., Yu, C. H., Chen, L. Y. Investigations of blue light-induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide on inactivation of E. coli. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 143, 82-88 (2015).
  11. Yang, M. J., et al. Effects of blue-light-induced free radical formation from catechin hydrate on the inactivation of Acinetobacter baumannii, Including a carbapenem-resistant strain. Molecules. 23 (7), 1631 (2018).
  12. Yuann, J. M. P., et al. A study of catechin photostability using photolytic processing. Processes. 9 (2), 293 (2021).
  13. Yuann, J. M. P., Wang, J. S., Jian, H. L., Lin, C. C., Liang, J. Y. Effects of Clinacanthus nutans (Burm. f) Lindau leaf extracts on protection of plasmid DNA from riboflavin photoreaction. MC-Transaction on Biotechnology. 4 (1), 45-59 (2012).
  14. Rineh, A., et al. Attaching NorA efflux pump inhibitors to methylene blue enhances antimicrobial photodynamic inactivation of Escherichia coli and Acinetobacter baumannii in vitro and in vivo. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 28 (16), 2736-2740 (2018).
  15. Dai, T., et al. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  16. Nitzan, Y., Ashkenazi, H. Photoinactivation of Acinetobacter baumannii and Escherichia coli B by a cationic hydrophilic porphyrin at various light wavelengths. Current Microbiology. 42 (6), 408-414 (2001).
  17. Tseng, C. C., et al. Altered susceptibility to the bactericidal effect of photocatalytic oxidation by TiO2 is related to colistin resistance development in Acinetobacter baumannii. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (19), 8549-8561 (2016).
  18. Boluki, E., et al. Antimicrobial activity of photodynamic therapy in combination with colistin against a pan-drug resistant Acinetobacter baumannii isolated from burn patient. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 18, 1-5 (2017).
  19. Yang, M. Y., et al. Blue light irradiation triggers the antimicrobial potential of ZnO nanoparticles on drug-resistant Acinetobacter baumannii. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 180, 235-242 (2018).
  20. Code of Federal Regulations. , Available from: https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2009-title21-vol6/pdf/CFR-2009-title21-vol6-sec582-5695.pdf (2022).
  21. Lu, C. Y., et al. Generation and photosensitization properties of the oxidized radical of riboflavin: a laser flash photolysis study. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 52 (1-3), 111-116 (1999).
  22. Sato, K., et al. The primary cytotoxicity in ultraviolet-a-irradiated riboflavin solution is derived from hydrogen peroxide. The Journal of Investigative Dermatology. 105 (4), 608-612 (1995).
  23. Tripathi, A. K., et al. Attenuated neuroprotective effect of riboflavin under UV-B irradiation via miR-203/c-Jun signaling pathway in vivo and in vitro. Journal of Biomedical Science. 21 (1), 39 (2014).
  24. Liang, J. Y., et al. Blue light induced free radicals from riboflavin on E. coli DNA damage. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 119, 60-64 (2013).
  25. Ottaway, P. B. The Technology of Vitamins in Food. , Chapman and Hall. London. Ch. 5 233-244 (1993).
  26. Kumar, V., et al. Riboflavin and UV-light based pathogen reduction: extent and consequence of DNA damage at the molecular level. Photochemistry and Photobiology. 80 (1), 15-21 (2004).
  27. Ito, K., Inoue, S., Yamamoto, K., Kawanishi, S. 8-Hydroxydeoxyguanosine formation at the 5'site of 5'-GG-3'sequences in double-stranded DNA by UV radiation with riboflavin. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13221-13227 (1993).
  28. Liang, J. Y., Yuann, J. M. P., Hsie, Z. J., Huang, S. T., Chen, C. C. Blue light induced free radicals from riboflavin in degradation of crystal violet by microbial viability evaluation. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 174, 355-363 (2017).
  29. Yang, M. Y., Chang, C. J., Chen, L. Y. Blue light induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide on lethality of HeLa cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 173, 325-332 (2017).
  30. Cui, Z., Huang, Y., Mo, Q., Wang, X., Qian, K. Inactivation of lymphocytes in blood products using riboflavin photochemical treatment with visible light. Photochemistry and Photobiology. 84 (5), 1195-1200 (2008).
  31. Wong, T. W., Cheng, C. W., Hsieh, Z. J., Liang, J. Y. Effects of blue or violet light on the inactivation of Staphylococcus aureus by riboflavin-5′-phosphate photolysis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 173, 672-680 (2017).
  32. Russell, L. F., Vanderslice, J. T. Comprehensive review of vitamin B2 analytical methodology. Journal of Micronutrient Analysis. 8, 257-310 (1990).
  33. Cheng, C. W., Chen, L. Y., Chou, C. W., Liang, J. Y. Investigations of riboflavin photolysis via coloured light in the nitro blue tetrazolium assay for superoxide dismutase activity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 148, 262-267 (2015).
  34. Huang, S. T., et al. Effects of 462 nm light-emitting diode on the inactivation of Escherichia coli and a multidrug-resistant by tetracycline photoreaction. Journal of Clinical Medicine. 7 (9), 278 (2018).
  35. Barua, M. G., Escalada, J. P., Bregliani, M., Pajares, A., Criado, S. Antioxidant capacity of (+)-catechin visible-light photoirradiated in the presence of vitamin B2. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 22 (6), 282-289 (2017).
  36. Castillo, C., Criado, S., Díaz, M., García, N. A. Riboflavin as a sensitiser in the photodegradation of tetracyclines. Kinetics, mechanism and microbiological implications. Dyes and Pigments. 72 (2), 178-184 (2007).
  37. Huvaere, K., Sinnaeve, B., Van Bocxlaer, J., Skibsted, L. H. Flavonoid deactivation of excited state flavins: reaction monitoring by mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (36), 9261-9272 (2012).
  38. Massad, W. A., Bertolotti, S., Garcia, N. A. Kinetics and mechanism of the vitamin B2-sensitized photooxidation of isoproterenol. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 428-433 (2004).
  39. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. High-intensity narrow-spectrum light inactivation and wavelength sensitivity of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 285 (2), 227-232 (2008).
  40. Huang, S. T., et al. The influence of the degradation of tetracycline by free radicals from riboflavin-5'-phosphate photolysis on microbial viability. Microorganisms. 7 (11), 500 (2019).
  41. Maisch, T., et al. Fast and effective photodynamic inactivation of multiresistant bacteria by cationic riboflavin derivatives. PLoS One. 9 (12), 111792 (2014).
  42. Grijzenhout, M., et al. Ultraviolet-B irradiation of platelets induces a dose-dependent increase in the expression of platelet activation markers with storage. British Journal of Haematology. 83 (4), 627-632 (1993).

Tags

Биоинженерия выпуск 182 FMN фотолиз ROS S. aureus фиолетовый свет
Инактивация патогенов <em>посредством</em> фотолиза рибофлавина-5'-фосфата в видимом свете
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T.… More

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T. Y., Yuann, J. M. P., Chiu, C. M., Huang, S. T., Liang, J. Y. Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5′-Phosphate. J. Vis. Exp. (182), e63531, doi:10.3791/63531 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter