Summary
该协议显示了如何获得白细胞心磷脂的质谱“指纹”以诊断Barth综合征。单心磷脂与心磷脂比值升高的评估将 Barth 综合征患者与对照心力衰竭患者区分开来,敏感性和特异性为 100%。
Abstract
心磷脂(CL)是一种在其结构中携带四个脂肪酸链的二聚体磷脂,是线粒体的脂质标记物,其中它在内膜的功能中起着至关重要的作用。其代谢物单心磷脂(MLCL)在生理上几乎不存在于动物细胞的脂质提取物中,其外观是Barth综合征(BTHS)的标志,Barth综合征是一种罕见的,经常被误诊的遗传性疾病,在婴儿期导致严重的心肌病。这里描述的方法产生“心磷脂指纹图谱”,并允许对细胞脂质谱中CL和MLCL物种的相对水平进行简单测定。在白细胞的情况下,只需要1 mL血液 即可通过 基质辅助激光解吸电离测量MLCL / CL比率 - 飞行时间/质谱(MALDI-TOF / MS),只需在抽血后2小时内。该测定方法很简单,可以很容易地整合到临床生化实验室的常规工作中,以筛查BTHS。该试验显示 BTHS 的敏感性和特异性为 100%,使其成为一种合适的诊断试验。
Introduction
Barth综合征(BTHS)是一种罕见的X连锁疾病,其特征为早发性心肌病,骨骼肌病,生长迟缓,中性粒细胞减少,可变线粒体呼吸链功能障碍和线粒体结构异常1,2,3,4,5。BTHS的患病率为每百万男性1例,目前全世界已知病例不到250例,尽管人们普遍认为该疾病被低估了2,6。BTHS 由定位于 Xq28.127,8 的 Tafazzin (TAFAZZIN) 基因的功能丧失突变引起,导致线粒体磷脂心磷脂 (CL) 重塑不足,这一过程通常导致高度对称和不饱和的酰基组成9,10。CL被认为是线粒体的标志性脂质,它是内膜的重要组成部分,对氧化磷酸化(即线粒体能量代谢),超复合物形成,蛋白质导入至关重要,并参与线粒体动力学,线粒体自噬和细胞凋亡11,12,13,14,15,16.当TAFAZZIN功能丧失时,CL重塑失败,并且在BTHS患者的线粒体中出现特定的磷脂异常:成熟CL水平(CLm)降低,而单心磷脂(MLCL)水平升高和CL酰基组成改变(即未成熟的CL物种,CLi)发生。这导致MLCL / CL比率显着增加17。
BTHS 的诊断通常很困难,因为该疾病呈现出极其多变的临床和生化特征,并且随着时间的推移,来自同一家庭和患者内部的受影响个体之间可能有所不同3,5。许多 BTHS 男孩的尿排泄水平非常高,3-甲基戊二酸 (3-MGCA),但随着时间的推移,患者的尿量可能正常或仅轻度升高3.然而,3-MGCA 升高是其他各种线粒体和非线粒体疾病的特征,例如 3-甲基谷氨酰辅酶 A 水合酶缺乏症(AUH 缺陷)、3-甲基戊二酸尿、肌张力障碍性耳聋、脑病、Leigh 样 (MEGDEL) 综合征、Costeff 综合征和扩张型心肌病伴共济失调 (DCMA) 综合征18,19.因此,3-MCGA作为BTHS标志物的特异性较差以及患者的巨大变异性使得生化诊断不明确。
此外,已经描述了超过120种不同的TAFAZZIN突变导致该疾病5 ,因此,遗传诊断可能很复杂,缓慢且昂贵。此外,TAFAZZIN基因的分子分析在非编码或调节序列3中存在突变时可导致假阴性结果。BTHS可以通过确定(单)CL物种的相对数量和分布来明确测试,并通过TAFAZZIN基因测序确认,反之亦然。
诊断的实用测试是通过高效液相色谱(HPLC)和电喷雾电离/质谱(ESI / MS)分析在血斑20,21中测量MLCL / CL比。单独测量 CL 水平不足以诊断,因为一些患者的 CL 水平接近正常,但 MLCL/CL 比值改变。因此,MLCL/CL 比值的测量对 BTHS 诊断具有 100% 的敏感性和特异性21。另一种基于HPLC和ESI / MS分析的经过验证的方法已经在白细胞22上建立,但是用于分离先前提取的脂质的复杂色谱技术以及仪器的昂贵限制了该分析仅限于少数临床实验室。所有这些因素,加上缺乏直接的诊断测试,导致了该病症的诊断不足。
MALDI-TOF/MS是脂质分析23,24中的另一个有效工具。这种分析技术可用于直接获得各种生物样品的脂质谱,从而跳过提取和分离步骤25,26,27,28,29,包括在用于MS成像应用的组织切片30。鉴于这一优势,开发了一种简单快速的诊断BTS的方法,通过分析具有MALDI-TOF / MS的完整白细胞中的线粒体CL来诊断28。通过红细胞沉降和裂解仅从1 mL全血中分离白细胞非常简单,不需要特殊的设备或试剂。此外,描述了适用于微量白细胞的快速脂质“迷你提取”方案,以确保成功获得具有比从完整白细胞获得的具有更高信噪比(S / N)的更清晰的MS信号的光谱28。这一进一步的步骤只需要很少的时间,即使在灵敏度较差的MS仪器上进行分析,也可以进行可重复的分析。总之,这里描述的分析方法需要最少的样品制备,因为可以跳过耗时且劳动密集型的色谱脂质分离,从而加快测试速度。
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Protocol
在巴里(意大利)的Policlinic医院收集了健康献血者和心力衰竭患者的血液样本,而BTHS患者的样本则由布里斯托尔皇家儿童医院(英国)的国家卫生服务英国BTHS诊所获得。获得健康捐赠者,患者和父母(在适当情况下)的书面知情同意以及各自伦理委员会的批准。
注意:如果不立即使用,血液(在K-EDTA凝胶管中)可以在4°C下储存长达24-48小时。
1. 通过右旋糖酐沉降红细胞(RBC)分离白细胞
- 将血液样本(在K-EDTA中)放在眼眶振荡器上10分钟以混合血液。
- 在1.5 mL管中的0.9mL全血中,加入0.1mL的20%葡聚糖溶液(分子量>100 kDa,在0.9%NaCl中)。移液并轻轻分散悬浮液20次,同时避免气泡,否则气泡会将红细胞保留在管的顶部。让红细胞在室温下沉淀约1小时。
- 使用注射器,收集黄色上清液并将其转移到15mL管中,然后在室温下以400× g 离心15分钟(无制动器,回转桶转子)。
- 弃去上清液,并将主要含有白细胞和残留红细胞的沉淀重悬于0.6mL冰冷的双蒸馏水(ddH2O)中。
- 约15秒后,向细胞悬浮液中加入0.2mL 0.6 M KCl以恢复正确的渗透压。短暂的渗透性休克会裂解红细胞,使白细胞完好无损。使用 1 倍 PBS 将最终体积调节至 2.5 mL。
- 在室温下以400× g 离心悬浮液15分钟(无制动器,回转桶转子)。弃去上清液,用2.5mL 1x PBS再次洗涤白细胞沉淀。
- 如步骤1.6所述离心并弃去上清液。将含有白细胞的沉淀重悬于200μL灭菌的ddH2O中。
注意:根据作者的经验,这对应于200μg至400μg的蛋白质含量。 - 将悬浮液在-80°C下冷冻或直接进行脂质提取,如下所示。
2. 从分离的白细胞中“小提取”脂质
- 将20μL白细胞悬浮液(约20-40μg蛋白质)转移到1.5mL管中,并以16,000× g 旋转30秒。
- 弃去上清液,向剩余的沉淀中加入10μLCHCl3 ,并反复移液以促进脂质提取。
- 最后,向CHCl3中的沉淀中加入10μL9-氨基吖啶(9-AA)基质溶液(10mg / mL 9-AA在2-丙醇/乙腈中,60:40 v / v)。移液并反复分散以混合。
- 将含有CHCl3 和9-AA中脂质的溶液在16,000× g 下旋转30秒,然后将上清液作为0.35μL的液滴(每个样品重复三个)沉积在要分析的MALDI靶标(样品板)上(“干液滴”沉积法)。
- 让液滴风干至少10-15分钟。
3. 通过 MALDI-TOF/MS 进行脂质分析
- 在MALDI-TOF质谱仪上一式三份获取样品的质谱。
- 使用脂质标准品校准后(参见 材料表),将分析设置为负离子模式,并优化检测 m / z 范围从200 Th到2,000 Th进行小分子分析。
- 将激光通量保持在阈值(CL和MLCL)以上5%以具有S / N(至少2)。
- 使用延迟脉冲提取在反射器模式下采集光谱。对于每个质谱,平均2,000次激光射击(总和为4 x 500)。将门控矩阵抑制应用于400 Th,以防止检测器饱和。
4. 如何计算(MLCL + CLi)/CLm比率
- 运行 MALDI-TOF/MS 仪器软件(参见 材料表)以分析采集的光谱。
- 使用 “打开” 命令,打开“ 频谱浏览器 ”对话框,该对话框允许选择和加载感兴趣的频谱。
- 在菜单栏上,单击图标 平滑质谱 和 减去质谱基线。
- 单击 “文件>导出>质谱 ”,然后选择ASCII格式,将光谱导出为包含成对数据点的两列表: m / z (x)和强度(y)。将坐标复制并粘贴到电子表格程序中(*.xls)。
- 对每个分析样品的一式三份重复步骤4.2至4.4,将坐标粘贴到同一电子表格程序文件中,如图 1 所示(步骤1)。
- 按照图1(步骤2)中所示的x范围,对于列出的每个物种,通过SUM函数计算y1,y2和yy 3值的总和(一式三份)以获得峰面积(图1;步骤 3)。
- 通过 AVERAGE 函数执行一式三份面积值的 平均值 (图 1;步骤 3)。
- 将每个物种的平均值放在列中,如图 1 所示(步骤2)。
- 为了仅考虑CLm 72:7物种的第一同位素,如28所示,计算CLm 72:8的M + 2同位素与CLm 72:7的单同位素峰之间的重叠的同位素 校正(步骤 4)。
- 最后,计算(MLCL + CLi)/CLm比率,如图 1 所示(步骤5)。
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Representative Results
在这项研究中,描述了一种从1 mL全血中分离白细胞并通过MALDI-TOF / MS获得CL指纹图谱的简单而快速的方法(见 图2)。 图3 显示了从对照组和BTHS幼儿获得的白细胞的代表性CL指纹图谱的比较,在CL和MLCL质量(m / z)范围内。 表1 列出了在这些质谱中检测到的CL和MLCL物种。
TAFAZZIN基因中的缺陷通常决定了BTHS特异性的脂质谱,即MLCL和CLi形式的外观以及CL指纹中CL中CLM形式的减少。对照组白细胞的脂质谱通常仅表现出两种分子种类的CLm(图3的上图)。该质谱中存在的唯一感兴趣的峰是CLm物种:四亚油酰CL(18:2)4在m / z 1,448.0和CL(18:2)3(18:1)1在m / z 1,450.0。该方法允许它们在MALDI脂质谱中可视化,以便可以在健康表型中轻松鉴定和测量两种CL物种。
受BTHS影响的男孩的代表性CL指纹图谱显示不同的MALDI信号模式( 图3的下图)。CLm物种的信号较低,同时还发现两种CLi物种(m / z 1,404.0和1,430.0)和两种MLCL物种( m / z 1,165.8和1,191.8)的峰值(见 表1)。综上所述, 图3 中的数据清楚地表明,线粒体CL和MLCL物种可以很容易地通过对白细胞的MALDI-TOF/MS分析来检测。
先前的一项研究表明,通过 MALDI-TOF/MS 获得的白细胞脂质谱中计算的 (MLCL + CLi)/CLm 比率可用作 BTHS28 的诊断参数。在这项研究中,从健康受试者和BTHS男孩中分离的白细胞的CL指纹图谱学比较了28。在这里,添加了从11名儿科心力衰竭患者(1名BTHS受累和10名非BTHS受累)分离的白细胞的MALDI脂质谱中获得的结果。
图4 显示了来自9名BTHS患者,10名非BTHS患者(即心力衰竭患者)和22名健康受试者的脂质迷你提取物的MALDI质谱中计算的(MLCL + CLi)/ CLm比率;如前所述,该比率是通过考虑质谱中检测到的CL和MLCL峰的面积来计算的,但是强度也可以与类似的结果一起使用(未显示数据)。
BTHS患者的(MLCL + CLi)/CLm比值为7.2±2.9,而健康受试者和心力衰竭患者的计算结果分别为0.19±0.10和0.13±0.07(平均±SD)。可以看出,对照组(包括健康受试者和心力衰竭患者)和BTHS患者相隔一个数量级以上,表明该方法具有很强的诊断能力。
图1:(MLCL+ CLi)/CLm比率测定。 (MLCL + CLi)/CLm 比率的计算是使用 Excel 程序执行的。步骤1:目标物种的 m / z (x)/强度(y)表(一式三份)。步骤2:x范围表,用于计算每个峰值区域。步骤 3:计算 y1、y2 和 y3 值的总和和平均值(一式三份)。步骤4:计算同位素校正。步骤5:计算(MLCL + CLi)/ CLm比率。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:工作流程图。 从抽血到测试结果,只需要2小时。基于MALDI-TOF / MS的BTHS诊断只需几个步骤:(1)抽血;(2)右旋糖酐沉降红细胞,(3)残余红细胞裂解(pp1)和白细胞收集(pp2)离心,(4)脂质“小提取”,(5)样品沉积,(6)MALDI-TOF / MS分析。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:BTHS 诊断性白细胞 CL 指纹图谱。 显示了从对照组 (CTRL) 和代表性 Barth 综合征患者 (BTHS) 分离的白细胞的心磷脂指纹图谱的比较。红色条带突出显示未成熟形式的心磷脂(CLi)和单心磷脂(MLCL)物种的峰值,而蓝色条带则标记成熟形式的CL(CLm)的峰值。标有星号的信号是指神经节苷脂,本研究不感兴趣。 请点击此处查看此图的大图。
图4:对照组和BTHS患者的(MLCL + CLi)/ CLm比率。 误差线表示从三组所有受试者的测量平均值中获得的标准偏差:9名BTHS患者,10名非BTHS影响的心力衰竭患者和22名健康受试者。每个样品通过MALDI-TOF / MS(一式三份)进行分析。y 轴显示对数刻度。控件的上限截断值(如参考文献22,28 所示)为 0.4。 请点击此处查看此图的大图。
m/z [M-H]- | 分配 |
1165.8 | MLCL 52:2 |
1191.8 | MLCL 54:1 |
1404.0 | CLi 68:2 |
1430.0 | CLi 70:3 |
1448.0 | CL 72:8 |
1450.0 | CL 72:7 |
表1:MALDI-TOF质谱中分配给CL和MLCL物种的检测到的峰列表。
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Discussion
巴特综合征是一种先天性的新陈代谢错误和一种改变生活的疾病,可能被低估2,6。如前所述,一个促成因素可能是缺乏直接的诊断测试。在这里,描述了一种简单快捷的通过MALDI-TOF/MS测量白细胞中MLCL/CL比值的方法,用于BTHS筛选。此外,MALDI-TOF质谱仪广泛分布在世界各地的临床实验室中,不需要很高的分析专业知识31,32。
与现有方法相比,当前方法具有主要优势,因为它可以在单次运行的MS分析中同时检测分离的白细胞总脂质谱中的CL和MLCL物种,从而避免了 通过 HPLC进行标准脂质提取和分离的耗时步骤。除了时间因素之外,在工作流中包含更多步骤还可能会引入错误。即使对于没有脂质组学相关经验的操作人员,本方法也很容易。
这里描述的BTHS筛选方法不仅依赖于CLm水平的降低,而且还考虑了CLi物种的增加,这与MLCL物种的存在一起特异性地表明了CL代谢缺陷,即TAFAZZIN基因的突变。这种方法之所以成功,是因为使用9-AA作为MALDI分析的基质,这特别适合于检测CL物种23,25,即使这些物种是复杂脂质谱中的次要成分。
将这些结果与白细胞或血斑LC / MS研究中获得的结果进行比较20,21,22,BTHS患者的平均MLCL / CL比值在所有报告中约为10。相反,对照中的平均比率各不相同,发现它在22中约为0.001,在21中为0.01,最后在28中为0.1。最后一个值略高的原因是计算28中采取的保守方法。实际上,先前在28中报告的方法和此处描述的方法也包括在对照组的质谱中测量MLCL和CLi,其中这些方法几乎不存在。这实际上意味着要考虑噪音水平,这人为地增加了健康对照中的比率。这种警示性方法的原因是,低性能的MALDI-MS仪器可能不够灵敏,无法检测低水平的感兴趣脂质。通过考虑噪声水平,该方法假设对照组的MLCL和CLi基础水平以及患者中的CLm基础水平。值得注意的是,即使采用这种预防性方法,应用MLCL/CL比值也会使BTHS患者和对照组之间的MLCL/CL比值相差>10倍(见图4)。因此,这里描述的测定保持100%的敏感性和特异性21,22,28。
这种方法的一个局限性在于它使用1 mL血液,尽管在实践中可以缩小到500μL。与使用血斑的LC / MS方法相比,这当然是一个缺点,后者可以与普通邮件一起运输,通常由约50μL血液制成。然而,这种MALDI方法的主要优点是,没有MS分析经验的操作员可以在2小时内执行。
总之,所提出的测定方法很简单,可以很容易地整合到临床生物化学实验室的常规工作中。这可能会增加可分析样本的数量,从而有助于识别新的隐藏病例。
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Disclosures
所有作者都声明,该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
Acknowledgments
我们感谢BTHS的个人及其家人参与我们的研究。我们感谢美国巴特综合症基金会和英国巴特综合症信托基金会的支持,以及在布里斯托尔年会上帮助收集血液样本。这项研究由美国巴特综合症基金会,Barth Italia Onlus和Apulia地区资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
References
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