Summary
Este protocolo muestra cómo obtener una "huella digital" espectrométrica de masas de cardiolipina leucocitaria para el diagnóstico del síndrome de Barth. La evaluación de la relación monolisocardiolipina a cardiolipina elevada discrimina a los pacientes con síndrome de Barth de los pacientes con insuficiencia cardíaca de control con 100% de sensibilidad y especificidad.
Abstract
La cardiolipina (CL), un fosfolípido dimérico que lleva cuatro cadenas de ácidos grasos en su estructura, es el marcador lipídico de las mitocondrias, en el que desempeña un papel crucial en el funcionamiento de la membrana interna. Su metabolito monolisocardiolipina (MLCL) está fisiológicamente casi ausente en el extracto lipídico de células animales y su aparición es el sello distintivo del síndrome de Barth (BTHS), una enfermedad genética rara y a menudo mal diagnosticada que causa miocardiopatía grave en la infancia. El método descrito aquí genera una "huella dactilar de cardiolipina" y permite un ensayo simple de los niveles relativos de las especies de CL y MLCL en los perfiles lipídicos celulares. En el caso de los leucocitos, solo se requiere 1 ml de sangre para medir la relación MLCL / CL a través de la ionización por desorción por láser asistida por matriz: tiempo de vuelo / espectrometría de masas (MALDI-TOF / MS) justo dentro de las 2 h posteriores a la extracción de sangre. El ensayo es sencillo y se puede integrar fácilmente en el trabajo de rutina de un laboratorio de bioquímica clínica para detectar BTHS. La prueba muestra una sensibilidad y especificidad del 100% para BTHS, lo que la convierte en una prueba de diagnóstico adecuada.
Introduction
El síndrome de Barth (BTHS) es una enfermedad rara ligada al cromosoma X caracterizada por miocardiopatía de inicio temprano, miopatía del músculo esquelético, retraso en el crecimiento, neutropenia, disfunción variable de la cadena respiratoria mitocondrial y estructura mitocondrial anormal 1,2,3,4,5. BTHS tiene una prevalencia de un caso por millón de hombres con actualmente menos de 250 casos conocidos en todo el mundo, aunque es ampliamente aceptado que la enfermedad está infradiagnosticada 2,6. BTHS resulta de mutaciones de pérdida de función del gen Tafazzin (TAFAZZIN) localizado en el cromosoma Xq28.12 7,8 que causan una remodelación deficiente del fosfolípido mitocondrial cardiolipina (CL), un proceso que normalmente conduce a una composición de acilo altamente simétrica e insaturada 9,10. Cl ha sido considerado el lípido característico de las mitocondrias, donde es un componente importante de la membrana interna, vital para la fosforilación oxidativa (es decir, el metabolismo energético mitocondrial), la formación de supercomplejos, la importación de proteínas y está involucrado en la dinámica mitocondrial, la mitofagia y la apoptosis 11,12,13,14,15,16 . Tras la pérdida de la función de TAFAZZIN, la remodelación de CL falla y surgen anomalías específicas de fosfolípidos en las mitocondrias de pacientes con BTHS: el nivel maduro de CL (CLm) disminuye, mientras que se produce un aumento de los niveles de monolisocardiolipina (MLCL) y una composición alterada de CL acilo (es decir, especies de CL inmaduras, CLi). Esto lleva a un aumento dramático de la relación MLCL/CL17.
El diagnóstico de BTHS es a menudo difícil, ya que el trastorno presenta características clínicas y bioquímicas extremadamente variables y puede diferir entre los individuos afectados de la misma familia y dentro de un paciente a lo largo del tiempo 3,5. Muchos niños BTHS muestran un nivel muy alto de excreción urinaria de ácido 3-metilglutacónico (3-MGCA), pero el nivel de orina puede ser normal o solo un aumento leve en pacientes con el tiempo3. Sin embargo, el aumento de 3-MGCA es una característica de varios otros trastornos mitocondriales y no mitocondriales, como la deficiencia de 3-metilglutaconil-CoA hidratasa (defecto AUH), aciduria 3-metilglutacónica, distonía-sordera, encefalopatía, síndrome de Leigh (MEGDEL), síndrome de Costeff y miocardiopatía dilatada con ataxia (DCMA)18,19 . Por lo tanto, la escasa especificidad del 3-MCGA como marcador de BTHS y la enorme variabilidad en los pacientes hacen que el diagnóstico bioquímico sea ambiguo.
Además, se han descrito más de 120 mutaciones diferentes de TAFAZZIN que causan el trastorno5 y, por lo tanto, un diagnóstico genético puede ser complicado, lento y costoso. Además, el análisis molecular del gen TAFAZZIN puede dar lugar a resultados falsos negativos en presencia de mutaciones en secuencias no codificantes o reguladoras3. BTHS puede ser probado inequívocamente determinando las cantidades relativas y la distribución de las especies (monolyso-)CL y confirmado por secuenciación del gen TAFAZZIN o viceversa.
Una prueba práctica para el diagnóstico es la medición de la relación MLCL/CL mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y análisis de ionización por electropulsión / espectrometría de masas (ESI/MS) en el punto sanguíneo20,21. La medición del nivel de CL por sí sola no es adecuada para el diagnóstico, ya que algunos pacientes tienen niveles casi normales de CL pero alteran la relación MLCL/CL. Por lo tanto, la medición de la relación MLCL/CL tiene una sensibilidad y especificidad del 100% para el diagnóstico de BTHS21. Se ha establecido otro método validado basado en el análisis de HPLC y ESI/MS sobre leucocitos22, pero las complejas técnicas cromatográficas para la separación de lípidos previamente extraídos y la cara de los instrumentos restringen este análisis a unos pocos laboratorios clínicos. Todos estos factores, junto con la falta de una prueba diagnóstica directa, han contribuido al infradiagnóstico de la afección.
MALDI-TOF/MS es otra herramienta válida en el análisis de lípidos23,24. Esta técnica analítica se puede utilizar para obtener directamente perfiles lipídicos de diversas muestras biológicas, saltándose así los pasos de extracción y separación 25,26,27,28,29, incluso en secciones de tejido para aplicaciones de MS Imaging 30. Dada esta ventaja, se desarrolló un método simple y rápido para diagnosticar BTHS mediante el perfil de CL mitocondrial en leucocitos intactos con MALDI-TOF/MS28. El aislamiento leucocitario de solo 1 ml de sangre total por sedimentación y lisis de eritrocitos es sencillo y no requiere equipos o reactivos especiales. Además, se describió un protocolo rápido de "miniextracción" de lípidos aplicable a cantidades diminutas de leucocitos para garantizar la adquisición exitosa de espectros que tienen señales MS más limpias con una relación señal-ruido (S / N) más alta que en las obtenidas de leucocitos intactos28. Este paso adicional lleva poco tiempo y permite que los análisis sean reproducibles incluso cuando se llevan a cabo en instrumentos de EM con poca sensibilidad. En resumen, el método analítico descrito aquí requiere una preparación mínima de la muestra porque se puede omitir la separación cromatográfica de lípidos que consume mucho tiempo y mano de obra, lo que acelera la prueba.
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Protocol
Las muestras de sangre de donantes sanos y pacientes con insuficiencia cardíaca se recogieron en el Hospital Policlínico de Bari (Italia), mientras que las muestras de pacientes con BTHS fueron obtenidas por la clínica BTHS del Servicio Nacional de Salud del Reino Unido en el Hospital Real para Niños de Bristol (Reino Unido). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de donantes, pacientes y padres sanos (cuando corresponda) y las aprobaciones de los respectivos comités de ética.
NOTA: Si no se usa inmediatamente, la sangre (en tubo de gel K-EDTA) se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 24-48 h.
1. Aislamiento de leucocitos por sedimentación de dextrano de glóbulos rojos (glóbulos rojos)
- Coloque muestras de sangre (en K-EDTA) en un agitador orbital durante 10 minutos para mezclar sangre.
- A 0,9 ml de sangre total en un tubo de 1,5 ml, agregue 0,1 ml de solución de dextrano al 20% (masa molecular > 100 kDa, en NaCl al 0,9%). Pipete y disperse la suspensión suavemente 20 veces mientras evita las burbujas de aire que de otro modo retendrían los glóbulos rojos en la parte superior del tubo. Deje sedimentar los glóbulos rojos durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente.
- Con una jeringa, recoja y transfiera el sobrenadante amarillo a un tubo de 15 ml, y luego centrífique a 400 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente (sin freno, rotor de cuchara oscilante).
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet que contiene principalmente leucocitos y glóbulos rojos residuales en 0,6 ml de agua bidestilocida helada (ddH2O).
- Después de ~15 s, agregue 0.2 mL de 0.6 M KCl a la suspensión celular para restaurar la osmolaridad correcta. El choque osmótico corto lisará los glóbulos rojos y dejará intactos los leucocitos. Ajuste el volumen final a 2,5 ml con 1x PBS.
- Centrifugar la suspensión a 400 x g durante 15 min a temperatura ambiente (sin freno, rotor de cucharón oscilante). Deseche el sobrenadante y lave el pellet de leucocitos nuevamente con 2.5 mL de 1x PBS.
- Centrifugar como en el paso 1.6 y desechar el sobrenadante. Resuspendir el pellet que contiene leucocitos en 200 μL de ddH2O esterilizado.
NOTA: En la experiencia de los autores, esto corresponde a un contenido de proteína que oscila entre 200 μg y 400 μg. - Congele la suspensión a -80 °C o realice directamente la extracción de lípidos de la siguiente manera.
2. "Miniextracción" de lípidos de leucocitos aislados
- Transfiera 20 μL de suspensión de leucocitos (aproximadamente 20-40 μg de proteínas) a un tubo de 1,5 ml y gire a 16.000 x g durante 30 s.
- Deseche el sobrenadante, agregue 10 μL de CHCl3 al pellet restante y pipetee repetidamente para promover la extracción de lípidos.
- Finalmente, agregue 10 μL de solución de matriz de 9-aminoacridina (9-AA) (10 mg/ml 9-AA en 2-propanol/acetonitrilo, 60:40 v/v) al pellet en CHCl3. Pipetear y dispersar repetidamente para mezclar.
- Girar la solución que contiene lípidos en CHCl3 y 9-AA a 16.000 x g durante 30 s, y luego depositar el sobrenadante como gotas de 0,35 μL (tres réplicas para cada muestra) en el objetivo MALDI (placa de muestra) a analizar (método de deposición de gotas secas").
- Deje que las gotas se sequen al aire al menos durante 10-15 min.
3. Análisis de lípidos por MALDI-TOF/MS
- Adquirir espectros de masas de muestras por triplicado en un espectrómetro de masas MALDI-TOF.
- Después de la calibración con estándares de lípidos (ver Tabla de Materiales), establezca los análisis en el modo de iones negativos y optimice el rango de detección m/z de 200 Th a 2.000 Th para el análisis de moléculas pequeñas.
- Mantenga la fluencia del láser un 5% por encima del umbral (de CL y MLCL) para tener un S / N (al menos 2).
- Adquirir espectros en modo reflector mediante extracción pulsada retardada. Para cada espectro de masas, un promedio de 2.000 disparos láser individuales (suma de 4 x 500). Aplique supresión de matriz cerrada a 400 Th para evitar la saturación del detector.
4. Cómo calcular la relación (MLCL + CLi)/CLm
- Ejecute el software del instrumento MALDI-TOF/MS (consulte la Tabla de materiales) para analizar los espectros adquiridos.
- Con el comando Abrir , abra el cuadro de diálogo Spectrum Browser que permite seleccionar y cargar el espectro de interés.
- En la barra de menús, haga clic en los iconos Suavizar espectro de masa y Restar línea base de espectro de masa.
- Haga clic en Archivo > Exportar > espectro de masas y elija el formato ASCII para exportar el espectro como una tabla de dos columnas con pares de puntos de datos: m / z (x) e intensidad (y). Copie y pegue las coordenadas en un programa de hoja de cálculo (*.xls).
- Repita los pasos 4.2 a 4.4 para las triplicaciones de cada muestra analizada, pegando las coordenadas en el mismo archivo de programa de hoja de cálculo como se muestra en la Figura 1 (Paso 1).
- Siguiendo los rangos x mostrados en la Figura 1 (Paso 2) para cada especie listada, calcule la suma de los valores y1, y2 e y3 (triplicados) mediante la función SUMA para obtener el área pico (Figura 1; Paso 3).
- Realizar el promedio de los valores de área triplicada por función PROMEDIO (Figura 1; Paso 3).
- Coloque los valores de área promedio para cada especie en la columna como se muestra en la Figura 1 (Paso 2).
- Para considerar solo el primer isotopólogo de la especie CLm 72:7 como en28, calcule la corrección isotópica para la superposición entre el isotopólogo M + 2 del CLm 72: 8 y el pico monoisotópico de CLm 72: 7 como se muestra en la Figura 1 (Paso 4).
- Finalmente, calcule la relación (MLCL + CLi)/CLm como se muestra en la Figura 1 (Paso 5).
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Representative Results
En este estudio, se ha descrito un método simple y rápido para aislar leucocitos de 1 ml de sangre total y obtener huellas dactilares de CL por MALDI-TOF/MS (ver Figura 2). La Figura 3 muestra la comparación de las huellas dactilares representativas de CL de leucocitos, obtenidas de sujetos de control y niños jóvenes con BTHS, en el rango de masa CL y MLCL (m / z). La Tabla 1 enumera las especies de CL y MLCL detectadas en estos espectros de masas.
Los defectos en el gen TAFAZZIN típicamente determinan un perfil lipídico específico para el BTHS, es decir, la aparición de formas MLCL y CLi junto con la reducción de las formas CLm en la huella digital CL. El perfil lipídico de los leucocitos de los sujetos de control exhibe típicamente sólo dos especies moleculares de CLm (panel superior de la Figura 3). Los únicos picos de interés presentes en este espectro de masas son las especies de CLm: tetralinoleoyl CL (18:2)4 a m/z 1,448.0 y CL (18:2)3 (18:1)1 a m/z 1,450.0. Este método permite su visualización en el perfil lipídico MALDI para que las dos especies de CL puedan ser fácilmente identificadas y medidas en el fenotipo sano.
La huella dactilar CL representativa de un niño afectado por BTHS muestra un patrón diferente de señales MALDI (panel inferior de la Figura 3). Las señales atribuibles a las especies de CLm son menores, mientras que también se encuentran picos asignados a dos especies de CLi (a m/z 1,404.0 y 1,430.0) y dos especies de MLCL (a m/z 1,165.8 y 1,191.8) (ver Tabla 1). En resumen, los datos de la Figura 3 muestran claramente que las especies mitocondriales de CL y MLCL pueden detectarse fácilmente mediante análisis MALDI-TOF/MS de leucocitos.
Un estudio previo ha demostrado que la relación (MLCL + CLi)/CLm calculada en perfiles lipídicos de leucocitos obtenidos por MALDI-TOF/MS puede utilizarse como parámetro diagnóstico para BTHS28. En ese estudio, se comparó la toma de huellas dactilares CL de leucocitos aislados de sujetos sanos y niños BTHS28. Aquí, se agregaron los resultados obtenidos del perfil lipídico MALDI de leucocitos aislados de 11 pacientes con insuficiencia cardíaca pediátrica (un afectado por BTHS y 10 no afectados por BTHS).
La Figura 4 muestra las proporciones calculadas (MLCL + CLi)/CLm en los espectros de masas MALDI de miniextractos lipídicos de leucocitos de nueve pacientes con BTHS, 10 no afectados por BTHS (es decir, pacientes con insuficiencia cardíaca) y 22 sujetos sanos; la relación se ha calculado considerando el área de picos cl y MLCL detectados en los espectros de masas, como se describe, pero las intensidades también se pueden usar con resultados similares (datos no mostrados).
La relación (MLCL + CLi)/CLm para los pacientes con BTHS fue de 7,2 ± 2,9, mientras que las calculadas para sujetos sanos y pacientes con insuficiencia cardíaca fueron de 0,19 ± 0,10 y 0,13 ± 0,07, respectivamente (media ± DE). Se puede ver que los grupos de control (tanto sujetos sanos como pacientes con insuficiencia cardíaca) y los pacientes con BTHS están separados por más de un orden de magnitud, lo que demuestra que este método tiene un fuerte poder de diagnóstico.
Figura 1: Determinación de la relación (MLCL+CLi)/CLm. El cálculo de la relación (MLCL + CLi)/CLm se realiza utilizando el programa Excel. Paso 1: Tabla de m/z (x) / intensidad (y) para especies de interés (en triplicados). Paso 2: Tabla de rangos x para calcular cada área de pico. Paso 3: Cálculo de suma y promedio de valores y1, y2 e y3 (triplicados). Paso 4: Cálculo de la corrección isotópica. Paso 5: Cálculo de la relación (MLCL+CLi)/CLm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo de trabajo. Desde la extracción de sangre hasta los resultados de la prueba, solo se necesitan 2 h. Diagnóstico de BTHS basado en MALDI-TOF/MS en pocos pasos: (1) Extracción de sangre; (2) Sedimentación de dextrano de eritrocitos, (3) lisis residual de eritrocitos (pp1) y recolección de leucocitos (pp2) por centrifugación, (4) "miniextracción" de lípidos, (5) deposición de muestras, (6) análisis MALDI-TOF/MS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Huellas dactilares cl de leucocitos de diagnóstico BTHS. Se muestra la comparación de las huellas dactilares de cardiolipina de leucocitos aislados de un sujeto control (CTRL) y un paciente representativo con síndrome de Barth (BTHS). Las bandas rojas resaltan los picos de la forma inmadura de las especies de cardiolipina (CLi) y monolisocardiolipina (MLCL), mientras que la banda azul marca los picos de las formas maduras de CL (CLm). Las señales marcadas con un asterisco se refieren a gangliósidos y no son de interés para este estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: (MLCL + CLi)/CLm ratios en controles y pacientes con BTHS. Las barras de error indican desviaciones estándar obtenidas de la media de las mediciones de todos los sujetos para cada uno de los tres grupos: nueve pacientes con BTHS, 10 pacientes con insuficiencia cardíaca no afectada por BTHS y 22 sujetos sanos. Cada muestra fue analizada por MALDI-TOF/MS (por triplicado). El eje y muestra una escala logarítmica. El valor de corte superior de los controles, calculado como en las referencias22,28 es 0,4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| m/z [M-H]- | Asignación |
| 1165.8 | MLCL 52:2 |
| 1191.8 | MLCL 54:1 |
| 1404.0 | CLi 68:2 |
| 1430.0 | CLi 70:3 |
| 1448.0 | CLm 72:8 |
| 1450.0 | CLm 72:7 |
Tabla 1: Lista de picos detectados asignados a especies CL y MLCL en los espectros de masas MALDI-TOF.
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Discussion
El síndrome de Barth es un error innato del metabolismo y una afección que cambia la vida y que es probable que no se diagnostiquelo suficiente 2,6. Como se mencionó anteriormente, un factor que contribuye puede ser la falta de una prueba de diagnóstico directa. Aquí, se describió un método simple y rápido para medir la relación MLCL/CL por MALDI-TOF/MS en leucocitos para el cribado de BTHS. Además, los espectrómetros de masas MALDI-TOF están ampliamente distribuidos entre los laboratorios clínicos de todo el mundo y no requieren una gran experiencia analítica31,32.
El método actual tiene una gran ventaja sobre los enfoques existentes, ya que puede detectar simultáneamente en una sola ejecución de análisis de EM las especies CL y MLCL en el perfil lipídico total de leucocitos aislados, evitando pasos lentos de extracción y separación de lípidos estándar a través de HPLC. Además del factor tiempo, tener más pasos en el flujo de trabajo puede potencialmente introducir errores. El método actual es fácil incluso para operadores sin experiencia relevante en lipidómica.
El método para la detección de BTHS descrito aquí no solo se basa en la disminución de los niveles de CLm, sino que también considera el aumento de las especies de CLi, que junto con la presencia de especies de MLCL sugieren específicamente el defecto del metabolismo de CL, es decir, mutaciones en el gen TAFAZZIN. Este enfoque es exitoso debido al uso de 9-AA como matriz para el análisis MALDI, que es particularmente adecuado para la detección de la especie CL23,25, incluso cuando estas especies son componentes menores en perfiles lipídicos complejos.
Comparando estos resultados con los obtenidos en estudios de LC/EM en leucocitos o manchas sanguíneas 20,21,22, la relación MLCL/CL media en pacientes con BTHS es de alrededor de 10 en todos los informes. Por el contrario, la relación media en los controles varía y se encuentra que es ~ 0.001 en22, 0.01 en21 y finalmente 0.1 en28. La razón por la que el último valor es ligeramente superior es el enfoque conservador adoptado en los cálculos28. De hecho, el método reportado previamente en28 y el descrito aquí incluyen mediciones para MLCL y CLi también en los espectros de masas de los controles, donde estos están casi ausentes. De hecho, esto significa tener en cuenta los niveles de ruido, que aumentan artificialmente la proporción en los controles saludables. La razón de este enfoque de precaución es que los instrumentos MALDI-MS de bajo rendimiento pueden no ser lo suficientemente sensibles como para detectar niveles bajos de lípidos de interés. Al considerar los niveles de ruido, este método asume un nivel basal de MLCL y CLi indetectables en los controles, y de CLm en los pacientes. En particular, incluso con este enfoque de precaución, la aplicación de la relación MLCL/CL produce una diferencia de >10 veces en la relación MLCL/CL entre los pacientes con BTHS y los grupos de control (ver Figura 4). Por lo tanto, el ensayo aquí descrito mantiene una sensibilidad y especificidad del 100% 21,22,28.
Una limitación de este método es que emplea 1 ml de sangre, aunque se puede reducir a 500 μL en la práctica. Esto es ciertamente un inconveniente en comparación con los métodos LC / MS que emplean manchas de sangre, donde estas últimas se pueden enviar con correo regular y generalmente están hechas de ~ 50 μL de sangre. Sin embargo, este método MALDI tiene la gran ventaja de ser ejecutable por operadores sin experiencia previa en análisis de EM, y dentro de solo 2 h desde la retirada.
En resumen, el ensayo propuesto es simple y se puede integrar fácilmente en el trabajo rutinario de un laboratorio de bioquímica clínica. Esto podría aumentar potencialmente el número de muestras analizables, contribuyendo así a la identificación de nuevos casos ocultos.
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Disclosures
Todos los autores declaran que el estudio se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Estamos agradecidos con las personas con BTHS y sus familias por participar en nuestra investigación. Agradecemos a barth Syndrome Foundation US y Barth Syndrome UK Trust por su apoyo y por ayudar con la recolección de las muestras de sangre en la reunión anual en Bristol. Este estudio fue financiado por Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus y Apulia Region.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
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