Summary
Wir führten eine einpunktige, lipophile Zell-Tracer-Injektion durch, um Endothelzellen zu verfolgen, gefolgt von einer Arteriotomie und dem Nähen von Seitenwandaneurysmen an der Bauchrattenaorta. Die Neointima-Bildung schien bei dezellularisierten Aneurysmen von der Elternarterie abhängig zu sein und wurde durch die Rekrutierung aus Aneurysmawandzellen in lebenswichtigen zellreichen Wänden gefördert.
Abstract
Mikrochirurgisches Clipping schafft eine nachfolgende Barriere des Blutflusses in intrakranielle Aneurysmen, während die endovaskuläre Behandlung auf Neointima- und Thrombusbildung beruht. Die Quelle der Endothelzellen, die die endoluminale Schicht der Neointima bedecken, bleibt unklar. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, den Ursprung neointimabildender Zellen nach Zell-Tracer-Injektion im bereits etablierten mikrochirurgischen Seitenwand-Aneurysma-Modell der Helsinki-Ratte zu untersuchen.
Seitenwandaneurysmen wurden bei männlichen Lewis-Ratten durch Nähen von dezellularisierten oder lebenswichtigen arteriellen Beuteln von Ende zu Seite an der Aorta erzeugt. Vor der Arteriotomie mit Aneurysmanaht wurde eine Zell-Tracer-Injektion mit CM-Dil-Farbstoff in die geklemmte Aorta durchgeführt, um Endothelzellen im benachbarten Gefäß zu markieren und ihre Proliferation während der Nachbeobachtung (FU) zu verfolgen. Behandlung mit anschließendem Aufwickeln (n = 16) oder Stenting (n = 15). An der FU (7 Tage oder 21 Tage) unterzogen sich alle Ratten einer Fluoreszenzangiographie, gefolgt von einer Aneurysma-Ernte und einer makroskopischen und histologischen Bewertung mit immunhistologischen Zellzahlen für bestimmte Regionen von Interesse.
Keines der 31 Aneurysmen war bei der Nachuntersuchung gerissen. Vier Tiere starben vorzeitig. Eine makroskopisch residuale Perfusion wurde bei 75,0 % gewickelten und 7,0 % bei entstentten Ratten beobachtet. Die Menge an zell-tracer-positiven Zellen war bei dezellularisierten Stented im Vergleich zu gewickelten Aneurysmen in Bezug auf Thrombus an Tag 7 (p = 0,01) und Neointima an Tag 21 (p = 0,04) signifikant erhöht. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei Thrombus oder Neointima bei vitalen Aneurysmen gefunden.
Diese Ergebnisse bestätigen schlechtere Heilungsmuster bei gewickelten Aneurysmen im Vergleich zu gestulten Aneurysmen. Die Neointima-Formation scheint bei dezellularisierten Aneurysmen besonders abhängig von der Elternarterie zu sein, während sie durch die Rekrutierung aus Aneurysmawandzellen in lebenswichtigen zellreichen Wänden unterstützt wird. In Bezug auf die Translation könnte die Stent-Behandlung für stark degenerierte Aneurysmen besser geeignet sein, während das Aufwickeln allein für Aneurysmen mit meist gesunden Gefäßwänden ausreichend sein könnte.
Introduction
Subarachnoidalblutungen, die durch die Ruptur eines intrakraniellen Aneurysmas (IA) verursacht werden, sind eine verheerende neurochirurgische Erkrankung, die mit hoher Morbidität und Mortalität einhergeht 1,2,3,4. Neben dem mikrochirurgischen Clipping, das einen direkten Endothel-zu-Endothel-Kontakt ermöglicht, haben endovaskuläre Geräte in den letzten Jahrzehnten zunehmend an Bedeutung für die Behandlung von rupturierten und zufällig entdeckten IAs gewonnen. Die Heilungsreaktion bei endovaskulär behandelten invasiven Therapien hängt hauptsächlich von der Neointima-Bildung und der Thrombusorganisation ab. Beides sind synergetische Prozesse, abhängig von der Zellmigration aus dem benachbarten Gefäß und der Aneurysmawand. 5 Bis heute ist der Ursprung von Endothelzellen bei der Neointima-Bildung von endovaskulär behandelten Aneurysmen unklar. In der Literatur gibt es eine anhaltende Debatte über die Quelle, aus der Neointima-bildende Zellen rekrutiert werden.
Durch die Verwendung einer Zell-Tracer-Injektion von CM-Dil-Farbstoff (siehe Materialtabelle) in die Bauchaorta von Ratten wollten wir die Rolle von Endothelzellen, die aus der Elternarterie stammen, bei der Neointima-Bildung an zwei verschiedenen FU-Zeitpunkten (Tag 7 und Tag 21) analysieren (Abbildung 1). Ein Vorteil des Modells ist die direkte lokale Zell-Tracer-Inkubation in vivo in einer Elternarterie vor der Aneurysmanaht, die FU zu späteren Zeitpunkten ermöglicht. In-vivo-Injektionstechniken , wie die Zell-Tracer-Inkubation, wurden in der Literatur nicht beschrieben. Ein Vorteil dieser Technik ist die direkte, einpunktige, intraoperative In-vivo-Injektion , die das Modell robust und reproduzierbar macht.
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Protocol
Die tierärztliche Betreuung erfolgte nach institutionellen Richtlinien. Die Experimente wurden von der Lokalen Ethikkommission, Schweiz, genehmigt (BE 60/19). Die ARRIVE-Richtlinien und 3R-Prinzipien wurden strikt befolgt6,7. Einunddreißig männliche Lewis-Ratten, 12 Wochen alt und mit einem Gewicht von 492 ± 8 g, wurden eingeschlossen. Halten Sie alle Ratten bei einer Raumtemperatur von 23 °C und einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus auf. Bieten Sie freien Zugang zu Wasser und Pellets. Statistische Analysen wurden mit dem nichtparametrischen Wilcoxon-Mann-Whitney U-Test durchgeführt. Wahrscheinlichkeitswerte (p) von ≤ 0,05 und/oder ≤ 0,01 wurden als signifikant eingestuft.
1. Präoperative Phase-allgemeine Vorbereitung und anästhesische Aspekte
- Randomisieren Sie Ratten entweder in Spulen- oder Stentbehandlungsgruppen (Abbildung 2) über ein webbasiertes Randomisierungssystem. Führen Sie nun eine präoperative klinische Untersuchung aller Tiere durch, die für eine Operation geplant sind, neben einem ruhigen, aseptischen Operationssaal mit einer Raumtemperatur von 23 ± 3 ° C. Analysieren Sie das Verhalten der Tiere und untersuchen Sie die Schleimhäute und den Turgor im Rahmen der präoperativen klinischen Untersuchung.
- Notieren Sie das Gewicht jedes Tieres.
- Vor der Operation die arteriellen Beutel von Spenderratten in 0,1% Natriumdodecylsulfat für 10 h bei 37 ° C inkubieren, um dezellularisierte Aneurysmenzu erhalten 8. Holen Sie diese Beutel einige Tage vor der Operation von Spendertieren ab.
- Bereiten Sie die gesamte Länge der Bauchaorta mit Mikroschere und Pinzette vor und tragen Sie 6-0 nicht resorbierbare Ligaturen in einem Abstand von 3-4 mm auf.
- Erzeugen Sie direkt lebenswichtige Aneurysmen intraoperativ durch einen zuvor ligierten arteriellen Gefäßbeutel aus dem Brustteil eines Spendertieres9. Führen Sie eine Thorakotomie mit einer Schere und einer chirurgischen Pinzette zum angegebenen FU-Zeitpunkt durch und ligiieren Sie den Gefäßbeutel in der gewünschten Länge.
- Implantieren Sie den Beutel direkt in den Empfänger und ernten Sie das Aneurysma vom Spendertier für die weitere makroskopische Analyse und histologische Verarbeitung.
- Für die Anästhesieinduktion legen Sie alle Ratten in eine saubere Box, die mit Sauerstoff (O2) versorgt ist, bis sie nach 5-10 min das Bewusstsein verlieren. Anästhesieren Sie Ratten mit einer subkutanen (SC) Injektion einer Mischung aus Fentanyl 0,005 mg/kg, Medetomidin 0,15 mg/kg und Midazolam 2 mg/kg.
HINWEIS: Dies gewährleistet eine Operationsebene von mindestens 45 min. - Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen des Pedalentzugsreflexes.
- Legen Sie die Ratten in Rückenlage und rasieren Sie den Thoracoabdominalteil mit einem elektrischen Rasierer.
- Befestigen Sie die 4 Pfoten der Ratten mit Klebeband auf einem Brett, das von einem Heizkissen bedeckt ist, das mit einer autoregulierenden rektalen Sonde verbunden ist. Setzen Sie die rektale Sonde in den Anus der Ratte ein, um die gewünschte Temperatur von 37 ° C mit Hilfe des Heizkissens aufrechtzuerhalten.
- Installieren Sie nun einen Sensor am rechten Hinterbein, der mit einem computergestützten System verbunden ist, um die Vitalparameter intraoperativ zu überprüfen.
- Bedecken Sie Nase und Mund der Ratte mit einer Gesichtsmaske. Wenn eine längere Anästhesie erforderlich ist, beginnen Sie mit Isofluran (1,0-2,0% titriert, um in 100% O2 zu wirken).
- Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit Povidon-Jod oder wechselnden Desinfektionsmitteln und drapieren Sie das Operationsfeld steril.
- Für die perianästhetische Pflege tragen Sie ein steriles ophthalmologisches Gleitmittel auf die Augen auf und bedecken Sie sie mit einer undurchsichtigen Folienmaske, um ein Austrocknen und Beschädigen durch die OP-Lampe zu verhindern.
- Versorgen Sie sich während der gesamten Operation kontinuierlich mit Sauerstoff über die Gesichtsmaske, überwachen Sie die Körpertemperatur und liefern Sie Wärme mit einem Heizkissen, um die Normothermie aufrechtzuerhalten.
- Überwachen Sie kontinuierlich andere Vitalfunktionen (Puls- und Atemdehnung, Herz- und Atemfrequenz sowie Sauerstoffsättigung).
2. Operative Phase - Zell-Tracer-Injektion
HINWEIS: Der detaillierte chirurgische Ansatz im mikrochirurgischen Seitenwandaneurysma Modell9 der Helsinkier Ratte und Techniken zur Spulen- und Stentimplantation werden an anderer Stellebeschrieben 8,10,11.
- Lagern Sie den fluoreszierenden lipophilen Zell-Tracer die ganze Zeit bei ≤ -20 °C, geschützt vor Licht.
- Führen Sie die Operation durch, indem Sie die Rattenaorta und die Cavalvene vorbereiten, gefolgt von der Trennung beider sowie proximaler und distaler temporärer Klemmung der Aorta.
HINWEIS: Diese Technik wurde bereits9 beschrieben.- Klemmen Sie die proximalen und distalen Teile der Aorta mit zwei temporären Titanclips.
- Legen Sie jeweils einen Mikrotupfer mit violetter Polsterung unter die proximalen und distalen Teile der Aorta, um die Arterie besser sichtbar zu machen.
- Schützen Sie nun den Bauch mit nasser Gaze.
- Am Tag der Operation werden 2 μL des Zell-Tracers durch Pipettieren in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst.
- Die Mischung wird in eine 1-ml-Spritze überführt, die mit einer sterilen Kanüle mit 27-1/2 G (0,4 x 13 mm) ausgestattet ist.
HINWEIS: Achten Sie darauf, bei den Schritten 2.5 und 2.6 keine Lichteinwirkung zu vermeiden. - Schalten Sie das Licht im Operationssaal aus. Während Sie unter ein Mikroskop schauen, führen Sie die Ein-Punkt-Injektion in den mittleren ventralen Teil der Aorta mit einer Mikrozange durch und injizieren Sie vorsichtig 1 ml heparinisierte 0,9% ige Kochsalzlösung.
- Injizieren Sie den Zell-Tracer vorsichtig (Video 1) und schalten Sie sofort auch das Operationsmikroskop aus. Schützen Sie den Bauch erneut mit nasser Gaze.
- Lassen Sie den Farbstoff mindestens 15 min inkubieren. Schalten Sie nach der Inkubationszeit das Mikroskop und die Operationssaalbeleuchtung ein.
- Führen Sie die Längsarteriotomie und das Nähen des Aneurysmas durch, wie an anderer Stellebeschrieben 11.
- Verwenden Sie eine Mikropinzette und eine Mikroschere, um die Arteriotomie so durchzuführen, dass ihre Länge den Durchmesser des geernteten Aneurysmas mittelt (Schritt 1.3). Um die richtige Länge zu gewährleisten, platzieren Sie das Aneurysma neben der Aorta, bevor Sie eine Arteriotomie durchführen. Nähen Sie das Aneurysma mit 8-10 Einzelstichen mit einer nicht resorbierbaren 10-0-Naht und entfernen Sie vorsichtig die temporären Klemmen, die distal unter kontinuierlicher Bewässerung mit heparinisierter Kochsalzlösung beginnen. Schließen Sie die Wunde in einer geschichteten Art und Weise. Bemerkenswert ist, dass Sie eine Spulenpackungsdichte von 1 cm verwenden.
ANMERKUNG: Die Technik der Spulen- oder Stentimplantation wurde an anderer Stellebeschrieben 8,10.
- Verwenden Sie eine Mikropinzette und eine Mikroschere, um die Arteriotomie so durchzuführen, dass ihre Länge den Durchmesser des geernteten Aneurysmas mittelt (Schritt 1.3). Um die richtige Länge zu gewährleisten, platzieren Sie das Aneurysma neben der Aorta, bevor Sie eine Arteriotomie durchführen. Nähen Sie das Aneurysma mit 8-10 Einzelstichen mit einer nicht resorbierbaren 10-0-Naht und entfernen Sie vorsichtig die temporären Klemmen, die distal unter kontinuierlicher Bewässerung mit heparinisierter Kochsalzlösung beginnen. Schließen Sie die Wunde in einer geschichteten Art und Weise. Bemerkenswert ist, dass Sie eine Spulenpackungsdichte von 1 cm verwenden.
3. Postoperative Phasenüberwachung und analgetische Versorgung
- Am Ende der Operation kehren Sie die Anästhesie mit einer SC-Injektionsmischung aus Buprenorphin 0,05 mg / kg, Atipamezol 0,75 mg / kg und Fumazenil 0,2 mg / kg um. Lassen Sie jedes betriebene Tier sich in einem sauberen Käfig erholen, bis es vollständig wach und warm ist, je nach Bedarf, mit einer Heizlampe.
- Verabreichen Sie 3 Tage lang 1 mg/kg Meloxicam (eine Injektion oder orale Anwendung pro Tag) und Buprenorphin (0,05 mg/kg viermal täglich) SC. Über Nacht Buprenorphin kontinuierlich im Trinkwasser mit der gleichen Dosierung bereitstellen: 6 ml Buprenorphin 0,3 mg/ml, 360 mL Trinkwasser, 10 ml 5% Glukose.
- In der unmittelbaren postoperativen Phase unterbringen Sie jedes Tier zum Schutz in einem einzigen Käfig. Gruppieren Sie die Tiere nach 24 Stunden neu.
- Wenn eine Ratte nach der SC-Injektion ein verzweifeltes oder aggressives Verhalten zeigt, verabreichen Sie Buprenorphin tagsüber im Trinkwasser.
- Stellen Sie weiches Futter auf dem Käfigboden bereit, um die Fütterung und Erholung postoperativ zu unterstützen.
- Beobachten und pflegen Sie alle Tiere gemäß dem Wohlfühl- und Schmerz-Score-Blatt.
- Verabreichen Sie bei Bedarf eine Rettungsanalgesie SC (Meloxicam 1 mg/kg und 0,05 mg/kg Buprenorphin).
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Representative Results
Insgesamt wurden 31 Tiere in die Laborumgebung einbezogen: 27 Ratten wurden in die endgültige statistische Analyse einbezogen; 4 Ratten starben vorzeitig (12,9% Mortalitätsrate). Intraoperativ war die Atemdehnung bei Stent- (12,9 μm ± 0,7) im Vergleich zu spulenbehandelten (13,5 μm ± 0,6) Ratten signifikant reduziert (p = 0,03). Die Fluoreszenzangiographie wurde für jede Ratte am Ende der abschließenden FU durchgeführt. Bei allen 6 mit Spulen behandelten Tieren war eine Reperfusion indiziert, während eine Reperfusion nur bei 12,5 % der 8 mit Stents behandelten Tiere beobachtet wurde.
Die gepoolten Baseline-Aneurysmavolumina für Tag 7 und Tag 21 unterschieden sich nicht signifikant (weder für dezellularisierte (p = 0,9) noch vitale (p = 0,1) Aneurysmen) zwischen den Spulen- oder Stentbehandlungsgruppen (Abbildung 3). Gepoolte FU-Volumina für dezellularisierte Aneurysmen zeigten ein nicht signifikantes Aneurysmawachstum in gewickelten Aneurysmen im Vergleich zu den Stented-Aneurysmen (p = 0,28), signifikant größer in der vital gewickelten Gruppe als in der Stented-Gruppe (60,1 mm 3 ±31,1 mm 3 vs. 20,5 mm 3 ± 20,6 mm 3; p = 0,002).
Die Mengen an zell-tracer-positiven Zellen in der Neointima dezellularisierter Aneurysmen unterschieden sich zwischen den mit Stents oder Spulen behandelten Gruppen am Tag 7 der FU (p = 0,8) nicht signifikant, waren aber bei Stent-Ratten am Tag 21 der FU signifikant höher (Abbildung 4; p = 0,04). Bei lebenswichtigen mit Aneurysmen vernähten Ratten wurden weder nach 7 Tagen (p = 1,0) noch nach 21 Tagen (Abbildung 5) keine signifikanten Unterschiede festgestellt. FU (p = 0,66). Bei dezellularisierten Aneurysmen nach 7 Tagen FU verblieben im Thrombus des Stent-Behandelten im Vergleich zur spulenbehandelten Gruppe signifikant mehr zell-tracer-positive Zellen (p = 0,01). Dieser Unterschied wurde bei lebenswichtigen Aneurysmen nach 7 Tagen FU nicht beobachtet. Siehe Tabelle 1 für den Anteil der Zell-Tracer-positiven Zellen für dezellularisierte, sowie vitale gewickelte und gestinkte Aneurysmen für Tag 7 und Tag 21 FU. Die Gegenfärbung des von-Willebrand-Faktors (F8) wurde in den Endothelzellen der Neointima jeder Ratte durchgeführt (Abbildung 6).
Die durchschnittliche Dauer des chirurgischen Eingriffs betrug 119,1 ± 21,3 min für die Wickelgruppe im Vergleich zu 154,1 ± 30,2 min für die Stentgruppe (p = 0,001). Die Anzahl der Stiche für Aneurysma-Nähte unterschied sich auch signifikant (p = 0,000002) für die Spulen- (15,6 ± 2,9 Stiche) und Stent-Gruppen (11,3 ± 1,1).
Abbildung 1: Flussdiagramm der Versuchsumgebung. Insgesamt wurden 35 Tiere operiert und in Wickel- oder Stentgruppen randomisiert. Zwei Tiere der Stentgruppe starben im unmittelbaren postoperativen Verlauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Intraoperative Aufnahmen von Aneurysmen während der Spulen- und Stentembolisation . (A) zeigt ein Seitenwand-Aneurysma (#), das an der Bauchrattenaorta (*) vernäht ist. Beachten Sie die im Aneurysma eingeführte Spulenvorrichtung, bevor Sie den letzten Stich durchführen, um die Aneurysmanaht zu vervollständigen. Beachten Sie die rosafarbene Färbung (Pfeil) auf der linken Seite der Arteriotomie, die die korrekte Verteilung des Zelltracers anzeigt. (B) Die gleiche Einstellung wie in A, die die Stentvorrichtung bereits vor Ort anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Makroskopische Obduktionsmessungen an 31 Tieren. Aneurysmavolumina (mm3) wurden vor der Implantation und bei der Nachuntersuchung entlang der y-Achse dokumentiert. (A) Baseline (dezellularisiert), (B) Follow-up (decellularisiert), (C) Baseline (vital), (D) Follow-up (vital). Daten für Tag 7 und Tag 21 werden gepoolt. ** p < 0,01. Werte werden als Mediane mit Interquartilsbereichen ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Beispielbild eines mit Stents behandelten dezellularisierten Aneurysmas am 21. Tag. Rechts ist eine Bildübersicht eines monoklonalen Antiα-SMA, zelldeplementierten Aneurysmas (2-fache Vergrößerung) zu sehen; Maßstab bar = 150 μm. Links, mit DAPI gebeizt; Rote Blutkörperchen sind Zell-Tracer-positiv (A) in der Aneurysmawand, (B) im Thrombus, (C) verbleibende gefärbte, aber verblasste Zell-Tracer-positive Zellen in der Neointima und (D) im angrenzenden Gefäßkomplex. Maßstabsstäbe = 100 μm (A-D). Ein einzelner Pfeil markiert die Aneurysmawand, der Doppelpfeil die übergeordnete Arterie. Abkürzungen: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; α-SMA = α-glattes Muskelaktin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Beispielbild eines spulenbehandelten Vitalaneurysmas am 21. Tag. Auf der rechten Seite ist eine Bildübersicht eines monoklonalen antiα-SMA, zellreichen Aneurysmas (2-fache Vergrößerung) zu sehen; Maßstab bar = 150 μm. Linke Seite, mit DAPI konterbefleckt; Rote Blutkörperchen sind zell-tracer-positiv (A) in der Aneurysmawand, (B) im Thrombus, (C) mehrere positive Zellen in der Neointima und (D) im angrenzenden Gefäßkomplex. Maßstabsstäbe = 100 μm (A-D). Ein einzelner Pfeil markiert die Aneurysmawand, der Doppelpfeil die übergeordnete Arterie. Abkürzungen: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; α-SMA = α-glattes Muskelaktin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: 40-fache Vergrößerung durch F8-Färbung. # zeigt die Thrombusbildung, * die Neointima und § die Endoluminalseite unterhalb der Aneurysmaöffnung. Beachten Sie die endotheliale Schichtung, die als violette Färbung in der endoluminalen Schicht der Neointima dargestellt ist. Maßstabsleiste = 175 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| DAPI/CM-Dil Farbstoff (%) | Spule | Stent | |||
| Tag 7 | Tag 21 | Tag 7 | Tag 21 | ||
| Dezellularisierte Beutel | Neointima | 68.00% | 7.70% | 72.20% | 34.30% |
| Elternarterie | 75.50% | 10.50% | 76.50% | 35.60% | |
| Thrombus | 7.50% | 5.50% | 25.20% | 8.30% | |
| Aneurysma-Wand | 12.20% | 8.50% | 11.70% | 9% | |
| Vitale Beutel | Neointima | 56.70% | 11.50% | 58.20% | 15.00% |
| Elternarterie | 60.00% | 24.20% | 81.50% | 26.00% | |
| Thrombus | 62.00% | 26.20% | 71.20% | 23.70% | |
| Aneurysma-Wand | 13.20% | 10.20% | 13.50% | 11.60% |
Tabelle 1: Anteil der Zell-Tracer-positiven Zellen in Neointima, Elternarterie, Thrombus und Aneurysmawand. Die Werte werden als Prozentsätze für dezellularisierte und lebenswichtige Beutel für die Spulen- und Stentbehandlung für Tag 7 und Tag 21 dargestellt. Abkürzung: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol.
Video 1: Zell-Tracer-Injektion in den Bauchteil der Rattenaorta. Diese Technik wird mit einer Ein-Punkt-Injektion in die geklemmte Rattenaorta durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Diese Studie zeigt, dass die Neointima-Bildung über Endothelzellen vermittelt wird, die aus der Elternarterie des Aneurysmakomplexes stammen, aber durch die Rekrutierung von Zellen aus der Aneurysmawand in lebenswichtigen Aneurysmen unterstützt wird. Dennoch bleibt die Rolle zirkulierender Vorfahrenzellen bei der Aneurysmaheilung umstritten12,13. Insgesamt wurden 31 männliche Lewis-Ratten in diese Untersuchung einbezogen; nur 4 starben vorzeitig (12,9% Mortalität).
Im Gegensatz zum chirurgischen Clipping, das den anschließenden Endothel-zu-Endothel-Kontakt fördert, beruht der Erfolg der endovaskulären Behandlung auf verzögerten biologischen Reaktionen. Neu entwickelte Techniken wie Strömungsumleitung, bioaktive endovaskuläre Geräte oder intraluminale zellbasierte Therapien sind in Bezug auf endovaskuläre Behandlungsgerätebemerkenswert 14,15. In diesem Zusammenhang zeigt sich, dass der Behandlungserfolg bei einer erfolgreichen Aneurysma-Eradikation additiv mit der biologischen Reaktion der Aneurysmawand selbst assoziiertist 5,16,17.
Neuere Studien deuten darauf hin, dass Thrombusorganisation und Neointima-Bildung gleichzeitige Prozesse in der Aneurysmaheilung nach endovaskulären Therapien sind. Beide Prozesse, die an der Heilung von Aneurysmen beteiligt sind, beruhen auf der Bewegung von Zellen aus dem benachbarten Gefäß des Aneurysmakomplexes und der Aneurysmawand selbst. Darüber hinaus werden beide Prozesse durch das Vorhandensein von endovaskulären Geräten wie Spulen oder Stents erleichtert. Wie Grüter et al. zeigten,5 Thrombus-organisierende Zellen stammen für beide Arten von endovaskulären Behandlungsansätzen hauptsächlich aus dem benachbarten Gefäß. Hier beruht die Neointimabildung bei spulenbehandelten Aneurysmen hauptsächlich auf der Zellmigration von der Gefäßwand, während das benachbarte Gefäß bei stentbehandelten Aneurysmen als primärer Spender diente.
Ein roter Faden bei der Etablierung und Erweiterung von Forschungsfragen mit dem mikrochirurgischen Seitenwand-Aneurysma-Modell der Helsinki-Ratte konnte im Laufe der Jahre beobachtet werden. Erstens sind dezellularisierte und damit degenerierte Aneurysmen anfälliger für Wachstum und Ruptur als zellreiche vitale Aneurysmen9. Darüber hinaus zeigte die Spulenbehandlung mehr Erfolg bei der Aneurysmabehandlung mit lebenswichtigen Beuteln als bei hochdegenerierten8. Darüber hinaus sorgte die Zelltransplantation für eine ausreichende Aneurysmaheilung auch bei stark degenerierten Aneurysmen14. Beim Vergleich verschiedener endovaskulärer Geräte in diesem Aneurysmamodell war die Stentbehandlung der Spulenbehandlung allein deutlich überlegen11. Wenn man also die verschiedenen Zellrekrutierungsmodi in gewundenen und gestauten Aneurysmen aus der Elternarterie und der Aneurysmawand5 schätzt, bleiben die Hauptfragen offen, ob die Neointimabildung hauptsächlich durch Endothelzellen aus der Elternarterie, Zellen aus der Aneurysmawand oder sogar zirkulierende Vorläuferzellen ausgelöst wird. Neuere Erkenntnisse über zirkulierende Vorläuferzellen, die die Neointima-Bildung auslösen, sind umstritten12,13,15,18.
Nur männliche Ratten wurden in diese Serie aufgenommen, um die verwirrenden Auswirkungen von Östrogen auf das Aneurysmawachstum, die Thrombusbildung und die Wandentzündung zu vermeiden, wie zuvorberichtet 19. Neben dem ausgeklügelten multimodalen Monitoring mit Fluoreszenzangiographie20 und Vitalzeichen-Monitoring haben wir einen speziellen Zelltracer verwendet, um die Elternarterie zu markieren, um Zellen aus zirkulierenden Zellen im Blutkreislauf von denen zu unterscheiden, die aus der echten Migration benachbarter Zellen stammen. Dennoch können wir ein leichtes Abklingen der Signalintensität der Endothelzellen mit Zeit und Zellteilung nicht ausschließen, obwohl Studien eine starke Signalintensität von Myofibroblasten zu diesen Zeitpunkten (Tag 7 und Tag 21) gezeigt haben14. Schließlich verwendete dieses Aneurysmamodell die Hämodynamik und nachfolgende biologische Prozesse, wie die Rate der spontanen Thrombose oder der Aneurysmaheilung, die stark von der Seitenwandkonstellation des Aneurysmas21 beeinflusst werden.
Wie in diesen Befunden gezeigt, bleibt es offensichtlich, dass das benachbarte Gefäß des Aneurysmakomplexes als wichtige Zellquelle bei der Bildung einer Neointima dient. Diese Ergebnisse stimmen stark mit den kürzlich veröffentlichten Ergebnissen von Kallmes et al. überein, die zeigen, dass die Federbeindicke auch eine Determinante der Wandapposition in Strömungsumleitungen ist, was ein wichtiger Treiber für eine effektive Endothelisierung ist. Hier verringert eine Erhöhung der Federbeindicke die Wahrscheinlichkeit einer Malapposition, verbessert den Kontakt mit der Elternarterienwand und optimiert somit die zelluläre Rekonstruktion über Streben22. Bei Ratten mit dezellularisierten Aneurysmen wurde in der Stent-Gruppe am 21. Tag eine signifikant höhere Menge an zell-tracer-positiven Endothelzellen beobachtet als in der gewickelten Gruppe zum gleichen Zeitpunkt (Tabelle 1).
Dieser Befund könnte auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass Stents, die in einer zellreichen Region der Elternarterie selbst bei stark degenerierten Aneurysmen angewendet werden, als Leitstrukturen für Zellbewegungen dienen, die eine kontinuierliche Endothelauskleidung der Endoluminalschicht der Neointima ermöglichen und eine progressive Aneurysmaheilung ermöglichen. Additiv wurde beim Vergleich von Stenting und Coiling am Tag 7 FU eine signifikant höhere Menge an Zell-Tracer-positiven Zellen im Thrombus von Stent-Tieren beobachtet als in gewickelten. Daher ist eine vernünftige Erklärung, dass Stentstreben die Zellmigration aus dem benachbarten Gefäß im Thrombus leicht erleichtern. In vitalen Aneurysmen, die Coiling mit Stenting vergleichen, wurden weder für Neointima nach 21 Tagen noch für die Thrombusbildung am Tag 7 signifikante Unterschiede in zell-tracer-positiven Zellen beobachtet. In Übereinstimmung mit einem früheren Befund5 kann dies auf die Unterstützung der Neointima-Bildung durch Zellrekrutierung in gesunden Gefäßwänden zurückgeführt werden.
Das Fehlen signifikanter Unterschiede in der Menge an zell-tracer-positiven Zellen im Thrombus nach 21 Tagen bei dezellularisierten oder vitalen gewickelten und gestinkten Aneurysmen liegt daran, dass die Neointima fast vollständig versiegelt war23. Daher ist auch über Stents eine Zellmigration in den Thrombus nicht mehr möglich. Zu den kritischen Punkten, die bei der Durchführung der Stentimplantation zu berücksichtigen sind, gehören ein möglicher iatrogener Gefäßbruch während der Stentapplikation oder eine kritische Stenosebildung im Bereich der Arteriotomie mit einer möglichen Ischämieentwicklung in den unteren Gliedmaßen. Um eine Ischämie zu verhindern, wählen Sie die Arteriotomiestelle neben der Gefäßverzweigung für die Einführung des Stents, der klein genug ist, um eine iatrogene Stenose nach Stentimplantation und Nahtarteriotomie zu vermeiden. Spülen Sie diese Region vor dem Verschluss mit heparinisierter Kochsalzlösung, um den distalen Transport potenzieller Embolien aufgrund des Vorhandenseins einer thrombogenen Komponente zu minimieren.
Materialien, die für diese Verfahren benötigt werden, sind in der Regel extrem kostenintensiv und selten, und ihre Verfügbarkeit ist für junge Assistenzärzte in der Neurochirurgie von entscheidender Bedeutung24,25. Zusätzlich zu der Fülle an Informationen, die aus diesem Modell gewonnen werden, wird das Üben dieser Operation jedoch dazu beitragen, die chirurgischen Fähigkeiten zu verbessern.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die biologische Heilungsreaktion von endovaskulär behandelten Aneurysmen im mikrochirurgischen Seitenwandaneurysma-Modell der Helsinki-Ratte von der Zellmigration aus dem benachbarten Gefäßkomplex abhängt. Es wird zusätzlich durch die Rekrutierung von Zellen aus einer vitalen, gesunden Aneurysmawand unterstützt. Bei dezellularisierten und daher stark entarteten Aneurysmen ist die Elternzell-reiche Arterie jedoch die wichtigste Zellquelle für die Bildung einer Neointima, die durch endovaskuläre Geräte wie Stents erleichtert wird, die das benachbarte zellreiche Gewebe mit der Aneurysmaöffnung verbinden. Um diesen Befund in klinische Umgebungen zu übertragen, könnten hochdegenerierte Aneurysmen über Gerüste behandelt werden, die in zellreichen gesunden Gefäßregionen platziert sind. Die Spulenembolisation allein könnte für Aneurysmen mit meist gesunden Gefäßwänden ausreichen.
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Disclosures
Die Autoren sind für die Gestaltung und Durchführung der vorgestellten Studie allein verantwortlich und erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Alessandra Bergadano, DVM, PhD, für die engagierte Überwachung der langfristigen Tiergesundheit. Diese Arbeit wurde durch die Forschungsmittel des Forschungsrates, des Kantonsspitals Aarau, Schweiz, und des Schweizerischen Nationalfonds SNF (310030_182450) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
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