Summary
Müller glia primära kulturer erhållna från mus näthinnor representerar ett mycket robust och pålitligt verktyg för att studera glialomvandlingen till retinala stamceller efter mikroRNA-behandling. Enstaka molekyler eller kombinationer kan testas innan de senare tillämpas in vivo-metoder .
Abstract
Müller glia (MG) är den dominerande glia i neurala näthinnan och kan fungera som en regenerativ källa för retinala nervceller. Hos lägre ryggradsdjur som fisk sker MG-driven regenerering naturligt; hos däggdjur krävs dock stimulering med vissa faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulation. Eftersom MG endast utgör 5% av retinalcellpopulationen finns det ett behov av modellsystem som tillåter studier av denna cellpopulation uteslutande. Ett av dessa modellsystem är primära MG-kulturer som är reproducerbara och kan användas för en mängd olika applikationer, inklusive molekyl/ faktorscreening och identifiering, testning av föreningar eller faktorer, cellövervakning och / eller funktionella tester. Denna modell används för att studera potentialen hos murin MG att omvandlas till retinala nervceller efter tillskott eller hämning av mikroRNA (miRNA) via transfektion av artificiella miRNA eller deras hämmare. Användningen av MG-specifika reportermöss i kombination med immunofluorescerande märkning och encells RNA-sekvensering (scRNA-seq) bekräftade att 80%-90% av cellerna som finns i dessa kulturer är MG. Med hjälp av denna modell upptäcktes att miRNA kan omprogrammera MG till retinala stamceller (RPC), som därefter differentieras till neuronalliknande celler. Fördelarna med denna teknik är att miRNA-kandidater kan testas för deras effektivitet och resultat innan de används i in vivo-applikationer .
Introduction
Müller glia (MG) är den dominerande glia i neural näthinnan. De har liknande funktioner jämfört med andra glia i andra delar av centrala nervsystemet, såsom att upprätthålla vatten- och jonhomeostas, närande neuroner och skydda vävnaden. MG har en annan fascinerande egenskap: även om de är mogna glia, uttrycker de fortfarande många gener uttryckta i retinala stamceller (RPC) under sen utveckling 1,2. Denna likhet antas vara orsaken till den naturligt förekommande MG-baserade neuronala regenereringen i fiskhinnan efter näthinneskada 3,4. Under denna process, MG återinträda i cellcykeln och de-differentiera till RPC som sedan differentierar till alla sex typer av retinala nervceller. Även om detta fenomen förekommer naturligt hos fisk, omvandlas däggdjurs MG inte till nervceller 5,6. De kan dock omprogrammeras. En mängd olika faktorer har visat sig omprogrammera MG till RPC/ nervceller; bland dessa faktorer är den grundläggande helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktorn achaete-scute homolog 1 (Ascl1) som är involverad i fiskregenerering 7,8. Hos möss uttrycks Ascl1 endast i RPC under retinogenes men saknas i mogna MG- eller retinalneuroner9.
Omprogrammering av celler direkt in vivo är inte bara metodologiskt utmanande utan kräver också godkännande från en institutionell djurvårds- och användningskommitté. För att få godkännande krävs preliminära uppgifter om den eller de faktorer som används eller ändras, koncentrationer, effekter utanför målet, underliggande mekanismer, toxicitet och effektivitet. Cellodlingssystem möjliggör testning för dessa kriterier före användning i in vivo-modeller. Eftersom MG endast utgör cirka 5 % av hela näthinnecellpopulationen10, tillåter MG-kulturer dessutom studier av deras funktion11 samt deras beteende, inklusive migration12,13, proliferation14, stressreaktion på skada/skada15,16, deras interaktion med andra celltyper såsom microglia17 eller retinala ganglionceller (RGCs)18, eller deras neurogena potential 19,20,21. Många forskare använder odödliga cellinjer för sina studier eftersom de har en obegränsad proliferativ potential och lätt kan underhållas och transinfekteras. Primära celler är dock att föredra för biologiskt relevanta analyser än odödliga celler eftersom de har sanna cellegenskaper (gen- och proteinuttryck) och, ännu viktigare, de representerar ett visst utvecklingsstadium och har därför en "ålder". Åldern hos ett djur (och följaktligen hos cellerna som erhållits från ett djur) är en särskilt avgörande faktor vid cellulär omprogrammering eftersom cell plasticitet minskar med framskridet utvecklingsstadium22.
Detta protokoll beskriver i detalj hur man omprogrammerar primär MG med miRNA som en aktuell in vitro-metod för att studera regenerering. Denna primära MG-odlingsmodell etablerades 2012 för att utvärdera cellproliferationsegenskaper hos MG hos P53 knock-out-möss (trp53-/- möss)23. Det visades att odlad MG behåller sina glialegenskaper (dvs uttryck av S100β-, Pax6- och Sox2-proteiner utvärderade via immunofluorescerande märkning) och att de liknar in vivo MG (mikroarray av FACS-renad MG)23. Kort därefter validerades och bekräftades glial mRNA och proteinuttryck i ett annat tillvägagångssätt med hjälp av virala vektorer20. Några år senare bekräftades att de allra flesta celler som finns i dessa kulturer är MG med hjälp av den MG-specifika Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reportermus24. Dessutom visade kvantifiering av uppsättningen miRNA i både FACS-renad MG och odlad primär MG att nivåerna av MG miRNA (mGLiomiRs) inte varierar mycket i odlad MG under tillväxtfasen. Långsträckta odlingsperioder orsakar emellertid förändringar i miRNA-nivåer och följaktligen i mRNA-nivåer och proteinuttryck eftersom miRNA är translationella regulatorer25.
I 2013, denna MG kulturmodell användes för att testa en mängd olika transkriptionsfaktorer med avseende på deras förmåga att omprogrammera MG till retinala nervceller20. Ascl1 befanns vara en mycket robust och pålitlig omprogrammeringsfaktor. Överuttryck av Ascl1 via virala vektorer inducerade morfologiska förändringar, uttryck av neuronala markörer och förvärv av neuronala elektrofysiologiska egenskaper. Ännu viktigare är att de insikter och resultat som erhölls från dessa första in vitro-experiment framgångsrikt överfördes till in vivo-applikationer 22,26, vilket visar att primära MG-kulturer representerar ett solidt och pålitligt verktyg för initiala faktorscreeningar och utvärdering av glialfunktioner före in vivo-implementering.
För några år sedan visade det sig att det hjärnberikade miRNA miR-124, som också uttrycks starkt i näthinneneuroner, kan inducera Ascl1-uttryck i odlad MG21. Ascl1-uttryck i levande celler visualiserades via en Ascl1-reportermus (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). En reportermus är en genetiskt konstruerad mus som har en reportergen införd i sitt DNA. Denna reportergen kodar för ett reporterprotein, som i denna studie är tdTomato, ett rött fluorescerande protein. Detta reporterprotein rapporterar uttrycket av en gen av intresse, i detta fall Ascl1. Med andra ord blir celler som uttrycker Ascl1 röda. Eftersom Ascl1 endast uttrycks i RPC9 tillåter denna Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-mus spårning av MG-omvandling till Ascl1 som uttrycker RPC, vilket innebär att konverterande celler kommer att uttrycka rött fluorescerande tdTomato-reporterprotein. Detta är irreversibel märkning eftersom DNA från dessa celler förändras. Följaktligen kommer all efterföljande neuronal differentiering att visualiseras eftersom tdTomato-etiketten förblir i differentierande celler. Om Ascl1 som uttrycker MG-härledda RPC (med tdTomato-etikett) differentieras till neuroner, kommer dessa neuroner fortfarande att ha sin röda etikett. Denna mus tillåter därför inte bara märkning av MG-härledda RPC för levande cellavbildning utan möjliggör också ödeskartläggning och spårning av dessa MG-härledda (röda) RPC. På senare tid identifierades uppsättningen miRNA i RPC och MG-kulturer av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermöss användes för att screena och testa effekten av dessa miRNA på omprogrammeringskapacitet och effektivitet27. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, befanns kunna omprogrammera odlad MG till Ascl1-uttryckande (Ascl1-Tomat+) celler. Dessa omprogrammerade celler antar neuronala egenskaper över tid, inklusive neuronal morfologi (liten somata och antingen korta eller långa fina processer), uttryck av neuronala transkript mätt via scRNA-Seq, samt uttryck av neuronala proteiner validerade via immunofluorescerande märkning27.
Här beskriver protokollet hur man odlar och transfekterar MG från P12-möss anpassat från det tidigare arbetet 21,24,27. Valt för detta protokoll är ovannämnda miRNA miR-25, ett miRNA som uttrycks starkt i RPC, med låga uttrycksnivåer i MG- eller retinalneuroner. För att överuttrycka miR-25 härmar murin miR-25, dvs artificiella miRNA-molekyler används. Som kontroll väljs miRNA av ett miRNA från Caenorhabditis elegans, som inte har någon funktion i däggdjursceller. Visualisering av omvandlingen av MG till RPC utfördes via RPC-reportermusen (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl), en mus med blandad bakgrund (C57BL / 6, S129 och ICR-stammar). Denna kultur kan dock utföras med alla musstammar, inklusive vildtypsstammar. Under de senaste åren har det ursprungliga protokollet modifierats för att minska tillväxtfasens varaktighet och den totala odlingsperioden och säkerställa en mer robust gliacellstatus och minimera graden av cellulär degenerering, som inträffar under långa odlingsperioder. Det vanliga transfektionstidsfönstret förlängdes också från 3 h till 2 dagar. Som nämnts tidigare, även om det nuvarande protokollet beskriver MG-kulturer som ett verktyg för regenereringsstudier, är metoden inte bara användbar för att testa omprogrammeringsfaktorer, utan kan också anpassas för andra applikationer, inklusive studier om MG-migrerande eller proliferativt beteende, skade- / cellskadarelaterade paradigmer och / eller identifiering av underliggande mekanismer och vägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försök med djurpersoner har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid SUNY College of Optometry.
OBS: Detta kulturprotokoll består av tre faser: tillväxt, transfektion och omvandlingsfas. En sammanfattning av det övergripande protokollet med tidslinjen ges i figur 1.
1. Beredning av media och alla nödvändiga reagenser
OBS: Alla steg måste utföras i ett A2- eller B2-biosäkerhetsskåp (BSC). Under tillväxtfasen används ett högserumtillväxtmedium som består av ett basalt neuronalt medium kompletterat med epidermal tillväxtfaktor (EGF). För omvandlingsfasen används ett neurofysiologiskt basalmedium med lågt serum kompletterat med neuronala tillskott för att säkerställa neuronal differentiering och överlevnad.
- Förbered tillväxtmedium (används under tillväxtfasen) genom att komplettera 200 ml basalt neuronalt medium med 20 ml fetalt bovint serum (FBS, 10%), 1 ml 200 mM L-glutamin (0,5%), 2 ml penicillin / streptomycin (1%) och 2 ml N2-tillskott (1%). Utför steril filtrering (filterenheter med 0,22 μm porstorlek). Förvärm mediet i 37 °C metallpärlbad före användning.
- Förbered neuronalt medium (används under omvandlingsfasen) enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell) genom att komplettera 100 ml serumfritt neurofysiologiskt basalmedium med 2 ml B27 neuronalt tillskott (2%), 1 ml N2-tillskott (1%), 20 μL 100 ng / ml hjärnderiverad neurotrofisk faktor (BDNF, rekonstituera i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, slutlig koncentration 20 ng/ml), 20 μl 100 ng/ml gliacell-härledd neurotrofisk faktor (GDNF, rekonstituerad i steril Hanks balanserade saltlösning [HBSS], slutkoncentration 20 ng/ml), 500 μl 100 mg/ml Dibutyryl-cAMP (rekonstituerad i DMSO), 70 μl 50 ng/ml askorbinsyra (rekonstituerad i steril PBS) och 1,5 ml penicillin/streptomycin. Utför steril filtrering (filterenheter med 0,22 μm porstorlek). Förvarmt medium i 37 °C metallpärlbad före användning.
OBS: Dessa medier kan lagras vid 4 °C i 1 månad. - Rekonstituera Papain-, DNasE I- och Ovomucoid-reagenser som krävs för retinal dissociation enligt tillverkarens protokoll. Alikvot 750 μL Papain i sterila 1,5 ml rör, 75 μl DNasE I i sterila 0,6 ml rör och 750 μl ovomucoidproteashämmare i 2 ml rör. Frys papain- och DNasE I-alikvoterna vid -20 °C och håll ovomucoida alikvoter vid 4 °C för att undvika nedbrytning av reagenserna. Tina vid rumstemperatur strax före användning.
OBS: Papain, DNase I och Ovomucoid finns i ett kit som heter Papain Dissociation System (se materialtabell). - Rekonstituera poly-L-ornitin (Poly-O) och Laminin för täckglasbeläggning om immunofluorescerande märkning utförs enligt anvisningarna i databladet (Poly-O: 0,1 mg / ml i sterilt vatten; Laminin: späd 1,2 mg/ml vid 1:50 i DMEM). Alikvotera poly-O och laminin (2,5 ml) och frys alikvoter vid -20 °C. Tina vid rumstemperatur strax före användning.
OBS: Steg 1.4. krävs endast om immunofluorescerande märkning och laserscanningsmikroskopi utförs.
2. Möss och vävnadsextraktion
OBS: För dessa omprogrammeringsstudier skapades Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-musen genom att korsa en Ascl1CreERT-mus (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) med en tdTomatoSTOPfl / fl-mus (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J: Jax # 007914). Denna mus har en blandad bakgrund (C57BL / 6, S129 och ICR-stam). Genotypen för denna mus visas i figur 1A. Alla stammar kan användas för detta protokoll.
- Använd handskar och desinficera arbetsytan, inklusive dissektionsmikroskop och alla fina verktyg (Dumont # 5 fin och Dumont # 7 böjda pincett, fin sax och Vannas sax) med 70% etanol. Sanera en 10 cm silikonbelagd svart dissektionsskål genom att utsätta den för UV-ljus i 20 minuter.
- Beredning av rätter och tallrikar för vävnadsextraktion
- Förbered en 24-brunnsplatta för ögonuppsamling och provseparation (två ögon per mus i en brunn, märkt med mus-ID) med ~ 1 ml kallt HBSS (4 ° C) per brunn. Lägg 24-brunnsplattan på is.
- Fyll en steril 10 cm petriskål (för tvätt) och den sanerade silikonbelagda dissektionsskålen med flera ml kall HBSS (4 °C) för att säkerställa att vävnaden är helt täckt med HBSS.
- Förbered ett sterilt 1,5 ml rör med 1 ml 70% etanol.
- Förbered en odlingsplatta med 12 brunnar genom att märka plattan med odlingsnummer, datum, stam och all nödvändig information.
- Avliva P12-möss med någon godkänd metod.
- Borttagning av ögon
- Håll försiktigt mushuvudet med tummen och pekfingret runt ögat.
- Använd Dumont #7 böjda tångar, gå försiktigt bakom ögongloben och klipp synnerven. Ta försiktigt ut ögat.
OBS: Om vuxna möss används, använd inte böjda pincett och dra inte i ögat. Klipp istället försiktigt runt ögongloben med en fin sax; skär synnerven men skär inte själva ögat. Använd pincett för att försiktigt ta bort ögongloben.
- Rengöring av ögonglob
- Doppa ögongloben kort i ett etanolinnehållande rör för att undvika överföring av bakterier från djuret.
- Tvätta ögongloben kort i 10 cm petriskålen innan du lägger den i 24-brunnsplattan på is.
- Upprepa steg 2.4 och 2.5 för de andra ögonen. Håll brunnsplattan på isen under processen. Placera två ögon från ett djur i dissektionsskålen placerad under ett dissektionsmikroskop med en ljuskälla.
- Retina extraktion
- Fixa en ögonglob genom att ta tag i synnerven och den omgivande bindväven runt sclera med Dumont #5 fina pincett och tryck den försiktigt mot dissektionsskålen (hornhinnan uppåt).
- Gör ett hål i mitten av hornhinnan med en 30 G nål för att underlätta åtkomst för Vannas sax.
- Dissekera hornhinnan runt ciliärkroppen med Vannas sax och ta bort hornhinna, lins, iris och glaskropp försiktigt med Dumont #5 fina pincett. Figur 2A illustrerar en ögonkopp med näthinnan inuti.
- Dissekera sclera med Vannas sax tills synnerven är nådd. Klipp synnerven och extrahera försiktigt näthinnan med Dumont #5 fina pincett.
- Använd ett andra par Dumont #5 fina pincett för att trycka mot näthinnan och möjliggöra fullständigt avlägsnande av glaskroppen. Figur 2B illustrerar två extraherade näthinnor.
- Överför och tvätta
- Skär ca 2,5 cm av spetsen på en steril överföringspipett för att förstora diametern. Använd detta tips och plocka upp (suga in) hela näthinnor utan att skada vävnaden.
- Överför näthinnorna till en ny steril petriskål med kallt HBSS (4 °C) och gunga skålen (fram och tillbaka, vänster och höger).
- Använd överföringspipettspetsen och tryck försiktigt runt näthinnorna för att tvätta bort retinala pigmentepitelceller (RPE).
OBS: Alternativt kan hela näthinnan med lins och glaskropp tas bort från ögonkoppen. Sedan kan linsen och glaskroppen tas bort från den extraherade näthinnan. Om näthinnan är rippad, se till att samla alla bitar för dissociation; annars kommer det att finnas otillräckliga mängder vävnad för att odla konfluenta cellskikt.
- Placera omedelbart den isolerade näthinnan i en ny, ren brunn på 24-brunnsplattan fylld med 1 ml HBSS. Håll 24-brunnsplattan på isen under dissektionsprocessen.
- Upprepa steg 2.7-2.9 för att isolera den andra näthinnan.
3. Retina dissociation
OBS: Alla följande steg (fram till cellskörd) måste utföras i ett A2- eller B2-biosäkerhetsskåp (BSC).
- Förbered Papain / DNase I-dissociationsblandningen enligt följande.
- För sex näthinnor, tillsätt 75 μL DNasE I i röret som innehåller 750 μL Papain (från steg 1.3) och blanda försiktigt (dissociationsblandning).
- För individuell provberedning som krävs för detta protokoll, dela den totala volymen på 825 μL i tre alikvoter: 275 μL av blandningen i ett 1,5 ml rör per mus (två näthinnor). Beräkna de erforderliga mängderna DNase I och Papain i enlighet därmed.
OBS: Upp till sex näthinnor kan dissocieras i ett rör av Papain / DNasE I-blandning. Individuell provberedning resulterar dock i färre klumpar och bättre celltillväxt än i kombinerade prover.
- Överför två näthinnor till Papain / DNase I dissociationsblandning. Använd en överföringspipett med en förstorad spetsdiameter (steg 2.8.1), plocka upp näthinnorna, vänta tills näthinnorna sätter sig längst ner på spetsen och släpp sedan näthinnorna utan överdriven HBSS i röret som innehåller Papain / DNasE I-blandning.
- Placera på en nutator och inkubera den i 10 minuter i en cellodlingsinkubator (37 °C, 5 %CO2).
- Dissociera cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ner (cirka 20-30 gånger) med en 1 ml pipett. Efter att celler har dissocierats (dvs. resulterat i en homogen lösning utan bitar), tillsätt 275 μL Ovomucoid proteashämmare från Papain Dissociation Kit för att neutralisera Papain. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner.
OBS: Om sex näthinnor dissocierades i 825 μL Papain / DNasE I-blandning krävs 825 μL Ovomucoid. - Centrifugera blandningen vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
- Lägg till epidermal tillväxtfaktor (EGF, 1 μL per 1 ml tillväxtmedium, rekonstituerad vid 200 μg/ml i PBS) till den beräknade volymen tillväxtmedium (1 ml per mus) som förvärmts vid 37 °C.
OBS: Beroende på den experimentella designen kan proliferationsmarkören 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU), liksom 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) eller andra erforderliga faktorer läggas till i början av odlingsperioden. - Ta försiktigt bort rören från centrifugen. Rör inte vid pelleten längst ner på röret.
- Ta bort supernatanten försiktigt och helt. Resuspendera cellpelleten med 500 μl EGF-kompletterat tillväxtmedium.
- Överför cellsuspensionen till en brunn på den märkta 12-brunnsplattan (figur 2C). Skölj röret med ytterligare 500 μl av det EGF-kompletterade tillväxtmediet och tillsätt det i brunnen (total volym på 1 ml per brunn).
- Upprepa steg 3.8 och 3.9 med alla andra prover.
- Gunga brunnsplattan tre gånger försiktigt (fram och tillbaka; vänster och höger). Placera plattan i inkubatorn (37 °C, CO2).
OBS: Om transgena möss används, utför genotypning för varje djur (figur 2D). Identifiera Cre-rekombinaspositiva och negativa möss och märk plattan därefter. För detta protokoll användes endast celler av Cre-rekombinaspositiva reportermöss för nästa steg. Celler av Cre-negativa prover fryses och används för andra applikationer.
4. Tillväxtfas
OBS: Tillväxtfasen har en varaktighet på cirka 4-5 dagar (figur 1B). För att tillsätta vätskor till brunnar som innehåller celler måste pipetten peka på brunnens vägg och vätskan måste släppas långsamt för att undvika cellavlossning. Pipettera inte direkt ovanpå cellerna.
- En dag efter dissociationen, ta bort mediet och tillsätt 1 ml färskt EGF-kompletterat tillväxtmedium.
- På dag 3, ta bort mediet och tillsätt 1 ml HBSS (rumstemperatur) för att ta bort cellskräp. Gunga försiktigt fram och tillbaka från vänster till höger. Ta bort HBSS, upprepa tvättsteget och tillsätt 1 ml förvärmt EGF-kompletterat tillväxtmedium.
- Övervaka cellerna varje dag och utvärdera deras tillväxtstatus tills cellerna når 90% -100% sammanflöde. Figur 3 visar ett exempel på god MG-tillväxt över tid. Kontrollera om det finns möjlig kontaminering eller celldöd (kompletterande figur 1). Kassera förorenade kulturer.
OBS: För att övervaka och spela in celltillstånd, ta bilder vid olika förstoringar med ett ljusmikroskop med en ansluten kamera och 4x, 10x eller 20x mål. I denna studie används ett fluorescensmikroskop.
5. Beredning av täckglas med poly-L-ornitin (Poly-O) och Lamininbeläggning
OBS: Detta steg är endast nödvändigt om immunofluorescerande märkning och konfokal laserskanningsmikroskopi utförs. Runda glasöverdrag (12 mm diameter) krävs för korrekt avbildning. Beläggningsprotokollet finns också i databladet för neuronala medier (se materialtabell).
- Placera sterila täckglas försiktigt i mitten av varje brunn på en 24-brunnsplatta med sterila Dumont #2AP-pincett.
OBS: Placera täckglas i mitten av brunnen. Att placera täckglas nära väggen i en brunn kommer att orsaka problem med ytspänningen för följande steg. - Tina en 2,5 ml Poly-O alikvot vid rumstemperatur och placera 100 μL av den i mitten av varje täckglas.
- Inkubera brunnsplattan i 30 min i en 37 °C inkubator.
- Ta bort Poly-O och tvätta brunnen med täckglaset tre gånger med ~1 ml sterilt vatten.
- Låt brunnsplattan torka över natten i BSC. Tina 2,5 ml Laminin vid 4 °C över natten.
- Nästa morgon, tillsätt 100 μL Laminin i mitten av varje täckglas och inkubera i 4 timmar i en 37 ° C inkubator.
- Ta bort Laminin försiktigt och helt.
- Håll plattan vid 4 °C om passering inte kan utföras omedelbart.
OBS: De belagda täckglasen i förberedda plattor kan förvaras i några dagar vid 4 °C.
6. Cellpassage för att ta bort neuronala överlevande
OBS: Cellpassage krävs för att ta bort neuronala celler, inte för att öka cellpopulationen. Glia delar bara några gånger och kommer inte att växa ytterligare efter passage. Späd inte ut cellsuspensioner. Cellerna i en sammanflytande brunn i en 12-brunnsplatta kan fördelas på en brunn på en 12-brunnsplatta eller två brunnar på en 24-brunnsplatta. När belagda täckglass används är endast cirka en tredjedel av täckglaset belagt. Därför kan sex täckglas som sitter i en 24-brunnsplatta med sammanflytande celler (~ 80% -90%) erhållas från en brunn av sammanflytande celler i en 12-brunnsplatta. Andra förhållanden kan också väljas för att öka eller minska celltätheten. För detta protokoll används en Cre + reportermus [ett experiment, två behandlingar: miR-25 eller control-miR; tekniska replikat n = 3 (tre täckglas per behandling), biologiskt replikera n = 1]. Antalet tekniska och biologiska replikat kan definieras olika beroende på den experimentella designen.
- Kontrollera om cellerna är 90% -100% konfluenta (även vid brunnens marginal; Figur 3E,F).
- Ta bort mediet och tillsätt 1 ml HBSS (rumstemperatur) för att tvätta. Gunga försiktigt plattan (fram och tillbaka, vänster och höger). Ta bort HBSS helt.
- Tillsätt 500 μL av en förvärmd trypsininnehållande lösning (förvärmd vid 37 °C i ett metallpärlbad) för att lossa cellerna från brunnen. Gunga försiktigt (fram och tillbaka, från vänster till höger) och inkubera i 2 minuter i en 37 °C kuvös.
- Flytta plattan från inkubatorn till BSC. Medan du lutar, aspirera den trypsininnehållande lösningen och sprid den försiktigt och långsamt över brunnen flera gånger tills cellerna lossnar helt. Håll plattan mot ljuset och se till att inga celler finns kvar längst ner.
- Överför denna cellsuspension till ett sterilt 1,5 ml rör. Centrifugera vid 300 x g i 8 min vid 4 °C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera försiktigt cellpelleten genom att tillsätta 600 μl (100 μl per brunn för 6 brunnar/täckglas) förvärmt tillväxtmedium (kompletterat med EGF; 1:1000). och pipettera upp och ner ~30-40 gånger.
OBS: Cellerna kan frysas vid denna tidpunkt vid -80 ° C eller i flytande kväve och tinas enligt standardprotokoll för upptining av cellinjer. Om cellerna fryses kommer de inte att återsuspenderas i medium som kompletterats med fonden (tillväxtmedium). De kommer att återsuspenderas i basiskt medium (utan EGF) och fryslösning (förhållandet 1/1). Steg 6.1.1 till 6.6.2 beskriver stegen för att frysa cellerna. Om inga celler är frysta fortsätter du med steg 6.7.- Förbered fryslösningen genom att blanda 100 μl DMSO och 400 μL FBS (total volym på 500 μL per brunn/prov).
- Resuspendera cellpelleten i 500 μL förvärmt tillväxtmedium. Tillsätt cellsuspensionen till 500 μl DMSO/FBS fryslösning (total volym på 1 ml). Förvara rören på is tills alla prover har bearbetats. Frys cellerna vid -20 °C i 1 timme och förvara dem sedan vid -80 °C.
- Fröceller genom att placera 100 μl av 600 μL cell/media suspension (steg 6.6) i mitten av sex belagda täckglas (se steg 5) på 24-brunnsplattan. Placera plattan försiktigt i inkubatorn och låt cellerna sätta sig.
OBS: 100 μL av 600 μL cellsuspension (skördad från en brunn på en 12-brunnsplatta) kommer att resultera i 90% -100% cellkonfluens, vilket krävs för transfektion. - Kontrollera cellerna efter 3 timmar för att se om de har lagt sig på täckglaset. Tillsätt 400 μl tillväxtmedium kompletterat med EGF.
OBS: Celler är vanligtvis redo för transfektion följande dag (figur 3G). Om inte sammanflödet (90% -100%), lämna dem för en annan dag. Om de fortfarande inte är sammanflytande, använd dem inte för transfektion. Om andra nedströmsapplikationer utförs, såsom miRNA-profilering, RNA-Seq, RT-qPCR eller western blot, måste celler passeras till 12-brunnsplattor (1: 1-förhållande; ingen plattbehandling krävs) och skördas för RNA / proteinutvinning.
7. Transfektion
OBS: Transfektionsfasen består av en 3 h-fas endast i transfektionsmedium (transfektionsprocedurer beskrivs i transfektionshandboken som medföljer transfektionsreagenset) och en långsträckt fas där transfektionsreagens och miRNA fortfarande är närvarande, men neuronalt medium med erforderliga tillskott tillsätts (total varaktighet är 2 dagar; Figur 1B). I detta protokoll kommer sex brunnar att transfekteras: tre brunnar kommer att få omprogrammering av miRNA miR-25 och tre brunnar kommer att få kontrollmiRNA.
- Kontrollera om cellerna nådde 90% sammanflöde och spela in / avbilda cellerna före transfektion.
- Ta bort tillväxtmediet och tillsätt 500 μL HBSS (rumstemperatur) för att tvätta cellerna.
- Ta bort HBSS och tillsätt 400 μL reducerat serummedium som används för transfektioner. Placera tillbaka plattan i en 37 °C inkubator.
- Förbered transfektionsblandningen genom att följa instruktionerna i tillverkarens transfektionsreagensprotokoll. Gör två blandningar: transfektionsreagensblandning och miRNA-blandning (se figur 1B för illustration).
- Förbered transfektionsreagensblandningen: För en 24-brunnsplatta krävs 49 μl reducerat serummedium och 1 μl transfektionsreagens för en brunn (totalt 50 μL). För sex brunnar kombineras och blandas 294 μl reducerat serummedium och 6 μl transfektionsreagens genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- Förbered miRNA-miMIKBLANDNING: För en 24-brunnsplatta krävs en total volym på 50 μL av mimikblandningen för en brunn. Tre brunnar kommer att få kontrollmiRNA och de andra tre brunnarna kommer att behandlas med miR-25. För detta protokoll används en slutkoncentration på 200 nM.
- För miR-25-behandlingen (tre brunnar) kombineras 150 μl reducerat serummedium och 3 μl miR-25 miR-25 miR-mimik (100 μM stamlösning) och blandas väl genom att försiktigt pipettera upp och ner. Inkubera i 5 min.
För kontrollmimikbehandlingen (tre brunnar) kombineras 150 μL reducerat serummedium och 3 μL kontroll-miRNA-miRNA-mimiker (100 μM stamlösning) och blandas väl genom att försiktigt pipettera upp och ner. Inkubera i 5 min.
OBS: Volymen av miRNA-miRNA-mimik beror på utspädningsfaktorn och koncentrationen som behövs (20-500 nM). miRNA-hämmare (antagomiRs), eller andra molekyler inklusive plasmider, kan också användas. Kombinationer av molekyler är också möjliga att transfekteras.
- För miR-25-behandlingen (tre brunnar) kombineras 150 μl reducerat serummedium och 3 μl miR-25 miR-25 miR-mimik (100 μM stamlösning) och blandas väl genom att försiktigt pipettera upp och ner. Inkubera i 5 min.
- Kombinera miRNA-efterliknande blandning och transfektionsreagensblandning. Blanda försiktigt genom att pipettera långsamt och noggrant genom att försiktigt pipettera upp och ner. Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur (enligt tillverkarens anvisningar).
- Tillsätt ovanstående transfektionsblandning droppvis och långsamt ovanpå cellerna, nära medieytan i brunnen med en 20 μL pipett. Gunga plattan försiktigt (fram och tillbaka, från vänster till höger).
- Inkubera i en 37 °C inkubator i 3 timmar.
- Efter 3 timmar, tillsätt neuronalt medium till brunnarna (500 μL per brunn) kompletterat med 4-Hydroxytamoxifen (5 mM lager rekonstituerat med 2,58 ml etanol, 250 nM slutlig koncentration) för att aktivera Cre-rekombinas och 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU, 10 mM stamlösning rekonstituerad med 2 ml DMSO, 1 μM slutlig koncentration) för att spåra cellproliferation.
VARNING: 4-Hydroxytamoxifen och EdU är kända för att vara cancerframkallande för människor, teratogener och mutagener. Läs materialsäkerhetsdatabladet före användning och använd handskar, skyddsglasögon och labbrock. Rekonstituera båda reagenserna enligt tillverkarens rekommendationer. Andas inte in ämnet/blandningen. Tätt nära efter användning. Avfallsmaterial måste kasseras enligt nationella och lokala bestämmelser. Tvätta händer och ansikte efter att ha arbetat med ämnet. - Inkubera i en 37 °C inkubator i 2 dagar (figur 1B).
8. Cell konvertering
OBS: Cellomvandlingsfasen har en varaktighet på cirka 5-6 dagar (figur 1B), men längre perioder är möjliga.
- Kontrollera celler dagligen för framgångsrik induktion av tdTomato-uttryck, potentiell celldöd och / eller kontaminering. Celltätheten ändras inte (figur 4). Första svaga röda fluorescerande märkta celler kan observeras 1 dag efter 4-Hydroxytamoxifen behandling. Ett fluorescerande mikroskop krävs för att övervaka och avbilda cellerna.
OBS: I denna studie används ett fluorescensmikroskop för levande avbildning. Bilder tas med 4x, 10x eller 20x mål. - Två dagar efter transfektion, ta bort mediet och tillsätt 500 μL förvärmt neuronalt medium kompletterat med 4-Hydroxytamoxifen och EdU i varje brunn.
- Byt ut mediet med ett nytt medium varannan dag tills cellerna skördas.
- Ta levande bilder för utvärdering och bedömning av antalet röda fluorescerande (Ascl1-uttryckande) celler och deras morfologiska förändringar (figur 4 och figur 5A-C).
9. Cellskörd: fixering för immunofluorescerande märkning
OBS: Celler kan skördas för andra nedströmsapplikationer, inklusive bulk eller scRNA-Seq, RT-qPCR eller western blot.
- Ta bort mediet och tillsätt 500 μL kallt HBSS (4 °C) per brunn och gunga plattan försiktigt (fram och tillbaka, från vänster till höger). Ta bort HBSS.
- Fixa cellerna genom att tillsätta 500 μL 2% paraformaldehyd (PFA) och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Utför immunofluorescerande märkning enligt etablerade protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver hur man odlar MG från P12 mus näthinnor och hur man omprogrammerar dessa celler med miR-25 till retinala nervceller med hjälp av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC reportermus. Denna metod användes i tidigare arbete med att i detalj rapportera andra lämpliga miRNA (miMIK eller hämmare, som enstaka molekyler eller i kombination) för att omprogrammera MG till RPC som sedan antar neuronala cellegenskaper27. Denna metod har modifierats för att odla kulturer snabbare och därmed minimera de cellulära förändringar som orsakas av den konstgjorda miljön över tiden 24,28,29.
Retinal dissociation och tillväxtfas av primära MG-kulturer
Den första MG kan upptäckas redan dag ett in vitro med hjälp av ett ljusmikroskop. MG har en rörformig, långsträckt form och ljusgrå cellkroppar (figur 3A-D, röda pilspetsar). De flesta av dem är dock täckta av cellulärt skräp i dessa tidiga skeden. MG från två näthinnor på en mus, odlad i en brunn på en 12-brunnsplatta, når 90% -95% sammanflöde inom 4-5 dagar (figur 3E, F). Med tiden kommer allt neuronalt skräp att rensas och ett tätt cellskikt kommer att vara närvarande. Cellerna är inte redo för passage om botten av brunnen inte är helt sammanflytande. Passage bör dock inte göras senare än 6 dagar in vitro eftersom glia förlorar sina glialegenskaper i kulturen över tiden. Innan transfektion eller någon annan behandling måste cellerna kontrolleras för densitet och vitalitet. Transfektion bör endast utföras på 90%-95% sammanflytande celler (figur 3G). För immunofluorescerande märkning och konfokalmikroskopianalys måste celler sås på belagda täckglas.
Tidig och sen fas av cellomvandlingsperioden
Så tidigt som 15 timmar efter transfektion och 4-Hydroxytamoxifen-behandling börjar de första cellerna uttrycka svag röd fluorescens, dvs tdTomato rött fluorescerande reporterprotein som drivs under (aktiverad) Ascl1-promotor. Ascl1-uttryckande celler kallas nu vidare Ascl1-Tom+ celler. Mer robust Ascl1-Tom-uttryck kan observeras 2 dagar efter transfektion med ökande röd fluorescens över tid (figur 4). Omprogrammeringseffekten blir synlig cirka 2 dagar i odling med många Ascl1-Tom + -celler per fält som finns i omprogrammering av miRNA-behandling: visas här för kontroll-miR och miR-25 (figur 4B-B ''' respektive figur 4C-C '''). I båda behandlingarna är Ascl1-Tom+ celler fortfarande ganska runda och relativt stora, med en mer glia/stamcellsliknande morfologi. Dessutom påverkar induktionen av den röda fluorescerande reportern inte kulturens celltäthet (fortfarande 90%-95% sammanflytande).
Tre till fem dagar efter transfektion (figur 4A och figur 5A) blir ökningen av antalet Ascl1-Tom+-celler tydligare i de miR-25-behandlade brunnarna (figur 5B-D) som visar en fyrfaldig ökning av antalet efter miR-25-behandlingar jämfört med kontroller. Dessutom blir de första morfologiska förändringarna synliga. Dessa förändringar inkluderar minskning av cellsomastorlek och utveckling av fina processer. Medan de allra flesta celler under kontrollförhållanden är stora och plana (glial / stamfaderliknande, figur- 5B-B ''), förekommer många celler med små kärnor och flera små processer som liknar retinala neuroner i miR-25-behandlingen (Figur- 5C-C ''). Dessa neuronalliknande celler representerar cirka 70% av den totala Ascl1-Tom-populationen (15% i kontrollbehandling; Figur 5E). Cellerna är mindre täta på grund av cellomvandling (mindre celler kräver mindre utrymme). Intressant nog verkar dessa neuronala celler till och med bilda små nätverk (figur 5C ''). Vid denna tidpunkt kan celler skördas för immunofluorescerande märkning för att bekräfta neuronal identitet.
Bekräftelse av neuronal identitet
Celler är märkta med antikroppar mot mikrotubuliassocierat protein 2 (Map2), en markör för neuronspecifika cytoskelettproteiner30,31, och mot Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) för att validera neuronal identitet32,33. Båda markörerna användes också i tidigare omprogrammeringsstudier21,27. Otx2 är en transkriptionsfaktor som finns i RPC 34,35,36, mogna bipolära celler 34,35,37,38,39 och fotoreceptorer 35,36,37,38,40 . DAPI-kärnmärkning används för att motverka kulturerna. Immunofluorescerande märkning visar lite till frånvarande Map2- eller Otx2-uttryck under kontrollförhållanden (figur 6A-A''',C). miR-25-behandlade prover har dock många Map2+ och Otx2+-celler (figur 6B-B'''). Kvantifiering av konfokala bilder visar att efter miR-25-överuttryck är cirka 40 neuronala celler per fält närvarande jämfört med fem neuronala celler per fält i kontroller (figur 6C, fältstorlek: 630 μm x 630 μm). Bilderna togs med 20x mål. Dessa neuronala celler utgör cirka 70% av den totala Ascl1-Tom + cellpopulationen i de miR-25-behandlade proverna (kontroll ~ 20%, figur 6D). Alla neuronalliknande Ascl1-Tom+-celler var Map2+ och Otx2+, vilket bekräftar neuronal identitet. Dessutom var det absoluta antalet Otx2+ och Map2+ celler högre efter miR-25-behandlingar jämfört med kontroll-miRNA-behandling (miR-25: 60 celler per fält; kontroll-miR: 10 celler per fält; Figur 6E).
Sammantaget visar resultaten att MG-kulturer kan odlas och omprogrammeras med miRNA. miR-25 tillskott inducerar Ascl1-Tom uttryck i primär MG. Många MG konverteras till RPC som antar en neuronal morfologi och uttrycker neuronala markörer Map2 och Otx2 efter några dagar.
Figur 1: Experimentell design och tidsförlopp för en primär Müller glia-kultur. (B) Tidsförlopp för odlingsperioderna bestående av tillväxtfas (blå, 0-4/5 dagar in vitro, div), transfektionsfas (lila, 5/6-7/8 div) och MG-omvandlingsfas (gul, börjar 7/8 div). Tillväxtfas: dissocierade näthinnor (två näthinnor av en mus) odlas i en brunn av en 12-brunnsplatta i ett tillväxtmedium. Runt dag 4/6 passeras celler in i en 24-brunnsplatta som innehåller belagda täckglas. Transfektionsfas: 5-7 div (1 dag efter passage) celler transfekteras med miRNA i 2 dagar i transfektionsmedium. Cre rekombinas aktiveras med 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT). Cellproliferation spåras med EdU. MG-omvandlingsfasen börjar 1 dag efter transfektion. Celler odlas nu i det neuronala mediet fram till skörden (6-7 dagar efter transfektioner, dpTF). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Retinal dissociation och genotypning. (B) Isolerade näthinnor; retinala pigmentepitelceller (RPE) avlägsnas efter en noggrann tvätt. (C) 12-brunnsplatta med dissocierade näthinnor (två näthinnor per brunn). (D) Utskärning av ett exempel på genotypningsgelbild. Genotypning krävs för att identifiera mössen som har Ascl1-drivet Cre-rekombinasuttryck och kommer att användas för att spåra cellkonvertering. Skalstreck: 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Primär Müller glia under tillväxtfasen. (B-G) Levande bilder (fas) av Müller glia (MG) under tillväxtfas efter 1 div (B), 2 div efter mediumförändringen (C), 3 div (D), 4 div före passage (E,F) och 5 div, 1 dag efter passage och före transfektion (G). MG-cellkroppar indikeras med röda pilspetsar. Efter 3 div är kulturer 60% -80% sammanflöde (D), efter 4-5 div är kulturer 90% -100% sammanflytande och redo att passeras (E-F). Efter passage på täckglas måste cellkulturer vara 80%-90% sammanflytande för efterföljande transfektion (G). Skalstänger: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Tidiga stadier i Müller glia-omvandlingsfasen. Analyspunkten som visas i denna figur indikeras av den röda stjärnan: 7 div, 2 dagar efter transfektion (dpTF). (B-C''') Levande bilder av Müller glia (MG) kulturer i fas och röd fluorescens, kombinerad eller enstaka röd fluorescens. Röd fluorescens visualiserar Ascl1 som uttrycker MG (tdTomato+, förkortat Ascl1-Tom), 2 dagar efter transfektion med antingen kontrollmiRNA-miRNA-mimiker (control-miR, B-B''') eller miR-25 mimics (C-C'''). Områden i B/B' och C/C' visas i högre förstoring i B''/B''', C''/C'''. Skala staplar 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Slutstadier i Müller glia-omvandlingsfasen. Analyspunkten som visas i denna figur indikeras av den röda stjärnan: 10 div, 5 dagar efter transfektion (dpTF). (B-C'') Levande bilder av Müller glia (MG) kulturer i fas och röd fluorescens, kombinerad eller enstaka röd fluorescens. Röd fluorescens visualiserar Ascl1 som uttrycker MG (tdTomato+, förkortat Ascl1-Tom), 5 dagar efter transfektion (pTF) med antingen kontrollmiRNA-miRNA-mimiker (kontroll-miR, B-B'') eller miR-25 mimiker (C-C''). Indrag i B'/C' visas i högre förstoring i B''/C'', respektive. (D) Det absoluta antalet Ascl1-Tomat+ celler per fält (10x; 1440 μm x 1080 μm) efter kontroll-miRNA- eller miR-25-behandling, 2- och 5-dagars efter transfektion (dpTF; n =1, fem bilder per brunn räknas; medelvärde ± S.D.). (E) Procentandel neuronalliknande Ascl1-Tomat + -celler av totalt Ascl1-Tomat + -celler per fält (10x; 1440 μm x 1080 μm) efter kontroll-miRNA eller miR-25-behandling, 5 dagar efter transfektion (5dpTF, n = 1, medelvärde ± S.D.). Skalstreck: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Bekräftelse av den neuronala identiteten hos omprogrammerade celler. B-B''') Immunofluorescerande märkning av primära mus Müller glia (MG) kulturer 5 dagar efter transfektion behandlad med kontroll miRNA mimics (control-miR, A-A''') eller miR-25 mimics (B-B'''). Celler fixerades med 2% paraformaldehyd (PFA) och inkuberades med antikroppar mot RFP för att märka tdTomato, Map2 och Otx2 för att märka neuroner. DAPI-kärnmärkning (blå) användes för att färga alla cellkärnor. (C-E) Kvantifiering (n = 1; fem bilder per omslagsglas räknas; medelvärde ± S.D.) av det absoluta antalet Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+-celler per fält (C), procentandel av Ascl1-Tom+Otx2+Map2+-celler av totalt Antal Ascl1-Tom+-celler (D) och det absoluta antalet Otx2+Map2+-celler per fält (E). Resultaten visar ett högre antal nervceller i miR-25-behandlingen jämfört med kontroller. Fältstorlek: 630 μm x 630 μm. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Celldöd och bakteriell kontaminering. (A-A'') Levande bilder av Müller glia (MG) kulturer 3 div förorenade med bakterier. Indrag 1 i A visas i högre förstoring i A' och visar atrofisk, död glia. Infällt 2 i A visas i A'' med levande glia. Skalfält: 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man odlar MG från dissocierade musnäthinnor för omprogrammering av studier med miRNA. Som visats och bekräftats i en mängd tidigare studier är de allra flesta (80% -90%) av cellerna som finns i dessa kulturer MG 20,23,24. Denna metod är en mycket robust och pålitlig teknik och resultaten kan enkelt reproduceras om protokollet följs korrekt21,27. Kulturens framgångsrika tillväxt- och omprogrammeringseffektivitet beror dock på en mängd olika faktorer.
För det första spelar musens ålder en viktig roll i framgångsrik celltillväxt. Därför, om MG-kulturer odlas från vildtypsmöss eller transgena möss som liknar vilda typer som reportermöss, är den senaste åldern för att odla sammanflytande MG-monolager P12. Vid P12 är alla retinala neuroner och MG differentierade, och inga RPC finns längre i näthinnan. MG uttrycker mogna MG-markörer såsom glutaminsyntetas eller glutamat aspartattransportör (GLAST)20,23,41,42. Odlad P12 MG kan fortfarande komma in i cellcykeln när den utsätts för EGF, men antalet cykler är begränsat om än tillräckligt för att bilda konfluenta cellskikt in vitro. Ändå kan det hända att även P12 MG inte växer bra eftersom EGF eller komponenter i mediet kan brytas ned. Ofullständig dissociation (bitar) kan också resultera i mindre eller försenad MG-tillväxt. En viktig orsak till ofullständig dissociation är inaktivering av DNase som jag använde för retinal dissociation genom hård hantering av enzymet (snabb pipettering, virvel, etc.). Även om cellerna växer bra fram till passage kan cellerna vara mindre sammanflytande efter passage. Orsaker till detta kan vara hård hantering under passageprocessen som leder till ökad celldöd eller för att cellerna såddes för glest. Eftersom glia inte växer mycket, bör cellerna pläteras i samma förhållande som odlade, inte utspädda (i motsats till passagingprocedurer för odödliga cellinjer). Observera att eftersom MG-kulturer växer från mitten till periferin av en brunn, kommer högre celltätheter alltid att hittas i mitten. Det är därför absolut nödvändigt att kontrollera marginalerna i varje brunn före passage för att säkerställa att hela brunnen täcks av celler. Cellkoncentrationsmätningar bör utföras för att säkerställa bearbetning av tillräckliga mängder celler.
Dessutom kommer primära kulturer erhållna från möss vid P6 eller yngre inte att innehålla någon MG, eftersom MG bara håller på att mogna vid denna tidpunkt. Detta visades via encellig RNA-seq-analys43. Immunofluorescerande märkning med mogna MG-markörer vid denna ålder kommer också att bekräfta detta. Andelen RPC är dock betydande vid P6. Resultaten bör därför tolkas noggrant. Dessutom är markörer såsom de mellanliggande filamentmarkörerna vimentin och nestin inte lämpliga för att identifiera primär MG eftersom dessa markörer också uttrycks i astrocyterna 44,45,46, mikroglia47,48, endotelceller och pericyter 49,50,51,52 , och är inte MG-specifika. GFAP, uttryckt i retinala astrocyter men inte i MG av oskadade näthinnor, är inte en bra markör för odlad MG. Även om det är uppreglerat i dissocierad MG på grund av den mekaniska skadan under dissociation, nedregleras den efter 3 dagar i kultur28.
Eftersom MG delar många RPC-markörer är det säkraste förfarandet för att säkerställa en robust MG-kultur att använda möss på P12 eller äldre möss. Även om detta protokoll beskriver kulturer erhållna från P12 mus MG, kan vuxen mus MG odlas och omprogrammeras27. Mer vävnad per brunn måste dock pläteras (fyra till sex näthinnor). Detta beror på att vuxna glia inte delar sig mycket, även om de utsätts för EGF och 10% serum. Minskade cellkontakter leder till celldöd och celldegenerering (utsträckta celler, förstorade celler). Vuxen glia är ett bra verktyg för samodlingsparadigmer18 och celltäthet kanske inte spelar lika stor roll i dessa applikationer. För nedströmsapplikationer som transfektion eller transduktion är dock sammanflytande cellskikt ett krav.
Förutom nedsatt tillväxt kan celldöd uppstå. Om celldöd inträffar utan några uppenbara tecken bör mykoplasmakontaminering övervägas (mykoplasmastorlek 0,1-0,3 μm) och ett mykoplasmadetekteringskit ska användas. Att hålla varje prov separat (inte slå samman prover) kan också minska risken för korskontaminering. Men större bakterier kan också överföras från djuret och kan orsaka kontaminering trots att allt arbete utförs i en ren, steril miljö. Doppa ögongloben kort i 70% etanol och en noggrann tvätt i ytterligare 10 cm petriskål rekommenderas innan du dissekerar ögat. För att uppnå en framgångsrik kultur är det absolut nödvändigt att arbeta under sterila förhållanden eftersom kontaminering kan ske snabbt. När bakterier, jäst eller mögel/svamp finns i en tallrik, även om inte alla brunnar påverkas, går kulturen förlorad. Föroreningar kommer att orsaka celldöd (kompletterande figur 1) och kommer att påverka cellerna, vilket resulterar i icke-representativa data.
Celldöd kan också orsakas av reagenser som krävs för nedströmsapplikationer såsom Poly-O (eller Poly-D-Lysin) som används för att belägga täckglas. Dessa ämnen är giftiga och noggranna tvättar krävs innan Laminin används. Täckglas ska hålla fast vid botten av brunnen, inte flyta inuti en brunn. Luftbubblor måste undvikas. Dessutom är komplett beläggning med Laminin avgörande för att säkerställa celladhesion till täckglaset. Brist på Laminin kommer också att leda till mindre celltäthet och/eller celldöd.
För identifiering av äkta omprogrammerad glia bör reportermöss och cellproliferationsmarkörer som möjliggör cellspårning, såsom EdU eller BrdU, användas. Eftersom hela näthinnor är pläterade finns neuronala överlevande närvarande i alla kulturer. De är dock nästan helt borttagna efter passage i de flesta fall. Ändå bör EdU (eller BrdU) märkning utföras för att validera att neuroner härstammar från prolifererande MG / RPC och inte är neuronala överlevande (post-mitotiska). Det lilla antalet neuroner som finns i kontrollerna som används här är neuronala överlevande.
Intressant nog finns också några Ascl1-Tom+ celler i kontrollbehandlingen med något ökande antal över tid. Dessa celler kan vara några ganska omogna MG express Ascl1 när de isoleras och odlas. Fraktionen av denna Ascl1-Tom+ cellpopulation är dock liten. Dessutom uttrycker de flesta av dessa Ascl1-Tom+ celler som finns i kontrollbehandlingen inte Otx2 och/eller Map2 och håller en ganska platt cellform. Ingen neuronal differentiering verkar ske under kontrollförhållanden. Mycket känsliga neuronalliknande celler som verkar bilda nätverk finns först efter miR-25-behandling.
Protokollet som beskrivs här användes i tidigare studier för att testa miRNA för MG-omprogrammeringav 21,27 och har modifierats något under de senaste åren med avseende på brunnsplattorna för att odla glia. De odlas nu i 12-brunnsplattor, istället för 6-brunnsplattor. Konfluenta monolager kan erhållas i 12-brunnsplattor efter 4/5 dagar (jämfört med 6/8 dagar med 6-brunnsplattor) och därför reduceras den totala odlingsperioden som leder till cellförändring / degenerering. Transfektionstidsfönstret är också långsträckt. Regelbundna transfektionsprotokoll har en transfektionstid på 3 timmar, varefter en fullständig mediumförändring måste utföras för att säkerställa cellöverlevnad. Alla molekyler avlägsnas efter denna mediumförändring. I det nuvarande protokollet förlängdes tidsfönstret och längre exponering för miRNA tilläts genom att tillsätta 50% neuronalt medium (kompletterat med de faktorer som krävs för Kre-induktion och cellproliferationsspårning) till transfektionsreagensmediet. Cellerna var friska och inga problem uppstod med denna modifiering. Det verkar som om transfektionsresultaten är bättre med den långsträckta transfektionstiden, men mer data krävs för att bekräfta den observationen.
Dessutom beskrivs alla steg som krävs för immunofluorescerande märkning för att utföra konfokal laserscanningsmikroskopi här. Därför måste MG passeras på glasöverdrag. Eftersom täckglasen är mindre än ytan på en 24-brunnsplatta, passar endast cirka en tredjedel av cellerna som skulle täcka en hel brunn på en 24-brunnsplatta på det belagda täckglaset. För andra applikationer som qPCR, RNA-Seq eller western blots passeras celler i förhållandet 1: 1, behandlas och skördas vid önskad tidpunkt.
Som nämnts tidigare kan detta odlingssystem också användas för andra applikationer, till exempel för att studera glialbeteende, inklusive neuroprotektiva mekanismer, glios och / eller för att profilera mRNA, miRNA eller proteiner av odlad glia som liknar de studier som använde något olika odlingsparadigmer eller arter 11,28,29,54 . Dessa applikationer skulle varken kräva neuronalt medium för att säkerställa neuronal överlevnad efter omprogrammering eller tillsats av EdU för att visualisera cellproliferation. Ett lågserum medium utan neuronala tillskott bör användas istället.
Även om denna metod är robust och pålitlig, liknar alla primära kultursystem har den begränsningar; Dessa är begränsad livslängd för cellerna, progressiv celldegenerering över tid28 och det faktum att det är ett 2-dimensionellt, artificiellt odlingssystem som inte kan efterlikna det fysiologiska sammanhanget med avseende på båda, andra retinala celltyper och extracellulär matris. Därför, efter att ha identifierat toppkandidater och deras mest effektiva koncentrationer i MG-primära kulturer, bör retinala explantkulturer, ett 3-dimensionellt odlingssystem som liknar näthinnevävnaden, utföras. Explantkulturer har också begränsade odlingsperioder och celler i explantat degenererar också över tiden. De tillåter emellertid studier av MG i sin naturliga 3-dimensionella miljö och kan utföras i olika åldrar som återspeglar djurets utvecklingsstadium 23,32,55,56.
Sammantaget rapporterar denna studie om MG-kulturer som används för att övervaka potentialen hos RPC miRNA miR-25 för att omprogrammera MG till neuronala celler, validerade genom immunofluorescerande märkning. Detta protokoll användes i de tidigare arbetena 21,24,27 och är en aktuell in vitro-metod för att studera den regenerativa potentialen hos MG. Sammantaget är MG-primära kulturer en robust teknik och möjliggör reproducerbara resultat20,21. Även om miRNA-överuttryck för MG-omprogrammering beskrivs här exklusivt, kan andra faktorer såsom små molekyler, DNA (antingen plasmider eller förpackade i virala vektorer), antikroppar för proteinhämning32 eller specifika föreningar användas / testas i MG-primära kulturer. Det finns också ett brett spektrum av nedströmsapplikationer, inklusive miRNA-profilering24, scRNA-seq27, RT-qPCR20,21 eller western blots20. Dessutom tillåter MG-primära kulturer daglig observation och övervakning av cellerna. Detta kan vara en betydande fördel för att bestämma tidpunkter, till exempel för början, varaktigheten och / eller slutet av en viss reaktion eller cellrespons. Migrerande eller proliferativt beteende samt skade- / cellskada relaterade paradigmer (till exempel global miRNA-radering i MG-kulturer)32 kan studeras och analyseras i MG-primära kulturer för att identifiera underliggande mekanismer och vägar. Därför är MG-kulturer ett mycket kraftfullt verktyg för att studera MG på molekylär och cellulär nivå före implementering i in vivo-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ett patent som inkluderar några av resultaten i denna rapport har lämnats in av University of Washington med uppfinnarna Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl och Thomas A. Reh. Patentet heter ''Metoder och kompositioner för att stimulera retinal regenerering.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Ann Beaton och alla labbmedlemmar för deras input på manuskriptet. Särskilt tack till Drs. Tom Reh, Julia Pollak och Russ Taylor för att ha introducerat MG primära kulturer som ett screeningverktyg för SGS under postdoktoral utbildning vid University of Washington i Seattle. Studien finansierades av Empire Innovation Program (EIP) Grant till S.G.W. och startfonder från SUNY Optometry till S.G.W., samt R01EY032532-utmärkelsen från National Eye Institute (NEI) till S.G.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
