Summary
यह प्रोटोकॉल बताता है कि जेब्राफिश भ्रूण वर्गों के सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में संयोजन करके छवियों को कैसे प्राप्त किया जाए। सीटू संकरण में क्रायोसेक्शनिंग से पहले किया गया था, इसके बाद एंटीबॉडी धुंधला हो गया था। एंटीबॉडी की कमी होने पर ज़ेबराफिश में दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाना उपयोगी है।
Abstract
कशेरुक के रूप में, जेब्राफिश का व्यापक रूप से जैविक अध्ययन में उपयोग किया गया है। ज़ेबराफ़िश और मनुष्य उच्च आनुवंशिक होमोलॉजी साझा करते हैं, जो मानव रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में इसके उपयोग की अनुमति देता है। जीन फ़ंक्शन अध्ययन जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाने पर आधारित है। यद्यपि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटीन अभिव्यक्ति को परख करने का एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है, जेब्राफिश में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी की सीमित संख्या कोस्टेनिंग के आवेदन को प्रतिबंधित करती है। एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए जेब्राफिश भ्रूण में सीटू संकरण का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि ज़ेबराफिश भ्रूण वर्गों के लिए सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में संयोजन करके छवियों को कैसे प्राप्त किया जाए। सीटू संकरण में क्रायोसेक्शनिंग से पहले किया गया था, इसके बाद एंटीबॉडी धुंधला हो गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और एकल क्रायोसेक्शन की इमेजिंग सीटू संकरण के बाद की गई थी। प्रोटोकॉल दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न को उजागर करने में सहायक है, पहले सीटू ट्रांसक्रिप्ट डिटेक्शन द्वारा और फिर एक ही खंड में एक प्रोटीन के खिलाफ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा।
Introduction
जेब्राफिश विकास और आनुवंशिकी 1,2 के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली कशेरुक मॉडल है। ज़ेबराफ़िश और मनुष्य उच्च आनुवंशिक होमोलॉजी साझा करते हैं (70% जीन मानव जीनोम के साथ साझा किए जाते हैं), जोमानव रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में इसके उपयोग की अनुमति देता है। ज़ेबराफ़िश में, दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न और उनके स्थानिक संबंध का पता लगाना काफी आम है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग पहली बार 1941 में एफआईटीसी-लेबल एंटीबॉडी4 को लागू करके संक्रमित ऊतकों में रोगजनकों का पता लगाने के लिए किया गया था। ऊतक अनुभाग में लक्ष्य प्रोटीन को पहले एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है, और फिर अनुभाग को प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों इम्युनोग्लोबुलिन के खिलाफ एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। एंटीबॉडी धुंधला प्रोटीन के स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण है, जो इंट्रासेल्युलर स्तर पर उच्च ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। हालांकि, ज़ेबराफ़िश में उपलब्ध एंटीबॉडी की संख्या बहुत सीमित है। हाल के एक अध्ययन से पता चलता है कि चूहों के लिए लगभग 112,000 एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; हालांकि, जेब्राफिश5 में बहुत कम एंटीबॉडी विश्वसनीय साबित हुए हैं।
इसके बजाय, ज़ेबराफ़िश में, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न विश्लेषण के लिए सीटू संकरण में व्यापक रूप से लागू किया गया है। इस विधि का उपयोग पहली बार 1980के दशक में ड्रोसोफिला भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया गया था, और तब से, इस तकनीक को लगातार विकसित और बेहतर बनाया गया है। प्रारंभ में, एमआरएनए प्रतिलेख का पता लगाने के लिए रेडियोलेबल डीएनए जांच का उपयोग किया गया था; हालांकि, स्थानिक रिज़ॉल्यूशन अपेक्षाकृत कम था, और रेडियोधर्मिता के कारण संभावित स्वास्थ्य जोखिम थे। इसके बाद, सीटू संकरण में डिगोक्सीजेनिन (डीआईजी) या फ्लोरेसिन (फ्लुओ) के साथ लेबल किए गए आरएनए जांच पर निर्भर करता है, जो क्षारीय फॉस्फेट (एपी) के लिए संयुग्मित होते हैं या फ्लोरोसेंट टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) 8,9 द्वारा पता लगाया जाता है। यद्यपि टीएसए का उपयोग दो या तीन जीनों का पता लगाने के लिए किया गया है, आरएनए जांच के डीआईजी लेबलिंग और एंटीडीआईजी एपी-संयुग्मित एंटीबॉडी अभी भी सीटू संकरण के लिए अत्यधिक संवेदनशील, स्थिर और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण हैं। इसलिए, डीआईजी-लेबल इन सीटू जांच के साथ संयुक्त व्यावसायिक एंटीबॉडी प्रोटीन स्थानीयकरण और एक जीन की अभिव्यक्ति में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उपयोगी हैं।
कम ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन के कारण पूरे-माउंट भ्रूण जीन के बीच स्थानिक संबंध को प्रकट नहीं कर सकते हैं, भले ही ज़ेबराफ़िश भ्रूण छोटेऔर पारदर्शी हों। इसलिए, इंट्रासेल्युलर स्तर पर जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए सेक्शनिंग आवश्यक है। क्रायोसेक्शनिंग का व्यापक रूप से ज़ेबराफ़िश में उपयोग किया गया है क्योंकि यह प्रदर्शन करना आसान है और एंटीजन को प्रभावी ढंग से संरक्षित कर सकता है। इसलिए, जेब्राफिश क्रायोसेक्शन में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयुक्त सीटू संकरण दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है। जेब्राफिश11 पर सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का एक संयोजन लागू किया गया है। हालांकि, एंटीजन अखंडता की कीमत पर जांच प्रवेश को बढ़ाने के लिए प्रोटीन के उपचार का उपयोग किया गया था। इस सीमा को दूर करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एंटीजन पुनर्प्राप्ति को प्रेरित करने के लिए हीटिंग का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल न केवल विभिन्न चरणों और विभिन्न मोटाई के ऊतक वर्गों (14 μm सिर अनुभाग और 20 μm रीढ़ की हड्डी के खंडों) के भ्रूण पर लागू होता है, बल्कि इसे सिर और रीढ़ की हड्डी सहित दो अंगों में व्यक्त जीन का उपयोग करके भी सत्यापित किया गया है।
यह लेख वर्णन करेगा कि क्रायोसेक्शन में ज़ेब्राफिश भ्रूण में सीटू संकरण और एंटीबॉडी धुंधलापन को कैसे संयोजित किया जाए। इस प्रोटोकॉल की बहुमुखी प्रतिभा को दो अलग-अलग न्यूरॉन्स के लिए सीटू संकरण जांच सहित कई सीटू संकरण-इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री संयोजनों का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है। यह विधि विभिन्न क्षेत्रों और विभिन्न उम्र के भ्रूणों में एमआरएनए और प्रोटीन का पता लगाने के साथ-साथ दो जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए उपयुक्त है।
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Protocol
सभी पशु प्रोटोकॉल नानतोंग विश्वविद्यालय (संख्या S20191210-402) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।
1. जेब्राफिश भ्रूण का संग्रह
- अंडे एकत्र करने से एक रात पहले प्रजनन टैंक ों में जेब्राफिश की एक जोड़ी स्थापित करें, एक ट्रांसजेनिक जेब्राफिश और दूसरा एबी वाइल्ड-टाइप जेब्राफिश (टीजी (फॉक्सपी 2: ईजीएफपी-कैक्स) एक्स एबी वाइल्ड-टाइप या टीजी (एचबी 9: ईजीएफपी) एक्स एबी वाइल्ड-टाइप) (सामग्री की तालिका देखें)। भौतिक पहुंच को रोकने के लिए पुरुष और महिला को अलग करने के लिए एक विकर्ण प्लास्टिक विभाजक का उपयोग करें। अगले दिन, प्रजनन टैंक के ऊपरी हिस्से को ताजे पानी से भरे एक साफ निचले हिस्से में फिट करें, और प्रजनन टैंक के विभाजक को हटा दें। मछली को 10-20 मिनट के लिए संभोग करने दें, और प्रजनन टैंक के तल पर डूबने के बाद अंडे इकट्ठा करें।
- ई 3 भ्रूण माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) में भ्रूण को 28.5 डिग्री सेल्सियस पर मेथिलीन ब्लू (ई 3 भ्रूण माध्यम के 1 एल में 0.05% मेथिलीन ब्लू का 1 एमएल) युक्त कल्चर करें।
- वर्णक गठन को रोकने के लिए फेनिलथियोयूरिया (पीटीयू, सामग्री की तालिका देखें) के साथ 24 घंटे पोस्ट फर्टिलाइजेशन (एचपीएफ) पर भ्रूण का इलाज करें।
नोट: प्रयोगों में किसी भी लिंग के जानवरों का उपयोग किया जाता है।
2. सीटू संकरण में।
नोट: चरण 2.1-2.11 के लिए उपयोग किया जाने वाला पानी डायथाइल पाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) -उपचारित पानी है ( सामग्री की तालिका देखें)।
- 12-14 घंटे के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 0.5-1 एमएल ताजा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए, सामग्री की तालिका देखें) के साथ ~ 10 भ्रूण ठीक करें।
नोट: सीटू संकरण के लिए प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित साहित्य12 से थोड़ा संशोधित किया गया है। पीएफए को ताजा तैयार किया जाना चाहिए और उपयोग के एक सप्ताह के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए संग्रहीत किया जाना चाहिए। सीटू संकरण में निम्नलिखित सभी चरण 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके किए गए थे। - केवल 48 एचपीएफ से पुराने भ्रूण की त्वचा को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
नोट: 48 एचपीएफ से पुराने भ्रूण के ट्रंक क्षेत्र में आरएनए जांच के प्रवेश की सुविधा के लिए त्वचा को हटा दिया जाता है। - धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.1% ट्वीन -20 युक्त 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन में 25%, 50%, और 75% मेथनॉल से धोकर भ्रूण को निर्जलित करें। फिर, कमरे के तापमान पर 100% मेथनॉल में 5 मिनट के लिए भ्रूण धोएं। भ्रूण को -20 डिग्री सेल्सियस पर 12-14 घंटे के लिए कम से कम रात भर के लिए 100% मेथनॉल में इनक्यूबेट करें।
नोट: निर्जलित भ्रूण को 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल में संग्रहीत किया जा सकता है। - धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएसटी में 75%, 50%, और 25% मेथनॉल के साथ धोकर भ्रूण को फिर से हाइड्रेट करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ भ्रूण को तीन बार धोएं।
- कमरे के तापमान पर PBST में 10 μg / mL प्रोटीनेज K ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ भ्रूण को पचाएं ( तालिका 1 देखें)।
- 5 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ भ्रूण धो लें। इस धोने के चरण को तीन बार करें।
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पीएफए में धुले हुए भ्रूण को फिर से ठीक करें।
नोट: यह कदम पाचन को रोकता है क्योंकि पीएफए प्रोटीन के को निष्क्रिय कर देता है। सुनिश्चित करें कि नमूना सभी भ्रूणों को पीएफए को उजागर करने के लिए धीरे से मिलाया जाता है; समाधान में भ्रूण को समान रूप से वितरित करने के लिए ट्यूबों को उनके किनारों पर रखा जा सकता है। इस पीएफए को ताजा होने की आवश्यकता नहीं है (इसे 2 सप्ताह तक प्रशीतित किया जा सकता है)। - भ्रूण को पीबीएसटी के साथ तीन बार धोएं, प्रत्येक धोने के दौरान 5 मिनट के लिए भिगोएं।
- 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहाइब्रिडाइजेशन समाधान (प्रीएचवाईबी, सामग्री की तालिका देखें) के साथ इंक्यूबेट करके भ्रूण का प्रीहाइब्रिडाइजेशन करें। प्रीएचवाईबी को संकरण समाधान (एचवाईबी, सामग्री की तालिका देखें) के साथ बदलें और एचवाईबी में कम से कम 4 घंटे के लिए प्रीहाइब्रिड करें।
नोट: प्रीहाइब्रिडाइजेशन के साथ आगे बढ़ने से पहले, समाधान को 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें। फॉर्मामाइड ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग ऊतक के आकार और संरचना को बनाए रखने के लिए किया जाता है। फॉर्मामाइड कम तापमान पर गैर-समरूप टुकड़ों के बंधन को भी रोकता है। - भ्रूण में जोड़ने से पहले 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एचवाईबी में प्रोब (Insm1a या 5-HT2C) को गर्म करें। 1 μg / mL HYB पर जांच का उपयोग करें। भ्रूण को हवा के संपर्क में आने के बिना जितना संभव हो उतना प्रीएचवाईबी निकालें, और भ्रूण युक्त ट्यूब में एचवाईबी में प्रीहीट जांच जोड़ें।
नोट: भ्रूण में एक लक्ष्य एमआरएनए अनुक्रम के साथ संकरण करने के लिए एक लेबल आरएनए जांच का उपयोग किया जा सकता है। इसलिए, जांच का उपयोग रुचि के जीन की अभिव्यक्ति और एमआरएनए के स्थान का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। - जांच को 50-70 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (12-14 घंटे) संकरण करने की अनुमति दें।
नोट: संकरण तापमान विभिन्न जांच के लिए भिन्न होता है। - अगले दिन, एक पिपेट के साथ जांच समाधान को एस्पिरेट करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर एक ट्यूब में स्टोर करें ताकि इसे कई बार पुन: उपयोग किया जा सके।
- भ्रूण को निम्नानुसार धोएं:
- 65 डिग्री सेल्सियस पर 100% एचवाईबी के साथ 15 मिनट के लिए भ्रूण धोएं।
- भ्रूण को क्रमिक रूप से 75%, 50%, और 25% HYB के साथ 2x मानक खारा साइट्रेट में धोएं जिसमें 0.1% ट्वीन -20 (एसएससीटी, सामग्री की तालिका देखें) प्रत्येक 65 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए होता है।
- 65 डिग्री सेल्सियस पर 2x SSCT में 15 मिनट के लिए भ्रूण धोएं।
- भ्रूण को 65 डिग्री सेल्सियस पर 0.2x SSCT में 15 मिनट के लिए धोएं।
- कमरे के तापमान पर 0.02% ट्वीन -20 (एमएबीटी, सामग्री की तालिका देखें) युक्त मैलिक एसिड बफर में 10 मिनट के लिए भ्रूण को दो बार धोएं।
- संकरित और धुले हुए भ्रूण को कमरे के तापमान पर कम से कम 2 घंटे के लिए ब्लॉक करें, जिसमें 2% ब्लॉकिंग समाधान -1 ( सामग्री की तालिका देखें)।
- ब्लॉकिंग समाधान -1 को एंटीडिगोक्सीजेनिन एपी (1: 4,000 कमजोर पड़ने, सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक ताजा 2% ब्लॉकिंग समाधान -1 में बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-14 घंटे के लिए रात भर हिलाएं।
- कमरे के तापमान पर एमएबीटी में 30 मिनट के लिए भ्रूण को चार बार धोएं।
नोट: तीसरे धोने के दौरान रेफ्रिजरेटर से बीएम बैंगनी ( सामग्री की तालिका देखें) निकालें और बाद के धोने के दौरान कभी-कभी इसे हिलाएं। - एनटीएमटी में 10 मिनट के लिए भ्रूण को दो बार धोएं (0.1 एम ट्रिस-एचसीएल, 0.1 एम एनएसीएल, 1% ट्वीन -20, सामग्री की तालिका देखें)।
- भ्रूण से जितना संभव हो उतना एनटीएमटी निकालने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। बीएम बैंगनी एपी सब्सट्रेट के साथ बदलें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर भ्रूण को दाग दें। रंगाई की डिग्री को नियंत्रित करने के लिए हर 30 मिनट में रंग परिवर्तन की निगरानी करें।
नोट: विशिष्ट रंगाई का समय अलग है और प्रत्येक जांच के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को इंजेक्ट करने से प्रतिक्रिया में तेजी आ सकती है। 4 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को इंजेक्ट करने से प्रतिक्रिया का समय बढ़ सकता है और इसे रात भर किया जा सकता है। - एक बार जब यह वांछित सीमा तक विकसित हो जाता है, तो एनटीएमटी के साथ दो बार संक्षेप में कुल्ला करके प्रतिक्रिया को रोकें। सीटू संकरण के बाद, भ्रूण को 20 मिनट के लिए तीन बार पीबीएसटी के साथ कुल्ला करें।
3. एम्बेड करना
- भ्रूण को 5% सुक्रोज में 1x PBS ( सामग्री की तालिका देखें) में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-14 घंटे के लिए डुबोएं।
- भ्रूण को कवर करने वाले घोल को 1x PBS में 15% सुक्रोज में बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए रात भर इनक्यूबेट करें।
- भ्रूण को कवर करने वाले घोल को 1x PBS में 30% सुक्रोज में बदलें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: इस घोल में तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि भ्रूण ट्यूब के तल तक डूब न जाए। - इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) माध्यम के साथ एक क्रायोमोल्ड भरें (सामग्री की तालिका देखें)। 30% सुक्रोज में भ्रूण को ओसीटी माध्यम के साथ क्रायोमोल्ड में स्थानांतरित करें। भ्रूण से सुक्रोज को हटाने के लिए उन्हें हिलाएं।
- भ्रूण को ऊतक के लिए एक नए क्रायोमोल्ड में स्थानांतरित करें और धीरे से इसे ओसीटी माध्यम से भरें, बुलबुले के गठन से बचें।
- प्रत्येक भ्रूण को डुबोएं, इसे क्रायोमोल्ड के तल पर धकेलें, और प्रत्येक भ्रूण को वांछित अभिविन्यास (या तो पृष्ठीय-उदर या पार्श्व) में रखें। भ्रूण को एक सीधी रेखा में रखें।
नोट: प्रत्येक क्रायोमोल्ड में केवल एक भ्रूण रखने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है ( सामग्री की तालिका देखें)। - ड्राई आइस इथेनॉल स्नान में क्रायोमोल्ड्स में एम्बेडेड भ्रूण रखें।
- कम से कम रात 12-14 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: क्रायोमोल्ड्स को कम से कम एक महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
4. क्रायोसेक्शनिंग
- क्रायोस्टैट का उपयोग करके क्रायोसेक्शन को -20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
- क्रायोमोल्ड से नमूना ब्लॉक निकालें और इसे क्रायोस्टेट में रखें। ओसीटी माध्यम को ठंडा चक के आधार पर रखें और ब्लॉक को शीर्ष पर रखें।
- सुनिश्चित करें कि नमूना ब्लॉक रेजर ब्लेड के समानांतर है। नमूने के चारों ओर अतिरिक्त ओसीटी माध्यम को सावधानीपूर्वक ट्रिम करें।
- क्रायोस्टैट का उपयोग करके 12-20 μm मोटे वर्गों में काटें। अनुभागों को शीघ्रता से ग्लास स्लाइड्स में स्थानांतरित करें ताकि प्रत्येक स्लाइड में 3-4 अनुभाग हों. नमूने को कमरे के तापमान तक पहुंचने दें, और बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक सीलबंद स्लाइड बॉक्स में अनुभागों को स्टोर करें।
5. इम्यूनोस्टेनिंग
नोट: जीएफपी धुंधला अनुभागों पर किया जाता है।
- 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ अनुभागों वाले स्लाइड्स को धो लें।
- माइक्रोवेव में उबलने के लिए साइट्रेट बफर को गर्म करें।
- स्लाइड्स को बफर में रखें और लगभग 20 मिनट के लिए घोल को उबलने के पास रखने के लिए गर्म करना जारी रखें।
नोट: यह चरण एंटीजन पुनर्प्राप्ति में मदद करता है। ऊतक उच्च तापमान पर भी बरकरार रहता है, जो ऊतकों की तह, क्षति या अलगाव को रोककर धुंधला गुणवत्ता में सुधार करता है। - अगले चरण से पहले नमूने को कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे ठंडा होने दें। अतिरिक्त घोल को छान लें, ऊतक के एक टुकड़े के साथ प्रत्येक खंड के आसपास के क्षेत्र को सावधानीपूर्वक सुखाएं, और हाइड्रोफोबिक बाधा बनाने के लिए पानी-रिपेलेंट पेन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ अनुभाग के चारों ओर एक सर्कल खींचें। सावधान रहें कि ऊतक वर्गों को सूखा न करें।
- पीबीएस के साथ स्लाइड ्स को दो बार धोएं, प्रत्येक धोने के दौरान 10 मिनट के लिए भिगोएं।
- कमरे के तापमान पर समाधान -2 ( सामग्री की तालिका देखें) को अवरुद्ध करने में 2 घंटे के लिए ब्लॉक करें।
- पिपेट प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (माउस मोनोक्लोनल α-जीएफपी, 1: 250, सामग्री की तालिका देखें) प्रति स्लाइड और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल वेट बॉक्स में स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस के साथ स्लाइड ्स को तीन बार धोएं, प्रत्येक धोने के दौरान 10 मिनट के लिए भिगोएं।
- अतिरिक्त पीबीएस निकालें। पीबीएस में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी (1:400, सामग्री की तालिका देखें) के साथ स्लाइड ्स को इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस के साथ स्लाइड ्स को तीन बार धोएं, प्रत्येक धोने के दौरान 10 मिनट के लिए भिगोएं।
- अतिरिक्त पीबीएस को छान ें, स्लाइड पर माउंटिंग माध्यम को पिपेट करें, और स्लाइड कवरस्लिप के साथ माउंट करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक साथ एक एमआरएनए और एक प्रोटीन के अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच करने के लिए किया जा सकता है। चित्र 1 प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो दिखाता है. 5-एचटी 2 सी रिसेप्टर न्यूरोट्रांसमीटर सेरोटोनिन (5-हाइड्रॉक्सीट्रिप्टामाइन, 5-एचटी) से बंधे 5-एचटी रिसेप्टर का एक उपप्रकार है। यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है और भूख, मनोदशा, चिंता और प्रजनन व्यवहारसहित विभिन्न प्रकार के मस्तिष्क कार्यों को महत्वपूर्ण रूप से विनियमित कर सकता है। सीएनएस में 5-एचटी 2 सी की अभिव्यक्ति ट्रांसजेनिक लाइन टीजी (फॉक्सपी 2 : ईजीएफपी-कैक्स) द्वारा पता लगाया गया था, जिसमें फॉक्सपी 2 न्यूरॉन्स को फ्लोरेसिन ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) द्वारा लेबल किया जाता है। जीएफपी को जंगली प्रकार की जेब्राफिश में नहीं बल्कि केवल ट्रांसजेनिक लाइन में व्यक्त किया गया था। आरएनए (5-एचटी 2 सी, एचटीआर 2 सी, चित्रा 2 ए के लिए जांच) और प्रोटीन (जीएफपी, एंटीजीएफपी, चित्रा 2 बी) की अभिव्यक्ति का एक साथ पता लगाने का उपयोग प्रोटीन और एमआरएनए कोलोकलाइजेशन विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
इंसुलिनोमा से जुड़े 1 ए (इनएसएम 1 ए), एक जस्ता-उंगली प्रतिलेखन कारक, को पहली बार ट्यूमर रिडक्शन लाइब्रेरी से पहचाना गया था और कशेरुक केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र और न्यूरोएंडोक्राइन सिस्टम के गठन और भेदभाव में कई कार्य किए गए थे। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि INSM1a मोटर न्यूरॉन विकास का एक महत्वपूर्ण नियामक है। जेब्राफिश रीढ़ की हड्डी और मोटर न्यूरॉन्स में इनएसएम 1 ए की अभिव्यक्ति का पता ट्रांसजेनिक लाइन टीजी (एचबी 9: ईजीएफपी) द्वारा लगाया गया था, जिसमें एचबी 9 न्यूरॉन्स को फ्लोरेसिन जीएफपी द्वारा लेबल किया जाता है। जीएफपी को जंगली प्रकार की जेब्राफिश में नहीं बल्कि केवल ट्रांसजेनिक लाइन में व्यक्त किया गया था। आरएनए (insm1a, insm1a, चित्रा 3A) और प्रोटीन (जीएफपी, एंटीजीएफपी, चित्रा 3बी) की अभिव्यक्ति का एक साथ पता लगाने का उपयोग प्रोटीन और एमआरएनए कोलोकलाइजेशन विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक प्रोटीन और आरएनए के कोलोकलाइजेशन का पता लगाने के लिए लागू किया गया था ताकि उनके स्थानिक संबंध को समझा जा सके।
चित्र 1: विधि की रूपरेखा। यह फ़्लोचार्ट एक प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो दिखाता है. वर्कफ़्लो को न्यूनतम 9 दिनों में पूरा किया जा सकता है (वर्कफ़्लो में प्रत्येक चरण के ऊपरी दाएँ कोने में दिनों की संख्या देखें), हालांकि कुछ चरणों को लंबी अवधि में पूरा किया जा सकता है, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है। संक्षेप: पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड; O/N = रात भर; आरटी = कमरे का तापमान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: टीजी (फॉक्सपी 2: ईजीएफपी-कैक्स) में 5-एचटी 2 सी जांच और जीएफपी एंटीबॉडी के साथ सना हुआ पूरे-माउंट भ्रूण। ब्राइट-फील्ड (ए), फ्लोरोसेंट (बी), और मर्ज की गई छवियां (सी) फॉक्सपी 2 न्यूरॉन्स और एक्सॉन ट्रैक्ट ्स में 5-एचटी 2 सी (एचटीआर 2 सी, ए के लिए जांच) और जीएफपी (एंटीजीएफपी, बी) अभिव्यक्ति दिखाती हैं। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: टीजी (एचबी 9: ईजीएफपी) में इनएसएम 1 ए जांच और जीएफपी एंटीबॉडी के साथ सना हुआ पूरे-माउंट भ्रूण। ब्राइट-फील्ड (ए), फ्लोरोसेंट (बी), और मर्ज की गई छवियां (सी) एचबी 9 न्यूरॉन्स में इनएसएम 1 ए (इनएसएम 1 ए, ए के लिए जांच) और जीएफपी (एंटी-जीएफपी, बी) अभिव्यक्ति दिखाती हैं। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| भ्रूण | समय |
| 24 एचपीएफ | 2 मिनट |
| 30 एचपीएफ | 3 मिनट |
| 36 एचपीएफ | 5 मिनट |
| 48 एचपीएफ | 10 मिनट |
| 72 एचपीएफ | 15 मिनट |
| 96 एचपीएफ | 45 मिनट |
| 4-5 dpf | 60 मिनट |
तालिका 1: ज़ेबराफिश भ्रूण के लिए प्रोटीन के पाचन समय। संक्षेप: एचपीएफ = निषेचन के बाद के घंटे; डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के संयोजन का प्रस्ताव करता है, जो ज़ेबराफिश भ्रूण पर कोलोकलाइजेशन प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह विधि एक साथ एक एमआरएनए और एक प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक आसान और कुशल तरीके के रूप में कार्य करती है। सीटू संकरण और एंटीबॉडी धुंधला जेब्राफिश भ्रूण पर किया गया था। पहले प्रकाशित कई प्रोटोकॉल के विपरीत14,15,16, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया गया था। कुछ ज़ेब्राफ़िश-विशिष्ट एंटीबॉडी को धारा17 में उपयोग के लिए उचित रूप से मान्य किया गया है। पिछले अध्ययनों ने केवल एक तकनीक का उपयोग किया है: इम्यूनोफ्लोरेसेंस, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, या सीटू संकरण में। आरएनए और प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में संयोजन किसी भी एक तकनीक की सीमाओं को दूर करता है। पहला कदम सीटू संकरण में था, जो एमआरएनए को गिरावट से बचाता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने के दौरान एंटीबॉडी बाइंडिंग के प्रोटीनके उपचार द्वारा व्यवधान से बचने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति को हीटिंग द्वारा प्रेरित किया गया था। क्या यह दृष्टिकोण सभी एंटीजन के लिए काम करता है, इसके लिए आगे के परीक्षण की आवश्यकता होगी। वर्गों की छवियों से पता चला है कि 5-एचटी 2 सी रिसेप्टर फॉक्सपी 2 न्यूरॉन्स में सहव्यक्त किया गया था और यह कि इनएसएम 1 ए रिसेप्टर एचबी 9 न्यूरॉन्स में सहव्यक्त किया गया था।
सीटू संकरण में होल-माउंट नमूनों की अखंडता को बहुत संरक्षित करता है। सीटू संकरण के बाद सेक्शनिंग एंटीबॉडी धुंधला होने के लिए इनक्यूबेशन समय को कम कर सकता है। इसके अलावा, सीटू संकरण के बाद एंटीबॉडी धुंधला पन प्रतिदीप्ति शमन से बचने में मदद कर सकता है।
प्रयोग की सफलता के लिए निम्नलिखित विशिष्ट कदम आवश्यक हैं। पहला महत्वपूर्ण कदम भ्रूण को 4% पीएफए में फिर से ठीक करना है। यह चरण प्रोटीन के प्रतिक्रिया को रोकता है क्योंकि पीएफए प्रोटीन के को निष्क्रिय कर देता है। पीएफए के लिए सभी भ्रूणों को उजागर करने के लिए नमूने को धीरे से मिलाया जाना चाहिए; ट्यूब को इसके किनारे भी रखा जा सकता है ताकि भ्रूण को समाधान में समान रूप से वितरित किया जा सके। दूसरा महत्वपूर्ण कदम ओसीटी आरोपण के दौरान भ्रूण का उपचार है। भ्रूण को एक विशिष्ट दिशा (या तो पृष्ठीय-उदर या पार्श्व) में व्यवस्थित किया जाना चाहिए, उन्हें सीधा रखना चाहिए ताकि उन्हें सभी भ्रूणों के लिए लगभग एक ही क्षेत्र से वर्गों में काटा जा सके। भ्रूण का पता लगाने और बुलबुले को हटाने के लिए चिपचिपे ओसीटी माध्यम में छोटे, सचेत आंदोलनों को बनाने के लिए एक छोटी सुई का उपयोग किया जाता है।
कई संभावित संशोधन हैं जिन्हें वर्णित परिदृश्य पर लागू किया जा सकता है। सीटू संकरण में प्रोटीन के के पाचन समय को ज़ेबराफिश भ्रूण के विभिन्न विकास चरणों के अनुसार निर्धारित किया जा सकता है (तालिका 1)। इसके अलावा, क्रायोसेक्शन की मोटाई बहुत लचीली है और प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार निर्धारित की जा सकती है। हालांकि यह भविष्यवाणी की जाती है कि यह दृष्टिकोण प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त होगा, लेकिन इसकी कुछ संभावित सीमाएं हैं। इस प्रक्रिया का सफल निष्पादन दो क्रमिक प्रयोगों के माध्यम से एक पूर्ण नमूना बनाए रखने पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल में कई संभावित विराम बिंदु हैं। निर्जलित भ्रूण कोकई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है। इसी तरह, तैयार स्लाइड्स को 1 वर्ष14 से अधिक समय तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड बॉक्स में संग्रहीत किया जा सकता है। जमे हुए ब्लॉक को तीन महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयुक्त सीटू संकरण के लिए यह प्रोटोकॉल ज़ेबराफिश भ्रूण में 5-एचटी 2 सी और इनएसएम 1 ए अभिव्यक्ति का पता लगाने में सफल रहा है और विभिन्न विकास चरणों में विभिन्न ऊतकों पर आसानी से लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को न्यूरॉन्स या ग्लियल कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है, जो तंत्रिका विज्ञानियों के लिए एक मजबूत जांच दृष्टिकोण प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के नानतोंग साइंस एंड टेक्नोलॉजी फाउंडेशन (MS12019011), चीन के नानतोंग साइंस एंड टेक्नोलॉजी फाउंडेशन (JC2021058), और जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21केजेबी 180009) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
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