Summary
В этом протоколе описывается, как получить изображения путем объединения гибридизации in situ и иммуногистохимии эмбриональных срезов рыбок данио. Гибридизация in situ проводилась перед криосекцией с последующим окрашиванием антителами. Полезно обнаружить паттерны экспрессии двух генов у рыбок данио, если антител не хватает.
Abstract
Как позвоночные, рыбки данио-рерио широко используются в биологических исследованиях. Рыбки данио-рерио и люди имеют высокую генетическую гомологию, что позволяет использовать его в качестве модели заболеваний человека. Исследование функции генов основано на обнаружении паттернов экспрессии генов. Хотя иммуногистохимия предлагает мощный способ анализа экспрессии белка, ограниченное количество коммерчески доступных антител у рыбок данио-рерио ограничивает применение окрашивания. Гибридизация in situ широко используется у эмбрионов рыбок данио-рерио для обнаружения экспрессии мРНК. В этом протоколе описывается, как получить изображения путем комбинирования гибридизации in situ и иммуногистохимии для срезов эмбрионов рыбок данио. Гибридизация in situ проводилась перед криосекцией с последующим окрашиванием антителами. Иммуногистохимия и визуализация одной криосекции были выполнены после гибридизации in situ . Протокол полезен для разгадки паттерна экспрессии двух генов, сначала путем обнаружения транскрипта in situ , а затем путем иммуногистохимии против белка в том же участке.
Introduction
Рыбки данио-рерио являются мощной моделью позвоночных для изучения развития и генетики 1,2. Рыбки данио-рерио и люди имеют высокую генетическую гомологию (70% генов являются общими с геномом человека), что позволяет использовать его в качестве модели для болезней человека3. У рыбок данио-рерио довольно часто обнаруживаются паттерны экспрессии двух генов и их пространственные отношения. Иммуногистохимия была впервые использована в 1941 году для обнаружения патогенов в инфицированных тканях путем применения антител, меченных FITC4. Белок-мишень в тканевом срезе сначала помечают первичным антителом, а затем срез помечают вторичным антителом против иммуноглобулина-хозяина первичного антитела. Окрашивание антител — это надежный подход к обнаружению локализации белков, который обеспечивает высокое оптическое разрешение на внутриклеточном уровне. Тем не менее, количество доступных антител очень ограничено у рыбок данио. Недавнее исследование показывает, что около 112 000 антител коммерчески доступны для мышей; Тем не менее, было продемонстрировано, что очень немногие антитела являются надежными у рыбокданио-рерио 5.
Вместо этого у рыбок данио-рерио гибридизация in situ широко применяется для анализа паттернов экспрессии генов. Этот метод был впервые использован для оценки экспрессии генов у эмбрионов дрозофилы в 1980-х годах6,7, и с тех пор эта технология постоянно развивалась и совершенствовалась. Первоначально для обнаружения транскриптов мРНК использовались ДНК-зонды с радиоактивной меткой; Однако пространственное разрешение было относительно низким, и существовали потенциальные риски для здоровья, вызванные радиоактивностью. Впоследствии гибридизация in situ опирается на РНК-зонды, меченные дигоксигенином (DIG) или флуоресцеином (Fluo), которые конъюгированы с щелочной фосфатазой (AP) или обнаруживаются с помощью флуоресцентного усиления тирамидного сигнала (TSA)8,9. Несмотря на то, что TSA используется для обнаружения двух или трех генов, маркировка DIG РНК-зондов и антиDIG-конъюгированные антитела AP по-прежнему являются высокочувствительными, стабильными и широко используемыми подходами для гибридизации in situ. Таким образом, коммерциализированные антитела в сочетании с DIG-меченными зондами in situ полезны для понимания локализации белка и экспрессии одного гена.
Цельные эмбрионы не могут выявить пространственную связь между генами из-за низкого оптического разрешения, даже несмотря на то, что эмбрионы рыбок данио-рерио маленькие и прозрачные10. Следовательно, секционирование необходимо для анализа паттернов экспрессии генов на внутриклеточном уровне. Криосекция широко используется у рыбок данио, поскольку она проста в выполнении и может эффективно сохранять антиген. Таким образом, гибридизация in situ в сочетании с иммуногистохимией в криосекциях рыбок данио-рерио предлагает мощный способ анализа паттернов экспрессии двух генов. Комбинация гибридизации in situ и иммуногистохимии была применена к рыбкам данио-рерио11. Однако лечение протеиназой К использовалось для усиления проникновения зонда за счет целостности антигена. Чтобы преодолеть это ограничение, этот протокол использует нагревание, чтобы вызвать извлечение антигена. Этот протокол применим не только к эмбрионам разных стадий и срезам тканей различной толщины (срезы головы 14 мкм и срезы спинного мозга 20 мкм), но также был проверен с использованием генов, экспрессируемых в двух органах, включая головной и спинной мозг.
В этой статье будет описано, как сочетать гибридизацию in situ и окрашивание антител у эмбрионов рыбок данио-рерио в криосекциях. Универсальность этого протокола демонстрируется с помощью ряда комбинаций гибридизации и иммуногистохимии in situ, включая зонды гибридизации in situ для двух разных нейронов. Этот метод подходит для обнаружения мРНК и белка в разных регионах и эмбрионах разного возраста, а также паттернов экспрессии двух генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Наньтун (No S20191210-402).
1. Коллекция эмбрионов рыбок данио-рерио
- За ночь до сбора яиц поместите пару рыбок данио-рерио в аквариумы для размножения, одну из которых - трансгенную рыбку данио-рерио, а другую - рыбку данио-рерио дикого типа AB (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB дикого типа или Tg (hb9: egfp) X дикого типа AB) (см. Таблицу материалов). Используйте диагональный пластиковый разделитель, чтобы разделить мужчину и женщину, чтобы исключить физический доступ. На следующий день поместите верхнюю часть резервуара для размножения в чистую нижнюю часть, заполненную пресной водой, и снимите разделитель резервуара для размножения. Дайте рыбе спариться в течение 10-20 минут и соберите икру после того, как она опустится на дно аквариума для разведения.
- Культивируют эмбрионы в среде эмбриона Е3 (см. Таблицу материалов), содержащей метиленовый синий (1 мл 0,05% метиленового синего в 1 л среды эмбриона Е3) при 28,5 °C.
- Обработайте эмбрионы через 24 часа после оплодотворения фенилтиомочевиной (ПТУ, см. Таблицу материалов) для предотвращения образования пигмента.
ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах используются животные обоего пола.
2. Гибридизация in situ
ПРИМЕЧАНИЕ: Вода, используемая для этапов 2.1-2.11, представляет собой воду, обработанную диэтилпирокарбонатом (DEPC) (см. Таблицу материалов).
- Зафиксируйте ~ 10 эмбрионов 0,5-1 мл свежего 4% параформальдегида (PFA, см. Таблицу материалов) в микропробирке объемом 1,5 мл при 4 ° C на ночь в течение 12-14 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол гибридизации in situ немного изменен по сравнению с ранее опубликованной литературой12. PFA должен быть свежеприготовленным и храниться при температуре 4 ° C в течение одной недели использования или в течение одного месяца при -20 ° C. Все последующие этапы гибридизации in situ выполнялись с использованием микропробирок объемом 1,5 мл. - Используйте пинцет для удаления кожи только у эмбрионов старше 48 лет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кожа удаляется для облегчения проникновения РНК-зондов в область ствола эмбрионов старше 48 hpf. - Постепенно обезвоживайте эмбрионы, промывая 25%, 50% и 75% метанолом в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,1% Tween-20 последовательно (PBST, см. Таблицу материалов) в течение 5 мин каждый при комнатной температуре. Затем промойте эмбрионы в течение 5 минут в 100% метаноле при комнатной температуре. Инкубируют эмбрионы в 100% метаноле при -20 °C, по крайней мере, в течение ночи в течение 12-14 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоженные эмбрионы можно хранить в 100% метаноле при -20 ° C в течение 6 месяцев. - Постепенно регидратируйте эмбрионы, промывая 75%, 50% и 25% метанола в PBST последовательно в течение 5 минут каждый при комнатной температуре. Промойте эмбрион трижды PBST в течение 5 минут каждый при комнатной температуре.
- Переваривают эмбрионы протеиназой K 10 мкг/мл (см. Таблицу материалов) в PBST при комнатной температуре (см. Таблицу 1).
- Промойте эмбрионы препаратом PBST в течение 5 минут. Выполните этот шаг стирки три раза.
- Зафиксируйте промытые эмбрионы в 4% PFA в течение 15 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг останавливает пищеварение, потому что PFA инактивирует протеиназу K. Убедитесь, что образец аккуратно перемешан, чтобы подвергнуть все эмбрионы воздействию PFA; Трубки могут быть размещены на боку, чтобы равномерно распределить эмбрионы в растворе. Этот PFA не обязательно должен быть свежим (его можно хранить в холодильнике до 2 недель). - Промойте эмбрион три раза PBST, инкубируя в течение 5 минут во время каждого мытья.
- Проводят прегибридизацию эмбрионов путем инкубации с прегибридизационным раствором (preHYB, см. Таблицу материалов) при 65 ° C в течение 5 мин. Замените preHYB гибридизационным раствором (HYB, см. Таблицу материалов) и проведите прегибридизацию в течение не менее 4 ч в HYB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к прегибридизации, предварительно нагрейте растворы до 65 °C. Формамид (см. Таблицу материалов) используется для поддержания формы и структуры ткани. Формамид также предотвращает связывание негомологичных фрагментов при низких температурах. - Нагрейте зонд (Insm1a или 5-HT2C) в HYB в течение 5 минут при 95 ° C перед добавлением к эмбрионам. Используйте зонд в концентрации 1 мкг/мл HYB. Удалите как можно больше preHYB, не позволяя эмбрионам вступать в контакт с воздухом, и добавьте предварительно нагретый зонд в HYB в пробирку, содержащую эмбрионы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Меченый РНК-зонд можно использовать для гибридизации с целевой последовательностью мРНК у эмбрионов. Таким образом, зонд может быть использован для обнаружения экспрессии интересующего гена и местоположения мРНК. - Дайте зонду гибридизоваться в течение ночи (12-14 ч) при 50-70 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура гибридизации различается для разных зондов. - На следующий день аспирируйте раствор зонда пипеткой и храните его в пробирке при температуре -20 °C, чтобы его можно было использовать многократно.
- Промывают эмбрионы следующим образом:
- Промойте эмбрионы в течение 15 минут со 100% HYB при 65 ° C.
- Промывают эмбрионы последовательно 75%, 50% и 25% HYB в 2x стандартном физиологическом растворе, содержащем 0,1% Tween-20 (SSCT, см. Таблицу материалов) в течение 15 мин каждый при 65 ° C.
- Промойте эмбрионы в течение 15 минут в 2x SSCT при 65 ° C.
- Промывают эмбрионы в течение 15 мин в 0,2x SSCT при 65 °C.
- Промойте эмбрионы два раза в течение 10 мин в буфере малеиновой кислоты, содержащем 0,02% Tween-20 (MABT, см. Таблицу материалов) при комнатной температуре.
- Гибридизованные и промытые эмбрионы блокируют не менее 2 ч при комнатной температуре 2% блокирующим раствором-1 (см. Таблицу материалов).
- Замените блокирующий раствор-1 антидигоксигенином АП (разведение 1:4000, см. Таблицу материалов) в свежем 2% блокирующем растворе-1 и встряхните в течение ночи в течение 12-14 ч при 4 °C.
- Промойте эмбрионы четыре раза в течение 30 мин в МАБТ при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выньте BM purple (см. Таблицу материалов) из холодильника во время третьей стирки и время от времени встряхивайте его во время последующих стирок. - Промойте эмбрионы два раза в течение 10 мин в NTMT (0,1 М Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, см. Таблицу материалов).
- Используйте пипетку, чтобы удалить как можно больше NTMT из эмбрионов. Замените БМ фиолетовым субстратом AP и окрасьте эмбрионы при комнатной температуре в темноте. Следите за изменением цвета каждые 30 минут, чтобы контролировать степень окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретное время окрашивания отличается и должно быть отрегулировано в соответствии с каждым зондом. Инкубация эмбрионов при 37 ° C может ускорить реакцию. Инкубация эмбрионов при 4 ° C может увеличить время реакции и может быть выполнена в течение ночи. - Как только он разовьется до желаемой степени, остановите реакцию, кратковременно промыв NTMT два раза. После гибридизации in situ трижды промывают эмбрионы PBST в течение 20 мин.
3. Встраивание
- Погрузить эмбрионы в 5% сахарозу в 1x PBS (см. Таблицу материалов) на ночь на 12-14 ч при 4 °C.
- Замените раствор, покрывающий эмбрионы, на 15% сахарозы в 1x PBS и инкубируйте в течение ночи в течение 12-16 ч при 4 ° C.
- Замените раствор, покрывающий эмбрионы, на 30% сахарозы в 1x PBS и инкубируйте в течение 1-2 дней при 4 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте в этом растворе до тех пор, пока эмбрионы не опустятся на дно пробирки. - Заполните криомолд средой с оптимальной температурой резки (OCT) (см. Таблицу материалов). Перенесите эмбрионы в 30% сахарозе в криомолд со средой ОКТ. Перемешайте их, чтобы удалить сахарозу из эмбрионов.
- Перенесите эмбрионы в новый криомолд для ткани и аккуратно заполните его средой ОКТ, избегая образования пузырьков.
- Погрузите каждый эмбрион, подталкивая его к нижней части криоформы, и поместите каждый эмбрион в желаемую ориентацию (дорсально-вентральную или латеральную). Держите эмбрионы по прямой линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется помещать только один эмбрион в каждый криомолд (см. Таблицу материалов). - Поместите внедренные эмбрионы в криоформы в ванну с сухим льдом.
- Хранить при температуре -80 °C не менее чем на ночь в течение 12-14 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Криоформы можно хранить при температуре -80 °C не менее одного месяца.
4. Криосекция
- Установите криосекцию с помощью криостата на -20 °C.
- Извлеките блок образцов из криомолда и поместите его в криостат. Поместите OCT medium на основание охлажденного патрона и поместите блок сверху.
- Убедитесь, что блок образцов параллелен лезвию бритвы. Аккуратно срежьте излишки среды OCT вокруг образца.
- Разрезают на срезы толщиной 12-20 мкм с помощью криостата. Быстро перенесите секции на предметные стекла так, чтобы на каждом слайде было 3-4 секции. Дайте образцам нагреться до комнатной температуры и храните их в герметичном скользящем ящике при температуре -80 °C для последующего использования.
5. Иммуноокрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание GFP выполняется на срезах.
- Промойте предметные стекла, содержащие секции, PBS в течение 5 мин.
- Нагрейте цитратный буфер до кипения в микроволновой печи.
- Поместите предметные стекла в буфер и продолжайте нагревать, чтобы раствор оставался на уровне кипения в течение примерно 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг помогает в извлечении антигена. Ткань остается неповрежденной даже при высоких температурах, что улучшает качество окрашивания, предотвращая складывание, повреждение или отслоение тканей. - Дайте образцам медленно остыть до комнатной температуры перед следующим этапом. Слейте излишки раствора, тщательно высушите область вокруг каждого участка кусочком ткани и нарисуйте круг вокруг участка водоотталкивающей ручкой (см. Таблицу материалов), чтобы сформировать гидрофобный барьер. Будьте осторожны, чтобы не пересушить участки ткани.
- Промойте предметные стекла два раза с помощью PBS, инкубируя в течение 10 минут во время каждой стирки.
- Блок в течение 2 ч в блокирующем растворе-2 (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре.
- Раствор первичного антитела пипеткой (мышиный моноклональный α-GFP, 1:250, см. Таблицу материалов) на предметное стекло и инкубируйте предметные стекла в иммуногистохимическом влажном боксе при 4 ° C в течение ночи.
- Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS, инкубируя в течение 10 минут во время каждой стирки.
- Слейте излишки PBS. Инкубируют предметные стекла с соответствующим вторичным антителом (1:400, см. Таблицу материалов) в течение 1 ч при комнатной температуре в PBS.
- Промойте предметные стекла три раза с помощью PBS, инкубируя в течение 10 минут во время каждой стирки.
- Слейте излишки PBS, нанесите монтажную среду пипеткой на предметное стекло и установите с помощью защитного стекла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол может быть использован для одновременного изучения паттерна экспрессии одной мРНК и одного белка. На рисунке 1 показан экспериментальный рабочий процесс. Рецептор 5-HT2C является подтипом рецептора 5-HT, связанного нейротрансмиттером серотонином (5-гидрокситриптамин, 5-HT). Он широко распространен в центральной нервной системе (ЦНС) и может значительно регулировать различные функции мозга, включая аппетит, настроение, беспокойство и репродуктивное поведение13. Экспрессия 5-HT2C в ЦНС была обнаружена трансгенной линией Tg (foxp2:egfp-caax), в которой нейроны foxP2 помечены флуоресцеиновым зеленым флуоресцентным белком (GFP). GFP не экспрессировался у рыбок данио-рерио дикого типа, а только у трансгенной линии. Одновременное обнаружение экспрессии РНК (5-HT2C, зонд для htr2c, рис. 2A) и белка (GFP, antiGFP, рис. 2B) может быть использовано для анализа колокализации белка и мРНК.
Инсулинома-ассоциированный 1a (insm1a), фактор транскрипции цинкового пальца, был впервые идентифицирован из библиотеки редукции опухолей и сыграл несколько функций в формировании и дифференцировке центральной и периферической нервной системы позвоночных и нейроэндокринной системы. Недавние исследования показали, что insm1a является важным регулятором развития двигательных нейронов. Экспрессия insm1a в спинном мозге и двигательных нейронах рыбок данио-рерио была обнаружена трансгенной линией Tg (hb9:egfp), в которой нейроны hb9 помечены флуоресцеином GFP. GFP не экспрессировался у рыбок данио-рерио дикого типа, а только у трансгенной линии. Одновременное детектирование экспрессии РНК (insm1a, зонд для insm1a, рис. 3A) и белка (GFP, antiGFP, рис. 3B) может быть использовано для анализа колокализации белка и мРНК. Этот протокол был успешно применен для обнаружения колокализации белка и РНК для понимания их пространственных отношений.
Рисунок 1: Схема метода. На этой блок-схеме показан экспериментальный рабочий процесс. Рабочий процесс может быть завершен как минимум за 9 дней (см. количество дней в правом верхнем углу каждого этапа рабочего процесса), хотя некоторые шаги могут быть выполнены в течение более длительного периода, как описано в протоколе. Сокращения: PFA = параформальдегид; O/N = на ночь; RT = комнатная температура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Цельные эмбрионы, окрашенные зондом 5-HT2C и антителом GFP в Tg (foxP2: egfp-caax). Яркопольные (A), флуоресцентные (B) и объединенные изображения (C) показывают экспрессию 5-HT2C (зонд для htr2c, A) и GFP (антиGFP, B) в нейронах foxP2 и аксонных трактах. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Цельные эмбрионы, окрашенные зондом insm1a и антителом GFP в Tg (hb9: egfp). Светлопольные (A), флуоресцентные (B) и объединенные изображения (C) показывают экспрессию insm1a (зонд для insm1a, A) и GFP (анти-GFP, B) в нейронах hb9. Масштабная линейка = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Эмбрионов | Время |
| 24 л.с. | 2 мин |
| 30 л.с. | 3 мин |
| 36 л.с. | 5 мин |
| 48 л.с. | 10 мин |
| 72 л.с. | 15 мин |
| 96 л.с. | 45 мин |
| 4-5 DPF | 60 мин |
Таблица 1: Время переваривания протеиназы К для эмбрионов рыбок данио. Сокращения: hpf = часы после оплодотворения; DPF = дни после оплодотворения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предлагает комбинацию гибридизации in situ и иммуногистохимии, что является важным шагом в экспериментах по колокализации эмбрионов рыбок данио. Этот метод служит простым и эффективным способом одновременного анализа одной мРНК и одного белка. Гибридизацию in situ и окрашивание антителами проводили на эмбрионах рыбок данио. В отличие от нескольких протоколов, опубликованных ранее14,15,16, для изучения экспрессии белка использовались иммунофлуоресценция и иммуногистохимия. Немногие антитела, специфичные для рыбок данио, были надлежащим образом проверены для использования в разделах17. В предыдущих исследованиях использовался только один метод: иммунофлуоресценция, иммуногистохимия или гибридизация in situ. Сочетание гибридизации in situ и иммуногистохимии для анализа РНК и белка преодолевает ограничения любого метода. Первым шагом была гибридизация in situ, которая в значительной степени защищает мРНК от деградации. Извлечение антигена индуцировали нагреванием, чтобы избежать нарушения связывания антител с помощью протеиназы К во время иммуногистохимического окрашивания. Работает ли этот подход для всех антигенов, потребуется дальнейшее тестирование. Изображения срезов показали, что рецептор 5-HT2C был коэкспрессирован в нейронах foxP2 и что рецептор insm1a был коэкспрессирован в нейронах hb9.
Цельная гибридизация in situ значительно сохраняет целостность образцов. Гибридизация in situ с последующим секционированием может уменьшить время инкубации для окрашивания антител. Кроме того, окрашивание антител после гибридизации in situ может помочь избежать гашения флуоресценции.
Следующие конкретные шаги необходимы для успеха эксперимента. Первым важным шагом является рефиксация эмбриона в 4% PFA. Этот шаг останавливает реакцию протеиназы К, потому что PFA инактивирует протеиназу К. Образцы следует аккуратно перемешать, чтобы подвергнуть все эмбрионы воздействию PFA; Трубку также можно положить на бок, чтобы эмбрионы равномерно распределились в растворе. Вторым важным этапом является лечение эмбриона во время ОКТ-имплантации. Эмбрионы должны быть расположены в определенном направлении (дорсально-вентрально или латерально), сохраняя их прямыми, чтобы их можно было разрезать на секции примерно из одной и той же области для всех эмбрионов. Маленькая игла используется для совершения небольших, сознательных движений в вязкой среде ОКТ, чтобы найти эмбрион и удалить пузырьки.
Существует несколько возможных модификаций, которые могут быть применены к описанному сценарию. Время переваривания протеиназы К при гибридизации in situ может быть определено в соответствии с различными стадиями развития эмбрионов рыбок данио-рерио (таблица 1). Кроме того, толщина криосекций очень гибкая и может быть определена в соответствии с экспериментальными требованиями. Хотя прогнозируется, что этот подход будет подходить для широкого спектра экспериментов, он имеет некоторые потенциальные ограничения. Успешное выполнение этой процедуры зависит от поддержания полной выборки в течение двух последовательных экспериментов. В этом протоколе есть несколько возможных точек паузы. Обезвоженные эмбрионы можно хранить в 30% растворе сахарозы при -20 °C в течение нескольких месяцев14. Точно так же подготовленные предметные стекла можно хранить в ящике для слайдов при -20 °C более 1 года14. Замороженные блоки можно хранить при температуре -80 °C в течение трех месяцев.
Было показано, что этот протокол гибридизации in situ в сочетании с иммуногистохимией успешно обнаруживает экспрессию 5-HT2C и insm1a у эмбрионов рыбок данио-рерио и может быть легко применен к различным тканям на разных стадиях развития. Кроме того, этот протокол может быть применен к нейронам или глиальным клеткам, обеспечивая надежный исследовательский подход для нейробиологов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Китайским научно-техническим фондом Наньтун (MS12019011), Китайским научно-техническим фондом Наньтун (JC2021058) и Фондом естественных наук высших учебных заведений провинции Цзянсу (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
