Summary
ここでは、アンジオテンシンII注入によって誘発された高血圧マウスにおける腎交感神経除神経(RDN)のプロトコルを提示します。この手順は再現性があり、便利であり、高血圧および心肥大に対するRDNの調節メカニズムを研究することを可能にする。
Abstract
血圧に対する腎交感神経除神経(RDN)の利点は、近年の多数の臨床試験で証明されています。しかし、高血圧に対するRDNの調節メカニズムはとらえどころのないままです。したがって、マウスでより単純なRDNモデルを確立することが不可欠です。この研究では、アンジオテンシンIIを充填した浸透圧ミニポンプを14週齢のC57BL / 6マウスに移植しました。ミニ浸透圧ポンプの移植の1週間後、フェノールを使用してマウスの両側腎動脈に対して修正RDN手順を実施した。年齢性別を一致させたマウスに生理食塩水を与え、偽群とした。血圧はベースライン時とその後21日間毎週測定されました。次に、腎動脈、腹部大動脈、心臓を採取し、H&Eおよびマッソン染色を用いた組織学的検査を行った。この研究では、高血圧を制御し、心肥大を緩和できる、シンプルで実用的で再現性のある標準化されたRDNモデルを提示します。この技術は、腎動脈に損傷を与えることなく末梢腎交感神経を除神経することができます。以前のモデルと比較して、修正されたRDNは、高血圧の病態生物学および病態生理学の研究を容易にします。
Introduction
高血圧は、世界中の主要な慢性心血管疾患です。制御されていない高血圧は、標的臓器に損傷を与え、心不全、脳卒中、および慢性腎臓病の一因となる可能性があります1,2,3。高血圧の有病率は、中国では1991年から2007年の間に20%から31%に増加しました。中国の高血圧症の成人の数は、高血圧の診断基準(130/80 mmHg)4の最近の改訂に続いて倍増する可能性があります。高血圧は薬で制御できますが、最大耐量で少なくとも3つの降圧薬(1つの利尿薬を含む)を投与された場合でも、患者の約20%が高血圧を制御できず、薬剤耐性高血圧の発症につながる可能性があります5。
腎交感神経除神経(RDN)は、高血圧の潜在的な治療法であることが証明されています。2009年、KrumらはRDNを用いた抵抗性高血圧治療を初めて報告した。経皮的腎動脈焼灼術は、患者6の持続的な血圧低下を効果的に引き起こす可能性があることがわかりました。しかし、シンプリシティ高血圧3(HTN-3)試験の失敗により、RDN7の適用が妨げられ、RDNは物議を醸す治療法になりました。それにもかかわらず、RDNの見通しはまだ排除されていません。RADIANCE-HTN SOLO、SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED、SPILAL HTN-OFF MED Pivotalなどの最近の臨床試験では、高血圧に対するRDNの有効性が確認されています8,9,10,11,12。したがって、RDNの効果を調査するには、より詳細な機構研究を実施する必要があります。
この研究の全体的な目的は、マウスのRDNをどのように変更して、より簡単で安定した手術を生み出すことができるかを示すことです。多数の実験が、異なる動物モデルにおける血管内凍結焼灼、体外超音波および化学的または神経毒の局所適用など、RDNの様々なアプローチを研究してきた13、14、15、16、17。フェノールによる化学的アブレーションを用いて生成されたRDNモデルは、高血圧に対する交感神経活性化の病因を研究するための確立された実験モデルです。このモデルは、綿棒18を使用した10%フェノール/エタノール溶液による腎交感神経の化学腐食によって生成されます。一方では、従来のRDNは腎交感神経活動を潜在的に阻害し、それがレニン分泌およびナトリウム再吸収を減少させ、腎血流を増加させる。一方、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系19を抑制する。これにより、RDNは高血圧に対して有益な効果を有する。しかし、化学的アブレーションで生成されたRDNモデルにはアブレーション基準やアブレーション時間が欠けており、実験手順の詳細はまだ不明です。また、利用可能なテクニカルレポートはありません。本報告では,C57BL/6マウスにおけるアンジオテンシンII(Ang II)誘発高血圧症における計量紙を用いたフェノールを用いたRDNモデル作製の手術プロトコールについて述べる.フェノールを含む秤量紙で腎動脈を包み、アブレーション時間を統一することで、より再現性と信頼性の高いRDNモデルの確立に貢献します。この実験モデルは、高血圧に対するRDNの効果を評価することを目的としています。
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Protocol
すべての動物実験手順は、実験動物の世話と使用に関する関連する倫理ガイド(NIH出版物第85-23号、2011年改訂)に準拠し、復旦大学付属華東病院の動物研究委員会によって承認されました。14週齢の雄C57BL/6マウス(28-30g)を無作為に4つの群に分けた:シャム群、シャム+アンII群、RDN群、RDN+Ang II群、n = 6各群。すべての動物は、24 ± 1°Cの温度管理された部屋で、12時間の明暗サイクルと標準的なげっ歯類の固形飼料と水への自由な自由アクセスを備えた、特定の閉鎖病原体のない条件下で維持されました。
1. 操作フィールドの準備
- 手術台を70%エタノールで消毒します。加熱パッドの温度を37°Cに調整します。
- 手術前に、すべての手術器具が121°Cで30分間、または他の方法で滅菌されていることを確認してください。この手順には、マイクロ外科用ハサミ、2つの細い直線鉗子、2つの細かい湾曲した鉗子、止血鉗子、滅菌ガーゼ、および計量紙が必要です。
2.アンジオテンシンII誘発性高血圧
- 麻酔導入の直前にメロキシカム(0.5 mg / kg、SC)をC57BL / 6マウスに提供します。.次いで、前述のようにペントバルビタールナトリウム注射を用いてマウスを麻酔する20、21。好ましい場合はイソフルランも使用することができる。負のつま先のピンチ反射で麻酔の深さを確認します。
- シェーバーで背中の毛を取り除きます。麻酔下での乾燥を防ぐために、獣医軟膏を目に塗ります。
- 動物を背側の手術台に置きます。剃った部分をポビドンヨードで拭き取り、続いて70%エタノールで3回拭きます。
- 前脚の肩甲骨の上の耳の後ろで、尾に垂直に滅菌メスの刃を使用して1 cmの切開を行います。
- 滅菌止血剤を用いて皮膚下に皮下トンネルを作り、ポンプ22用のポケットを作る。アンジオテンシンII(1,000ng/kg/min)を充填した浸透圧ポンプをポケットにそっと挿入します。皮膚を伸ばさずに傷を縫合するのに十分な空きスペースがあることを確認してください。
- 中断された6-0ビクリル縫合糸で筋肉を縫合し、中断された4-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。傷の部位をポビドンヨードで拭きます。対照群に対して等量の生理食塩水で同じ手術を行う。
- すべての手術器具を滅菌器に10秒間入れ、手術の合間に滅菌手袋を交換します。完全に回復するまですべてのマウスを監視します。
- マウスの創傷治癒を注意深く監視し、最初の週に少なくとも1日2回、その後は毎日1回、発赤、腫れ、感染を含めます。.Ang II注入中にマウスが死亡した場合は、直ちに解剖を行います。
- ベースライン時および毎週、意識のあるマウスのテールカフプレチスモグラフィ法23 を使用して、Ang II注入後に血圧を測定します。.血圧測定実験は、実験開始前にマウスを1時間順応させる22±2°Cの静かな場所で実施してください。ベースライン血圧測定の前に少なくとも5日間連続してマウスを馴化させる23、24。
3.両側腎除神経
- Ang II注入の1週間後に血圧(BP)が上昇≥140 / 90mmHgまたは収縮期血圧/拡張期血圧が25%増加したマウスを選択します。
- 手術前に動物の体重を記録し、腎除神経手術には最小体重24 gの動物を選択してください。
- ペントバルビタールナトリウムを用いてマウスを麻酔する。負のつま先のピンチ反射で麻酔の深さを確認します。
- シェーバーで腹部の毛を取り除きます。外科的汚染を避けるために、この手順を慎重かつ徹底的に実行してください。
- マウスを手術台の上に置き、腹部を上に保ち、その手足をテープで固定します。腹部の皮膚をポビドンヨードで消毒した後、70%エタノールで3回拭きます。
- メスの刃を使用して2cmの腹側正中線腹部切開を行います。37°Cの生理食塩水に浸したガーゼで腸を引き戻し、左腎動脈を露出させる。湾曲したピンセットを使用して、腎動脈から脂肪を注意深く、しかし鈍く解剖します。(図1A-C)。
- 計量紙を滅菌鋭利なハサミで腎動脈と同じサイズの長方形に切ります。参考までに、計量紙を 図1Cの点線で示されているのと同じサイズにカットします。
注:それは手術の重要な部分であり、同じ形状を維持するために一度に計量紙のいくつかの部分をカットするようにしてください。 - 計量紙を10%フェノール/エタノール溶液に少なくとも30秒間浸します。左腎動脈の表面を覆い、血管を計量紙で包み、2分間保持します(図1D)。ガーゼを使用して周囲の組織を保護し、計量紙が周囲の腎臓や腸に触れないようにします。
注意: フェノール溶液はプラスチックチューブでは安定していますが、ガラスバイアルでは安定していません。したがって、溶液は、実験18毎に新たに調製されなければならない。 - 右腎動脈についても同じ手順を実行します。生理食塩水に浸した計量紙で偽手術を行います。
- 筋肉を初期位置に再配置し、中断された縫合糸で6-0ビクリル縫合糸で腹膜を閉じます。次に、中断した4-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。完全に回復するまですべてのマウスを監視します。
4.術後のケア
- ポビドンヨードを切開部に塗布し、回復と術後のモニタリングのために動物を温めた電気毛布に入れます。
- マウスを1日2回監視して、発赤、腫れ、痛みまたは腹部感染症を評価します。メロキシカム(0.5 mg / kg、SC)をRDN手順の約1時間前と24時間後にすべてのマウスに提供します。.
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Representative Results
統計学
すべてのデータは、平均±標準偏差として表されます。一元配置分散分析は、3つ以上の条件での実験に使用され、その後、個々のグループ間の比較のためにボンフェローニ事後検定が行われました。0.05以下のp値を有意値と見なします。すべての統計分析を実行するために、市販のソフトウェアが使用されました。
Ang IIによって誘発される血圧の上昇は、RDN後に減弱しました
収縮期血圧(SBP)の有意な増加は、Ang II注入の1週間後に観察されました。.RDN + Ang II群は、RDN処置後21日目にSham + Ang II群と比較してSBPの有意な減少を示した(143.50 ± 5.43 vs 196.67 ± 14.26 mmHg、p < 0.01)。RDN後2週間で、Sham群とRDN群の間に差はありませんでした(113.33 ± 9.35 vs 113.17 ± 8.47 mmHg、p > 0.05)(図2)。
RDNと腎動脈の損傷の確認
Ang II注入の21日後、動物はペントバルビタールナトリウム(250 mg / kg)の腹腔内注射で安楽死させました。.心臓と腎臓を採取しました。H&E染色は、腎神経および腎動脈の損傷を検出するために実施した。結果は、各群において腎血管内膜層の明らかな肥厚がないことを示した(図3A〜D)。腎神経のH&E染色では、RDNに起因する多数のピノティック核、消化室、および神経核の腫脹が見られました(図3E-H)。神経束の免疫組織化学により、RDN群とRDN+Ang II群でチロシンヒドロキシラーゼ(TH、1:500希釈)の発現が有意に低下することが明らかになりました(図4)。RDNは、正常血圧群と高血圧群の両方で腎皮質ノルエピネフリン含有量を低下させました(偽群対RDN群、18.60 ± 6.91対180.76 ± 11.47 ng / g、p < 0.01;図5)。
RDN治療はAng II注入誘発性病的心肥大を緩和した
マッソン染色では、これらの群の中で腹部大動脈の内膜中膜の顕著な増加は見られませんでした。Ang II注入誘発性心肥大は、間質線維症(7.45%±0.28対4.53%±0.32、p<0.01)および心筋細胞サイズ(348.39 ± 31.56 vs 322.21 ± 22.26 μm、p = 0.37)の減少によって示されるように、RDN治療によって改善されました。 図6)。
図1:計量紙を使用したRDNの手順 。 (A,B)C57BL/6(ex vivo)マウスからの腎動脈の解剖学的画像。(C)2本の点線内の部分は、計量紙で覆われている領域を指します。(D)両側腎動脈の表面を、10%フェノール/エタノール溶液に浸した適切な計量紙で覆います。点線を超えてろ紙を覆わないでください。*は計量紙を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:RDNは、Ang II注入によって誘発される高血圧を緩和します。 血圧は、ベースライン時およびAng II注入後毎週テールカフプレチスモグラフィ法によって測定されました。.*は統計的有意性(p < 0.05)を示し、**は統計的有意性(p < 0.01)を示す。値は平均値±標準誤差として表されます。各グループでN = 6;RDN + Ang IIグループは、C57BL / 6マウスにおけるAng II注入の1週間後に腎除神経が手術されたことを示しています。.略語:SBP =収縮期血圧。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:腎交感神経と腎動脈の代表的な画像。 (A-D)腎動脈の内膜層の肥厚は4群で認められなかった。RDN後の損傷した腎神経の代表的な画像。(E-H)断片化およびピノティック核は、消化、神経内組織の腫脹がRDNおよびRDN+Ang II群の両方で観察された。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:腎交感神経におけるチロシンヒドロキシラーゼの免疫染色 。 (A)偽手術マウスではTH抗体染色に対する強い陽性反応が観察されたが、RDN手術マウスでは弱い反応が観察された。スケールバー= 50μm。 (B)腎神経におけるTH発現の定量化。**は統計的有意性(p<0.01)を示し、nsは有意でないことを示す。値は平均値±標準誤差です。各グループでN = 6;RDN + Ang IIグループは、C57BL / 6マウスにおけるAng II注入の1週間後に腎除神経が手術されたことを示しています。. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ELISAによって分析された腎皮質組織ノルエピネフリンレベル。 除神経腎臓の腎皮質ノルエピネフリン含量は、神経支配腎臓のノルエピネフリン含有量と比較して著しく減少しました。.**は統計的有意性(p<0.01)を示し、nsは有意でないことを示す。値は平均値±標準誤差です。各グループでN = 6;RDN + Ang IIグループは、C57BL / 6のAng II注入の1週間後に腎除神経が手術されたことを示します。. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:RDNは、Ang II誘発の病的心肥大を緩和する 。 (A)腹部大動脈の代表的な写真。これらの群では腹部大動脈の内膜層の肥厚は認められなかった(マッソン染色)。(B,C)異なる群における心筋の代表的な画像(H&E、マッソン染色)。(d)左室領域の線維化の割合の定量化と線維化領域の割合の分析(マウスあたりの視野数)。スケールバー= 50 μm。 N = 6 各グループで;RDN + Ang IIは、C57BL / 6のAng II注入の1週間後に腎除神経が手術されたことを示します。. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
RDNが血圧を下げることができるかどうかは、シンプリシティHTN-3試験7,25の否定的な結果が発表されて以来、物議を醸しています。しかし、いくつかの臨床試験および動物実験は、高血圧のヒトおよび動物に対するRDNの肯定的かつ効果的な結果を示している9、10、11、12、13、14、15、16、17。フェノールは動物の腎神経の破壊に使用され、アブレーションの詳細は、アブレーション領域やアブレーション時間などの以前の研究では不明のままであり、異なる結果に寄与した可能性があります16。
ラットにおけるフェノールを含む綿棒の使用、ブタにおけるカテーテルベースのアブレーション、およびブタにおける定位放射線療法などのRDNの従来の方法は、腎神経に損傷を引き起こす18,26,27,28。これらの方法は、体重がわずか数十グラムのマウスにも適しておらず、死に至る可能性が高くなります。その上、これらの方法は腎動脈狭窄を引き起こします。実際、RDNモデルを用意し、これらの手法を事前実験に使用しました。しかし、40/50匹のマウスが死亡した。フェノールを含む綿棒を使用する方法は、高い死亡率をもたらしました。
そこで、本研究では、RDNの性能を標準化しながらも、手術技術が少なくて済み、手術時間を短縮できる方法を確立した。フェノール/エタノール溶液に浸した10%秤量紙を腎動脈に2分間置いたことで、マウスの腎交感神経を腐食させる信頼性の高い方法を提供しました。その有効性は腎神経の組織病理学によって確認される。それは、Ang IIによって誘発されたSBP上昇を有意に減衰させた。また、Ang II誘発心肥大も緩和した。さらに、改良された手順には、実行が容易で、従来の手順と比較して成功率と生存率が向上するなど、いくつかの特徴があります。
プロトコルの最も重要な部分は、フェノールを含む計量紙が周囲の組織に触れてはならないということです、さもなければ、それは致命的な腸閉塞、腹部感染症、および腎動脈狭窄を引き起こすかもしれません。少量のフェノールだけが腎交感神経の過活動を引き起こす可能性があるため、腎臓への溶液に触れないことをお勧めします18。また、計量紙を切るときは特別な注意を払う必要があります。手術用ハサミで顕微鏡下で調整することをお勧めします。腎神経をマイクロピンセットで隔離することは、腎血管を損傷する可能性があるため、お勧めしません。通常、この手順は、パフォーマンスが遅くても20分以内に安全に実行できます。さらに、フェノールの融点は40.5°Cである。
改善されたRDN手順の主な制限は、術後のフォローアップ時間がわずか2週間であったことです。BPおよび腎神経再生に対する長期RDNの効果は不明である。
このモデルの将来の応用は、高血圧と心肥大のプロセスの根底にある経路の説明に貢献できる、より標準化された除神経動物モデルを作成することです。
結論として、この方法は実用的で再現可能です。最も重要なことは、標準化されたRDNモデルを生成して、高血圧を制御し、心肥大などの心血管疾患と戦うメカニズムを研究できることです。
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Disclosures
著者が宣言したように、金銭的またはその他の利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(81770420)、上海市科学技術委員会(20140900600)、上海臨床老年医学重点研究所(13dz2260700)、上海市重点臨床専門(shslczdzk02801)、および復旦大学付属華東病院老人冠状動脈疾患センターの支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sangon Biotech | CAS:4474-91-3 | To make a hypertensive animol model |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Abcam | ab137869 | To evaluate the expression of TH of renal nerves |
| Blood Pressure Analysis | Visitech Systems | BP-2000 | Measure the blood pressure of mice |
| Mini-osmotic pump | DURECT Corporation | CA 95014 | To fill with Angiotensin II |
| Norepinephrine ELISA Kit | Abcam | ab287789 | to measure renal norepinephrine levels |
| Phenol | Sangon Biotech | CAS:108-95-2 | Damage the renal sympathetic nerve |
| Weighing paper | Sangon Biotech | F512112 | To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. |
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