Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para denervação simpática renal (RDN) em camundongos com hipertensão induzida por infusão de Angiotensina II. O procedimento é repetível, conveniente e permite estudar os mecanismos regulatórios da RDN na hipertensão e hipertrofia cardíaca.
Abstract
Os benefícios da denervação simpática renal (RDN) sobre a pressão arterial foram comprovados em um grande número de ensaios clínicos nos últimos anos. No entanto, o mecanismo regulador da RDN na hipertensão permanece indefinido. Assim, é essencial estabelecer um modelo RDN mais simples em camundongos. Neste estudo, minibombas osmóticas cheias de angiotensina II foram implantadas em camundongos C57BL/6 de 14 semanas de idade. Uma semana após o implante da bomba mini-osmótica, um procedimento RDN modificado foi realizado nas artérias renais bilaterais dos camundongos usando fenol. Camundongos pareados por idade-sexo receberam soro fisiológico e serviram como grupo simulado. A pressão arterial foi medida no início do estudo e a cada semana subsequentemente durante 21 dias. Em seguida, artéria renal, aorta abdominal e coração foram coletados para exame histológico com coloração H&E e Masson. Neste estudo, apresentamos um modelo de RDN simples, prático, repetível e padronizado, que pode controlar a hipertensão e aliviar a hipertrofia cardíaca. A técnica pode desnervar os nervos simpáticos renais periféricos sem danos na artéria renal. Em comparação com os modelos anteriores, o RDN modificado facilita o estudo da patobiologia e fisiopatologia da hipertensão.
Introduction
A hipertensão é uma importante doença cardiovascular crônica em todo o mundo. A hipertensão não controlada pode danificar órgãos-alvo e contribuir para insuficiência cardíaca, acidente vascular cerebral e doenças renais crônicas 1,2,3. A prevalência de hipertensão aumentou de 20% para 31% entre 1991 e 2007 na China. O número de adultos com hipertensão na China pode dobrar após uma recente revisão dos critérios diagnósticos para hipertensão (130/80 mmHg)4. A hipertensão pode ser controlada por medicamentos, no entanto, aproximadamente 20% dos pacientes são incapazes de controlar sua hipertensão, mesmo quando recebem pelo menos três medicamentos anti-hipertensivos (incluindo um diurético) na dose máxima tolerada, o que pode levar ao desenvolvimento de hipertensão resistente a medicamentos5.
A denervação simpática renal (RDN) provou ser um tratamento potencial para a hipertensão. Em 2009, Krum e seus colegas relataram tratamento de hipertensão resistente usando RDN pela primeira vez. Verificou-se que a ablação percutânea da artéria renal pode efetivamente causar redução persistente da pressão arterial em pacientes6. No entanto, o fracasso do estudo Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) impediu a aplicação do RDN7, transformando o RDN em uma terapia controversa. No entanto, a perspectiva de RDN ainda não foi descartada. Ensaios clínicos recentes, incluindo RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED e SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal confirmaram a eficácia do RDN na hipertensão 8,9,10,11,12. Assim, pesquisas mecanicistas mais detalhadas precisam ser realizadas para explorar os efeitos da RDN.
O objetivo geral deste estudo é demonstrar como a RDN em camundongos pode ser modificada para produzir uma cirurgia mais simples e estável. Um grande número de experimentos tem estudado várias abordagens da RDN, como crioablação intravascular, ultrassonografia extracorpórea e aplicação local de uma substância química ou neurotoxina em diferentes modelos animais 13,14,15,16,17. O modelo RDN gerado por ablação química com fenol é um modelo experimental bem estabelecido para estudar a patogênese da ativação simpática na hipertensão. Este modelo é gerado pela corrosão química dos nervos simpáticos renais com solução de fenol/etanol a 10% utilizando um cotonete18. Por um lado, o RDN convencional potencialmente inibe a atividade simpática renal, o que diminui a secreção de renina e a reabsorção de sódio e aumenta o fluxo sanguíneo renal. Por outro lado, suprime o sistema renina-angiotensina-aldosterona19. Assim, RDN tem um efeito benéfico sobre a hipertensão. No entanto, o modelo RDN gerado pela ablação química carece de critérios de ablação e tempo de ablação e os detalhes do procedimento experimental ainda não estão claros. Além disso, não há relatórios técnicos disponíveis. Neste relato, descrevemos um protocolo cirúrgico para a geração de modelo RDN com fenol utilizando papel de pesagem na hipertensão induzida por Angiotensina II (Ang II) em camundongos C57BL/6. Envolvemos a artéria renal com papel de pesagem contendo fenol e unificamos o tempo de ablação, o que ajuda a estabelecer um modelo RDN mais reprodutível e confiável. Este modelo experimental tem como objetivo avaliar o efeito da RDN sobre a hipertensão.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais em animais cumpriram o Guia Ético relevante para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication no. 85-23, revisado em 2011) e foram aprovados pelos comitês de pesquisa animal do Hospital Huadong, afiliado à Universidade de Fudan. Camundongos C57BL/6 machos de quatorze semanas de idade (28-30g) foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: grupo Sham, grupo Sham+Ang II, grupo RDN, grupo RDN+Ang II, n = 6 em cada grupo. Todos os animais foram mantidos sob condições específicas fechadas livres de patógenos em uma sala com temperatura controlada a 24 ± 1 °C com um ciclo claro/escuro de 12h e livre acesso à ração padrão de roedores e água ad libitum.
1. Preparação do campo de operação
- Desinfete a mesa de operação com etanol a 70%. Ajustar a temperatura da almofada de aquecimento para 37 °C.
- Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados antes da cirurgia a 121 °C por 30 min ou por outros métodos. Este procedimento requer uma tesoura microcirúrgica, duas pinças finas e retas, duas pinças curvas finas, pinças hemostáticas, gazes estéreis e papéis de pesagem.
2. Hipertensão induzida por angiotensina II
- Fornecer meloxicam (0,5 mg/kg, SC) aos camundongos C57BL/6 pouco antes da indução anestésica. Em seguida, anestesiar os camundongos com injeção de pentobarbital sódico conforme descrito anteriormente20,21. O isoflurano também pode ser usado, se preferir. Confirme a profundidade da anestesia com um reflexo negativo de pinça do dedo do pé.
- Remova o cabelo nas costas com um barbeador. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar a secura durante a anestesia.
- Coloque o animal sobre uma mesa de operação na posição dorsal. Esfregue e limpe a área raspada com iodopovidona seguido de três toalhetes com etanol a 70%.
- Faça uma incisão de 1 cm usando uma lâmina de bisturi estéril, perpendicular à cauda, atrás da orelha sobre a omoplata da perna dianteira.
- Utilizar um hemostato estéril para fazer um túnel subcutâneo sob a pele e criar uma bolsa para a bomba22. Insira uma bomba osmótica cheia de angiotensina II (1.000 ng/kg/min) no bolso suavemente. Certifique-se de que há espaço livre suficiente para suturar a ferida sem esticar a pele.
- Suture o músculo com suturas de Vicryl 6-0 interrompidas e feche a pele com suturas de nylon 4-0 interrompidas. Swab e limpar o local da ferida com povidona-iodo. Realizar a mesma cirurgia com igual volume de soro fisiológico para o grupo controle.
- Coloque todos os instrumentos cirúrgicos em um esterilizador por 10 s e substitua as luvas estéreis entre as cirurgias. Monitore todos os ratos até que estejam totalmente recuperados.
- Monitore de perto e observe a cicatrização de feridas em camundongos pelo menos duas vezes por dia durante a primeira semana e uma vez por dia posteriormente, incluindo vermelhidão, inchaço e infecção. Efectuar a dissecção imediatamente se os ratinhos morrerem durante a perfusão de Ang II.
- Medir a pressão arterial no início do estudo e todas as semanas após a perfusão de Ang II com o método de pletismografia do manguito caudal23 em ratinhos conscientes. Certifique-se de que os experimentos de medição da pressão arterial sejam conduzidos em uma área silenciosa, a 22 ± 2 °C, onde os camundongos sejam aclimatados por 1 h antes do início do experimento. Habituar camundongos por pelo menos 5 dias consecutivos antes das medidas basais da pressão arterial23,24.
3. Denervação renal bilateral
- Selecione os camundongos com pressão arterial (PA) elevada ≥140/90mmHg ou aumento de 25% na PA sistólica/PA diastólica, 1 semana após a infusão de Ang II.
- Registrar o peso do animal antes da cirurgia e escolher animais com peso mínimo de 24 g para cirurgia de desnervação renal.
- Anestesiar os ratos usando pentobarbital sódico. Confirme a profundidade da anestesia com um reflexo negativo de pinça do dedo do pé.
- Remova o cabelo no abdômen com um barbeador. Realize este procedimento com cuidado e minuciosamente para evitar qualquer contaminação cirúrgica.
- Coloque os ratos na mesa de operação, mantendo o abdômen para cima e fixe seus membros com fita adesiva. Desinfetar a pele abdominal com iodopovidona seguido de três toalhetes com etanol a 70%.
- Faça uma incisão abdominal ventral de 2 cm na linha média usando uma lâmina de bisturi. Puxe o intestino para trás com gaze embebida em solução salina de 37 °C para expor a artéria renal esquerda. Cuidadosamente, mas sem rodeios, disseque a gordura para longe da artéria renal usando pinças curvas. (Figura 1A-C).
- Corte o papel de pesagem em um retângulo do mesmo tamanho que a artéria renal com uma tesoura afiada estéril. Para referência, corte o papel de pesagem no mesmo tamanho mostrado pela linha pontilhada na Figura 1C.
NOTA: É uma parte crítica da cirurgia, tente cortar vários pedaços do papel de pesagem de cada vez para manter a mesma forma. - Mergulhe o papel de pesagem em solução de fenol/etanol a 10% por pelo menos 30 s. Cobrir a superfície da artéria renal esquerda e envolver o vaso com o papel de pesagem, manter por 2 min (Figura 1D). Use gaze para proteger os tecidos circundantes para evitar que o papel de pesagem toque o rim e o intestino circundantes.
NOTA: A solução de fenol é estável em tubos de plástico, mas não em frascos para injetáveis de vidro. Portanto, a solução deve ser preparada na hora para cada experimento18. - Realizar o mesmo procedimento para a artéria renal direita. Realize a cirurgia simulada com papel de pesagem imerso em solução salina.
- Reposicione os músculos em sua posição inicial e feche o peritônio com suturas de Vicryl 6-0 em uma sutura interrompida. Em seguida, feche a pele com suturas de nylon 4-0 interrompidas. Monitore todos os ratos até que estejam totalmente recuperados.
4. Cuidados pós-operatórios
- Aplique iodopovidona na incisão e coloque o animal em um cobertor elétrico aquecido para recuperação e monitoramento pós-operatório.
- Monitore os ratos duas vezes ao dia para avaliar se há vermelhidão, inchaço e dor ou infecção abdominal. Fornecer meloxicam (0,5 mg/kg, SC) a todos os ratinhos cerca de 1 h antes e 24 h após o procedimento RDN.
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Representative Results
Estatística
Todos os dados são expressos como média ± desvio padrão. A ANOVA one-way foi utilizada para experimentos com três ou mais condições, seguida de testes post-hoc de Bonferroni para comparações entre grupos individuais. Considere um valor de p igual ou menor que 0,05 como significativo. Um software comercial foi utilizado para realizar todas as análises estatísticas.
O aumento da pressão arterial induzido por Ang II foi atenuado após a RDN
Observou-se aumento significativo da PA sistólica (PAS) em 1 semana após a perfusão de Ang II. O grupo RDN + Ang II apresentou redução significativa na PAS quando comparado com o grupo Sham + Ang II aos 21 dias após o procedimento RDN (143,50 ± 5,43 vs 196,67 ± 14,26 mmHg, p < 0,01). Não houve diferença entre o grupo Sham e o grupo RDN (113,33 ± 9,35 vs 113,17 ± 8,47 mmHg, p > 0,05) às 2 semanas após o RDN (Figura 2).
Confirmação de RDN e dano da artéria renal
Após 21 dias de infusão de Ang II, os animais foram eutanasiados com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (250 mg/kg). Coração e rim foram coletados. A coloração H&E foi realizada para detectar o dano ao nervo renal e às artérias renais. Os resultados mostraram que não houve espessamento óbvio da camada intimal vascular renal em cada grupo (Figura 3A-D). A coloração H&E dos nervos renais mostrou um grande número de núcleos picnóticos, câmaras de digestão e inchaço dos núcleos nervosos causados por RDN (Figura 3E-H). A imuno-histoquímica dos feixes nervosos revelou que a expressão de tirosina hidroxilase (TH, diluição 1:500) foi significativamente diminuída no grupo RDN e no grupo RDN+Ang II (Figura 4). RDN reduziu o conteúdo de norepinefrina cortical renal no grupo normotenso e hipertenso (grupo sham vs grupo RDN, 18,60 ± 6,91 vs 180,76 ± 11,47 ng / g, p < 0,01; Figura 5).
O tratamento com RDN atenuou a infusão de Ang II induzida por hipertrofia cardíaca patológica induzida por infusão
A coloração de Masson não mostrou aumento notável na íntima média da aorta abdominal entre esses grupos. A hipertrofia cardíaca induzida por infusão de Ang II foi melhorada pelo tratamento com RDN, como demonstrado pela diminuição da fibrose intersticial (7,45% ± 0,28 vs 4,53% ± 0,32, p < 0,01) e do tamanho dos cardiomiócitos (348,39 ± 31,56 vs 322,21 ± 22,26 μm, p = 0,37; Figura 6).
Figura 1: Procedimento de RDN com papel de pesagem. (A,B) Imagens anatômicas da artéria renal de camundongos C57BL/6 (ex vivo). (C) A parte dentro das duas linhas pontilhadas refere-se à área coberta pelo papel de pesagem. (D) Cobrindo a superfície da artéria renal bilateral com o papel de pesagem apropriado imerso em solução de fenol/etanol a 10%. Não cubra o papel de filtro além da linha pontilhada. * indica o papel de pesagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: RDN alivia a hipertensão induzida pela infusão de Ang II. A pressão arterial foi medida pelo método de pletismografia do manguito caudal no início do estudo e todas as semanas após a perfusão de Ang II. * indica significância estatística (p < 0,05), ** indica significância estatística (p < 0,01). Os valores são representados como média ± erro padrão; N = 6 em cada grupo; O grupo RDN + Ang II indica desnervação renal operada 1 semana após a perfusão de Ang II em ratinhos C57BL/6. Abreviaturas: PAS = pressão arterial sistólica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas do nervo simpático renal e da artéria renal. (A-D) Não foi observado espessamento da camada íntima da artéria renal nos quatro grupos. Imagens representativas dos nervos renais danificados após RDN. (E-H) Núcleos fragmentados e picnóticos, digestão, inchaço do tecido endoneural foram observados no grupo RDN e RDN + Ang II. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imunocoloração da tirosina hidroxilase no nervo simpático renal . (A) Forte reação positiva à coloração do anticorpo TH foi observada em camundongos operados por simulação, enquanto uma reação mais fraca foi observada em camundongos operados por RDN. Barra de escala = 50 μm. (B) Quantificação da expressão de HT em nervos renais. ** indica significância estatística (p < 0,01), ns indica não significativo. Os valores são média ± erro padrão; N = 6 em cada grupo; O grupo RDN + Ang II indica desnervação renal operada 1 semana após a perfusão de Ang II em ratinhos C57BL/6. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Níveis de norepinefrina do tecido cortical renal analisados por ELISA. O conteúdo de norepinefrina cortical renal nos rins desnervados foi acentuadamente diminuído em comparação com os do rim inervado. ** indica significância estatística (p < 0,01), ns indica não significativo. Os valores são média ± erro padrão; N = 6 em cada grupo; O grupo RDN+Ang II indica desnervação renal operada 1 semana após a perfusão de Ang II em C57BL/6. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: RDN alivia a hipertrofia cardíaca patológica induzida por Ang II. (A) Quadros representativos da aorta abdominal. Não foi observado espessamento da camada íntima da aorta abdominal nesses grupos (coloração de Masson). (B,C) Imagens representativas do miocárdio em diferentes grupos (H&E, coloração de Masson). (D) Quantificação da porcentagem de fibrose na área ventricular esquerda e análise da porcentagem de área de fibrose (o número de campos visuais por camundongo). Barra de escala = 50 μm. N = 6 em cada grupo; RDN + Ang II indica desnervação renal operada em 1 semana após a infusão de Ang II em C57BL/6. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Se a RDN poderia reduzir a pressão arterial tornou-se controversa desde a publicação do resultado negativo do estudo de simplicidade HTN-3 7,25. No entanto, os diversos ensaios clínicos e experimentos com animais têm demonstrado resultados positivos e efetivos da RDN em humanos e animais hipertensos 9,10,11,12,13,14,15,16,17. O fenol é utilizado para destruição do nervo renal em animais, e os detalhes da ablação permanecem desconhecidos em pesquisas anteriores, como a área de ablação e o tempo de ablação, o que pode ter contribuído para diferentes resultados16.
Os métodos convencionais para RDN, como o uso de cotonete com fenol em ratos, ablação por cateter e radioterapia estereotáxica em suínos, causam danos ao nervo renal 18,26,27,28. Esses métodos também não são adequados para camundongos, que pesam apenas dezenas de gramas e são mais propensos a levar à morte. Além disso, esses métodos causam estenose da artéria renal. Na verdade, preparamos modelos RDN e usamos esses métodos em nosso pré-experimento. No entanto, 40/50 ratos morreram. O método utilizado pelo cotonete com fenol resultou em alta mortalidade.
Assim, neste estudo, estabeleceu-se um método que possibilita o desempenho padronizado da RDN, mas requer menor habilidade cirúrgica e menor tempo de operação. Utilizamos papel de pesagem embebido em solução de fenol/etanol a 10%, colocado por 2 min na artéria renal, o que fornece um método confiável para corroer o nervo simpático renal em camundongos. Sua eficácia é confirmada pela histopatologia do nervo renal. Atenuou significativamente a elevação da PAS induzida por Ang II. Além disso, também aliviou a hipertrofia cardíaca induzida por Ang II. Além disso, o procedimento melhorado tem várias características, incluindo facilidade de execução e aumento da taxa de sucesso e taxas de sobrevivência quando comparado com os procedimentos convencionais.
A parte mais crítica do protocolo é que o papel de pesagem com fenol não deve tocar os tecidos circundantes, caso contrário, pode causar obstrução intestinal fatal, infecção abdominal e estenose da artéria renal. Recomenda-se não tocar a solução no rim, pois apenas uma pequena quantidade de fenol pode causar hiperatividade simpática renal18. Além disso, atenção especial deve ser dada ao cortar o papel de pesagem. É melhor adaptá-lo sob o microscópio com tesoura cirúrgica. Não recomendamos isolar os nervos renais com micropinças, pois isso pode danificar os vasos sanguíneos renais. Normalmente, o procedimento pode ser realizado com segurança dentro de 20 minutos, mesmo com desempenho lento. Além disso, o ponto de fusão do fenol é de 40,5 °C.
A principal limitação do procedimento RDN melhorado é que o tempo de seguimento pós-operatório foi de apenas 2 semanas. O efeito da RDN a longo prazo na PA e na regeneração do nervo renal não é claro.
A aplicação futura desse modelo é produzir modelos animais de desnervação mais padronizados que possam contribuir para expor as vias subjacentes ao processo de hipertensão e hipertrofia cardíaca.
Em conclusão, este método é prático e repetível. Mais importante ainda, pode gerar modelos padronizados de RDN para estudar os mecanismos que controlam a hipertensão e combatem doenças cardiovasculares, como a hipertrofia cardíaca.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse, financeiros ou não, conforme declarado pelos autores.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81770420), Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai (20140900600), Laboratório Chave de Medicina Geriátrica Clínica de Xangai (13dz2260700), Especialidade Clínica Chave Municipal de Xangai (shslczdzk02801) e Centro de Doença Arterial Coronária geriátrica, Hospital Huadong Afiliado à Universidade de Fudan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sangon Biotech | CAS:4474-91-3 | To make a hypertensive animol model |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Abcam | ab137869 | To evaluate the expression of TH of renal nerves |
| Blood Pressure Analysis | Visitech Systems | BP-2000 | Measure the blood pressure of mice |
| Mini-osmotic pump | DURECT Corporation | CA 95014 | To fill with Angiotensin II |
| Norepinephrine ELISA Kit | Abcam | ab287789 | to measure renal norepinephrine levels |
| Phenol | Sangon Biotech | CAS:108-95-2 | Damage the renal sympathetic nerve |
| Weighing paper | Sangon Biotech | F512112 | To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. |
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