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Chemistry

이온 이동성-질량 분광법을 이용한 Ni(II) 및 Zn(II) 삼항 복합체의 열화학적 연구

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63722
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Texas A&M University-Commerce, 2Laboratoire de Chimie Théorique, Sorbonne Université

Summary

이 기사에서는 전기 분무 이온 이동성 - 질량 분광법, 반 경험적 양자 계산 및 에너지 해결 임계 충돌 유도 해리를 사용하여 관련 삼원 금속 착물의 해리의 상대적 열화학을 측정하는 실험 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

이 기사에서는 전기 분무 이온 이동성 - 질량 분광법 (ES-IM-MS) 및 에너지 분해 임계 충돌 유도 해리 (TCID)를 사용하여 음전하를 띤 [amb + M (II) + NTA]- 삼원 복합체를 두 개의 제품 채널로 해리시키는 열화학을 측정하는 실험 프로토콜을 설명합니다 : [amb + M (II)] + NTA 또는 [NTA + M (II)]-  + amb, 여기서 M=Zn 또는 Ni이고 NTA는 니트릴로트리아세트산이다. 상기 복합체는 1차 구조를 갖는 대체 금속 결합(amb) 헵타펩타이드 중 하나를 함유하며, 여기서 아미노산은 아세틸-His 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7 또는 아세틸-Asp1-Cys 2-Gly3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys7이며, 여기서 아미노산' Aa 1,2,6,7 위치는 잠재적인 금속 결합 부위이다. 삼항 복합체와 그 제품의 기하학적으로 최적화된 고정 상태는 양자 화학 계산(현재 PM6 반경험적 해밀턴)에서 전자 에너지와 충돌 단면(CCS)을 ES-IM-MS에 의해 측정된 것과 비교하여 선택되었다. PM6 주파수 계산에서, 삼원 복합체 및 그 생성물의 분자 파라미터는 경쟁적인 TCID 방법을 사용하여 두 제품 채널의 에너지 의존적 강도를 모델링하여 해리의 0K 엔탈피(ΔH0)와 관련된 반응의 임계 에너지를 결정한다. PM6 회전 및 진동 주파수를 사용하는 통계 역학 열 및 엔트로피 보정은 해리의 298K 엔탈피를 제공합니다 (ΔH298). 이들 방법은 삼항 금속 이온 착물의 범위에 대한 열화학 및 평형 상수를 결정할 수 있는 EI-IM-MS 루틴을 기술한다.

Introduction

이 연구는 대체 금속 결합 (amb) 삼원 금속 착물 [amb + M (II) + NTA]의 해리에 대한 상대 열화학의 결정을 허용하는 상업적으로 이용 가능한 이온 이동성 질량 분광계를 사용하는 새로운 기술을 설명합니다 (여기서 M = Zn 또는 Ni 및 NTA = 니트릴로 트리아세트산 (그림 1). 이들 반응은 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)1,2 동안 NTA 고정화된 금속에 부착된 amb-태깅된 재조합 단백질의 해리를 모델링한다. 예로서, 이 방법은 amb A 및 H의 amb 헵타펩티드 태그를 사용하여 기술된다 (도 2) (이전 연구로부터 선택된 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 )는 Zn(II) 및 Ni(II) 결합 특성을 나타내므로, 정제 태그로서 잠재적인 응용을 갖는다. 그러나, 기술된 공정은 임의의 유기금속 시스템에서 열화학적 에너지를 평가하는데 사용될 수 있다. 이들 amb 펩티드는 NTA의 카르복실레이트 및 아민 부위와 경쟁하는 Aa1-Aa2 및 Aa6-Aa7 위치에 금속 결합 부위를 갖는다. 3개의 중앙 amb 아미노산은 스페이서(Gly3), 두 팔에 대한 힌지(Pro4), 및 장거리 π-금속 양이온 상호작용(Tyr5)을 제공한다.

복합체의 전체 1-전하 상태는 [amb+M(II)+NTA]-복합체의 잠재적 결합 부위의 양성자화 상태에 의해 결정된다. 2+ 산화 상태를 갖는 Ni(II) 또는 Zn(II)이 존재하기 때문에, 세 개의 탈양성자화된 음전하를 띤 부위의 그물이 있어야 한다. [amb+M(II)+NTA]- 복합체의 분자 모델링은 이들이 NTA로부터의 두 양성자와 amb로부터의 하나의 양성자(즉, [amb-H+M(II)+NTA-2H]-)임을 예측한다. 생성물 채널은 이온성 종 및 중성 종(즉, [NTA-3H+M(II)]- + amb 또는 [amb-3H+M(II)]- + NTA)를 함유한다. 원고에서 "-3H"는 복합체의 이름에서 제외되지만 독자는 -3H가 암시되어 있음을 알아야합니다. 이 기기는 두 개의 이온성 질량 대 전하 (m / z) 종의 상대적 강도를 측정합니다. ES-IM-MS 분석의 주요 특성은 여기와 이전 amb 연구 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 에서 활용 된 특정 M / Z 종의 반응성을 검사 할 수 있다는 것입니다.

충돌-유도된 해리를 사용하여 대규모 복합체에 대한 열화학적 데이터를 획득하는 것은 상당한 관심의 대상이다(13,14). 운동 방법을 포함한 방법론은 에너지 범위에 걸쳐 데이터를 피팅하는 데 도움이되지 않으며 다중 충돌 환경15,16,17,18을 설명하지도 않습니다. 여기서, Armentrout, Ervin, Rodgers에 의해 유도 이온 빔 탠덤 질량 분광법을 사용하여 개발된 임계 CID(TCID) 방법은 이동파 이온 가이드를 활용한 새로운 ES-IM-MS 계측기 플랫폼에19를 적용한다. TCID 방법은 삼원 복합체를 두 제품 채널로 해리시키는 상대적 열화학적 분석을 허용하며, 반응물의 번역 에너지 (이 연구에서 삼원 복합체)와 불활성 표적 가스 (이 경우 아르곤) 사이의 충돌 에너지 전달을 설명하는 임계 법칙을 포함합니다. 이 방법은 반응물의 내부 에너지 분포(20), 반응물과 표적 가스(21) 사이의 번역 에너지 분포, 및 총 각운동량 분포(22,23)를 통한 통합을 포함한다. 제품의 관찰을 위한 제한된 시간 윈도우로부터 기인하는 운동 이동의 해리 확률 및 통계적 라이스-람스퍼거-카셀-마커스(RRKM) 보정이 포함된다(24). 두 개의 독립적인 제품 채널의 경우, 경쟁력 있는 TCID 방식을 통해 두 개의 경쟁 제품 채널을 동시에 장착할 수 있습니다. 복합체의 해리는 궤도 전이 상태를 통해 이루어지며, 이는 생성물의 특성을 갖지만 잠긴 쌍극자(25)에 의해 함께 유지된다. TCID 방법은 CRUNCH 프로그램(26)에 통합되고, 사용자 인터페이스의 동작은 삼원(amb+M(II)+NTA]-복합체의 두 해리 채널의 열화학을 평가하기 위해 여기에서 설명된다. CRUNCH 프로그램은 개발자26의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.

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Protocol

참고: 그림 1 에서는 프로토콜의 개요를 보여 줍니다.

1. 시약의 제조

  1. 동결건조된 amb 펩티드(>98% 순도)를 구입하여 -80°C 냉동고에 보관한다.
  2. >99% 순도의 아연(II) 질산염 육수화물과 니켈(II) 질산염 육수화물을 구입합니다.
    주의: 니켈(II) 질산염 육수화물은 환경 및 건강에 위험을 초래합니다.
  3. 니트릴로트리아세트산, 폴리DL-알라닌 중합체, 초순수/미량 금속 등급 암모늄 아세테이트, 수산화암모늄, 빙초산 및 HPLC 등급 아세토니트릴을 구입하십시오.

2. 스톡 솔루션의 준비

  1. 펩티드 amb 원액
    1. 12.5 mM amb 농도의 수용액을 제조하여 10-20 mg의 동결건조된 펩타이드를 칭량하여 3가지 이상의 유의한 수치를 사용하고 이를 1.7 mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브에 넣었다.
    2. 적절한 부피의 탈이온수 (>17.8 MΩ cm)를 마이크로 원심분리 튜브에 첨가하십시오. 뚜껑을 닫고 적어도 20 개의 반전과 잘 섞으십시오.
    3. 12.5 mM amb 용액으로부터 50 μL 분취량을 만들고 표시된 1.7 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 분취량 원료 용액을 -80°C에 보관하십시오.
  2. 금속 이온 스톡 솔루션
    1. 3 개의 중요한 수치 이상을 사용하여 10-30 mg의 금속 질산염 육수화물을 칭량하여 12.5 mM 농도의 수성 Zn(II) 및 Ni(II) 용액을 제조하고이를 1.7 mL 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브에 넣는다.
    2. 적절한 양의 DI 물을 마이크로 원심분리 튜브에 첨가하십시오. 뚜껑을 닫고 적어도 20 개의 반전과 잘 섞으십시오. 50 μL 분취량 스톡 용액을 -80°C에서 보관하십시오.
  3. NTA 이온 스톡 솔루션
    1. 3개 이상의 중요한 수치를 사용하여 NTA 10-30 mg을 칭량하고 이를 1.7 mL 미세원심분리 튜브에 배치하여 NTA 수용액을 제조하였다.
    2. 적절한 양의 DI 물을 마이크로원심분리 튜브 내의 NTA에 첨가하여 12.5 mM의 최종 농도를 달성한다. 뚜껑을 닫고 적어도 20 개의 반전과 잘 섞으십시오. 50 μL 분취량 스톡 용액을 -80°C에서 보관하십시오.
  4. 아세트산암모늄 원액: 아세트산암모늄 30.8mg을 계량하고 DI 물 40mL를 첨가하여 10mM 용액을 얻었다. 아세트산암모늄 용액의 pH를 1 mM 수산화암모늄으로 pH 7.7로 조정한다.
  5. 폴리-DL-알라닌 원액: DI 물에 PA 1.0 mg을 용해시켜 1 mL, 1,000 ppm 폴리DL-알라닌(PA) 원액을 만든다. 포괄적으로 혼합하십시오. 50 μL 분취량을 만들어 개별적으로 라벨이 붙은 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 1,000ppm 용액을 -80°C에서 보관한다.

3. 전기 분무 이온 이동성 - 질량 분광법 (ES-IM-MS) 충돌 유도 해리 (CID) 분석

  1. 500 μL의 0.1 M 빙초산, 500 μL의 0.1 M 수산화암모늄, 및 최종적으로 500 μL의 pH 7.7 아세트산암모늄 용액을 주입하여 ES 유입 튜브 및 금속 모세관을 세척하여 계기를 준비한다.
  2. 12.5 mM amb 원액을 실온으로 가져와 액화시킨다. DI 물로 두 개의 연속 희석물을 만들어 0.125 mM amb의 최종 농도를 생성한다. 각 희석 후에 종합적으로 혼합하십시오.
  3. 12.5 mM 금속 이온 원액을 실온으로 가져와 액화시킨다. DI 물로 두 개의 연속 희석물을 만들어 0.125 mM 금속 이온의 최종 농도를 생성한다. 각 희석 후에 종합적으로 혼합하십시오.
  4. 12.5 mM NTA 원액을 액화시킨다. DI 물로 두 개의 연속 희석물을 만들어 0.125 mM NTA의 최종 농도를 생성한다. 각 희석 후에 종합적으로 혼합하십시오.
  5. 삼원 복합체의 2 mL 샘플을 만들기 위해, 800 μL의 0.125 mM NTA 용액과 400 μL의 0.125 금속 이온 용액을 2 mL 마이크로원심분리 튜브에 첨가하고, 적어도 20개의 역전으로 완전히 혼합한다. 400 μL의 아세트산암모늄 용액 (pH 7.7) 및 400 μL의 0.125 mM amb 용액을 첨가하고, 적어도 20 개의 역전과 완전히 혼합하고, 샘플을 실온에서 10 분 동안 평형화시키도록 허용한다.
  6. 2mL 샘플을 2.5mL 무딘 노즈 주사기에 넣고 10μL/min의 흐름으로 계측기의 주사기 펌프를 사용하여 계측기의 ES에 시료를 주입합니다.
  7. 계측기를 음극 IM-MS 모드로 전환합니다. 이러한 실험을 위해 계측기(27 )의 전형적인 작동 조건을 사용하여 다음과 같다.
    1. 샘플을 10μL/min 유속으로 -2kV로 유지되는 ES 모세관에 500L/h 질소의 용해 유량으로 주입합니다. ES 소스 및 용해 온도를 각각 130°C 및 263°C로 설정합니다. 샘플링 및 추출 원뿔을 각각 25V 및 3V로 설정합니다.
    2. CID 실험의 경우, 사중극자 질량 분석기를 사용하여 낮은 질량 = 4.5 및 높은 질량 = 16.5의 분해능 설정을 갖는 단일동위원소 피크의 m/z를 사용하여 [amb+M(II)+NTA]- 삼원 복합체의 동위원소 패턴을 선택합니다.
      참고: [amb+M(II)+NTA]- 이온은 순차적 세 개의 이동파(T파) 이온 가이드로 전달됩니다.
    3. 트랩 T-파의 아르곤 가스 흐름이 3 mL/min이고 압력이 2.83 x 10-2 mbar인지 확인하십시오. 충돌 에너지(CE)를 트랩에 5V로 설정하여 삼항 복합체의 해리를 방지합니다. 트랩이 방출하기 전에 (200 μs 방출 시간) 삼항 복합 이온을 14 V의 트랩 DC 바이어스를 사용하여 이온 이동성 (IM) T-파 이온 가이드로 수집하게하여 IM 입구에서 복합체의 해리를 최소한으로 유지합니다.
    4. IM 이온 가이드의 압력이 20mL/min인 초순수 N2 버퍼 가스를 사용하여 0.507mbar인지 확인하십시오. IM 이온 가이드의 각 시작 및 끝 스윕에 대해 7V ~ 30V의 높이와 290m/s ~ 801m/s의 속도로 IM의 T파를 램프합니다.
    5. 전달 T파의 아르곤 흐름과 압력을 트랩 T파와 동일하게 설정합니다. 전사 T파는 전사 CE를 사용하여 삼원형 [amb+M(II)+NTA]- 복합체의 충돌 유도된 해리를 위해 사용되었다.
  8. 분해능 모드에서 전송 사중극자를 사용하여 음전하를 띤 [amb+M(II)+NTA]- 복합체의 m/z 동위원소 패턴을 선택합니다.
    1. 질량 분광법 프로그램을 열고 스펙트럼을 선택하여 m/z 동위원소 패턴을 식별합니다. 동위원소 모델> 도구를 선택합니다. 팝업 창에서 복합체의 분자식을 나열하고 충전 된 이온 표시 상자를 선택한 다음 음수 이온의 충전에 대해 1을 입력 한 다음 확인을 클릭하십시오.
    2. 복합체의 표시된 동위원소 패턴에서, 가장 낮은 질량 피크를 주목한다. 계측기 소프트웨어에서 쿼드 프로파일 설정> 선택합니다. 창이 열리면 수동 고정 을 선택하고 가장 낮은 동위원소 패턴 피크의 질량을 입력합니다. 업데이트를 클릭 한 다음 닫기를 클릭하십시오.
    3. 설정을 다시 선택하고 쿼드 해결을 클릭하십시오. 음이온 ES-IM-MS 스펙트럼을 5분 실행 지속 시간 및 2s 스캔 시간을 사용하여 전송 충돌 에너지 범위에 걸쳐 점진적으로 수집합니다.
      참고: 예비 전송 에너지는 26-60V 간격으로 2V 간격으로 테스트할 수 있습니다. 조사된 전달 충돌 에너지의 최종 범위는 가장 낮은 에너지에서 삼항 복합체의 해리가 없고 가장 높은 에너지에서 생성물로의 완전한 해리를 입증해야 한다. 고품질 통계 분석을 위해, 이 ES-IM-MS 분석은 평균과 표준 편차를 결정하기 위해 서로 다른 사람들에 의해 그리고 다른 날에 적어도 3배의 각 amb 삼항 복합체에 대해 수행되어야 합니다.

4. ES-IM-MS 충돌 단면(CCS) 분석

  1. ES 입구 튜빙 및 금속 모세관을 500 μL의 0.1 M 빙초산으로 세척하고, 이어서 500 μL의 0.1 M 수산화암모늄, 및 최종적으로 500 μL의 pH 7.7 아세트산암모늄 용액을 세척하였다.
  2. 1,000 ppm PA 원액을 실온으로 액화시키고 두 개의 연속 희석을 수행한다; DI 물로 100 ppm PA로 희석한 다음, DI 물과 HPLC 등급 아세토니트릴의 1:1 비율로 희석하여 10 ppm PA 용액으로 희석하였다.
  3. 10 ppm PA 샘플의 음이온 IM-MS 스펙트럼을 10분 동안 도구 작동 조건을 사용하여 수집한다.
    참고: 주입 유량 및 ES 소스 조건은 CID 실험에 대한 것과 동일하였다(단계 3.). CCS의 측정을 위해, 사중극자 질량 분석기는 비분해능 모드에 있었고 모든 이온을 순차적으로 세 개의 T-웨이브 이온 가이드 상에 전달하였다. 트랩 T-웨이브 및 IM T-웨이브 이온 가이드의 작동은 CID 실험에 대한 것과 동일하였다. 전달 T파 셀의 충돌 에너지는 이온이 해리 없이 통과할 수 있도록 4V에 있었다.
  4. 단계 3.2.-3.6에 설명된 대로 각 삼항 복합체를 준비합니다.
  5. 5분 동안 각 삼항 복합체의 IM-MS 스펙트럼을 수집한다.
    참고: 4.3단계와 동일한 도구 조건을 사용하십시오.
  6. 10분 동안 10 ppm PA 샘플의 음이온 IM-MS 스펙트럼을 수집한다.
    참고: amb 삼항 복합체 전후에 수집된 PA 교정제의 도착 시간 평균은 CCS 결정에 사용됩니다.

5. ES-IM-MS CID 데이터 분석

  1. 삼항 복합체와 그 생성물의 이론적 m/z 동위원소 패턴을 실험적 IM-MS 스펙트럼과 일치시켜 종을 식별한다.
    1. 질량 분석기 프로그램을 열고 크로마토그램 을 선택하여 새 창을 엽니다.
    2. 크로마토그램 창에서 파일 > 열기를 클릭하여 원하는 IM-MS 데이터 파일을 찾아 엽니다.
    3. 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 크로마토그램을 가로질러 드래그한 다음 놓습니다. MS 스펙트럼은 별도의 스펙트럼 창에 표시됩니다.
    4. 스펙트럼을 표시하는 새 창에서 동위원소 모델을 > 도구를 선택합니다. 작은 창이 나타납니다. amb 종의 분자식을 입력하고 하전 이온 표시 상자를 선택한 다음 원하는 충전 상태로 들어갑니다. 확인을 클릭합니다.
    5. IM-MS 스펙트럼의 모든 종을 구별하려면 스펙트럼 창에서이 과정을 반복하고 m / z 동위 원소 범위를 기록하십시오.
  2. 삼항 amb 복합체 및 그 제품의 경우, m/z 동위원소 범위를 사용하여 이를 식별하고 도착 시간 분포(ATD)를 추출합니다.
    1. 이온 모빌리티 분리 소프트웨어를 열고 파일 > 열기 를 선택하여 데이터 파일을 찾아 엽니다.
    2. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 마우스로 드래그하여 삼항 복합체 [amb + M (II) + NTA]의 m / z 동위 원소 범위를 확대합니다.
    3. 선택 도구를 사용하여 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 드래그하여 5.1단계에서 확인한 대로 [amb+M(II)+NTA]의 특정 동위원소 범위를 선택합니다. 현재 선택 수락 단추를 클릭합니다.
    4. 우연한 m/z 종 또는 배경 신호를 제거하려면 선택 도구를 사용하여 삼항 복합체와 연관된 ATD를 선택합니다. 현재 선택 수락 단추를 클릭합니다.
    5. ATD 파일을 질량 분석 소프트웨어로 내보내려면 파일 > 내보내기로 이동한 다음 드리프트 시간 유지를 클릭합니다. 원하는 경우 파일 이름을 바꾸고 해당 폴더에 파일을 저장합니다.
  3. 추출된 ATD 곡선 아래의 면적을 종들의 상대적 강도의 통합에 의해 결정한다.
    1. 크로마토그램 창에서 이온 이동성 분리 소프트웨어에서 내보낸 저장된 파일을 엽니다. 프로세스를 선택한 다음 통합을 선택합니다. 피크 대 피크 진폭 설정을 20으로 사용하고 확인을 클릭하십시오.
    2. 크로마토그램 창에 표시된 대로 통합 영역을 기록합니다. 5.2.2.-5.2.5단계를 반복합니다. 두 제품, 즉 [NTA + M (II)]- 및 [amb + M (II)]-.
    3. 5.2.1.-5.3.2단계를 반복합니다. 각각의 전달 충돌 에너지에 대해 기록된다.
  4. 각 전송 충돌 에너지 포인트에서 삼항 복합 컴플렉스 [amb+M(II)+NTA]와 두 제품 [NTA+M(II)]- 및 [amb+M(II)]에 대한 통합 ATD 영역을 활용하여 상대적 백분율 스케일로 정규화합니다.
    1. 각 충돌 에너지에서 삼항 단지와 그 제품 및 통합 ATD의 ID를 입력하여 스프레드 시트를 만듭니다.
    2. 각 충돌 에너지에 대해 [amb+M(II)+NTA]-, [NTA+M(II)]- 및 [amb+M(II)]-에 대한 통합 ATD의 합계를 활용하여 개별 ATD를 상대적 백분율 스케일로 정규화합니다.
    3. 복제된 TCID 측정에서 각 데이터 포인트의 평균 및 표준 편차를 찾습니다. 아르곤(mAr) 충돌 가스와 삼원 복합체(m복합체)의 평균 질량을 사용하여 랩-프레임 전송 충돌 에너지(E 랩)를 질량 중심 충돌 에너지(Ech)로 변환합니다: E cm = E랩(m Ar)/(mAr + m복합체).
      참고: Cm 은 삼항 복합체의 해리에 사용할 수 있는 아르곤 가스와의 충돌로 인한 최대 에너지를 나타냅니다.
    4. 상대 강도(%) 대 질량 중심 충돌 에너지(eV)의 그래프에서 [amb+M(II)+NTA]-, [NTA+M(II)]-, [amb+M(II)]-의 개별 백분율 강도의 평균 및 표준 편차를 플롯하여 종의 상대 강도가 충돌 에너지의 함수로서 어떻게 변하는지를 나타낸다.

6. 충돌 단면(CCS) 결정을 위한 평균 도달 시간 분석

  1. 이온 이동성 분리 소프트웨어 및 4V에서 설정된 전달 충돌 에너지로 수집된 10ppm PA 샘플의 IM-MS 스펙트럼이 포함된 파일을 엽니다. 음전하를 띤 각 단일 PA 종의 ATD를 추출하고 드리프트 시간 유지 옵션을 사용하여 파일을 질량 분광법 소프트웨어로 내보냅니다(단계 5.2.5 참조). 두 번째 PA 교정기 파일에 대해 이 단계를 반복합니다.
  2. 이온 이동성 분리 소프트웨어를 엽니다. 파일 > 열기 를 사용하여 PA 교정기 사이에 기록된 amb 삼항 복합체의 IM-MS 스펙트럼을 포함하는 파일 중 하나를 엽니다. 각 삼항 복합체의 ATD를 추출하고 드리프트 시간 유지 옵션을 사용하여 해당 파일을 질량 분석기 소프트웨어로 내보냅니다(단계 5.2.5 참조).
  3. 단면 교정 방법(28 )을 사용하여 삼항 복합체 및 그 생성물의 CCS를 계산한다.
    1. 스프레드시트에서, 수학식 1을 사용하여 헬륨 버퍼 가스(31)에서 측정된 그들의 CCS(Ω)29,30으로부터 각각의 단일 음전하를 띤 PA 종에 대한 보정된 CCS(Ωc)를 계산하고, 여기서 z=삼원 착물의 전하, ec=1.602 x 10-19C; Mn2 = 질소의 질량 (u), 및 m이온 = 삼원 착물의 질량28.
       Equation 1(1)
    2. 먼저 해당 ATD 곡선의 최대값으로부터 평균 도달 시간(tA)을 구한 다음 수학식 2를 적용하여 PA 교정제 및 삼항 복합체의 드리프트 시간(TD)을 찾으십시오. 여기서 c = 검출기 지연 계수(1.41ms; 계측기마다 다를 수 있으므로 계측기확인) 및 m/z = PA 교정제 또는 amb 삼항 복합체의 질량 대 전하 비율.
      t D  = tAEquation 2 (2) 
    3. PA 교정자의 tD 대 Ω c를 플로팅하여 그래프를만듭니다. 그런 다음 방정식 3을 사용하여 데이터를 최소 제곱 회귀로 맞추어 상수 A' 및 B를 찾습니다. 여기서 A'는 계측기의 전기 장, 온도 및 압력을 보정하고 B는 T-wave IM 장치의 비선형 동작을 보정 합니다.
      Ωc = A'tDB (3)
    4. amb 삼항 복합체의 A' 및 B 상수 및 tD 값을 활용하여, 수학식 3을 사용하여 그들의 Ωc를 계산하고, 그들의 Ω을 사용하여 수학식 1을 사용한다. 이 방법으로 추정된 CCS 값의 절대 오차는 약 2%29입니다.

7. 계산 방법

  1. 구조 모델링 및 계산 소프트웨어(33)에서 구현된 반경험적 PM6(32) 방법을 사용하여 CID 실험으로부터 관찰된 [amb+M(II)+NTA]- 삼항 복합체 및 이온 및 중립 생성물 쌍: [amb+M(II)]- + NTA 및 [NTA+M(II)]- + amb의 기하학적 최적화된 적합성을 위치시킨다. 계산을 개발하고 제출하는 방법에 대한 자세한 내용은 보충 파일의 계산 시각화기 사용을 참조하십시오.
    참고: 현재 시스템의 경우 PM6 방법이 실험 데이터를 올바르게 재생산했지만 일반적으로 신뢰할 수 있고 계산적으로 실행 가능한 양자 화학 방법을 사용할 수 있습니다.
  2. 여러 시작 구조에서 형상 최적화 및 주파수 계산을 실행하여 다양한 형태, 양성자화 상태 및 잠재적 결합 부위를 탐색합니다. 삼항 단지와 그 제품의 각각에 대해 위치된 각 고정점의 전자 + 영점 에너지를 기록하십시오.
    참고: 지오메트리 최적화를 위한 시작 구조는 결합 부위와 형태 배열의 다양한 가능한 조합을 조사해야 합니다. 출발 구조는 이전에 위치된 B3LYP34 [amb+M(II)]-순응자 3,4,6에 기초하였다. [amb+M(II)+NTA]-의 경우, NTA는 Zn(II)의 일중항 스핀 상태 또는 Ni(II)의 삼중항 스핀 상태에 대해 Aa1-Aa2-Aa6-Aa7 및 카르복실레이트 말단에서 amb의 치환기 부위와 경쟁하도록 위치되었다.
  3. 이러한 양자 화학 계산(35)으로부터의 원자 좌표를 사용하여 헬륨 완충 가스(CCSHe)에서 측정된 바와 같이 정확한 충돌 단면 측정을 수행할 수 있는 프로그램을 사용한다.
    참고: 양자 화학 계산에 의해 위치한 펩티드 구조로부터 정확한 CCS He를 계산하기 위해 개발된 프로그램에는 MobCal36 및 HPCCS37,38이 포함됩니다.
  4. 아래의 CRUNCH 모델링에 포함할 삼항 복합체 및 해리 생성물의 구조를 선택하기 위해 IM-MS 측정 CCS에 동의하는 Lennard-Jones CCSHe를 전시하는 가장 낮은 에너지 컨포머를 선택하십시오.

8. 크런치 모델링

  1. 토론 섹션에 설명된 형식("CRUNCH 입력 텍스트 파일 형식")으로 텍스트 파일을 만듭니다.
    참고: 파일에는 (-1) 질량 중심 충돌 에너지(Cm 포함), (1) [amb+M(II)]- 생성물의 상대 강도의 평균, (2) [amb+M(II)]-강도의 표준 편차, (3) [NTA+M(II)]- 생성물의 상대 강도의 평균, (4) [NTA+M(II)]- 강도의 표준 편차.
  2. 모델 E센티미터-두 반응 채널의 의존적 강도[amb+M(II)+NTA]-에 [amb + M (II)]- + NTA 및 [amb + M (II) + NTA]- 에 [NTA + M (II)]- + CRUNCH 프로그램에서 TCID 기술을 사용하는 amb.
    참고: 삼항 복합 채널과 두 개의 이온 및 중립 제품 채널에 대해 PM6 진동 및 회전 주파수를 사용하십시오. 삼항 복합체, 아르곤 충돌 가스, 이온 및 중립 생성물의 평균 질량을 사용하십시오. PM6 계산 또는 NIST 데이터베이스의 값을 편광성(Å3) 및 중립 제품에 대한 쌍극자 모멘트 (Debye).
    1. CRUNCH 주 메뉴에서 텍스트 파일(. GB5) 제품의 Cm 의존성 상대 강도를 함유한다. 매개 변수를 읽으려면 아니오로 응답합니다.
    2. CRUNCH 주 메뉴에서 모델링을 선택> 모든 매개 변수 설정을 선택합니다. 반응 모델 옵션에서, 삼항 복합체(20)의 에너지 전달 분포에 대한 통합이 있는 RRKM이 뒤따르는 기본 임계값 CID 옵션을 선택하고, 모델링된 독립 제품 채널에 대해 2를 입력하고, 횡단면 계산을 선택하십시오. 아니오를 입력하여 두 제품 채널이 동일한 이온 질량을 갖습니까?
    3. 제품 채널 #1의 경우 [amb+M(II)]- 제품의 실험 데이터에 대해 열 [1]을 입력하고, [amb+M(II)]- 제품의 표준 편차에 대해 열 [2]를, 비컨볼루션 모델 횡단면의 경우 열 [5]를, 컨볼루션된 모델 횡단면의 열 [6]을 입력합니다. 적합의 잔차에 대해 0을 입력합니다.
      참고: 이 열 번호는 8.1단계의 입력 파일에 있는 열에 해당합니다. 토론에 설명 된대로 ( "CRUNCH 입력 텍스트 파일 형식").
    4. 제품 채널 #2의 경우, [NTA+M(II)]- 제품의 실험 데이터에 대해 컬럼 [3]을 입력하고, [NTA+M(II)]- 제품의 표준 편차에 대해 컬럼 [4]를, 컨볼루션되지 않은 모델 횡단면에 대해 컬럼 [7]을, 컨볼루션된 모델 횡단면에 대해 컬럼 [8]을 입력합니다. 적합의 잔차에 대해 0을 입력합니다.
    5. 비컨볼루션 모델의 유형에 대해, 충돌 셀로부터 TOF 검출기(18)로의 50μs 시간 윈도우로 인한 운동 시프트의 통계적 RRKM 보정을 포함하는 0K 단면(kinetic shift 포함)을 선택하십시오.
    6. 컨볼루션 옵션에 대해, 삼항 복합 이온과 아르곤 충돌 가스(21) 사이의 번역 에너지 분포에 대한 컨볼루션을 포함하는 티어난의 이중 적분을 선택한다.
    7. 수치 통합 방법의 경우 미리 저장된 횡단면이 있는 가우시안 직교를 선택한 다음 적분점 수 = 32, 표준 편차 수 = 3.0, 두 번째 적분에 대한 표준 편차 수 = 3.0을 선택합니다.
    8. 삼항 복합 이온(u)의 질량은 . GB5 텍스트 파일, 충돌 가스의 질량 (아르곤의 경우 39.948 ); 이온 빔의 FWHM에는 0.20eV , 가스 온도에는 298.15K 의 기본값을 사용합니다. 이 프로그램은 에서 최소 및 최대 질량 중심 충돌 에너지를 자동으로 읽습니다. GB5 텍스트 파일; 최소 에너지 증가에 기본값을 사용합니다.
    9. 배율 조정 인자 Sig0의 기본값, 개별 제품 채널의 크기 조정을 허용하는 경우 아니요, N 및 M의 기본값을 사용합니다. g(i) 계산 방법에 대해, 삼항 복합체 [amb+M(II)+NTA]-의 내부 에너지 분포(20)를 포함하는 상태의 ro-진동 밀도에 대한 통합을 선택하십시오.
    10. 분자 파라미터를 입력하기 위한 옵션으로부터, G를 입력하여, 삼항 복합체의 PM6 진동 및 회전 주파수를 갖는 구조 모델링 파일(33)을 판독한다. 질문에 대답 예 원자 반응물 중 하나입니까? 모델링 파일의 위치와 이름을 씁니다.
      참고: 진동 및 회전 주파수를 입력하기 위한 다른 옵션으로는 텍스트 파일에서 매개 변수를 읽는 읽기 매개 변수 파일 또는 각 매개 변수를 수동으로 입력할 수 있는 상수 편집/입력 등이 있습니다.
    11. NIST에서 권장하는 PM6 스케일링 팩터(1.062)를 사용하여 주파수를 스케일링합니다. 크기 조정에 대한 자세한 내용은 토론("진동 주파수의 스케일링 팩터")을 참조하십시오. 삼항 복합체의 원자 수는 파일에서 읽습니다. 아니오에 대한 답변 은 분자가 선형입니까? 반응물에 대한 설명을 입력합니다(예: H+Zn+NTA- + Ar).
    12. 이온에 대한 전하를 위해 1을 입력하고 아르곤 가스(39)의 분극성에 대해서는 1.664를 입력하십시오. 이온의 질량과 표적의 질량은 각각 삼항 복합체와 아르곤에 대한 것이며, 에서 자동으로 판독됩니다. GB5 텍스트 파일. 고조파 진동의 경우 0을 입력합니다.
      참고: 다음 옵션은 높은 진동 주파수 또는 낮은 진동 주파수에 대해 서로 다른 스케일링 팩터를 선택하기 위한 것입니다. 고주파의 경우 1.062를, 저주파의 경우 0.0을 입력합니다(설명: 진동 주파수의 스케일링 팩터 참조). 배율이 조정된 주파수가 표시됩니다. 0을 선택하여 변경 없음을 선택합니다.
    13. Enter 키를 눌러 8.2.10단계에서 입력한 구조 모델링 파일(33)로부터 1-D 및 2-D 회전 상수를 판독한다. 방해가 된 로터 처리의 경우 기본값 0을, 분자 대칭에 대해 1을 선택합니다.
      참고 : 프로그램은 입력 된 데이터를 보여줍니다. 변경 없음에 대해 Enter 키를 누릅니다.
    14. 반응물 온도에 대해 기본 300K를 선택합니다. 상태 배열의 밀도를 줄이는 방법에 대해 통합을 선택합니다. 예를 선택하여 에너지 분포를 자릅니다. 분배를 위해 최대 에너지의 경우 40000cm-1, 빈 크기의 경우 2.0cm-1, 에너지 분배의 포인트 수에 대해 32를 입력합니다.
      참고: Enter 2x를 누르고 잘린 32pt 배열의 모집단 >0.9를 가집니다. >0.9인 경우 아니오를 입력하여 빈 또는 응축 계수를 변경합니다. <0.9인 경우 Yes를 입력하고 분배 및/또는 빈 크기에 대한 최대 에너지를 변경합니다.
    15. TCID/RRKM 모델에 대한 매개변수의 경우 변경에 대해 예를 선택하고 고정 시간에는 0을, 감지 창의 상한에는 0.000050초를 입력합니다. 활용 계측기의 경우, 이것은 이온이 충돌 전달 셀에서 TOF 검출기로 이동하는 데 걸리는 시간이며 수학식 2를 사용하여 계산됩니다.
    16. 동력이 공급된 분자의 경우, C를 입력하여 이미 입력된 반응물의 값을 복사합니다. 소스 전환 상태(TS)에 대해 -1을, 목적지 TS에 대해 0을, 계속하려면 P를 입력합니다.
    17. 제품 채널 1의 경우 해리 채널 옵션에서 단일 전환 상태에 대해 1을, 순차적 해리에 대해 없음에 대해 0을 선택합니다. 전환 상태 유형에서 궤도에 대해 1을 선택합니다.
    18. G를 선택하여 [amb+M(II)]- + NTA 제품에 대한 PM6 회전 및 진동 파라미터가 포함된 모델링 프로그램 파일을 읽습니다. 아니오를 입력하면 PSL TS 종 중 하나가 원자입니까? [amb+M(II)]- 파일의 위치와 이름을 입력합니다. 스케일 주파수에 1.062를 사용하고, 원자 수에 대해 Enter 키를 누른 다음, 분자가 선형입니까?
    19. NTA 제품의 진동 및 회전 주파수를 포함하는 모델링 파일의 위치와 이름을 입력합니다. 스케일 주파수에 1.062를 사용하고, 원자 수에 대해 Enter 키를 누른 다음, 분자가 선형입니까 ? 궤도 TS에 대한 설명, 예를 들어, H+Zn을 입력하-... NTA.
    20. [amb+M(II)]-ion의 충전을 위해 1을 입력하고 NTA의 분극성(16.12 Å3)과 쌍극자 모멘트(4.6183 Debye)를 입력합니다. 회전 온도에 대해 0K를 선택하고 궤도 전이 상태의 처리를 위해 잠긴 쌍극자를 선택하십시오. [amb+M(II)]-이온과 NTA의 평균 질량(u)을 입력합니다.
    21. 고조파 진동의 경우 0을 입력합니다. 고주파의 경우 1.062를, 저주파의 경우 0.0을 입력합니다. 주파수 스케일링에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. 배율이 조정된 주파수가 표시됩니다. 0을 선택하여 변경 없음을 선택합니다. Enter 키를 눌러 모델링 파일에서 1-D 및 2D 회전 상수를 읽습니다. 방해 로터의 경우 0을, 분자 대칭에 대해 1을, 반응 축퇴성에 대해 1을 선택합니다. 변경 안 함 옵션을 입력합니다.
    22. 제품 채널 2의 경우 단일 전환 상태에 대해 1을, 순차적 해리에 대해 없음에 대해 0을, 전환 상태 유형에 대해 궤도를 돌려면 1을 선택합니다.
    23. G를 선택하여 [NTA+M(II)] 및 amb 제품에 대한 PM6 회전 및 진동 파라미터가 포함된 모델링 파일에서 읽습니다. 아니오를 입력하면 PSL TS 종 중 하나가 원자입니까? [NTA+M(II)]- 모델링 파일의 위치와 이름을 씁니다.
    24. 스케일 주파수에 1.062를 사용하고, Enter 키를 눌러 원자 수를 읽고, 분자가 선형입니까? amb 모델링 파일의 위치와 이름을 작성합니다. 스케일 주파수에 1.062를 사용하고, 원자 수에 대해 Enter 키를 누른 다음 분자가 선형입니까?
    25. 궤도 TS(예를 들어, NTA+Zn-...에 대한 설명을 입력한다. H). [NTA+M(II)]- 이온의 충전을 위해 1.0을 입력하고 amb의 분극성(Å3)과 쌍극자 모멘트(Debye)를 입력합니다. 회전 온도에는 0.0K를, 궤도 전이 상태의 처리를 위해 잠긴 쌍극자를 선택합니다. [NTA+M(II)]- 및 amb 제품의 평균 질량(u)을 입력합니다.
      참고: 출력 파일에는 amb의 편광 가능성과 쌍극자 모멘트가 포함되어 있습니다. 분극성은 Bohr 3의 단위이며 Å3의 단위로 변환해야합니다.
    26. 고조파 진동의 경우 0을 입력합니다. 고주파의 경우 1.062를, 저주파의 경우 0을 입력합니다. 주파수 크기 조정에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오. 배율이 조정된 주파수가 표시됩니다. 0을 선택하여 변경 없음을 선택합니다. Enter 키를 눌러 모델링 파일에서 1-D 및 2D 회전 상수를 읽습니다. 방해 로터의 경우 0을, 분자 대칭에 대해 1을, 반응 축퇴성에 대해 1을 선택합니다. 변경 내용 없음을 입력합니다.
    27. 비활성 2D 회전을 처리하려면 기본 옵션 통계 각운동량 분포를 선택하고 J 분포에 P(E,J)를 통합합니다. 통합의 점 수에 기본값인 32를 사용합니다.
      참고: 이러한 선택은 총 각운동량 J 레벨16,17에 대한 통합 방법을 선택합니다. 결과 출력을 통해 조사자는 모든 입력이 올바른지 확인할 수 있습니다.
    28. 통전된 분자 옵션에 상대적인 활성화 에너지를 선택하고 [amb+M(II)]-생성물의 상대적 강도 대 질량 중심 충돌 에너지의 그래프에서 관찰된 임계 에너지에 근접한 생성물 채널 1에 대한 상대 에너지(eV)를 입력한다(그림 4).
    29. 생성물 채널 2의 경우, [NTA+M(II)]-생성물의 강도 대 질량 중심 충돌 에너지의 그래프에서 관찰된 임계 에너지에 근접한 상대 에너지(eV)를 입력한다. 각 제품 채널의 상태 수를 계산하려면 bin 크기 2.0을 사용합니다. Enter 키를 누른 다음 아니요를 눌러 계속합니다.
    30. 모델 메뉴에서 데이터에 맞게 매개변수 최적화를 선택하고 데이터 피팅을 시작하고 종료할 최소 에너지와 최대 에너지를 각각 입력합니다.
      주: 두 채널의 임계값을 포함하는 작은 에너지 범위를 사용하십시오. 자세한 내용은 토론: 선택한 TCID 모델을 실험 데이터에 맞추기 위한 에너지 범위를 참조하십시오.
    31. 가중치 모드 실험 표준 편차에 대해 -1을 선택합니다. 데이터를 기반으로 일반적으로 0.01 ~ 0.001의 최소 허용 가능한 표준 편차를 선택합니다. 개별 채널의 크기 조정을 최적화하려면 아니요를 선택하고 반복 횟수에 대해 0을 선택합니다.
      참고: 표준 편차를 사용하는 대안은 통계 옵션입니다.
    32. E0 수렴 한계의 기본값을 사용하고 아니오를 선택하여 현재 값에 매개 변수를 보유합니다. 하한 및 상한에 대해 0.5 및 2.0eV를 입력하여 최적화 실패를 방지하고 미분 평가 방법에 대한 중앙 유한 차이를 선택합니다. 숫자 정밀도에 기본값을 사용하고 미분 단계 크기를 변경하려면 아니요를 선택합니다.
      참고: 다른 방법은 예를 선택하여 현재 값에 매개 변수를 보유하는 것입니다. 이 방법은 매개 변수의 최적화라는 설명에서 더 자세히 설명합니다.
    33. 최적화 메뉴에서 최적화 시작을 선택합니다. CRUNCH 프로그램은 선택된 TCID 모델을 실험 데이터에 최적화합니다.
      참고: 최적화에서 만족스러운 적합치를 찾지 못하면 변경 메뉴에서 임계값에서 상승하는 처음 몇 가지 강도만 포함하도록 에너지 범위를 변경해 보십시오. 적당한 핏을 찾으면 에너지 범위를 늘리고 다시 맞춥니다. 데이터에 적합치를 찾는 데 도움이 될 수 있는 다른 옵션으로는 최적화된 매개 변수에서 현재 값에 매개 변수를 보유하도록 선택하고 가중치에서 가중치 옵션을 변경하는 것이 포함됩니다. 이러한 옵션에 대한 토론을 참조하십시오.
    34. 데이터에 맞는 모델이 발견되면 모델 메뉴가 나타날 때까지 Enter 키를 누릅니다. 실험 데이터의 에너지 범위의 일부만 TCID 모델에 장착된 경우 계산 및 컨볼루트 모델을 선택하여 모델 적합도를 모든 실험 충돌 에너지로 확장합니다.
    35. 모델 메뉴에서 T에서 델타 H 및 S를 선택합니다.
      참고: 비복잡한 CRUNCH 모델은 0K 임계 에너지를 삼항 복합체를 2개의 독립적인 제품 채널로 해리시키는 0K 엔탈피(ΔH0)와 관련시킨다(표 2). 해리의 298K 엔탈피 (ΔH 298) 및 깁스 자유 에너지 (ΔG298)는 또한 반응물 및 제품 PM6 회전 및 진동 주파수를 사용하는 통계 역학 열 및 엔트로피 보정으로 파생됩니다.

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Representative Results

A 및 H의 삼항 복합체를 [amb+M(II)]- + NTA 또는 [NTA+M(II)]- + amb로 [amb+M(II)+NTA]- + amb로 경쟁적 충돌-유도된 해리가 도 3에 도시되어 있다. amb는 A 또는 H로 표시되고 M=Zn 또는 Ni로 표시된다. [A+Zn(II)+NTA]- 삼원 복합체(도 3A)는 [A+Zn(II)]를 생성하기 위해 약 0.7eV 충돌 에너지(CE)의 겉보기 임계값을 나타내고 [NTA+Zn(II)]-를 생성하기 위해 약 0.9eV를 나타낸다. [A+Ni(II)+NTA]- 복합체(그림 3B)의 해리는 [NTA+Ni(II)]- 및 [A+Ni(II)]- 제품 모두에 대해 유사한 임계값(~1.1eV)을 나타내며, [NTA+Ni(II)]- 상대 강도는 90%로 증가하는 반면, [A+Ni(II)]-의 강도는 18% 이상 상승하지 않습니다. [H+Zn(II)+NTA]-삼원 복합체(그림 3C)의 경우, 주요 생성물은 [H+Zn(II)]-임계 값에서 약 0.6eV에서 약 85%의 상대 강도로 상승하고, 1.0eV 이상의 에너지에서는 [NTA+Zn(II)]-가 약 30%로 상승한다. [H-H2 O + Zn (II)]-로부터의 물 손실을위한 채널도 있습니다. [H+Ni(II)+NTA]-(도 3D)의 경우, [H+Ni(II)]-는 임계치에서 약 0.9eV에서 약 40%의 상대 강도로 상승하는 반면, [NTA+Ni(II)]-는 ~1.0eV에서 약 80%로 상승한다. 그래프에는 삼항 복합체가 50 % 해리되는 CE가 포함됩니다. Ni(II) 삼차 복합체는 50% 해리되기 위해 Zn(II) 삼항 착물 상대물보다 0.31-0.37eV 더 높은 CE를 필요로 한다. 이것은 Ni (II) 복합체가 더 안정하고 해리하기 위해 더 높은 CE가 필요하다는 것을 시사하며, 이는 TCID 기술을 사용하여 추가로 조사됩니다.

그림 4 는 두 경쟁 제품 채널을 동시에 피팅할 수 있는 경쟁력 있는 TCID 방법을 보여줍니다.

[amb + M (II) + NTA] → [amb + M (II)]- + NTA (1)

[amb + M (II) + NTA] → [NTA + M (II)]- + amb (2)

잠재적 에너지 표면(PES)은 경쟁 제품 채널로 해리되는 동력화된 삼원 복합체를 예시하고 [ambH+Zn(II)+NTA]-의 해리를 모델링하는 데 사용되는 PM6 기하학적 최적화 종을 보여줍니다. PES에는 삼항 복합체의 상태 밀도와 제품의 상태 합계가 포함됩니다. 0K 임계 에너지인 E1 및 E2는 반응 1 및 2에 대한 0K 엔탈피 변화와 동일합니다.

도 5는 본 연구에 사용된 다른 세 개의 기하학적 최적화된 삼항 복합체의 구조를 보여준다. 이 종들은 예측 된 전자 및 제로 포인트 에너지와 IM-MS 측정 충돌 횡단면 (CCSHe)과의 일치를 기반으로 선택되었습니다. 표 1은 삼항 복합체인 LJ CCSHe와 실험적 IM-MS CCSHe 사이에 합의가 존재한다는 것을 보여주는데, 이는 그들이 상호 불확실성 내에서 동의하기 때문이다. [amb + M (II)] 및 amb의 형태는 이전 DFT 모델링 3,4,5,6의 결과를 기반으로합니다. 이들 PM6 적합성 인자의 분자 파라미터는 그들의 밀도와 상태의 합을 계산하기 위한 그들의 ro-진동 주파수를 포함하여, 삼항 복합체의 에너지 분해된 해리의 TCID 모델링에 사용되었다.

그림 6은 에너지 분해 제품 강도에 맞는 복잡한 CRUNCH TCID 임계값을 보여줍니다. 복잡한 핏에는 [amb+M(II)+NTA]- + Ar 반응물의 사용 가능한 에너지 및 각운동량 분포가 포함됩니다. 비컨볼루트 핏(도시되지 않음)은 삼원 복합체의 해리에 대한 엔탈피(ΔH0)의 0K 변화를 예측하고, 표 2는 반응 1 및 2에 대한ΔH0 및ΔH298(kJ/mol)을 나타낸다. Zn(II) 삼원 착물의 해리에 대해, A 및 H 둘 다 반응 1 에 대해 ΔH0을 나타내는데, 이는 각각 반응 2에 대한 ΔH0보다 31 kJ/mol 및 15 kJ/mol 더 낮으며, 이는 A 및 H 둘 다 NTA보다 더 큰 Zn(II) 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. [A+Ni(II)+NTA]-삼원 복합체는 반응 1 및 2에 대해 각각ΔH0 = 146 및 148kJ/mol을 나타내는데, 이는 A 및 NTA가 Ni(II)에 대해 유사한 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. 그러나, [H+Ni(II)+NTA]-의 해리는 반응 1에 대한ΔH0이 반응 2에 대한 것보다 36 kJ/mol 낮음을 보여주며, 이는 H가 NTA보다 더 큰 Ni(II) 친화도를 갖는다는 것을 나타낸다. 전반적으로, [amb+Ni(II)+NTA]- 복합체는 [amb+Zn(II)+NTA]-로 해리되는 A를 제외하고는 그들의 [amb+Zn(II)+NTA]-대응물보다 더 높은 해리 엔탈피를 나타낸다. 표 3은 역반응에 대한 결합과 형성 상수(K)의 깁스 자유 에너지(ΔG298)를 나타낸다:

[amb + M (II)] - + NTA → [amb + M (II) + NTA]- (3)

[NTA + M (II)] - + amb → [amb + M (II) + NTA]- (4)

표 3은 Ni(II) 삼원 착물의 형성이 더 가혹하고 모든 경우에 Zn(II) 착물보다 더 큰 형성 상수 K를 나타낸다는 것을 입증한다. 반응 4 (즉, NTA 금속 이온 착물과의 amb 태그 회합)는 IMAC 컬럼 내부의 NTA 고정화 금속 이온에 결합하는 amb 태그 재조합 단백질을 나타내는 것으로서 특히 관심의 대상이다. [ambA+Ni(II)+NTA]의 형성에 대한 반응 4는 가장 자발적인 ΔG298 = 53.1 kJ/mol 및 가장 높은 형성 상수인 K=2.01 x 109를 나타낸다.

Figure 1
그림 1: ES-IM-MS TCID 메서드 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: amb A 및 H 펩티드의 일차 구조. 색상은 잠재적 인 금속 결합 부위를 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 질량 중심, 에너지 분해(eV) 임계값 충돌로 인한 [amb+M(II)+NTA]의 해리. 생성물 이온 [amb+M(II)]- [NTA+M(II)]- 및 [amb-H2O+Zn(II)]-의 에너지 의존성이 도시되어 있다. 삼항 복합체의 50% 해리가 있는 질량 중심 충돌 에너지가 그래프에 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 에너지 분해 TCID 방법의 모델. [amb H + Zn (II) + NTA]- + 아르곤 사이의 충돌은 [amb H + Zn (II)]- + NTA 또는 [NTA + Zn (II)]- + amb H 제품과의 해리를 초래합니다. 임계 에너지 E1 및 E2는 각각 [amb H + Zn (II) + NTA]- → [ambH + Zn (II) + NTA]- → [amb H + Zn (II) + NTA]- + ambH에 대한 해리 (ΔH0)의 0 K 엔탈피와 동일시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: PM6 지오메트리 최적화 삼항 [amb+M(II)+NTA]- A와 H의 복합체. 실험 데이터의 TCID 모델링에 사용되는 적합성. 이들 순응자는 그들의 PM6 전자 에너지와 그들의 LJ 충돌 단면 (CCSHe)이 IM-MS 측정 CCSHe와 비교되는 방법을 비교함으로써 다른 후보 구조로부터 선택되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: [amb+M(II)+NTA]의 에너지 해결, 충돌 유발 해리. 종 A 및 H의 경우, 복잡한 CRUNCH 역치 적합치를 갖는 [amb+M(II)]- 및 [NTA+M(II)]-의 생성물 이온이 도시된다. 표시된 에너지 (eV) 값은 [amb + M (II) + NTA]- → [amb + M (II)]- + NTA 또는 [amb + M (II) + NTA]- → [AMB + M (II) ]- + amb에 대해 0K에서 해리하는 엔탈피입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: CRUNCH 텍스트 입력 파일의 형식입니다. 이 파일에는 질량 중심 충돌 에너지의 함수로 형성된 생성물 이온의 평균 상대 강도와 표준 편차가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

증권 시세 표시기 [amb + Zn (II) + NTA] - [amb + Ni (II) + NTA] -
PM6 특급 PM6 특급
A 214±2 214 219±2 218
H 211±5분 216 212±3 215
a ES-IM-MSCCS 그는 측정이 ±4 Å 2의 불확실성을 가지고있습니다.

표 1: [amb+M(II)+NTA]-의 PM6 순응자의 LJ 충돌 단면의 비교. PM6 순응자의 이론적 단면은 ES-IM-MS로 측정된 실험 CCS와 비교된다.

[amb + Zn (II) + NTA] - → [amb + Ni (II) + NTA] - →
[amb + Zn (II)] - + NTA [NTA + Zn (II)] - + amb [amb + Ni (II)] - + NTA [NTA + Ni (II)] - + amb
증권 시세 표시기 ΔH0 ΔH298 ΔH0 ΔH298 ΔH0 ΔH298 ΔH0 ΔH298
A 118 127 149 182 146 171 148 154
H 96.4 92.3 111 115 125 140 161 216
 

표 2: TCID 분석으로부터의 열화학적 결과. 에너지 의존 반응 [amb+M(II)+NTA]- → [amb+M(II)]- + NTA 또는 [amb+M(II)+NTA]- → [NTA+M(II)]- + amb, 비컨볼루션 TCID 모델 적합으로부터 유도된 해리 (ΔH0)의 0 K 엔탈피, 및ΔH0으로부터 유도된 해리 (ΔH 298)의 298 K 엔탈피 및 PM6 회전 및 진동 주파수를 이용한 통계적 역학 열 보정을 보여준다. 값은 kJ / mol로 제공됩니다.

[amb + Zn (II)] - + NTA → [NTA + Zn (II)] - + amb → [amb + Ni (II)] - + NTA → [NTA + Ni (II)] - + amb →
[amb + Zn (II) + NTA] - [amb + Zn (II) + NTA] - [amb + Ni (II) + NTA] - [amb + Ni (II) + NTA] -
증권 시세 표시기 증권 시세 표시기298 K 증권 시세 표시기298 K 증권 시세 표시기298 K 증권 시세 표시기298 K
A -34.0 9.05 엑스 105 -21.8 6.59 엑스 103 -45.7 1.01 엑스 108 -53.1 2.01 엑스 109
H -29.3 1.36 엑스 105 -30.2 1.95 엑스 105 -47.0 1.71 엑스 108 -31.1 2.81 엑스 105
 

표 3: 깁스 자유 에너지 회합 (ΔG298) 및 평형 형성 상수 (K). 역반응에 대해 ΔG298 및 K에서 K는 [amb+M(II)]- + NTA → [amb+M(II)+NTA]- 및 [NTA+M(II)]- + amb → [amb+M(II)+NTA]-. ΔH298 및 PM6 회전 및 진동 주파수를 사용한 통계 역학 엔트로피 계산에서 파생됩니다. ΔG298에 대한 값은 kJ/mol입니다.

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Discussion

중요한 단계
ES-IM-MS 역치 충돌 유도 해리(TCID) 분석. TCID는 아르곤의 존재하에 전달 T-파 셀을 충돌 셀로 사용했다. 해리 전에, 전구체 이온은 이온 이동성 (IM) 셀을 통과 할 때 질소 가스와의 저에너지 충돌에 의해 열화됩니다. 이는 트랩을 충돌 셀(6,40)로서 사용함으로써 달성되는 것보다 더 재현가능한 에너지 분해능 TCID를 초래한다. 해리 전에 [amb + M (II) + NTA]- 의 열화는 또한 삼원 복합체의 사용 가능한 내부 에너지가 298K 온도를 사용하여 특성화 될 수있게합니다. 전달 세포에서의 해리는 또한 삼원 복합체를 의미하며 그의 생성물 이온은 검출기에서 동일한 평균 도달 시간을 가지며, 이는 전달 세포에서만 발생한 삼원 복합체의 해리를 확인하는데 유용했다. 해리가 발생할 수 있는 다른 영역은 ES 소스(샘플링 콘은 이를 피하기 위해 25V로 유지됨) 또는 IM 셀의 입구에 있습니다. 이들 영역에서 삼원 복합체의 해리에 의해 생성된 생성물 이온은 생성물 이온이 IM 세포 내의 삼원 복합체로부터 분리되기 때문에 전사 세포에서 생성된 것과 상이한 드리프트 시간을 갖는다. 이들 생성물 이온은 분석으로부터 배제되었다. 이 프로토콜에서는 공동 정렬된 전구체 및 생성물 이온에 대한 통합 도달 시간 분포만 강도를 결정하는 데 사용됩니다. 트랩 바이어스 설정은 IM 셀의 주입 전압을 제어하는 전압으로, IM 셀 입구의 CID에 기여합니다. 트랩 바이어스는 14V로 설정되었으며, 이는 전체 강도에 과도하게 영향을 미치지 않으면서 배경 해리를 최소한으로 유지했습니다. 이전의 연구(41)는 류신 엔케팔린의 펩티드 이량체의 유효 온도(상한)가 IM 세포의 입구에서 449 K인 것으로 결정하였다. 그러나, 유효 온도는 이량체가 IM 세포를 통과함에 따라 급격히 감소하였다. 여기에서 연구된 amb 복합체의 도착 시간은 가우스 분포를 나타내었으며, 이는 그들이 IM 세포를 통과할 때 열화되었음을 나타낸다.

ES-IM-MS 충돌 횡단면(CCS) 분석. CCS 드리프트 시간은 질소와의 충돌의 결과로서 실험적으로 발견되었다. 이들 값은 공지된 표준의 보정 곡선을 사용하여 헬륨 유래 CCS 드리프트 시간으로 변환되었다. 이는 PM6 준수자의 CCS를 측정하는 데 사용되는 프로그램이보다 일반적으로 사용되는 헬륨 표준을 필요로하기 때문에 필수적입니다.

기술의 수정 및 문제 해결
CRUNCH 입력 텍스트 파일 형식입니다. CRUNCH 프로그램에 적합한 입력 텍스트 파일은 그림 7에 나와 있습니다. 위에서 아래로 순서대로 헤더는 파일 위치와 CRUNCH 버전입니다. 날짜; 에너지의 수; 첫 번째 에너지 열을 제외한 데이터 계열의 수; Number of data series including the first energy column; 소스 파일; 전구체 복합체의 질량; 아르곤의 질량; 실험 온도; 창조의 날짜; x-1로 지정된 데이터(질량 중심 충돌 에너지); 이온 빔의 절반 최대 (FWHM)에서 전체 폭을 포함한다. 이러한 값은 각 TCID 실험에 대해 수정해야 합니다. 이온 빔과 에너지 제로의 FWHM 에너지 확산은 저전압을 통해 CE를 스캔하고 총 이온 전류를 모니터링하여 지연 전위 분석 (RPA)을 통해 결정해야합니다. 그러나, 현재 연구에서 IM의 동작 조건 하에서, 이온 전류 신호는 전송 CE가 가장 낮은 값으로 설정되었을 때 단지 약 50% 감소하였다. 이온 빔 에너지 제로 및 FWHM은 출구 IM 렌즈를 낮춤으로써 추가적인 위상차 시에만 측정될 수 있었다. 이 후자의 경우, RPA 곡선의 유도체의 FWHM은 랩 프레임에서 1.5V, 질량 중심 프레임(13)에서 0.035eV의 전형적인 이온 에너지 확산을 주었다.

압력 행은 충돌 셀 내부의 압력과 관련이 있지만 여기서는 사용되지 않습니다. 충돌 셀에서 아르곤의 압력은 다양 할 수 있으며 TCID 데이터는 단일 충돌 조건으로 추정하기 위해 세 가지 압력에서 측정 될 수 있습니다. 그러나이 연구에서는 하나의 압력 만 사용되었으며 압력으로 인해 여러 충돌이 발생합니다. 단일 충돌을위한 새로운 플랫폼을 개발하는 것은 진행중인 연구의 영역입니다. 질량은 강도가 아래 열에있는 두 개의 제품 이온과 관련이 있습니다. 거주자는 기본값으로 남겨 둘 수 있습니다. 다섯 개의 기둥은 질량 중심 충돌 에너지 (지정 -1)입니다. 질량 898.30 u를 가진 종의 이온 강도의 평균; 종의 이온 강도의 표준 편차 898.30 u; 질량 253.53 u를 가진 종의 이온 강도의 평균; 및 종의 이온 강도의 표준 편차 253.53 u.

분자 모델링
순응자의 수는 이전 연구 9,10,11,12,13에서 파생 된 모델을 사용하여 초기에 좁혀졌습니다. CRUNCH 피팅은 정확한 역치 에너지를 얻기 위해 반응물, 활성화 된 분자 및 전이 상태를 신중하게 스크리닝해야합니다. 이전의 연구 9,10,11,12,13에는 CRUNCH 모델링에 사용 된 매개 변수를 가진 구조를 얻기 위해 [amb + M (II)] 순응자의 광범위한 스크리닝이 포함되었습니다. 트랜스 펩티드 결합을 갖는 복합체만이 IM-MS 측정 CCSHe10과 일치하기 때문에 사용되었다. B3LYP 및 PM6 분자 모델링 방법은 모두 Aa1-Cys 2-Cys7 및 Zn (II) 또는 Ni (II) 10,11,12,13의 카르복실레이트 말단 배위를 나타내는 가장 낮은 에너지 [amb + M (II)]-형성자를 예측합니다. 알려진 모델의 동작에 익숙해지면 [amb + M (II) + NTA]의 새로운 순응자가보다 효율적으로 결정될 수있었습니다. PM6 방법에 의해 더 낮은 에너지 순응자가 위치함에 따라, 그들은 가장 실현 가능하고 가장 낮은 에너지 순응자가 남아있을 때까지 체계적으로 필터링되고 재평가되었습니다.

크런치 모델링
해리를 관찰하기 위한 시간 창입니다. 본 연구에서, 다중 채널 플레이트 검출기가 위치하는 TOF 분석기의 시작부터 TOF 분석기의 끝까지의 50 μs 시간 윈도우가 사용되었다. 전사 셀에서의 활성화와 TOF 질량 분석기의 입구 사이의 실험 시간 창을 사용하는 것이 더 나을 수 있는데, 왜냐하면 활성화된 이온이 반사경 TOF에서 그 시간 동안 해리된다면, 이 준안정한 붕괴는 다른 m/z에서 측정될 것이기 때문이다. 그러나 이 연구에서, 질량 스펙트럼에서 관찰된 생성물 이온은 모두 그림 3에 도시된 변형되지 않은 m/z 종으로 식별될 수 있었다. 이것은 준안정 붕괴가 문제가되지 않았 음을 나타냅니다. 추가 연구는 높은 임계 값을 가진 알려진 반응을 조사하고 50 μs 시간 창 및 RRKM 모델링을 사용하여 정확한 임계 에너지가 얻어 졌는지 확인하여이를 조사 할 수 있습니다.

진동 주파수에 대한 스케일링 팩터. PM6(1.062) 진동 주파수에 대한 NIST가 권장하는 스케일링 팩터가 사용되었습니다. 이들은 [A+Zn(II)+NTA]-, [A+Ni(II)+NTA]-, 및 [H+Zn(II)+NTA]- 데이터를 피팅하는 데 만족하였다. 더 높은 에너지 채널이 더 낮은 에너지 채널보다 엔트로피컬하게 선호되는 일부 경우들에서, 두 번째 채널의 주파수들을 추가로 스케일링하는 것이 필요할 수 있다. 한 가지 접근법은 주파수를 900cm-1 이하로 스케일링하여 주파수를 느슨하게하고 TS를보다 엔트로피컬하게 선호하는 것입니다.

매개 변수 최적화. Yes 옵션을 사용하여 현재 값에 매개 변수를 보유하면 데이터를 성공적으로 맞추는 데 도움이 될 수 있습니다. 첫 번째 적합의 경우 E 0(2)이 유지되고 모델 TCID는 CONST, E0(1) 및 N 변수를 최적화하여 데이터에 적합하게 됩니다. 적합도가 양호하면 파라미터 옵션과 현재 값의 매개변수 보유를 사용하여 CONST, E 0(1) 및 N을 보유하는 동시에 E0(2)이 데이터에 최적화되도록 할 수 있습니다. 마지막으로, E 0(2)이 최적화되면 파라미터 옵션에서 네 개의 파라미터 CONST, E0(1), E0(2) 및 N이 모두 데이터에 최적화되도록 허용되어야 합니다.

선택된 TCID 모델을 실험 데이터에 맞추기 위한 에너지 범위. 실험 데이터에 적합하도록 사용되는 에너지 범위는 임계 영역에서 양호한 적합도를 유지하면서 가능한 한 많은 실험 강도 데이터를 재현해야 합니다. TCID 모델을 실험 데이터의 임계 값에서 작은 에너지 범위에 맞추는 것으로 시작할 수 있습니다. 상승 강도 임계 거동 직전에 배경 강도를 나타내는 시작 에너지를 선택할 수 있습니다. TCID 핏이 실험 데이터 범위에 최적화되면 범위를 0.1eV만큼 늘리고 피팅을 다시 최적화해야 합니다. 이 절차는 임계 영역의 적합도를 유지하면서 가능한 한 많은 데이터 범위에 맞게 반복되어야 합니다.

열화학 분석. T 옵션에서 델타 H 및 S의 열화학적 결과는 TCID 모델 적합도의 표준 편차를 추정하기 위해 데이터에 맞는 일련의 다른 에너지 범위와 비교되어야 합니다. 비교하기에 적합한 것은 초기 상승 임계 강도에 잘 맞는 더 작은 범위를 포함해야하며 더 높은 에너지를 포함하는 더 큰 범위를 가진 범위를 포함해야합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 자료는 1764436, NSF REU 프로그램 (CHE-1659852), NSF 계측기 지원 (MRI-0821247), 성공을위한 물리학 및 천문학 장학금 (PASS) NSF 프로젝트 (1643567), 웰치 재단 (T-0014) 및 에너지부 (TX-W-20090427-0004-50) 및 L3 통신의 컴퓨팅 자원에 따라 국립 과학 재단이 지원하는 작업을 기반으로합니다. 저자들은 CRUNCH 프로그램을 공유하고 PBA의 피팅에 대한 조언을 해준 Kent M. Ervin (University of Nevada - Reno)과 Peter B. Armentrout (University of Utah)에게 감사드립니다. 저자들은 시그마 프로그램을 공유해 준 캘리포니아 대학교 산타바바라의 마이클 T. 보워(Michael T. Bower) 그룹에게 감사를 표한다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
Alternative metal binding (amb) peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Ammonium acetate (ultrapure) VWR 97061-014
Ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Gaussian 09 Gaussian Electronic Structure Modeling Software
GaussView Gaussian Graphical Interface to Visualize Computations
Glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Ion-scaled Lennard-Jones (LJ) method Sigma Michael T. Bowers’ group of University of California at Santa Barbara
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
Microcentrifuge Tubes VWR 87003-294 1.7 mL, polypropylene
Microcentrifuge Tubes VWR 87003-298 2.0 mL, polypropylene
Ni(II) nitrate hexahydrate (99% purity) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A15540
Poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com)  quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
Zn(II) nitrate hexahydrate (99%+ purity) Alfa Aesar (www.alfa.com) 12313

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References

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화학 문제 184
이온 이동성-질량 분광법을 이용한 Ni(II) 및 Zn(II) 삼항 복합체의 열화학적 연구
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Corrales, A. J., Arredondo, A. V., Flores, A. A., Duvak, C. L., Mitchell, C. L., Spezia, R., Angel, L. A. Thermochemical Studies of Ni(II) and Zn(II) Ternary Complexes Using Ion Mobility-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (184), e63722, doi:10.3791/63722 (2022).

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