Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Termokemiska studier av Ni(II) och Zn(II) ternära komplex med jonmobilitet-masspektrometri

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63722
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry, Texas A&M University-Commerce, 2Laboratoire de Chimie Théorique, Sorbonne Université

Summary

Denna artikel beskriver ett experimentellt protokoll som använder elektrospray-jonmobilitet-masspektrometri, semi-empiriska kvantberäkningar och energiupplöst tröskelkollisionsinducerad dissociation för att mäta den relativa termokemin för dissociationen av relaterade ternära metallkomplex.

Abstract

Denna artikel beskriver ett experimentellt protokoll med elektrospray-jonmobilitet-masspektrometri (ES-IM-MS) och energiupplöst tröskelkollisionsinducerad dissociation (TCID) för att mäta termokemin för dissociationen av negativt laddad [amb + M (II) + NTA] - ternära komplex i två produktkanaler: [amb + M (II)] + NTA eller [NTA + M (II)] -  + amb, där M = Zn eller Ni och NTA är nitrilotriättiksyra. Komplexen innehåller en av de alternativa metallbindande (amb) heptapeptiderna med de primära strukturerna acetyl-His 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7 eller acetyl-Asp 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7, där aminosyrornas Aa1,2,6,7 positioner är de potentiella metallbindningsställena. Geometrioptimerade stationära tillstånd för de ternära komplexen och deras produkter valdes från kvantkemiska beräkningar (för närvarande PM6 semi-empirisk Hamiltonian) genom att jämföra deras elektroniska energier och deras kollisionstvärsnitt (CCS) med de som mättes av ES-IM-MS. Från PM6-frekvensberäkningarna modellerar de molekylära parametrarna för det ternära komplexet och dess produkter de energiberoende intensiteterna hos de två produktkanalerna med hjälp av en konkurrenskraftig TCID-metod för att bestämma tröskelenergierna för reaktionerna som relaterar till 0 K-entalpierna av dissociation (ΔH0). Statistisk mekanik termiska och entropikorrigeringar med hjälp av PM6 rotations- och vibrationsfrekvenser ger 298 K entalpier av dissociation (ΔH298). Dessa metoder beskriver en EI-IM-MS-rutin som kan bestämma termokemi och jämviktskonstanter för en rad ternära metalljonkomplex.

Introduction

Denna studie beskriver en ny teknik med hjälp av en kommersiellt tillgänglig jonmobilitetsmasspektrometer som möjliggör bestämning av den relativa termokemin för dissociation av ett alternativt metallbindande (amb) ternära metallkomplex [amb + M (II) + NTA], där M = Zn eller Ni och NTA = nitrilotriättiksyra (Figur 1). Dessa reaktioner modellerar dissociationen av det amb-taggade rekombinanta proteinet fäst vid den NTA-immobiliserade metallen under immobiliserad metallaffinitetskromatografi (IMAC)1,2. Som ett exempel beskrivs denna metod med hjälp av amb heptapeptidtaggarna amb A och H (figur 2) (vald från tidigare studier 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ) som uppvisar Zn(II) och Ni(II)-bindande egenskaper och därmed har potentiella tillämpningar som reningstaggar. Den beskrivna processen kan emellertid användas för att utvärdera termokemiska energier i vilket organometalliskt system som helst. Dessa amb-peptider har metallbindningsställen i positionerna Aa1-Aa 2 och Aa6-Aa 7 som konkurrerar med NTA: s karboxylat- och aminställen. De tre centrala amb-aminosyrorna ger en distans (Gly3), gångjärnet för de två armarna (Pro4) och en långdistansinteraktion mellan π och metall katjon (Tyr5).

Det totala 1− laddningstillståndet för [amb + M (II) + NTA] - -komplexen bestäms av protoneringstillståndet för deras potentiella bindningsställen. Eftersom det finns Ni(II) eller Zn(II) med oxidationstillståndet 2+ måste det finnas ett nät av tre deprotonerade negativt laddade platser. Den molekylära modelleringen av [amb + M (II) + NTA] - komplexen förutsäger att dessa är två protoner från NTA och en proton från amb (dvs [amb-H + M (II) + NTA-2H]-). Produktkanalerna innehåller en jonart och en neutral art (dvs. [NTA-3H+M(II)]- + amb eller [amb-3H+M(II)]- + NTA). I manuskriptet utesluts "-3H" i komplexens namn, men läsaren bör veta att -3H är underförstått. Instrumentet mäter de relativa intensiteterna hos de två joniska mass-till-laddning-arterna (m/z). En viktig egenskap hos ES-IM-MS-analyser är att den möjliggör undersökning av reaktiviteten hos en specifik m/z-art, som används här och i tidigare amb-studier 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

Att förvärva termokemiska data för stora komplex med hjälp av kollisionsinducerad dissociation är ett ämne av betydande intresse13,14. Metoder inklusive den kinetiska metoden bidrar inte till att anpassa data över en rad energier, och de tar inte heller hänsyn till miljöer med flera kollisioner15,16,17,18. Här tillämpas tröskel-CID (TCID) -metoden, utvecklad med hjälp av styrd jonstråle tandemmasspektrometri av Armentrout, Ervin och Rodgers19 på en ny ES-IM-MS-instrumentplattform som använder resevågsjonguider. TCID-metoden möjliggör relativ termokemisk analys av dissociationen av de ternära komplexen i deras två produktkanaler och inkluderar en tröskellag som beskriver överföringen av kollisionsenergi mellan reaktantens translationella energi (ternära komplex i denna forskning) och en inert målgas (argon i detta fall). Metoden inkluderar integration över reaktantens interna energifördelning 20, de translationella energifördelningarna mellan reaktanten och målgasen21 och de totala rörelsemängdsmomentfördelningarna22,23. En dissociationssannolikhet och statistisk Rice-Ramsperger-Kassel-Marcus (RRKM) korrigering av de kinetiska skiften till följd av det begränsade tidsfönstret för observation av produkterna ingår24. För två oberoende produktkanaler möjliggör den konkurrenskraftiga TCID-metoden samtidig anpassning av de två konkurrerande produktkanalerna. Dissociation av komplexet sker genom ett kretsande övergångstillstånd, som har produkternas egenskaper men hålls samman av en låst dipol25. TCID-metoden ingår i CRUNCH-programmet26, och användargränssnittets funktion beskrivs här för att utvärdera termokemin för de två dissociationskanalerna i de ternära [amb + M (II) + NTA] - komplexen. CRUNCH-programmet är tillgängligt på begäran från utvecklarna26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Figur 1 visar en översikt över protokollet.

1. Beredning av reagenser

  1. Köp frystorkade amb-peptider (>98% renhet) och förvara dem i en −80 °C frys.
  2. Köp >99% renhet zink (II) nitrathexahydrat och nickel (II) nitrathexahydrat.
    VARNING: Nickel(II)nitrathexahydrat utgör en miljö- och hälsorisk.
  3. Köp nitrilotriättiksyra, poly-DL-alaninpolymerer, ultraren / spår metallkvalitet ammoniumacetat, ammoniumhydroxid, isättika och HPLC-kvalitet acetonitril.

2. Beredning av stamlösningar

  1. Peptid amb stamlösning
    1. Bered en vattenlösning med 12,5 mM amb-koncentration genom att väga 10-20 mg av den frystorkade peptiden med inte mindre än tre signifikanta siffror och placera den i ett 1,7 ml polypropenmikrocentrifugrör.
    2. Tillsätt lämplig volym avjoniserat vatten (>17,8 MΩ cm) till mikrocentrifugröret. Stäng locket och blanda väl med minst 20 inversioner.
    3. Skapa alikvoter på 50 μl från 12,5 mM amb-lösningen och placera dem i märkta 1,7 ml mikrocentrifugrör. Förvara alikvoten i lagerlösningar vid −80 °C.
  2. Metalljonlagerlösningar
    1. Bered de vattenhaltiga Zn(II)- och Ni(II)-lösningarna med en koncentration på 12,5 mM genom att väga 10–30 mg av metallnitrathexahydratet med minst tre signifikanta siffror och placera det i ett 1,7 ml mikrocentrifugrör av polypropen.
    2. Tillsätt lämplig mängd DI-vatten till mikrocentrifugröret. Stäng locket och blanda väl med minst 20 inversioner. Förvara 50 μL alikvot stamlösningar vid −80 °C.
  3. NTA-jonlagerlösningar
    1. Förbered en vattenhaltig NTA-lösning genom att väga 10-30 mg av NTA med inte mindre än tre signifikanta siffror och placera den i ett 1,7 ml mikrocentrifugrör.
    2. Tillsätt lämplig mängd DI-vatten till NTA i mikrocentrifugröret för att uppnå en slutlig koncentration på 12,5 mM. Stäng locket och blanda väl med minst 20 inversioner. Förvara 50 μL alikvot stamlösningar vid −80 °C.
  4. Stamlösningar av ammoniumacetat: Väg 30,8 mg ammoniumacetat och tillsätt till 40 ml DI-vatten för att ge en 10 mM lösning. Justera ammoniumacetatlösningens pH till pH 7,7 med 1 mM ammoniumhydroxid.
  5. Poly-DL-alanin stamlösning: Gör en 1 ml, 1,000 ppm poly-DL-alanin (PA) stamlösning genom att lösa 1,0 mg PA i DI-vatten. Blanda omfattande. Skapa 50 μl alikvoter och lägg dem i individuellt märkta mikrocentrifugrör. Förvara lösningen på 1 000 ppm vid −80 °C.

3. Analys av elektrosprayjonmobilitet-masspektrometri (ES-IM-MS) kollisionsinducerad dissociation (CID)

  1. Bered instrumentet genom att rengöra ES-inloppsslangen och metallkapillären genom att injicera 500 μl 0,1 M isättika, följt av 500 μl 0,1 M ammoniumhydroxid och slutligen 500 μl pH 7,7 ammoniumacetatlösning.
  2. Kondensera 12,5 mM amb stamlösning genom att föra den till rumstemperatur. Skapa en slutlig koncentration på 0,125 mM amb genom att göra två på varandra följande utspädningar med DI-vatten. Blanda fullständigt efter varje utspädning.
  3. Kondensera 12,5 mM metalljonstamlösning genom att föra den till rumstemperatur. Skapa en slutlig koncentration på 0,125 mM metalljon genom att göra två på varandra följande utspädningar med DI-vatten. Blanda fullständigt efter varje utspädning.
  4. Kondensera 12,5 mM NTA-stamlösningen. Skapa en slutlig koncentration på 0,125 mM NTA genom att göra två på varandra följande utspädningar med DI-vatten. Blanda fullständigt efter varje utspädning.
  5. För att göra ett 2 ml prov av det ternära komplexet, tillsätt 800 μL 0,125 mM NTA-lösning och 400 μL 0,125 metalljonlösning till ett 2 ml mikrocentrifugrör och blanda noggrant med minst 20 inversioner. Tillsätt 400 μl ammoniumacetatlösning (pH 7,7) och 400 μl 0,125 mM amb-lösning, blanda noggrant med minst 20 inversioner och låt provet balansera i 10 minuter vid rumstemperatur.
  6. Ladda provet på 2 ml i en trubbig nässpruta på 2,5 ml och injicera provet i instrumentets ES med hjälp av instrumentets sprutpump med ett flöde av 10 μl/min.
  7. Placera instrumentet i negativt IM-MS-läge. Använd de typiska driftsförhållandena för instrumentet27 för dessa experiment enligt följande.
    1. Injicera provet med en flödeshastighet på 10 μl/min i ES-kapillären som hålls vid −2 kV med ett 500 l/h utlösningsflöde av kväve. Ställ in ES-källan och upplösningstemperaturerna på 130 °C respektive 263 °C. Ställ in provtagnings- och extraktionskonerna på 25 V respektive 3 V.
    2. För CID-experimenten, använd quadrupole massanalysator för att välja isotopmönstret för [amb + M (II) + NTA] - ternära komplex med m / z för den monoisotopiska toppen med upplösningsinställningar på låg massa = 4,5 och hög massa = 16,5.
      OBS: [amb + M (II) + NTA] - jonerna skickas till de sekventiella tre resande våg (T-wave ) jonguiderna.
    3. Se till att fällans T-våg har ett argongasflöde på 3 ml/min och ett tryck på 2,83 x 10-2 mbar. Ställ in kollisionsenergin (CE) på fällan vid 5 V för att undvika dissociation av det ternära komplexet. Låt fällan samla de ternära komplexa jonerna innan de släpper ut (200 μs frigöringstid) dem i jonmobilitetsjonstyrningen (IM) med hjälp av en fälla DC-bias på 14 V, vilket håller dissociationen av komplexet vid IM-ingången till ett minimum.
    4. Se till att IM-jonstyrningen har ett tryck på 0,507 mbar med en flödeshastighet på 20 ml/min av ultraren N2-buffertgas . Rampa T-vågorna i IM med höjderna 7 V till 30 V och med hastigheter på 290 m/s till 801 m/s för varje start- och slutsvep av IM-jonstyrningen.
    5. Ställ in argonflödet och trycket på överförings-T-vågen på samma sätt som fällans T-våg. Överförings-T-vågen användes för kollisionsinducerad dissociation av det ternära [amb + M (II) + NTA] - komplexet med hjälp av överföringen CE.
  8. Välj m/z isotopmönster för det negativt laddade [amb+M(II)+NTA]-komplexet med hjälp av transmissionskvadrupolen i upplösningsläge.
    1. Identifiera m/z isotopmönstret genom att öppna masspektrometriprogrammet och välja Spektrum. Välj Verktyg > Isotopmodell. I popup-fönstret listar du komplexets molekylformel, markerar rutan för Visa laddad jon, anger 1 för laddning av negativ och klickar på OK.
    2. I komplexets visade isotopmönster noterar du den lägsta masstoppen. I instrumentprogramvaran väljer du Konfigurera > Quad Profile. I fönstret som öppnas väljer du Manuell fast och anger massan av den lägsta isotopmönstertoppen. Klicka på Uppdatera och sedan på Stäng.
    3. Välj Konfigurera igen och klicka sedan på Lösa quad. Samla in den negativa jonen ES-IM-MS-spektra stegvis över en rad överföringskollisionsenergier med en 5 minuters körtid och 2 s skanningstid.
      OBS: Preliminära överföringsenergier kan testas från 26-60 V i intervaller om 2 V. Det slutliga intervallet av överföringskollisionsenergier som undersöks bör inte visa någon dissociation av det ternära komplexet vid den lägsta energin och fullständig dissociation i produkterna vid den högsta energin. För högkvalitativ statistisk analys bör denna ES-IM-MS-analys utföras för varje amb ternärt komplex minst 3x av olika personer och på olika dagar för att bestämma medel och standardavvikelser.

4. ANALYS AV ES-IM-MS-kollisionstvärsnitt (CCS)

  1. Rengör ES-inloppsslangen och metallkapillären med 500 μl 0,1 M isättika, följt av 500 μl 0,1 M ammoniumhydroxid och slutligen 500 μl pH 7,7 ammoniumacetatlösning.
  2. Kondensera 1 000 ppm PA-stamlösningen till rumstemperatur och gör två seriella utspädningar; späd till 100 ppm PA med DI-vatten och späd sedan till 10 ppm PA-lösning genom att späda med ett förhållande 1:1 mellan DI-vatten och acetonitril av HPLC-kvalitet.
  3. Samla in IM-MS-spektra med negativ jon för PA-provet på 10 ppm i 10 minuter med hjälp av instrumentella driftsförhållanden.
    OBS: Injektionsflödeshastigheten och ES-källförhållandena var desamma som för CID-experimenten (steg 3.). För mätningar av CCS var quadrupole massanalysatorn i icke-upplösningsläge och skickade alla joner till de sekventiella tre T-vågjonstyrningarna. Funktionen av fällans T-våg- och IM T-vågjonstyrningar var densamma som för CID-experimenten. Kollisionsenergin hos överförings-T-vågcellen var vid 4 V för att tillåta joner att passera utan dissociation.
  4. Förbered vart och ett av de ternära komplexen enligt beskrivningen i steg 3.2.-3.6.
  5. Samla IM-MS-spektra för varje ternärt komplex i 5 minuter.
    OBS: Använd samma instrumentella villkor som i steg 4.3.
  6. Samla in IM-MS-spektra med negativ jon i PA-provet på 10 ppm i 10 minuter.
    OBS: Medelvärdet av ankomsttiderna för de PA-kalibranter som samlats in före och efter amb-ternära komplex används vid CCS-bestämningen.

5. Analys av uppgifter från ES-IM-MS CID

  1. Identifiera arten genom att matcha de teoretiska m/ z-isotopmönstren för det ternära komplexet och dess produkter med de experimentella IM-MS-spektra.
    1. Öppna masspektrometriprogrammet och välj Kromatogram för att öppna ett nytt fönster.
    2. I kromatogramfönstret klickar du på Arkiv > Öppna för att hitta och öppna önskad IM-MS-datafil.
    3. Högerklicka med musen, dra över kromatogrammet och släpp. MS-spektrumet visas i ett separat spektrumfönster .
    4. I det nya fönstret som visar spektra väljer du Verktyg > isotopmodell. Ett litet fönster dyker upp. Ange molekylformeln för amb-arten, markera rutan Visa laddad jon och ange önskat laddningstillstånd. Klicka på OK.
    5. För att särskilja alla arter i IM-MS-spektrumet, upprepa denna process i spektrumfönstret och registrera deras m / z-isotopintervall .
  2. För det ternära amb-komplexet och dess produkter, använd deras m / z-isotopintervall för att identifiera dem och extrahera deras ankomsttidsfördelningar (ATD).
    1. Öppna programvaran för separation av jonmobilitet och välj Arkiv > Öppna för att hitta och öppna datafilen.
    2. Vänsterklicka och dra med musen för att zooma in på m/z-isotopområdet för det ternära komplexet [amb+M(II)+NTA]-.
    3. Använd markeringsverktyget och vänsterklicka och dra för att välja det specifika isotopområdet för [amb + M (II) + NTA] - som identifieras i steg 5.1. Klicka på knappen Acceptera aktuellt val .
    4. För att eliminera eventuella tillfälliga m/z-arter eller bakgrundssignaler, använd markeringsverktyget för att välja den ATD som är associerad med det ternära komplexet. Klicka på knappen Acceptera aktuellt val .
    5. För att exportera ATD-filen till masspektrometriprogramvaran, gå till File > Export och klicka sedan på Behåll drifttid. Byt namn på filen om så önskas och spara filen i lämplig mapp.
  3. Genom integrering av området under den extraherade ATD-kurvan bestäms artens relativa intensitet.
    1. I fönstret Chromatogram öppnar du den sparade exporterade filen från programvaran för jonmobilitetsseparation. Välj Process och sedan Integrera. Använd en topp-till-topp-amplitudinställning på 20 och klicka på OK.
    2. Spela in det integrerade området som visas i kromatogramfönstret. Upprepa steg 5.2.2.-5.2.5. för de två produkterna, nämligen [NTA+M(II)]- och [amb+M(II)]-.
    3. Upprepa steg 5.2.1–5.3.2. för varje registrerad överföringskollisionsenergi.
  4. Använd de integrerade ATD-områdena för det ternära komplexet [amb + M (II) + NTA] - och två produkter [NTA + M (II) ] - och [amb + M (II) ] - vid varje överföringskollisionsenergipunkt för att normalisera till en relativ procentuell skala.
    1. Skapa ett kalkylblad genom att ange identiteterna för det ternära komplexet och dess produkter och deras integrerade ATD vid varje kollisionsenergi.
    2. För varje kollisionsenergi, använd summeringen av de integrerade ATD: erna för [amb + M (II) + NTA] -, [NTA + M (II)] - och [amb + M (II) - för att normalisera deras individuella ATD: er till en relativ procentuell skala.
    3. Från TCID-replikerade mätningar hittar du medelvärdet och standardavvikelserna för varje datapunkt. Konvertera lab-frame transfer kollisionsenergi (E lab) till centrum av massa kollisionsenergi (E cm) med hjälp av de genomsnittliga massorna av argon (m Ar) kollisionsgas och det ternära komplexet (m komplex): E cm = Elab (m Ar) / (m Ar + mkomplex).
      OBS: Ecm representerar den maximala energin från kollisionen med argongasen, som är tillgänglig för dissociation av det ternära komplexet.
    4. Plotta medelvärdet och standardavvikelsen för de individuella procentuella intensiteterna för [amb + M (II) + NTA] -, [NTA + M (II) - och [amb + M (II)] - i ett diagram över relativ intensitet (%) kontra centrum för masskollisionsenergi (eV) för att visa hur artens relativa intensiteter förändras som en funktion av kollisionsenergi.

6. Analys av de genomsnittliga ankomsttiderna för bestämning av kollisionstvärsnitt (CCS)

  1. Öppna programvaran för jonmobilitetsseparation och filen som innehåller IM-MS-spektrumet för 10 ppm PA-provet som samlats in med överföringskollisionsenergin inställd på 4 V. Extrahera ATD för var och en av de enda negativt laddade PA-arterna och exportera filerna till masspektrometriprogramvaran med alternativet Behåll drifttid (se steg 5.2.5.). Upprepa för den andra PA-calibrants-filen.
  2. Öppna programvaran för separation av jonmobilitet. Använd File > Open för att öppna en av filerna som innehåller IM-MS-spektra för amb-ternära komplex som registrerats mellan PA-kalibranterna. Extrahera ATD för vart och ett av de ternära komplexen och exportera deras filer till masspektrometriprogramvaran med alternativet Behåll drifttid (se steg 5.2.5.).
  3. Använd en tvärsnittskalibreringsmetod28 för att beräkna CCS för det ternära komplexet och dess produkter.
    1. Beräkna i ett kalkylblad den korrigerade CCS-koden (Ω c) för var och en av de enskilda negativt laddade PA-arterna från deras CCS (Ω)29,30 mätt i heliumbuffertgas31 med hjälp av ekvation 1, där z = laddning av det ternära komplexet, ec = 1,602 x 10−19 C; m N2 = massa kväve (u) och mjon = massa av ternära komplex28.
       Equation 1(1)
    2. Hitta drifttiderna (tD) för PA-kalibrerna och de ternära komplexen genom att först erhålla de genomsnittliga ankomsttiderna (tA) från maxima för motsvarande ATD-kurvor och sedan tillämpa ekvation 2, där c = detektorfördröjningskoefficient (1,41 ms; kontrollera instrument eftersom detta kan variera mellan instrument) och m / z = mass-till-laddningsförhållande för PA-kalibrat- eller amb-ternära komplexet.
      tD =tA Equation 2 (2)
    3. Skapa en graf genom att plotta PA-kalibranternas tD jämfört med Ωc. Använd sedan ekvation 3 för att anpassa data med en minsta kvadratregression för att hitta konstanterna A 'och B, där A ' korrigerar för det elektriska fältet, temperaturen och trycket i instrumentet och B korrigerar för det olinjära beteendet hos T-wave IM-enheten.
      Ωc = A' tDB (3)
    4. Med hjälp av A' - och B-konstanterna och tD-värdet för amb-ternära komplex beräknar du deras Ωc med hjälp av ekvation 3 och deras Ω med ekvation 1. De CCS-värden som uppskattas med denna metod har absoluta fel på cirka 2%29.

7. Beräkningsmetoder

  1. Använda den semi-empiriska PM632-metoden implementerad i strukturell modellerings- och beräkningsprogramvara33 för att lokalisera geometrioptimerade konformare av [amb + M (II) + NTA] - ternära komplex och jon- och neutrala produktpar: [amb + M (II)] - + NTA och [NTA + M (II)] - + amb observerad från CID-experimenten. Se användningen av beräkningsvisualiseraren i tilläggsfilen för information om hur du utvecklar och skickar beräkningar.
    OBS: För de nuvarande systemen reproducerade PM6-metoden korrekt experimentella data, men i allmänhet kan alla kvantkemiska metoder som är tillförlitliga och beräkningsmässigt genomförbara användas.
  2. Kör geometrioptimeringar och frekvensberäkningar på flera olika startstrukturer för att utforska olika konformationer, protoneringstillstånd och potentiella bindningsställen. Spela in de elektroniska + nollpunktsenergierna för var och en av de placerade stationära punkterna för vart och ett av de ternära komplexen och deras produkter.
    OBS: Startstrukturerna för geometrioptimeringarna bör undersöka olika möjliga kombinationer av bindningsställen och konformationsarrangemang. Startstrukturerna baserades på tidigare lokaliserade B3LYP34 [amb + M (II)] - konformatorer 3,4,6. För [amb+M(II)+NTA]-var NTA positionerat för att konkurrera med de substituenta platserna för amb vid Aa1-Aa 2-Aa 6-Aa 7 och karboxylatänden för singletspinntillståndet för Zn(II) eller triplettspinntillståndet för Ni(II).
  3. Använd ett program som kan utföra exakta kollisionstvärsnittsmätningar mätt i heliumbuffertgas (CCSHe) med hjälp av atomkoordinaterna från dessa kvantkemiska beräkningar35.
    OBS: Program som utvecklats för att beräkna exakt CCSHe från peptidstrukturer belägna genom kvantkemiska beräkningar inkluderar MobCal 36 och HPCCS37,38.
  4. Välj den lägsta energikonformatorn som uppvisar Lennard-Jones CCS He som håller med IM-MS-uppmätt CCSHe för att välja strukturerna för ternära komplex och dissociationsprodukter som ska inkluderas i CRUNCH-modelleringen nedan.

8. CRUNCH-modellering

  1. Skapa en textfil i det format som beskrivs i diskussionsavsnittet ("CRUNCH-format för inmatningstext").
    OBS: Filen innehåller följande kolumner: (−1) kollisionsenergi i masscentrum (Ecm), (1) medelvärdet av den relativa intensiteten hos [amb+M(II)]- produkten, (2) standardavvikelsen för [amb + M (II)] - intensitet, (3) medelvärdet av den relativa intensiteten för [NTA + M (II)] - produkten och (4) standardavvikelsen för [NTA + M (II) - intensitet.
  2. Modellera Ecentimeter-beroende intensiteter hos de två reaktionskanalerna [amb+M(II)+NTA]-till [amb+M(II)]- + NTA och [amb+M(II)+NTA]- till [NTA+M(II)]- + amb med TCID-tekniken i CRUNCH-programmet.
    OBS: Använd PM6 vibrations- och rotationsfrekvenser för det ternära komplexet och de två jon- och neutrala produktkanalerna. Använd genomsnittliga massor av det ternära komplexet, argonkollisionsgas och jon- och neutrala produkter. Använd värden från PM6-beräkningarna eller NIST-databasen för polariserbarheterna (Å3) och dipolmoment (Debye) för de neutrala produkterna.
    1. Från CRUNCH-huvudmenyn öppnar du textfilen (. GB5) som innehåller produkternas Ecm-beroende relativa intensiteter. Svara Nej för att läsa parametrar.
    2. Från CRUNCH-huvudmenyn väljer du Modellering > Ställ in alla parametrar. Från reaktionsmodellalternativen väljer du standardalternativet Tröskel CID följt av RRKM med integration över energiöverföringsfördelningen för det ternära komplexet20, anger 2 för oberoende produktkanaler modellerade och väljer Beräkna tvärsnitt. Ange Nej till Gör några två produktkanaler samma jonmassa?
    3. För produktkanal # 1 anger du kolumn [1] för experimentella data för [amb + M (II) - produkten, kolumn [2] för standardavvikelserna för [amb + M (II) - produkten, kolumn [5] för det oinvecklade modelltvärsnittet och kolumn [6] för det invecklade modelltvärsnittet. Ange 0 för rester av passform.
      OBS: Dessa kolumnnummer motsvarar kolumnerna i inmatningsfilen i steg 8.1. enligt beskrivningen i diskussionen ("CRUNCH-filformat för inmatningstext").
    4. För produktkanal # 2 anger du kolumn [3] för experimentella data för [NTA+M(II)]- produkten, kolumn [4] för standardavvikelserna för [NTA+M(II)]- produkten, kolumn [7] för det oinvecklade modelltvärsnittet och kolumn [8] för det invecklade modelltvärsnittet. Ange 0 för rester av passform.
    5. För typen av oinvecklad modell, välj 0 K tvärsnitt (kinetisk förskjutning ingår), vilket inkluderar den statistiska RRKM-korrigeringen av de kinetiska skiften på grund av 50 μs tidsfönstret från kollisionscellen till TOF-detektorn18.
    6. För faltningsalternativen väljer du Tiernans dubbelintegral, som inkluderar faltningen över translationella energifördelningar mellan den ternära komplexa jonen och argonkollisionsgasen21.
    7. För den numeriska integrationsmetoden väljer du gaussisk kvadratur med försparade tvärsnitt, följt av antalet integrationspunkter = 32, antalet standardavvikelser = 3,0 och antalet standardavvikelser för den andra integralen = 3,0.
    8. Massan av ternär komplex jon (u) läses automatiskt från . GB5-textfil, följt av kollisionsgasens massa (39.948 för argon); använd standardvärdena 0,20 eV för jonstrålens FWHM och 298,15 K för gastemperatur. Programmet läser automatiskt in de minsta och maximala centrum-av-masskollisionsenergierna från . GB5 textfil; Använd standardvärdet för minsta energiökning.
    9. Använd standardvärdet för skalningsfaktorn Sig0, Nej för tillåt skalning av enskilda produktkanaler och standardvärdena för N och M. För metoden för g(i)-beräkningen väljer du integrera framför ro-vibrationstäthet av tillstånd, vilket inkluderar den interna energifördelningen20 av det ternära komplexet [amb+M(II)+NTA]-.
    10. Från alternativen för att ange molekylära parametrar anger du G för att läsa den strukturella modelleringsfilen33 med PM6-vibrations- och rotationsfrekvenserna i det ternära komplexet. Svar Ja på frågan är en av reaktanterna atomisk? Skriv platsen och namnet på modelleringsfilen.
      OBS: De andra alternativen för att ange vibrations- och rotationsfrekvenserna inkluderar läsparameterfil, som kommer att läsa in parametrarna från en textfil, eller redigera / ange konstanter, vilket möjliggör manuell inmatning av varje parameter.
    11. Skala frekvenserna med hjälp av den NIST-rekommenderade PM6-skalningsfaktorn (1,062). Mer information om skalning finns i diskussionen ("skalningsfaktorer för vibrationsfrekvenserna"). Antalet atomer i det ternära komplexet läses från filen. Svar Nej till är molekylen linjär? Ange beskrivningen av reaktanterna (t.ex. H+Zn+NTA- + Ar).
    12. Ange 1 för laddningen på jon och 1.664 för polariserbarheten hos argongasen39. Massan av jon och målmassa är för det ternära komplexet respektive argon och läses automatiskt från . GB5 textfil. Ange 0 för harmoniska vibrationer.
      OBS: Följande alternativ är för att välja olika skalningsfaktorer för höga eller låga vibrationsfrekvenser. Ange 1.062 för höga frekvenser och 0.0 för låga frekvenser (se diskussion: skalningsfaktorer för vibrationsfrekvenserna). De skalade frekvenserna visas. Välj 0 för att välja Ingen ändring.
    13. Tryck på Enter för att läsa 1-D- och 2-D-rotationskonstanterna från den strukturella modelleringsfilen33 som anges i steg 8.2.10. Välj standardvärdena 0 för de hindrade rotorbehandlingarna och 1 för molekylsymmetri.
      OBS: Programmet visar inmatade data; tryck Enter för inga ändringar.
    14. Välj standard 300 K för reaktanttemperatur. Välj Integrering som metod för minskning av densiteten för tillståndsmatris. Välj Ja för att trunkera energifördelningen. Ange 40000 cm−1 för maximal energi för distribution, 2,0 cm−1 för fackstorlek och 32 för antal punkter i energifördelningen.
      OBS: Tryck på Enter 2x och kontrollera att den trunkerade 32-pt-matrisen har en befolkning >0.9. Om >0,9 anger du Nej för att ändra fack eller kondensationsfaktor. Om <0,9 anger du Ja och ändrar maximal energi för distribution och/eller lagerplatsstorlek.
    15. För parametrar för TCID/RRKM-modell väljer du Ja för Ändra, anger 0 för fast tid och 0,000050 s för den övre gränsen för identifieringsfönstret. För det använda instrumentet är detta den tid det tar för joner att resa från överföringskollisionscellen till TOF-detektorn och beräknas med hjälp av ekvation 2.
    16. För energisk molekyl anger du C för att kopiera värden från de reaktanter som redan har angetts. Ange −1 för källövergångstillstånd (TS), 0 för mål TS och P för att fortsätta.
    17. För produktkanal 1 väljer du 1 för enstaka övergångstillstånd från dissociationskanalalternativen och 0 för ingen för sekventiell dissociation. För övergångstillståndstypen väljer du 1 för omloppsbana.
    18. Välj G för att läsa modelleringsprogramfilerna som innehåller PM6-rotations- och vibrationsparametrarna för [amb + M (II)] - + NTA-produkterna. Ange Nej för är en av PSL TS-arterna atomisk? Ange plats och namn för filen [amb + M (II)] - . Använd 1.062 för skalfrekvenser, tryck Enter för antalet atomer och ange Nej för är molekylen linjär?
    19. Ange plats och namn på modelleringsfilen som innehåller vibrations- och rotationsfrekvenserna för NTA-produkten. Använd 1.062 för skalfrekvenser, tryck Enter för antalet atomer och ange Nej för är molekylen linjär? Ange beskrivningen av den kretsande TS, t.ex. H + Zn-... NTA.
    20. Ange 1 för laddning av [amb + M (II) - ion och ange polariserbarheten (16.12 Å3) och dipolmomentet (4.6183 Debye) för NTA. Välj 0 K för rotationstemperatur och låst dipol för behandling av omloppsövergångstillståndet. Ange de genomsnittliga massorna (u) för [amb + M (II)] - jonen och NTA.
    21. Ange 0 för harmoniska vibrationer. Ange 1.062 för höga frekvenser och 0.0 för låga frekvenser. Se diskussionsavsnittet för mer information om skalningsfrekvenser; De skalade frekvenserna visas. Välj 0 för att välja Ingen ändring. Tryck på Enter för att läsa 1D- och 2-D-rotationskonstanterna från modelleringsfilerna. Välj 0 för hindrade rotorer, 1 för molekylsymmetri och 1 för reaktionsdegenerering. Ange alternativet Inga ändringar.
    22. För produktkanal 2 väljer du 1 för enstaka övergångstillstånd, 0 för ingen för sekventiell dissociation och 1 för omloppsbana för övergångstillståndstypen.
    23. Välj G för att läsa i modelleringsfiler som innehåller PM6-rotations- och vibrationsparametrarna för [NTA+M(II)]- och amb-produkterna. Ange Nej för är en av PSL TS-arterna atomisk? Skriv plats och namn på [NTA+M(II)]- modelleringsfilen.
    24. Använd 1.062 för skalfrekvenser, tryck Enter för att läsa antalet atomer och ange N för är molekylen linjär? Skriv plats och namn på amb-modelleringsfilen. Använd 1.062 för skalfrekvenser, tryck Enter för antalet atomer och ange N för är molekylen linjär?
    25. Ange beskrivningen av den kretsande TS (t.ex. NTA+Zn-... H). Ange 1.0 för laddning av [NTA + M (II)] - jon och ange polariserbarheten (Å3) och dipolmomentet (Debye) för amb. Välj 0,0 K för rotationstemperatur och låst dipol för behandling av det kretsande övergångstillståndet. Ange de genomsnittliga massorna (u) för [NTA+M(II)]- och amb-produkterna.
      OBS: Utdatafilen innehåller polariserbarheten och dipolmomenten i amb. Polariserbarheten är i enheter av Bohr 3 och måste omvandlas till enheterna i Å3.
    26. Ange 0 för harmoniska vibrationer. Ange 1.062 för höga frekvenser och 0 för låga frekvenser. Mer information om skalningsfrekvenser finns i diskussionen. De skalade frekvenserna visas. Välj 0 för att välja Ingen ändring. Tryck på Enter för att läsa 1D- och 2-D-rotationskonstanterna från modelleringsfilerna. Välj 0 för hindrade rotorer, 1 för molekylsymmetri och 1 för reaktionsdegenerering. Ange inga ändringar.
    27. Om du vill hantera inaktiva 2D-rotationer väljer du standardalternativen statistisk vinkelmomentfördelning och integrerar P(E,J) över J-fördelning. Använd standardvärdet 32 i antalet punkter i integreringen.
      OBS: Dessa val väljer metod för integration över det totala rörelsemängdsmomentet J nivåer16,17. Den resulterande utgången gör det möjligt för utredaren att kontrollera att all inmatning är korrekt.
    28. Välj aktiveringsenergierna i förhållande till alternativet för den strömförande molekylen och ange relativ energi (eV) för produktkanal 1 som ligger nära den tröskelenergi som observerats i diagrammet för den relativa intensiteten kontra masskollisionsenergin för [amb + M (II)] - produkten (figur 4).
    29. För produktkanal 2 anger du relativ energi (eV) som ligger nära den tröskelenergi som observerats i diagrammet över intensiteten kontra masscentrumkollisionsenergin för [NTA+M(II)]- produkten. Om du vill beräkna antalet tillstånd för varje produktkanal använder du en lagerplatsstorlek på 2,0. Tryck på Enter och sedan på Nej för att fortsätta.
    30. På menyn Modell väljer du Optimera parametrar för att passa data och anger minsta energi och maximal energi för att påbörja respektive avsluta datapassningen.
      OBS: Använd ett litet energiområde som inkluderar trösklarna för båda kanalerna. För mer information, se diskussion: energiintervall för att anpassa den valda TCID-modellen till experimentella data.
    31. Välj -1 för viktningslägen experimentella standardavvikelser. Baserat på data väljer du en minsta acceptabel std.-avvikelse på vanligtvis 0,01 till 0,001. Välj Nej för optimerad skalning av enskilda kanaler och 0 för antalet iterationer.
      OBS: Ett alternativ till att använda standardavvikelser är det statistiska alternativet.
    32. Använd standardvärdet för E0-konvergensgränsen och välj Nej för att hålla någon parameter vid det aktuella värdet. Ange 0,5 och 2,0 eV för de nedre och övre gränserna för att undvika optimeringsfel och välj central ändlig skillnad för derivatutvärderingsmetoden. Använd standardvärdet för numerisk precision och välj Nej för att ändra derivatstegstorlekar.
      En alternativ metod är att välja Ja för att hålla en parameter vid nuvarande värde. Denna metod beskrivs vidare i diskussionen: optimering av parametrar.
    33. På menyn Optimering väljer du påbörja optimering. CRUNCH-programmet optimerar den valda TCID-modellen till experimentella data.
      OBS: Om optimeringen inte hittar tillfredsställande passningar, från menyn Ändringar , försök ändra energiområdet för att täcka bara de första intensiteterna som stiger från trösklarna. När en rimlig passform är belägen, öka energiområdet och passa igen. Andra alternativ som kan hjälpa till att hitta anpassningar till data inkluderar att välja att hålla valfri parameter vid nuvarande värde i parametrar optimerade och ändra viktningsalternativ i vikter. Se diskussionen för dessa alternativ.
    34. När en modell som passar till data hittas trycker du på Retur tills menyn Modell visas. Om endast en del av energiområdet för experimentella data är utrustat med TCID-modellen, välj Beräkna och inveckla modell för att utöka modellens passform till alla experimentella kollisionsenergier.
    35. I menyn Modell väljer du Delta H och S vid T.
      OBS: Den oinvecklade CRUNCH-modellen relaterar 0 K-tröskelenergierna till 0 K-entalpierna (ΔH0) för dissociation av det ternära komplexet i de två oberoende produktkanalerna (tabell 2). 298 K-entalpierna (ΔH 298) och Gibbs fria energier (ΔG298) för dissociation härleds också med statistisk mekanik termiska och entropikorrigeringar med hjälp av reaktanten och produkterna PM6 rotations- och vibrationsfrekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den konkurrenskollisionsinducerade dissociationen av [amb + M (II) + NTA] - ternära komplex av A och H till [amb + M (II) - + NTA eller [NTA + M (II) - + amb, visas i figur 3. Amb visas som antingen A eller H och M = Zn eller Ni. [A+Zn(II)+NTA]- ternära komplex (figur 3A) uppvisar uppenbara trösklar på cirka 0,7 eV kollisionsenergi (CE) för att producera [A+Zn(II)]- och cirka 0,9 eV för att producera [NTA+Zn(II)]-. Dissociationen av [A+Ni(II)+NTA]- komplexet (figur 3B) uppvisar liknande tröskelvärden (~1,1 eV) för både [NTA+Ni(II)]- och [A+Ni(II)]- produkterna, med [NTA+Ni(II)]- ökar till 90% relativ intensitet, medan intensiteterna för [A+Ni(II)]- inte stiger över 18%. För [H+Zn(II)+NTA]- ternära komplexet (figur 3C) är huvudprodukten [H+Zn(II)]- stiger från en tröskel på cirka 0,6 eV till cirka 85% relativ intensitet, och vid energier över 1,0 eV stiger [NTA+Zn(II)]- till cirka 30%. Det finns också en kanal för vattenförlust från [H-H2O+Zn(II)]-. För [H+Ni(II)+NTA]- (Figur 3D) stiger [H+Ni(II)]- från ett tröskelvärde på cirka 0,9 eV till cirka 40% relativ intensitet, medan [NTA+Ni(II)]- stiger från ~1,0 eV till cirka 80%. Inkluderat på graferna är CE där det ternära komplexet är 50% dissocierat. Ni (II) ternära komplex kräver 0,31-0,37 eV högre CE än deras Zn (II) ternära komplexa motsvarigheter för att vara 50% dissocierade. Detta tyder på att Ni(II)-komplexen är mer stabila och kräver högre CE för att dissociera, vilket undersöks ytterligare med TCID-tekniken.

Figur 4 illustrerar den konkurrenskraftiga TCID-metoden, som möjliggör samtidig anpassning av de två konkurrerande produktkanalerna.

[amb+M(II)+NTA] → [amb+M(II)]- + NTA (1)

[amb+M(II)+NTA] → [NTA+M(II)]- + amb (2)

Den potentiella energiytan (PES) illustrerar det energiska ternära komplexet som dissocierar i de konkurrerande produktkanalerna och visar de PM6-geometrioptimerade arter som används för att modellera dissociationen av [ambH+Zn(II)+NTA]-. Inkluderat i PES är densiteten av tillstånd i det ternära komplexet och summan av tillstånd av produkterna. 0 K-tröskelenergierna, E 1 och E 2, motsvarar 0 K entalpiförändringen för reaktionerna 1 och 2.

Figur 5 visar strukturerna för de andra tre geometrioptimerade ternära komplexen som används i denna studie. Dessa arter valdes utifrån deras förutsagda elektroniska energier och nollpunktsenergier och deras överensstämmelse med de IM-MS-uppmätta kollisionstvärsnitten (CCSHe). Tabell 1 visar att det finns en överenskommelse mellan de ternära komplexen LJ CCS He och den experimentella IM-MS CCSHe eftersom de är överens inom sina ömsesidiga osäkerheter. Konformationerna av [amb + M (II)] och amb baserades på resultaten från vår tidigare DFT-modellering 3,4,5,6. De molekylära parametrarna för dessa PM6-konformatorer användes i TCID-modelleringen av de energiupplösta dissociationerna av de ternära komplexen, inklusive deras ro-vibrationsfrekvenser för beräkning av deras densitet och summan av tillstånd.

Figur 6 visar det invecklade CRUNCH TCID-tröskelvärdet som passar de energiupplösta produktintensiteterna. De invecklade passningarna inkluderar tillgängliga energi- och vinkelmomentfördelningar för [amb + M (II) + NTA] - + Ar-reaktanterna. De oinvecklade passningarna (visas inte) förutspådde 0 K-förändringen i entalpier (Δ H 0) för dissociationen av det ternära komplexet, och tabell 2 visar ΔH0 och ΔH298 (kJ / mol) för reaktionerna 1 och 2. För dissociationen av Zn(II)-ternära komplex uppvisar både A och H Δ H0 för reaktion 1, vilka är 31 kJ/mol och 15 kJ/mol lägre än Δ H0 för reaktion 2, vilket indikerar att både A och H har större Zn(II)-affinitet än NTA. Det [A+Ni(II)+NTA]- ternära komplexet uppvisar ΔH0 = 146 och 148 kJ/mol för reaktionerna 1 respektive 2, vilket indikerar att A och NTA har liknande affiniteter för Ni(II). Dissociationen av [H+Ni(II)+NTA]- visar dock att Δ H 0 för reaktion 1 är 36 kJ/mol lägre än för reaktion 2, vilket indikerar attH har en större Ni(II)-affinitet än NTA. Sammantaget uppvisar [amb + Ni (II) + NTA] - komplex högre dissociationsentalpies än deras [amb + Zn (II) + NTA] - motsvarigheter, med undantag för A som dissocierar till [NTA + Ni (II)]-. Tabell 3 visar Gibbs fria energier (ΔG298) för association och bildningskonstanterna (K) för de omvända reaktionerna:

[amb+M(II)] - + NTA → [amb+M(II)+NTA]- (3)

[NTA+M(II)] - + amb → [amb+M(II)+NTA]- (4)

Tabell 3 visar att bildandet av Ni(II)-ternära komplex är mer exergoniskt och uppvisar större bildningskonstanter K än Zn(II)-komplexen i samtliga fall. Reaktion 4 (dvs. amb-taggföreningen med NTA-metalljonkomplexet) är av särskilt intresse eftersom den representerar den amb-taggade rekombinanta proteinbindningen till den NTA-immobiliserade metalljonen inuti IMAC-kolonnen. Reaktion 4 för bildandet av [ambA+Ni(II)+NTA] uppvisar den mest spontana ΔG298 = 53,1 kJ/mol och den högsta bildningskonstanten, K = 2,01 x 109.

Figure 1
Figur 1: Översikt över ES-IM-MS TCID-metoden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: De primära strukturerna för amb A- och H-peptider. Färg markerar de potentiella metallbindningsställena. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Masscentrum, energiupplöst (eV) tröskel kollisionsinducerad dissociation av [amb + M (II) + NTA]-. Energiberoendet hos produktjonerna [amb + M (II)] - [NTA + M (II) - och [amb-H2O + Zn (II) ] - visas. Centrum-av-masskollisionsenergin, där det finns 50% dissociation av [amb + M (II) + NTA] - ternära komplexet, ingår i graferna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: Modellen för den energiupplösta TCID-metoden. Kollisionerna mellan [amb H+Zn(II)+NTA]- + argon resulterar i dissociation till [ambH+Zn(II)]- + NTA eller [NTA+Zn(II)]- + ambH-produkter. Tröskelenergierna E1 och E2 motsvarar 0 K entalpier av dissociation (Δ H 0) för reaktionerna [amb H+Zn(II)+NTA]- → [amb H+Zn(II)]- + NTA eller [amb H+Zn(II)+NTA]- → [NTA+Zn(II)]- + ambH, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: PM6-geometrioptimerade ternära [amb + M (II) + NTA] - komplex av A och H. Konformare som används i TCID-modellering av experimentella data. Dessa konformatorer valdes från andra kandidatstrukturer genom att jämföra deras PM6 elektroniska energier och hur deras LJ-kollisionstvärsnitt (CCS He) jämfört med IM-MS mätte CCSHe. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Den energiupplösta, kollisionsinducerade dissociationen av [amb + M (II) + NTA]. För arterna A och H visas produktjonerna [amb+M(II)]- och [NTA+M(II)]- med de invecklade CRUNCH-tröskelpassningarna. De energivärden (eV) som visas är entalpierna för dissociation vid 0 K för reaktionerna [amb + M (II) + NTA] - → [amb + M (II)] - + NTA eller [amb + M (II) + NTA] - → [NTA + M (II)] - + amb. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Bild 7: Formatet för CRUNCH-textinmatningsfilen. Filen innehåller de genomsnittliga relativa intensiteterna och deras standardavvikelser för produktjonerna som bildas som en funktion av masskollisionsenergi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Amb [amb+Zn(II)+NTA] - [amb+Ni(II)+NTA] -
PM6 Exp.a PM6 Exp.a
A 214±2 214 219±2 218
H 211±5 216 212±3 215
en ES-IM-MS CCSMätningarna har osäkerheter på ±4 Å2.

Tabell 1: Jämförelse av LJ-kollisionstvärsnitt av PM6-konformatorerna för [amb+M(II)+NTA]-. Teoretiska tvärsnitt av PM6-konformatorerna jämförs med den experimentella CCSHan mätte med ES-IM-MS.

[amb+Zn(II)+NTA] - → [amb+Ni(II)+NTA] - →
[amb+Zn(II)] - + NTA [NTA+Zn(II)] - + amb [amb+Ni(II)] - + NTA [NTA+Ni(II)] - + amb
Amb ΔH0 ΔH298 ΔH0 ΔH298 ΔH0 ΔH298 ΔH0 ΔH298
A 118 127 149 182 146 171 148 154
H 96.4 92.3 111 115 125 140 161 216
 

Tabell 2: Termokemiska resultat från TCID-analyserna. De energiberoende reaktionerna [amb+M(II)+NTA]- → [amb+M(II)]- + NTA eller [amb+M(II)+NTA]- → [NTA+M(II)]- + amb, som visar 0 K-entalpierna för dissociation (Δ H 0) härledda från den oinvecklade TCID-modellpassningen och 298 K-entalpier av dissociation (Δ H 298) härledda från ΔH0 och statistisk mekanik termiska korrigeringar med hjälp av PM6-rotations- och vibrationsfrekvenserna. Värden anges i kJ/mol.

[amb+Zn(II)] - + NTA-→ [NTA+Zn(II)] - + amb → [amb+Ni(II)] - + NTA-→ [NTA+Ni(II)] - + AMB-→
[amb+Zn(II)+NTA] - [amb+Zn(II)+NTA] - [amb+Ni(II)+NTA] - [amb+Ni(II)+NTA] -
Amb ΔG298 K ΔG298 K ΔG298 K ΔG298 K
A -34.0 9,05 x 105 -21.8 6,59 x 103 -45.7 1,01 x 108 -53.1 2,01 x 109
H -29.3 1,36 x 105 -30.2 1,95 x 105 -47.0 1,71 x 108 -31.1 2,81 x 105
 

Tabell 3: Gibbs fria associationsenergier (ΔG298) och jämviktsbildningskonstanter (K). ΔG 298 och K vid 298 K för de omvända reaktionerna [amb+M(II)]- + NTA → [amb+M(II)+NTA]- och [NTA+M(II)]- + amb → [amb+M(II)+NTA]-. Härledd från ΔH298 och statistisk mekanik entropiberäkningar med hjälp av PM6 rotations- och vibrationsfrekvenser. Värdena för ΔG298 är i kJ/mol.

Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg
ES-IM-MS analyser av tröskelkollisionsinducerad dissociation (TCID). TCID använde överförings-T-vågcellen i närvaro av argon som kollisionscell. Före dissociation termiseras prekursorjonerna av lågenergikollisioner med kvävgas när de passerar genom jonmobilitetscellen (IM). Detta resulterar i en mer reproducerbar energiupplöst TCID än vad som uppnås genom att använda fällan som kollisionscell 6,40. Termaliseringen av [amb + M (II) + NTA] - före dissociation gör det också möjligt att karakterisera den tillgängliga inre energin hos det ternära komplexet med användning av 298 K temperatur. Dissociationen i överföringscellen betyder också att det ternära komplexet och dess produktjoner har samma genomsnittliga ankomsttider vid detektorn, vilket var användbart för att identifiera dissociationen av det ternära komplexet som endast inträffade i överföringscellen. Andra regioner där dissociation kan uppstå är ES-källan (provtagningskonen hålls vid 25 V för att undvika detta) eller vid ingången till IM-cellen. Produktjonerna som produceras genom dissociationen av det ternära komplexet i dessa regioner har olika drifttider från de som produceras i överföringscellen eftersom produktjonerna separeras från det ternära komplexet i IM-cellen. Dessa produktjoner undantogs från analysen. I detta protokoll används endast de integrerade ankomsttidsfördelningarna för prekursoren och produktjonerna som är samjusterade för att bestämma deras intensiteter. Fällans förspänningsinställning är den spänning som styr injektionsspänningen i IM-cellen, vilket bidrar till CID vid ingången till IM-cellen. Fällans bias sattes till 14 V, vilket höll bakgrundsdissociationen till ett minimum samtidigt som den inte påverkade de totala intensiteterna alltför mycket. En tidigare studie41 bestämde den effektiva temperaturen (övre gränsen) för peptiddimeren av leucin enkefalin till 449 K vid ingången till IM-cellen. Den effektiva temperaturen minskade dock snabbt när dimeren passerade ner i IM-cellen. Ankomsttiderna för amb-komplexen som studerades här uppvisade Gaussiska distributioner, vilket indikerar att de termiskiserades när de passerade ner IM-cellen.

ES-IM-MS kollisionstvärsnitt (CCS) analyserar. CCS-drifttider hittades experimentellt som ett resultat av kollisioner med kväve. Dessa värden omvandlades till helium-härledda CCS-drifttider med hjälp av en kalibreringskurva av kända standarder. Detta är viktigt eftersom de program som används för att mäta CCS för PM6-konformorerna kräver de vanligaste heliumstandarderna.

Modifieringar och felsökning av tekniken
CRUNCH-format för inmatningstext. Den inmatade textfilen som är lämplig för CRUNCH-programmet visas i figur 7. Rubrikerna i ordning från topp till botten är filplats och version av CRUNCH; datum; antal energier; Antal dataserier exklusive den första energikolumnen. källfil; massan av prekursorkomplexet; massa av argon; experimentets temperatur; datum för skapande x-data betecknad som −1 (centrum för masskollisionsenergier); och jonstrålens fulla bredd vid halva maximalt (FWHM). Dessa värden måste ändras för varje TCID-experiment. FWHM-energispridningen för jonstrålen och energinollan bör bestämmas genom att fördröja potentialanalys (RPA) genom att skanna CE genom låga spänningar och övervaka den totala jonströmmen. Under driftsförhållandena för IM i den aktuella studien minskade emellertid jonströmssignalen endast med cirka 50% när överförings-CE sattes till sitt lägsta värde. Jonstrålens energi noll och FWHM kunde mätas endast vid ytterligare retardation genom att sänka utgången IM-objektivet. I det senare fallet gav FWHM för derivatan av RPA-kurvan en typisk jonenergispridning på 1,5 V i lab-ramen eller 0,035 eV i masscentrumramen13.

Tryckraden avser tryck inuti kollisionscellen men används inte här. Trycket av argon i kollisionscellen kan varieras och TCID-data kan mätas vid tre tryck för att extrapolera till enstaka kollisionsförhållanden. Men endast ett tryck användes i denna studie, och trycket resulterar i flera kollisioner. Att utveckla den nya plattformen för en enda kollision är ett område för pågående forskning. Massorna relaterar till de två produktjonerna vars intensiteter finns i kolumnerna nedan. Dwells kan lämnas som standard. De fem kolumnerna är centrum för masskollisionsenergier (betecknade −1); medelvärdet av artens jonintensiteter med massa 898,30 u; standardavvikelserna för jonintensiteterna hos arter 898,30 u; medelvärdet av artens jonintensiteter med massa 253,53 u; och standardavvikelserna för jonintensiteterna för arter 253,53 u.

Molekylär modellering
Antalet konformare minskades initialt med hjälp av modeller härledda från tidigare studier 9,10,11,12,13. CRUNCH-montering kräver noggrann screening av reaktanter, aktiverade molekyler och övergångstillstånd för att erhålla exakta tröskelenergier. Tidigare forskning 9,10,11,12,13 har inkluderat omfattande screening av [amb + M (II)] konformare för att erhålla strukturerna med parametrarna som används i CRUNCH-modelleringen här. Endast komplex med transpeptidbindningar användes eftersom endast de överensstämmer med IM-MS-uppmätt CCSHe 10. De molekylära modelleringsmetoderna B3LYP och PM6 förutsäger båda den lägsta energin [amb + M (II)] - konformatör som uppvisar Aa1-Cys 2-Cys 7 och karboxylatterminkoordination av Zn (II) eller Ni (II) 10,11,12,13. Förtrogenhet med beteendet hos de kända modellerna gjorde det möjligt att bestämma de nya konformarna för [amb + M (II) + NTA] - mer effektivt. För att hjälpa till med konformarbestämning, eftersom lägre energikonformatorer lokaliserades med PM6-metoden, filtrerades de bort och omvärderades systematiskt tills de mest genomförbara, lägsta energikonformatorerna återstod.

CRUNCH-modellering
Tidsfönster för att observera dissociation. I denna studie användes tidsfönstret 50 μs från början av överföringscellen till slutet av TOF-analysatorn, där flerkanalsplattdetektorn är placerad. Det kan vara bättre att använda det experimentella tidsfönstret mellan aktivering i överföringscellen och ingången till TOF-massanalysatorn, för om den aktiverade jonen dissocierar under sin tid i reflektron TOF, kommer detta metastabila sönderfall att mätas vid en annan m / z. I denna studie kunde emellertid de produktjoner som observerades i masspektra alla identifieras som de omodifierade m/z-arter som visas i figur 3. Detta indikerar att metastabilt förfall inte var ett problem. Ytterligare forskning skulle kunna undersöka detta genom att undersöka en känd reaktion med hög tröskel och kontrollera att rätt tröskelenergi erhålls med hjälp av 50 μs tidsfönster och RRKM-modellering.

Skalningsfaktorer för vibrationsfrekvenserna. De NIST-rekommenderade skalningsfaktorerna för PM6 (1,062) vibrationsfrekvenser användes. Dessa var tillfredsställande för att passa in i [A+Zn(II)+NTA]-, [A+Ni(II)+NTA]-, och [H+Zn(II)+NTA]- data. För vissa fall där den högre energikanalen är entropiskt gynnad framför den lägre energikanalen kan det vara nödvändigt att dessutom skala frekvenserna för den andra kanalen. Ett tillvägagångssätt är att skala frekvenserna under 900 cm−1 (eftersom dessa är minst exakta) för att lossa frekvenserna och göra TS mer entropiskt gynnad.

Optimering av parametrar. Att använda alternativet Ja för att hålla en parameter till det aktuella värdet kan vara användbart för att passa data. För den första anpassningen hålls E 0(2) och modellen TCID anpassas till data genom att optimera variablerna CONST, E0(1) och N. När en bra passform har hittats kan parameteralternativet och Håll vilken parameter som helst vid nuvärdet användas för att hålla CONST, E 0 (1) och N, samtidigt som E0 (2) kan optimera till data. Slutligen, när E 0(2) har optimerats, i parameteralternativet, bör alla fyra parametrarna CONST, E 0(1), E 0(2) och N tillåtas optimera till data.

Energiområde för att anpassa den valda TCID-modellen till experimentella data. Det energiområde som används för att passa experimentella data bör reproducera så mycket av experimentella intensitetsdata som möjligt samtidigt som man behåller en bra passform i tröskelregionen. Man kan börja med att anpassa TCID-modellen till ett litet energiområde vid trösklarna för experimentella data. Man kan välja en startenergi som uppvisar bakgrundsintensiteten strax före det stigande intensitetströskelbeteendet. När TCID-passningen har optimerats till det experimentella dataområdet bör intervallet ökas med 0,1 eV och passformen ska optimeras igen. Den här proceduren bör upprepas för att passa så mycket av dataintervallet som möjligt samtidigt som tröskelregionens passform bibehålls.

Termokemiska analyser. De termokemiska resultaten från Delta H och S vid T-alternativet bör jämföras med en serie olika energiintervall som passar data för att uppskatta standardavvikelsen för TCID-modellens passform. Passar att jämföra bör inkludera mindre intervall som passar de initiala stigande tröskelintensiteterna väl med de med större intervall som också inkluderar de högre energierna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation under 1764436, NSF REU-programmet (CHE-1659852), NSF-instrumentstöd (MRI-0821247), Physics and Astronomy Scholarship for Success (PASS) NSF-projekt (1643567), Welch Foundation (T-0014) och datorresurser från Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) och L3 Communications. Författarna tackar Kent M. Ervin (University of Nevada - Reno) och Peter B. Armentrout (University of Utah) för att de delar CRUNCH-programmet och för råd om montering från PBA. Författarna tackar Michael T. Bowers grupp vid University of California - Santa Barbara för att dela Sigma-programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
Alternative metal binding (amb) peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Ammonium acetate (ultrapure) VWR 97061-014
Ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Gaussian 09 Gaussian Electronic Structure Modeling Software
GaussView Gaussian Graphical Interface to Visualize Computations
Glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Ion-scaled Lennard-Jones (LJ) method Sigma Michael T. Bowers’ group of University of California at Santa Barbara
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
Microcentrifuge Tubes VWR 87003-294 1.7 mL, polypropylene
Microcentrifuge Tubes VWR 87003-298 2.0 mL, polypropylene
Ni(II) nitrate hexahydrate (99% purity) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A15540
Poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com)  quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
Zn(II) nitrate hexahydrate (99%+ purity) Alfa Aesar (www.alfa.com) 12313

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y. -M., Chen, P. Ligand binding energy in [(bipy)Rh(PCH)]+ by collision-induced dissociation threshold measurements. International Journal of Mass Spectrometry. 202 (1-3), 1-3 (2000).
  2. Plattner, D. Electrospray mass spectrometry beyond analytical chemistry: Studies of organometallic catalysis in the gas phase. International Journal of Mass Spectrometry. 207 (3), 125-144 (2001).
  3. Narancic, S., Bach, A., Chen, P. Simple fitting of energy-resolved reactive cross sections in threshold collision-induced dissociation (T-CID) experiments. Journal of Physical Chemistry A. 111 (30), 7006-7013 (2007).
  4. Ervin, K., Armentrout, P. B. Systematic and random errors in ion affinities and activation entropies from the extended kinetic method. Journal of Mass Spectrometry. 39 (9), 1004-1015 (2004).
  5. Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic method of making thermochemical determinations: Advances and applications. Accounts of Chemical Research. 31 (7), 379-386 (1998).
  6. Ervin, K. Microcanonical analysis of the kinetic method. The meaning of the "apparent entropy". Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 13 (5), 435-452 (2002).
  7. Amarasinghe, C., Jin, J. -P. The use of affinity tags to overcome obstacles in recombinant protein expression and purification. Protein & Peptide Letters. 22 (10), 885-892 (2015).
  8. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
  9. Yousef, E. N., Angel, L. A. Comparison of the pH-dependent formation of His and Cys heptapeptide complexes of nickel(II), copper(II), and zinc(II) as determined by ion mobility-mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 55 (3), 4489 (2020).
  10. Lin, Y. -F., et al. Weak acid-base interactions of histidine and cysteine affect the charge states, tertiary structure, and Zn(II)-binding of heptapeptides. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 30, 2068-2081 (2019).
  11. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrometry. 51 (12), 1120-1129 (2016).
  12. Flores, A. A., et al. Formation of Co(II), Ni(II), Zn(II) complexes of alternative metal binding heptapeptides and nitrilotriacetic acid: Discovering new potential affinity tags. International Journal of Mass Spectrometry. 463, 116554 (2021).
  13. Flores, A. A., et al. Thermochemical and conformational studies of Ni(II) and Zn(II) ternary complexes of alternative metal binding peptides with nitrilotriacetic acid. International Journal of Mass Spectrometry. 473, 116792 (2022).
  14. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
  15. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
  16. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying ion mobility-mass spectrometry techniques for explicitly identifying the products of Cu(II) reactions of 2His-2Cys motif peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
  17. Yousef, E. N., et al. Ion mobility-mass spectrometry techniques for determining the structure and mechanisms of metal ion recognition and redox activity of metal binding oligopeptides. Journal of Visualized Experiments. (151), e60102 (2019).
  18. Ilesanmi, A. B., Moore, T. C., Angel, L. A. pH dependent chelation study of Zn(II) and Ni(II) by a series of hexapeptides using electrospray ionization - Ion mobility - Mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 455, 116369 (2020).
  19. Armentrout, P. B., Ervin, K. M., Rodgers, M. T. Statistical rate theory and kinetic energy-resolved ion chemistry: Theory and applications. Journal of Physical Chemistry A. 112 (41), 10071-10085 (2008).
  20. Dalleska, N. F., Honma, K., Sunderlin, L. S., Armentrout, P. B. Solvation of transition metal ions by water. Sequential binding energies of M+(H2O)x (x = 1-4) for M = Ti to Cu determined by collision-induced dissociation. Journal of the American Chemical Society. 116 (8), 3519-3528 (1994).
  21. Ervin, K. M., Armentrout, P. B. Translational energy dependence of Ar + XY → ArX+ + Y (XY = H2,D2,HD) from thermal to 30 eV c.m. Journal of Chemical Physics. 83, 166-189 (1985).
  22. DeTuri, V. F., Ervin, K. M. Competitive threshold collision-induced dissociation: Gas-phase acidities and bond dissociation energies for a series of alcohols. Journal of Physical Chemistry A. 103 (35), 6911-6920 (1999).
  23. Iceman, C., Armentrout, P. B. Collision-induced dissociation and theoretical studies of K+ complexes with ammonia: a test of theory for potassium ions. International Journal of Mass Spectrometry. 222 (1-3), 329-349 (2003).
  24. Rodgers, M. T., Ervin, K. M., Armentrout, P. B. Statistical modeling of collision-induced dissociation thresholds. Journal of Chemical Physics. 106, 4499-4508 (1997).
  25. Rodgers, M. T., Armentrout, P. B. Statistical modeling of competitive threshold collision-induced dissociation. Journal of Chemical Physics. 109, 1787-1800 (1998).
  26. Armentrout, P. B., Ervin, K. M. CRUNCH, Fortran program, version 5.2002. , (2016).
  27. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
  28. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
  29. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 140 (20), 6853-6861 (2015).
  30. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
  31. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  32. Stewart, J. J. P. Optimization of parameters for semiempirical methods V: Modification of NDDO approximations and application to 70 elements. Journal of Molecular Modeling. 13, 1173 (2007).
  33. Frisch, M. J., et al. Gaussian 09, Revision C.01. Wallingford CT: Gaussian, Inc. , (2012).
  34. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98, 5648-5652 (1993).
  35. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8, 275-282 (1997).
  36. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chemical Physics Letters. 261 (1-2), 86-91 (1996).
  37. Heerdt, G., Zanotto, L., Souza, P. C. T., Araujo, G., Skaf, M. S. Collision cross section calculations using HPCCS. Methods in Molecular Biology. 2084, 297-310 (2020).
  38. Zanotto, L., Heerdt, G., Souza, P. C. T., Araujo, G., Skaf, M. S. High performance collision cross section calculation-HPCCS. Journal of Computational Chemistry. 39 (21), 1675-1681 (2018).
  39. https://cccbdb.nist.gov/pollistx.asp. , Available from: https://cccbdb.nist.gov/pollistx.asp (2022).
  40. Raja, U. K. B., Injeti, S., Culver, T., McCabe, J. W., Angel, L. A. Probing the stability of insulin oligomers using electrospray ionization ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 21 (6), 759-774 (2015).
  41. Merenbloom, S. I., Flick, T. G., Williams, E. R. How hot are your ions in TWAVE ion mobility spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23 (3), 553-562 (2012).

Tags

Kemi utgåva 184
Termokemiska studier av Ni(II) och Zn(II) ternära komplex med jonmobilitet-masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corrales, A. J., Arredondo, A. V.,… More

Corrales, A. J., Arredondo, A. V., Flores, A. A., Duvak, C. L., Mitchell, C. L., Spezia, R., Angel, L. A. Thermochemical Studies of Ni(II) and Zn(II) Ternary Complexes Using Ion Mobility-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (184), e63722, doi:10.3791/63722 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter