Summary
この記事では、エレクトロスプレー-イオン移動度-質量分析、半経験的量子計算、およびエネルギー分解閾値衝突誘起解離を使用して、関連する三元金属錯体の解離の相対熱化学を測定する実験プロトコルについて説明します。
Abstract
この記事では、エレクトロスプレーイオン移動度質量分析(ES-IM-MS)とエネルギー分解閾値衝突誘起解離(TCID)を使用して、負電荷[amb+M(II)+NTA]-三元錯体の2つの製品チャネルへの解離の熱化学を測定する実験プロトコルについて説明します。 + amb、ここでM=ZnまたはNiおよびNTAはニトリロ三酢酸である。この複合体は、一次構造アセチル-His 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7またはアセチル-Asp 1-Cys 2-Gly3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7を有する代替金属結合(amb)ヘプタペプチドの1つを含み、ここでアミノ酸はAa1,2,6,7 位置は潜在的な金属結合部位である。三元複合体とその生成物の幾何学的に最適化された定常状態は、電子エネルギーとその衝突断面積(CCS)をES-IM-MSによって測定されたものと比較することによって、量子化学計算(現在はPM6半経験的ハミルトニアン)から選択された。PM6周波数計算から、三元複合体とその生成物の分子パラメータは、競合TCID法を用いて2つの生成物チャネルのエネルギー依存強度をモデル化し、解離の0Kエンタルピー(ΔH0)に関連する反応の閾値エネルギーを決定する。PM6の回転周波数と振動周波数を用いた統計力学の熱およびエントロピー補正は、解離の298Kエンタルピー(ΔH298)を提供する。これらの方法は、一連の三元金属イオン錯体の熱化学および平衡定数を決定することができるEI-IM-MSルーチンを記述する。
Introduction
この研究は、代替金属結合(amb)三元金属錯体[amb + M(II)+NTA](M = ZnまたはNiおよびNTA = ニトリロ三酢酸)の解離のための相対熱化学の決定を可能にする市販のイオン移動度質量分析計を用いた新しい技術を説明する(図1)。これらの反応は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)1,2中のNTA固定化金属に結合したambタグ付き組換えタンパク質の解離をモデル化する。一例として、この方法は、amb AおよびHのambヘプタペプチドタグ(図2)を用いて記載される(先行研究3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)は、Zn(II)およびNi(II)結合特性を示し、したがって、精製タグとしての潜在的な用途を有する。しかしながら、記載されたプロセスは、任意の有機金属系における熱化学エネルギーを評価するために使用することができる。これらのambペプチドは、NTAのカルボキシレート部位およびアミン部位と競合するAa1−Aa2およびAa6−Aa7位に金属結合部位を有する。3つの中心ambアミノ酸は、スペーサー(Gly3)、2つのアームのヒンジ(Pro4)、および長距離π金属カチオン相互作用(Tyr5)を提供する。
[amb+M(II)+NTA]-錯体の全体的な1-電荷状態は、それらの潜在的な結合部位のプロトン化状態によって決定される。2+酸化状態のNi(II)またはZn(II)が存在するため、3つの脱プロトン化された負電荷部位の正味がなければならない。[amb+M(II)+NTA]-複合体の分子モデリングは、これらがNTAからの2つの陽子とambからの1つの陽子(すなわち、[amb-H+M(II)+NTA-2H]-)であると予測する。生成物チャネルは、イオン種および中性種(すなわち、[NTA-3H+M(II)]- + ambまたは[amb-3H+M(II)]- + NTA)を含む。原稿では、複合体の名前に「-3H」が除外されていますが、読者は-3Hが暗示されていることを知っておくべきです。この装置は、2つのイオン質量電荷(m / z)種の相対強度を測定します。ES-IM-MS分析の主な属性は、ここおよび以前のAMB研究3,4,5,6,7,8,9,10,11,12で利用されているように、特定のM / Z種の反応性を調べることができることです。
衝突誘発解離を用いた大型錯体の熱化学的データの取得は、重要な関心の対象である13,14。キネティック法を含む方法論は、ある範囲のエネルギーにわたってデータをフィッティングするのに役立たず、また、多重衝突環境15,16,17,18を説明するものでもない。ここで、Armentrout、Ervin、Rodgersによる誘導イオンビームタンデム質量分析法を用いて開発された閾値CID(TCID)法は、走行波イオンガイドを利用した新しいES-IM-MS機器プラットフォームに19で適用されています。TCID法は、三元錯体の2つの生成物チャネルへの解離の相対熱化学的分析を可能にし、反応物(本研究における三元錯体)と不活性標的ガス(この場合はアルゴン)の並進エネルギー間の衝突エネルギーの移動を記述する閾値法則を含む。この方法は、反応物の内部エネルギー分布20にわたる積分、反応物と標的ガス21との間の並進エネルギー分布、および総角運動量分布22、23を含む。解離確率および生成物の観察のための限られた時間枠から生じる動態シフトの統計的ライス・ラムスペルガー・カッセル・マーカス(RRKM)補正が含まれる24。2つの独立した製品チャネルの場合、競合TCID方式により、競合する2つの製品チャネルを同時にフィッティングできます。複合体の解離は、生成物の性質を有するが、ロックダイポール25によって一緒に保持される軌道遷移状態を通る。TCID法はCRUNCHプログラム26に組み込まれており、ここでは三元系[amb+M(II)+NTA]-錯体の2つの解離チャネルの熱化学を評価するためのユーザインタフェースの動作について説明する。CRUNCHプログラムは、開発者26からの要求に応じて利用可能です。
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Protocol
メモ: 図 1 に、プロトコルの概要を示します。
1. 試薬の調製
- フリーズドライアンブペプチド(純度>98%)を購入し、-80°Cの冷凍庫に保管してください。
- 純度>99%の硝酸亜鉛(II)六水和物と硝酸ニッケル(II)六水和物を購入してください。
警告: 硝酸ニッケル(II)六水和物は、環境および健康上の危険があります。 - ニトリロ三酢酸、ポリDL-アラニンポリマー、超高純度/微量金属グレードの酢酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、氷酢酸、HPLCグレードのアセトニトリルを購入してください。
2. 原液の調製
- ペプチドamb原液
- 3つ以上の有効数字を使用して凍結乾燥ペプチドの10〜20mgを秤量し、1.7mLポリプロピレン微量遠心チューブに入れることによって、12.5mM amb濃度の水溶液を調製する。
- 適切な量の脱イオン水(>17.8MΩ cm)を微量遠心チューブに加えます。蓋を閉め、少なくとも20回の反転でよく混ぜる。
- 12.5 mM amb 溶液から 50 μL アリコートを作成し、マークの付いた 1.7 mL 微量遠心チューブに入れます。アリコートストック溶液を−80°Cで保存する。
- 金属イオンストックソリューション
- 3つ以上の有効数字を使用して10〜30mgの金属硝酸六水和物を秤量し、1.7mLポリプロピレン微量遠心チューブに入れることによって、12.5mM濃度のZn(II)およびNi(II)水溶液を調製する。
- 微量遠心管に適量のDI水を加える。蓋を閉め、少なくとも20回の反転でよく混ぜる。50 μL のアリコートストック溶液を −80 °C で保管します。
- NTAイオンストックソリューション
- 3つ以上の有効数字を使用してNTAの10〜30mgを秤量し、それを1.7mLの微量遠心管に入れることによって、NTA水溶液を調製する。
- 微量遠心管内のNTAに適量のDI水を加えて、最終濃度12.5mMを達成する。蓋を閉め、少なくとも20回の反転でよく混ぜる。50 μL のアリコートストック溶液を −80 °C で保管します。
- 酢酸アンモニウム原液:30.8mgの酢酸アンモニウムを秤量し、40mLのDI水を加えて10mM溶液を得た。1 mM水酸化アンモニウムで酢酸アンモニウム溶液のpHをpH 7.7に調整する。
- ポリDL-アラニン原液:1.0mgのPAをDI水に溶解して、1mL、1,000ppmのポリDL-アラニン(PA)原液を作る。包括的に混合する。50 μL のアリコートを作成し、個別にラベル付けされた微量遠心チューブに入れます。1,000ppmの溶液を-80°Cで保存します。
3. エレクトロスプレーイオン移動度質量分析(ES-IM-MS)衝突誘起解離(CID)解析
- ES入口チューブと金属キャピラリーを洗浄して器具を調製し、0.1 M氷酢酸500 μL、続いて0.1 M水酸化アンモニウム500 μL、最後にpH7.7酢酸アンモニウム溶液500 μLを注入します。
- 12.5 mM ambの原液を室温にして液化する。DI水で2回連続希釈することにより、0.125 mM ambの最終濃度を作成します。各希釈後に包括的に混合する。
- 12.5mMの金属イオン原液を室温にして液化する。DI水で2回連続希釈することにより、最終濃度0.125mMの金属イオンを作成します。各希釈後に包括的に混合する。
- 12.5 mM NTAストック溶液を液化する。DI水で2つの連続希釈を行うことによって、0.125 mM NTAの最終濃度を作成します。各希釈後に包括的に混合する。
- 三元錯体の2 mLサンプルを作製するには、2 mL の微量遠心管に 800 μL の 0.125 mM NTA 溶液および 400 μL の 0.125 金属イオン溶液を加え、少なくとも 20 回の反転で十分に混合します。400 μL の酢酸アンモニウム溶液 (pH 7.7) および 400 μL の 0.125 mM amb 溶液を加え、少なくとも 20 回の間、十分に混合し、サンプルを室温で 10 分間平衡化させます。
- 2 mL サンプルを 2.5 mL の鈍いノーズシリンジにロードし、機器のシリンジポンプを使用して 10 μL/minの流量でサンプルを機器のESに注入します。
- 計測器を負のIM-MSモードにします。これらの実験のための機器27 の典型的な動作条件を以下のように使用する。
- 窒素の脱溶媒流量が500 L/hで-2 kVに保持されたESキャピラリーに、10 μL/分の流量でサンプルを注入します。ESソース温度と脱溶媒温度をそれぞれ130°Cと263°Cに設定します。サンプリングコーンと抽出コーンをそれぞれ25 Vと3 Vに設定します。
- CID実験では、四重極質量分析計を使用して、低質量= 4.5、高質量= 16.5の分解能設定でモノアイソトピックピークのm/zを使用して、[amb + M(II)+NTA]-三元複合体の同位体パターンを選択します。
注:[amb + M(II)+ NTA]- イオンは、連続した3つの進行波(T波)イオンガイドに渡されます。 - トラップT波のアルゴンガス流量が3 mL/分、圧力が2.83 x 10-2 mbarであることを確認します。トラップへの衝突エネルギー(CE)を5Vに設定して、三元複合体の解離を回避します。トラップが三元錯体イオンを捕集してから(放出時間200μs)、IM入口での錯体の解離を最小限に抑える14VのトラップDCバイアスを使用して、それらをイオン移動度(IM)T波イオンガイドに放出させます。
- IMイオンガイドの圧力が0.507 mbarであることを確認し、20 mL/分の超高純度N2 バッファーガスの流量を使用します。IM イオン ガイドの開始と終了の掃引ごとに、高さ 7 V ~ 30 V、速度 290 m/s ~ 801 m/s の IM 内の T 波をランプします。
- 転写T波のアルゴン流量と圧力をトラップT波と同じに設定する。転送T波は、転送CEを用いた三元[amb+M(II)+NTA]- 複合体の衝突誘起解離に用いられた。
- 分解能モードで透過四重極を使用して、負に帯電した[amb+M(II)+NTA]-複合体のm/z同位体パターンを選択します。
- 質量分析プログラムを開き、[スペクトル]を選択して、m/z同位体パターンを特定します。[同位体モデル>ツール]を選択します。ポップアップウィンドウで、複合体の分子式を一覧表示し、[荷電イオンを表示]のチェックボックスをオンにし、負の電荷に1を入力して[OK]をクリックします。
- 表示された複合体の同位体パターンで、最も低い質量ピークに注意してください。計測器ソフトウェアで、 Quadプロファイル>設定を選択します。開いたウィンドウで、 手動固定 を選択し、最も低い同位体パターンピークの質量を入力します。[ 更新 ]をクリックし、[ 閉じる]をクリックします。
- [セットアップ]をもう一度選択し、[クワッドの解決]をクリックします。マイナスイオンES-IM-MSスペクトルを、5分間の実行時間と2秒のスキャン時間を使用して、転送衝突エネルギーの範囲にわたって段階的に収集します。
メモ:予備伝達エネルギーは、26~60Vから2Vの間隔でテストできます。調査された移動衝突エネルギーの最終範囲は、最低エネルギーでの三元複合体の解離がなく、最高エネルギーでの生成物への完全な解離を実証すべきである。高品質の統計分析のためには、このES-IM-MS分析は、平均と標準偏差を決定するために、異なる人々によって異なる日に少なくとも3倍の各AMB三元複合体に対して実行する必要があります。
4. ES-IM-MS 衝突断面積(CCS)解析
- ES 入口チューブと金属キャピラリーを 500 μL の 0.1 M 氷酢酸、続いて 500 μL の 0.1 M 水酸化アンモニウム、最後に 500 μL の pH 7.7 酢酸アンモニウム溶液で洗浄します。
- 1,000ppm PA原液を室温に液化し、2回の段階希釈を行う。DI水で100ppm PAに希釈し、次いでDI水とHPLCグレードアセトニトリルの1:1の比率で希釈することによって10ppm PA溶液に希釈する。
- 機器動作条件を使用して、10ppm PAサンプルの負イオンIM-MSスペクトルを10分間収集します。
注:注入流量およびESソース条件は、CID実験の場合と同じであった(ステップ3。CCSの測定のために、四重極質量分析器は非分解モードであり、すべてのイオンを連続した3つのT波イオンガイドに渡した。トラップT波およびIM T波イオンガイドの動作は、CID実験の場合と同様であった。移動T波セルの衝突エネルギーは4Vで、イオンが解離せずに通過できるようにした。 - ステップ 3.2.-3.6 の説明に従って、各三元複合体を準備します。
- 各三元複合体のIM-MSスペクトルを5分間収集する。
メモ: 手順 4.3 と同じ計測器条件を使用します。 - 10ppm PAサンプルの負イオンIM-MSスペクトルを10分間収集します。
注:amb三元複合体の前後に収集されたPAキャリブラントの到着時間の平均は、CCS測定に使用されます。
5. ES-IM-MS CID データの解析
- 三元複合体とその生成物の理論上の m/z 同位体パターンを実験的なIM-MSスペクトルに一致させることによって、種を同定する。
- 質量分析プログラムを開き、[ クロマトグラム ]を選択して新しいウィンドウを開きます。
- クロマトグラムウィンドウで、[ファイル>開く]をクリックして、目的のIM-MSデータファイルを見つけて開きます。
- マウスを右クリックし、クロマトグラムを横切ってドラッグして離します。MSスペクトルは、別の スペクトラム ウィンドウに表示されます。
- スペクトルを表示する新しいウィンドウで、[ 同位体モデル>ツール]を選択します。小さなウィンドウがポップアップ表示されます。amb 種の分子式を入力し、[ 荷電イオンを表示] ボックスにチェックを入れて、目的の電荷状態を入力します。[ OK]をクリックします。
- IM-MSスペクトル内のすべての種を区別するには、[スペ クトラム] ウィンドウでこのプロセスを繰り返し、 m/z 同位体範囲を記録します。
- 三元AMB複素数とその生成物については、それらの m/z 同位体範囲を使用してそれらを識別し、それらの到着時間分布(ATD)を抽出する。
- イオンモビリティ分離ソフトウェアを開き、[ファイル] > [開く] を選択して、データ ファイルを見つけて開きます。
- 左クリックしてマウスでドラッグすると、三元複素数の m/z 同位体範囲 [amb+M(II)+NTA]- がズームインします。
- 選択ツールを使用して、左クリックしてドラッグし、手順 5.1 で特定した[amb + M(II)+NTA]- の特定の同位体範囲を選択します。[ 現在の選択を承認] ボタンをクリックします。
- 偶発的な m/z 種またはバックグラウンド信号を除去するには、 選択 ツールを使用して、三元複合体に関連付けられた ATD を選択します。[ 現在の選択を承認] ボタンをクリックします。
- ATDファイルを質量分析ソフトウェアにエクスポートするには、[ ファイル>エクスポート]に移動し、[ ドリフト時間の保持]をクリックします。必要に応じてファイルの名前を変更し、適切なフォルダにファイルを保存します。
- 抽出されたATD曲線の下の面積の積分によって、種の相対強度を決定する。
- クロマトグラムウィンドウで、イオンモビリティ分離ソフトウェアから保存したエクスポートファイルを開きます。[プロセス] を選択し、[統合] を選択します。ピークツーピーク振幅設定の20を使用し、「OK」をクリックします。
- クロマトグラムウィンドウに示すように、統合領域を記録します。手順 5.2.2.-5.2.5 を繰り返します。2つの製品、すなわち[NTA+M(II)]-と[amb+M(II)]-について。
- 手順 5.2.1.-5.3.2 を繰り返します。各転送衝突エネルギーについて記録される。
- 三元複合体 [amb+M(II)+NTA]- と 2 つの積分 [NTA+M(II)]- および [amb+M(II)]- の統合 ATD 領域を各転送衝突エネルギーポイントで利用して、相対的なパーセンテージスケールに正規化します。
- 三元複合体とその製品の ID と、各衝突エネルギーにおけるそれらの統合 ATD を入力して、スプレッドシートを作成します。
- 各衝突エネルギーについて、[amb+M(II)+NTA]-、[NTA+M(II)]-、および[amb+M(II)]-の積分ATDの合計を利用して、個々のATDを相対的なパーセンテージスケールに正規化します。
- 複製TCID測定値から、各データポイントの平均値と標準偏差を求めます。アルゴン(m Ar)衝突ガスと三元複合体(m錯体)の平均質量を使用して、ラボフレーム転送衝突エネルギー(Elab)を質量中心衝突エネルギー(Ecm)に変換します:Ecm = Elab (m Ar)/(m Ar + m錯体)。
注:Ecmは、三元複合体の解離に利用可能なアルゴンガスとの衝突による最大エネルギーを表す。 - [amb+M(II)+NTA]-、[NTA+M(II)]-、および[amb+M(II)]-の個々のパーセント強度の平均と標準偏差を、相対強度(%)対質量中心衝突エネルギー(eV)のグラフにプロットして、種の相対強度が衝突エネルギーの関数としてどのように変化するかを示します。
6. 衝突断面積(CCS)判定のための平均到達時間の解析
- イオン移動度分離ソフトウェアと、4 V に設定した転送衝突エネルギーで収集された 10 ppm PA サンプルの IM-MS スペクトルを含むファイルを開きます。負に帯電した単一の PA 種の ATD を抽出し、[ ドリフト時間を保持する] オプションを使用して、ファイルを質量分析ソフトウェアにエクスポートします (手順 5.2.5 を参照)。2番目のPAキャリブラントファイルについても同じ手順を繰り返します。
- イオンモビリティ分離ソフトウェアを開きます。PAキャリブラント間>記録されたamb三元錯体のIM-MSスペクトルを含むファイルの1つを開くには、 ファイルオープン を使用します。各三元複合体の ATD を抽出し、[ ドリフト時間の保持] オプションを使用して、そのファイルを質量分析ソフトウェアにエクスポートします (手順 5.2.5 を参照)。
- 断面較正法28 を使用して、三元複合体およびその生成物のCCSを計算する。
- スプレッドシートで、式1を使用して、ヘリウムバッファガス31で測定されたCCS(Ω Ω)29,30から、負に荷電した単一のPA種のそれぞれについて、z=三元錯体の電荷、ec = 1.602 x 10−19 C;mN2=窒素(u)の質量、及びmイオン=三元錯体28の質量。
(1) - PAキャリブラントと三元複合体のドリフト時間(tD)を求めるには、まず対応するATD曲線の最大値から平均到着時間(tA)を求め、次に 式2( c = 検出器遅延係数(1.41ms;機器間で異なる可能性があるため、機器を確認してください)と m/z =PAキャリブラントまたはamb三元複合体の質量電荷比)を適用します。
tD =tA
(2) - PAキャリブラントのtD対Ωcをプロットしてグラフを作成します。次に、式3を使用してデータを最小二乗回帰で当てはめ、定数A'とBを求めます。ここで、A'は計測器内の電界、温度、圧力を補正し、BはT波IMデバイスの非線形挙動を補正します。
Ωc = A' tDB (3) - A'定数とB定数、およびamb三元錯体のtD値を利用して、式3を使用してそれらのΩcを計算し、式1を使用してそれらのΩを計算します。この方法で推定されたCCS値の絶対誤差は約2%29です。
- スプレッドシートで、式1を使用して、ヘリウムバッファガス31で測定されたCCS(Ω Ω)29,30から、負に荷電した単一のPA種のそれぞれについて、z=三元錯体の電荷、ec = 1.602 x 10−19 C;mN2=窒素(u)の質量、及びmイオン=三元錯体28の質量。
(1)
(2)7. 計算方法
- 構造モデリングおよび計算ソフトウェア33で実装された半経験的PM632法を使用して、[amb + M(II)+NTA]-三元錯体とイオンと中性積のペアの幾何学的に最適化された適合者を見つけます:[amb + M(II)]- + NTAおよび[NTA+M(II)]- + AMBはCID実験から観察されました。計算を開発および送信する方法の詳細については、補足ファイルの計算ビジュアライザーの使用法を参照してください。
注:現在のシステムでは、PM6法は実験データを正しく再現しましたが、一般的には、信頼性が高く計算上実行可能な量子化学法を使用できます。 - 複数の異なる開始構造に対して幾何学的最適化と周波数計算を実行して、異なる立体配座、プロトン化状態、および潜在的な結合部位を探索します。三元複合体とその積のそれぞれについて、位置する静止点のそれぞれについての電子+ゼロ点エネルギーを記録する。
注: ジオメトリ最適化の開始構造は、結合部位と立体構造配置のさまざまな可能な組み合わせを調査する必要があります。出発構造は、以前に位置付けられたB3LYP34 [amb + M(II)]-コンフォーマー3,4,6に基づいていた。[amb+M(II)+NTA]-の場合、NTAは、Zn(II)の一重項スピン状態またはNi(II)の三重項スピン状態のAa1-Aa 2-Aa 6-Aa7およびカルボキシレート末端におけるambの置換基部位と競合するように位置付けられた。 - これらの量子化学計算35からの原子座標を用いてヘリウム緩衝ガス(CCSHe)中で測定された正確な衝突断面積測定を行うことができるプログラムを使用する。
注:量子化学計算によって位置付けられたペプチド構造から正確なCCSHeを計算するために開発されたプログラムには、MobCal 36およびHPCCS37,38が含まれる。 - 以下のCRUNCHモデリングに含める三元複合体および解離生成物の構造を選択するためにIM-MS測定CCS Heに同意するレナード・ジョーンズCCSHeを示す最も低いエネルギーコンフォーマを選択してください。
8. クランチモデリング
- 「ディスカッション」セクションで説明した形式 (「CRUNCH 入力テキストファイル形式」) でテキストファイルを作成します。
注: このファイルには、(−1) 質量中心衝突エネルギー (Ecm)、(1) [amb+M(II)]- 積の相対強度の平均、(2) [amb+M(II)]- 強度の標準偏差、(3) [NTA+M(II)]- 積の相対強度の平均、および (4) [NTA+M(II)] - 強度の標準偏差の列が含まれています。 - モデル化 Eセンチメートル-2つの反応チャネルの-依存性強度 [amb+M(II)+NTA]-[amb+M(II)]- + NTA および [amb+M(II)+NTA]- [NTA+M(II)] へ- + AMBは、CRUNCHプログラムでTCID技術を使用しています。
メモ:PM6振動周波数と回転周波数は、三元複合体と2つのイオンと中性プロダクトチャンネルに使用します。三元錯体、アルゴン衝突ガス、イオンおよび中性生成物の平均質量を使用します。PM6 計算または NIST データベースの値を使用して、分極率 (Å3)と中立的な製品の双極子モーメント(デバイ)です。- CRUNCH メインメニューから、テキストファイル (.GB5)製品のEcm依存性相対強度を含有する。パラメーターを読み取るには No と応答します。
- CRUNCH メインメニューから、「モデリング」>「すべてのパラメーターを設定」を選択します。反応モデルオプションから、デフォルトのしきい値CIDオプションを選択し、その後に三元複合体20のエネルギー移動分布を積分したRRKMを選択し、モデル化した独立した製品チャネルに2を入力し、断面の計算を選択します。「いいえ」と入力して、2つの製品チャネルのイオン質量が同じですか?
- 製品チャネル #1 の場合、[amb+M(II)]- 積の実験データには列 [1]、[amb+M(II)]- 積の標準偏差には列 [2]、複雑でないモデル断面には列 [5]、複雑化モデル断面には列 [6] を入力します。適合度の残差に0を入力します。
メモ: これらの列番号は、手順 8.1 の入力ファイルの列に対応しています。説明(「CRUNCH入力テキストファイル形式」)で説明したとおりです。 - 製品チャネル #2 の場合、[NTA+M(II)]- 製品の実験データには列 [3]、[NTA+M(II)]- 製品の標準偏差には列 [4]、複雑化されていないモデル断面の場合は列 [7]、複雑化モデル断面の場合は列 [8] を入力します。適合度の残差に0を入力します。
- 畳み込まれていないモデルのタイプについては、コリジョンセルからTOF検出器18までの50μsの時間窓による動態シフトの統計的RRKM補正を含む0K断面(キネティックシフトを含む)を選択します。
- 畳み込みオプションについては、三元複素イオンとアルゴン衝突ガス21との間の並進エネルギー分布上の畳み込みを含むティアナンの二重積分を選択する。
- 数値積分法では、事前に保存された断面を持つガウス直交を選択し、その後に積分点数 = 32、標準偏差の数 = 3.0、および 2 番目の積分の標準偏差の数 = 3.0 を選択します。
- 三元複素イオン(u)の質量は、 から自動的に読み取られます。GB5テキストファイル、それに続く衝突ガスの質量(アルゴンの場合は39.948 )。イオンビームのFWHMには 0.20 eV 、ガス温度には 298.15 K のデフォルトを使用します。プログラムは、 から 最小 および 最大の 重心衝突エネルギーを自動的に読み取ります。GB5テキストファイル。 最小エネルギー増分にデフォルト値を使用します。
- スケール係数 Sig0 にはデフォルト値を、個々の製品チャネルのスケーリングを許可するには No を、N と M にはデフォルト値を使用します。g(i) 計算の方法としては、三元複素数 [amb+M(II)+NTA] の内部エネルギー分布20 を含む状態の ro-振動密度に対する積分を選択します。
- 分子パラメータを入力するためのオプションから、 G と入力して、三元複合体のPM6振動および回転周波数を有する構造モデリングファイル33 を読み取る。質問に はい と答える 原子の 反応物の1つですか? モデリングファイルの場所と名前を書き込みます。
メモ:振動周波数と回転周波数を入力するための他のオプションには、テキストファイルからパラメータを読み込む 読み取りパラメータファイル、または各パラメータを手動で 入力できる編集/入力定数があります。 - NISTが推奨するPM6スケーリング係数(1.062)を使用して周波数をスケーリングします。スケーリングの詳細については、説明(「振動周波数のスケーリング係数」)を参照してください。三元複合体中の原子の数は、ファイルから読み取られます。いいえと答える 分子は線形ですか?反応物の説明を入力します(例:H+Zn+NTA-+Ar)。
- イオン上の電荷に1を入力し、アルゴンガス39の分極率に1.664を入力します。イオンの質量とターゲットの質量は、それぞれ三元錯体とアルゴンの質量であり、 から自動的に読み取られます。GB5 テキスト ファイル。高調波振動の場合は 0 と入力します。
メモ: 次のオプションは、高振動数または低振動周波数に対して異なるスケーリング係数を選択するためのものです。高周波の場合は 1.062、低周波の場合は 0.0 と入力します(説明:振動周波数のスケーリング係数を参照)。スケーリングされた周波数が表示されます。0 を選択して [変更なし] を選択します。 - Enter キーを押して、ステップ 8.2.10 で入力した構造モデリング ファイル33 から 1-D および 2-D 回転定数を読み取ります。ヒンダーローター処理の場合はデフォルト値の 0、分子対称性の場合は 1 を選択します。
メモ: プログラムは入力されたデータを表示します。ヒット 変更なし のために入力してください。 - 反応剤温度にデフォルトの 300 K を選択します。状態配列の密度を下げる方法には [積分] を選択します。[はい] を選択して、エネルギー分布を切り捨てます。分布の最大エネルギーには 40000 cm-1、ビン サイズの場合は 2.0 cm-1、エネルギー分布のポイント数には 32 と入力します。
メモ: Enter 2x キーを押して、切り捨てられた 32 pt 配列の母集団が 0.9 >あることを確認します。>0.9 の場合、「いいえ」と入力してビンまたは凝縮係数を変更します。<0.9 の場合、Yes と入力し、分布やビン サイズの最大エネルギーを変更します。 - TCID/RRKM モデルのパラメータの場合は、変更にはいを選択し、固定時間の場合は 0、検出ウィンドウの上限には 0.000050 秒を入力します。利用される機器の場合、これはイオンが転送コリジョンセルからTOF検出器に移動するのにかかる時間であり、式2を使用して計算されます。
- 通電分子の場合、Cと入力して、すでに入力された反応物から値をコピーします。ソース遷移状態 (TS) の場合は -1、宛先 TS の場合は 0、続行するには P を入力します。
- 製品チャネル 1 の場合、解離チャネルオプションからの単一遷移状態の場合は 1 を選択し、逐次解離の場合は 0 を選択します。 遷移状態タイプとして、軌道を周回するには 1 を選択します。
- [amb+M(II)]- + NTA 製品の PM6 回転および振動パラメータを含むモデリング プログラム ファイルを読み取ります。PSL TS種の1つが原子であるためにいいえと入力しますか?[amb+M(II)]- ファイルの場所と名前を入力します。スケール周波数には1.062を使用し、原子数にはEnterキーを押し、分子は線形ですか?
- NTA 製品の振動周波数と回転周波数を含むモデリングファイルの場所と名前を入力します。スケール周波数には1.062を使用し、原子数にはEnterキーを押し、分子は線形ですか?軌道を周回するTSの説明(例:H+Zn)を入力-...国税庁。
- [amb+M(II)]-イオンの電荷に1を入力し、NTAの分極率(16.12 Å3)と双極子モーメント(4.6183 Debye)を入力します。回転温度には 0 K を、軌道遷移状態の処理にはロック双極子を選択します。[amb+M(II)]-イオンとNTAの平均質量(u)を入力します。
- 高調波振動の場合は 0 と入力します。高周波の場合は 1.062、低周波の場合は 0.0 と入力します。スケーリング頻度の詳細については、ディスカッションセクションを参照してください。スケーリングされた周波数が表示されます。0 を選択して [変更なし] を選択します。Enter キーを押して、モデリング ファイルから 1-D 回転定数と 2-D 回転定数を読み取ります。ヒンダーローターの場合は 0、分子対称性の場合は 1、反応縮重の場合は 1 を選択します。「変更なし」オプションを入力します。
- プロダクトチャネル 2 の場合、単一の遷移状態の場合は 1、逐次解離の場合はなしの場合は 0、遷移状態タイプの場合は軌道回の場合は 1 を選択します。
- [NTA+M(II)]-およびamb製品のPM6回転パラメータと振動パラメータを含むモデリングファイルを読み込むには、[G]を選択します。PSL TS種の1つが原子であるためにいいえと入力しますか?[NTA+M(II)]- モデリング ファイルの場所と名前を記述します。
- スケール周波数には1.062を使用し、原子数を読み取るにはEnterキーを押し、分子は線形ですか? amb モデリングファイルの場所と名前を書き込みます。スケール周波数には1.062を使用し、原子数にはEnterキーを押し、分子は線形ですか?
- 軌道を周回するTSの説明を入力します(例:NTA+Zn-...[NTA+M(II)]-イオンの電荷には1.0を入力し、アンブの分極率(Å3)と双極子モーメント(デバイ)を入力します。回転温度には0.0 K、軌道遷移状態の処理にはロック双極子を選択します。[NTA+M(II)]-およびamb製品の平均質量(u)を入力します。
メモ: 出力ファイルには、amb の分極率と双極子モーメントが含まれています。分極率はボーア3 の単位であり、Å3の単位に変換する必要があります。 - 高調波振動の場合は 0 と入力します。高周波の場合は 1.062、低周波の場合は 0 を入力します。スケーリング頻度の詳細については、説明を参照してください。スケーリングされた周波数が表示されます。0 を選択して [変更なし] を選択します。Enter キーを押して、モデリング ファイルから 1-D 回転定数と 2-D 回転定数を読み取ります。ヒンダーローターの場合は 0、分子対称性の場合は 1、反応縮重の場合は 1 を選択します。変更なしと入力します。
- 非アクティブな 2-D 回転を処理するには、デフォルトのオプションである統計的角運動量分布を選択し、P (E,J) 分布を J 分布に統合します。積分のポイント数にはデフォルト値の 32 を使用します。
注: これらの選択は、総角運動量 J レベル16,17 に対する積分方法を選択します。結果の出力により、調査員はすべての入力が正しいことを確認できます。 - [エネルギーを与えられた分子に対する活性化エネルギー]オプションを選択し、[amb+M(II)]-プロダクトの相対強度対質量中心衝突エネルギーのグラフで観測される閾値エネルギーに近い、製品チャネル1の相対エネルギー(eV)を入力します(図4)。
- 製品チャネル 2 の場合は、[NTA+M(II)]-製品の強度対質量中心衝突エネルギーのグラフで観測されるしきい値エネルギーに近い相対エネルギー(eV)を入力します。各製品チャネルの状態数を計算するには、ビン サイズ 2.0 を使用します。Enter キーを押してから No キーを押して続行します。
- モデルメニューから、データを適合させるパラメータの最適化を選択し、データ適合の開始と終了にそれぞれ最小エネルギーと最大エネルギーを入力します。
メモ:両方のチャンネルのスレッショルドを含む小さなエネルギー範囲を使用してください。詳細については、考察:選択したTCIDモデルを実験データに適合させるためのエネルギー範囲を参照してください。 - 重み付けモードの実験標準偏差には -1 を選択します。データに基づいて、通常 0.01 ~ 0.001 の最小許容標準偏差を選択します。個々のチャンネルのスケーリングを最適化するには [いいえ] を選択し、反復回数には 0 を選択します。
注: 標準偏差を使用する代わりに、 統計 オプションを使用します。 - E0 収束限界のデフォルト値を使用し、「いいえ」を選択して、現在の値でパラメーターを保持します。下限と上限に0.5 eVと2.0 eVと入力して最適化の失敗を回避し、微分評価法に中心有限差を選択します。数値精度にはデフォルト値を使用し、微分ステップサイズを変更するには「いいえ」を選択します。
メモ: 別の方法として、[ はい ] を選択して 、パラメータを現在の値で保持します。このメソッドについては、「パラメータの最適化」で詳しく説明します。 - 最適化メニューから、最適化の開始を選択します。CRUNCHプログラムは、選択したTCIDモデルを実験データに最適化します。
注: 最適化で満足のいく適合度が得られない場合は、変更メニューから、しきい値から上昇する最初の数個の強度だけをカバーするようにエネルギー範囲を変更してみてください。妥当なフィット感が見つかったら、エネルギー範囲を広げて再びフィットします。データへの適合度を見つけるのに役立つその他のオプションには、最適化されたパラメータの現在値で任意のパラメータを保持することの選択や、重みの重み付けオプションの変更などがあります。これらのオプションについては、説明を参照してください。 - データに適合するモデルが見つかったら、[ モデル ] メニューが表示されるまで Enter キーを押します。実験データのエネルギー範囲の一部のみが TCID モデルに適合している場合は、[モデルの 計算と畳み込み] を選択して、モデルの適合度をすべての実験衝突エネルギーに拡張します。
- モデルメニューで、T のデルタ H と S を選択します。
注:畳み込みのないCRUNCHモデルは、0Kの閾値エネルギーを、三元複合体の2つの独立した製品チャネルへの解離の0Kエンタルピー(ΔH0)に関連付けます(表2)。解離の298Kエンタルピー(ΔH298)およびギブス自由エネルギー(ΔG298)も、反応物および生成物PM6回転周波数および振動周波数を用いた統計力学熱およびエントロピー補正によって導出される。
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Representative Results
AとHの[amb+M(II)+NTA]-三元錯体の[amb+M(II)]-+NTAまたは[NTA+M(II)]-+ambへの競合衝突誘発解離を図3に示す。amb は A または H のいずれかで示され、M = Zn または Ni として表示されます。[A+Zn(II)+NTA]-三元複合体(図3A)は、[A+Zn(II)]を生成するために約0.7eVの衝突エネルギー(CE)と[NTA+Zn(II)]を生成するために約0.9eVの見かけ上の閾値を示す。[A+Ni(II)+NTA]-錯体(図3B)の解離は、[NTA+Ni(II)]-および[A+Ni(II)]-生成物の両方について同様の閾値(~1.1eV)を示し、[NTA+Ni(II)]-は相対強度が90%に増加するが、[A+Ni(II)]-の強度は18%を超えない。[H+Zn(II)+NTA]-三元錯体(図3C)の場合、主な積は[H+Zn(II)]-であり、約0.6eVの閾値から約85%の相対強度まで上昇し、1.0eVを超えるエネルギーでは[NTA+Zn(II)]-は約30%に上昇する。[H-H2O+Zn(II)]-からの水損失のためのチャネルもあります。[H+Ni(II)+NTA]- (図 3D) の場合、[H+Ni(II)]- は約 0.9 eV のしきい値から約 40% の相対強度に上昇し、[NTA+Ni(II)]- は ~1.0 eV から約 80% に上昇します。グラフには、三元複合体が50%解離したCEが含まれています。Ni(II)三元錯体は、対応するZn(II)三元錯体よりも0.31〜0.37eV高いCEが50%解離することを必要とする。これは、Ni(II)錯体がより安定であり、解離するためにより高いCEを必要とすることを示唆しており、TCID技術を用いてさらに調査されている。
図4 は、競合する2つの製品チャネルを同時にフィッティングできる競合TCID方式を示しています。
[amb+M(II)+NTA] → [amb+M(II)]- + NTA (1)
[amb+M(II)+NTA] → [NTA+M(II)]- + amb (2)
ポテンシャルエネルギー表面(PES)は、競合する製品チャネルに解離する通電三元複合体を示し、[ambH+Zn(II)+NTA]-の解離をモデル化するために使用されるPM6幾何学的に最適化された種を示す。PESには、三元複合体の状態の密度と積の状態の合計が含まれます。0 K の閾値エネルギー E 1 および E 2 は、反応 1 および 2 の 0 K エンタルピー変化に相当します。
図5は、この研究で使用された他の3つの幾何学的に最適化された三元複合体の構造を示す。これらの種は、予測された電子エネルギーとゼロ点エネルギー、およびIM-MS測定衝突断面積(CCSHe)との一致に基づいて選択されました。表1は、三元複合体LJ CCS Heと実験的IM-MS CCSHeの間に、相互の不確実性の中で合意があるため、合意があることを示している。[amb+M(II)]とambの立体配座は、以前のDFTモデリング3,4,5,6の知見に基づいていた。これらのPM6コンフォーマーの分子パラメータは、三元複合体のエネルギー分解解離のTCIDモデリングに使用され、それらの密度および状態の合計を計算するためのそれらの回転振動周波数を含む。
図6は、エネルギー分解された製品強度に収まる複雑なCRUNCH TCIDスレッショルドを示しています。畳み込み適合には、[amb+M(II)+NTA]- + Ar反応物の利用可能なエネルギー分布と角運動量分布が含まれる。非畳み込み適合(図示せず)は、三元複合体の解離に関するエンタルピー(ΔH0)の0K変化を予測し、表2は反応1および2のΔH0およびΔH298(kJ/mol)を示す。Zn(II)三元錯体の解離に関して、AとHの両方が反応1のΔH0を示し、反応2のΔH0よりもそれぞれ31kJ/molおよび15kJ/mol低く、AとHの両方がNTAよりも大きなZn(II)親和性を有することを示す。[A+Ni(II)+NTA]-三元錯体は、反応1および2に対してそれぞれΔH0 = 146および148kJ/molを示し、AおよびNTAがNi(II)に対して同様の親和性を有することを示す。しかし、[H+Ni(II)+NTA]-の解離は、反応1のΔH0が反応2よりも36kJ/mol低いことを示し、HがNTAよりも大きなNi(II)親和性を有することを示す。全体として、[amb+Ni(II)+NTA]-錯体は、[amb+Zn(II)+NTA]-錯体よりも高い解離エンタルピーを示すが、[NTA+Ni(II)]-に解離するAを除く。表3は、会合のギブス自由エネルギー(ΔG298)と逆反応の形成定数(K)を示しています。
[amb+M(II)] - + NTA → [amb+M(II)+NTA]- (3)
[NTA+M(II)] - + amb → [amb+M(II)+NTA]- (4)
表3 は、Ni(II)三元錯体の形成がより労作的であり、すべての場合においてZn(II)錯体よりも大きな形成定数 K を示すことを実証する。反応4(すなわち、NTA金属イオン錯体とのambタグ会合)は、IMACカラム内部のNTA固定化金属イオンに結合するambタグ付き組換えタンパク質を表すものとして特に興味深い。[ambA+Ni(II)+NTA]の形成に関する反応4は、最も自発的なΔG298 = 53.1 kJ/molおよび最も高い形成定数である K = 2.01 x 109を示す。
図 1: ES-IM-MS TCID 方式の概要。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:amb AおよびHペプチドの一次構造。 色は、潜在的な金属結合部位を強調表示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:質量中心、エネルギー分解(eV)閾値の衝突誘発解離[amb+M(II)+NTA]-。生成物イオン[amb+M(II)]-[NTA+M(II)]-および[amb-H2O+Zn(II)]-のエネルギー依存性を示す。[amb+M(II)+NTA]-三元複合体の50%解離がある質量中心衝突エネルギーはグラフに含まれる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:エネルギー分解TCID法のモデル。[amb H+Zn(II)+NTA]- + アルゴン間の衝突は、[ambH+Zn(II)]- + NTAまたは[NTA+Zn(II)]- + ambH 生成物への解離をもたらす。閾値エネルギー E 1 および E2 は、それぞれ反応 [ambH+Zn(II)+NTA]- → [amb H+Zn(II)]- + NTA または [ambH+Zn(II)+NTA]- → [NTA+Zn(II)]- + amb H の解離の 0 K エンタルピー (ΔH 0) に相当します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:PM6ジオメトリに最適化された三項式[amb+M(II)+NTA]- AとHの複合体。 コンフォーマーは、実験データのTCIDモデリングに用いられる。これらのコンフォーマーは、PM6電子エネルギーを比較し、それらのLJ衝突断面積(CCSHe)をIM-MSと比較してCCSHeを測定する方法を比較することによって、他の候補構造から選択されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:エネルギー分解、衝突誘発解離[amb+M(II)+NTA]-。 種Aと種Hの場合、[amb+M(II)]-と[NTA+M(II)]-の積イオンと、入り組んだCRUNCH閾値が適合することを示す。示されているエネルギー(eV)値は、反応 [amb+M(II)+NTA]- → [amb+M(II)]- + NTA または [amb+M(II)+NTA]- → [NTA+M(II)]- + ambの 0 K での解離のエンタルピーです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:CRUNCHテキスト入力ファイルの形式。 このファイルには、質量中心衝突エネルギーの関数として形成される製品イオンの平均相対強度とその標準偏差が含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| アンブ | [amb+Zn(II)+NTA]- | [amb+Ni(II)+NTA]- | ||
| ティッカー | 経験 | ティッカー | 経験 | |
| ある | 214±2 | 214 | 219±2 | 218 |
| H | 211±5 | 216 | 212±3 | 215 |
| ある ES-IM-MSCCS 彼の 測定値は±4 Å2の不確実性を有する。 | ||||
表1:PM6適合体の[amb+M(II)+NTA]-のLJ衝突断面の比較 PM6コンフォーマーの理論的断面は、彼がES-IM-MSで測定した 実験CCSと比較されます。
| [amb+Zn(II)+NTA]- → | [amb+Ni(II)+NTA]- → | |||||||
| [amb+Zn(II)]- + 国税庁 | [NTA+Zn(II)]- + アンブ | [amb+Ni(II)]- + 国税庁 | [国税庁+ニ(II)]- + アンブ | |||||
| アンブ | δH0 | ΔH298 | δH0 | ΔH298 | δH0 | ΔH298 | δH0 | ΔH298 |
| ある | 118 | 127 | 149 | 182 | 146 | 171 | 148 | 154 |
| H | 96.4 | 92.3 | 111 | 115 | 125 | 140 | 161 | 216 |
表2:TCID分析からの熱化学的結果。 エネルギー依存反応 [amb+M(II)+NTA]- → [amb+M(II)]- + NTA または [amb+M(II)+NTA]- → [NTA+M(II)]- + ambは、非複雑 TCID モデル適合に由来する解離の 0 K エンタルピー (Δ H 0) と、ΔH0 に由来する解離の 298 K エンタルピー (ΔH298) と、PM6 回転周波数と振動周波数を用いた統計力学の熱補正を示しています。値は kJ/mol で指定します。
| [amb+Zn(II)]- + NTA→ | [NTA+Zn(II)]- + アンブ→ | [amb+Ni(II)]- + NTA→ | [国税庁+ニ(II)]- + アンブ→ | |||||
| [amb+Zn(II)+NTA]- | [amb+Zn(II)+NTA]- | [amb+Ni(II)+NTA]- | [amb+Ni(II)+NTA]- | |||||
| アンブ | △298 | K | △298 | K | △298 | K | △298 | K |
| ある | -34.0 | 9.05×105 | -21.8 | 6.59×103 | -45.7 | 1.01×108 | -53.1 | 2.01×109 |
| H | -29.3 | 1.36×105 | -30.2 | 1.95×105 | -47.0 | 1.71×108 | -31.1 | 2.81×105 |
表3:ギブスの会合の自由エネルギー(ΔG298)と平衡形成定数(K)。ΔG 298 および K における 298 K の逆反応 [amb+M(II)]- + NTA → [amb+M(II)+NTA]- および [NTA+M(II)]- + amb → [amb+M(II)+NTA]- に対する。ΔH298とPM6回転および振動周波数を用いた統計力学エントロピー計算から導出される。ΔG298 の値は kJ/mol 単位です。
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Discussion
重要なステップ
ES-IM-MS しきい値衝突誘発解離 (TCID) 解析。 TCIDは、衝突セルとしてアルゴンの存在下での転送T波セルを使用した。解離に先立ち、前駆体イオンは、イオン移動度(IM)セルを通過する際に窒素ガスとの低エネルギー衝突によって熱化される。これは、トラップをコリジョンセル6、40として使用することによって達成されるよりも再現性のあるエネルギー分解TCIDをもたらす。解離前の[amb+M(II)+NTA]- の熱化はまた、三元錯体の利用可能な内部エネルギーを298Kの温度を用いて特徴付けることを可能にする。転写セル内での解離とは、三元複合体およびその生成イオンが検出器への同じ平均到着時間を有することも意味し、これは、転写セル内でのみ起こった三元複合体の解離を特定するのに有用であった。解離が起こり得る他の領域は、ES源(これを避けるためにサンプリングコーンは25Vに保たれる)またはIMセルの入り口である。これらの領域における三元錯体の解離によって生成される生成イオンは、IM細胞内の三元複合体から分離されるため、転写セル内で生成されるものとはドリフト時間が異なる。それらの生成物イオンは分析から除外した。このプロトコルでは、共に整列した前駆体イオンと生成物イオンの積分到着時間分布のみが、それらの強度を決定するために使用されます。トラップバイアス設定は、IMセルへの注入電圧を制御する電圧で、IMセルの入り口のCIDに寄与します。トラップバイアスは14Vに設定され、バックグラウンドの解離を最小限に抑えながら、全体的な強度に過度に影響しませんでした。以前の研究41 では、ロイシンエンケファリンのペプチド二量体の有効温度(上限)がIM細胞の入り口で449Kであると決定された。しかし、有効温度は、二量体がIM細胞を通過するにつれて急速に低下した。ここで研究されたamb複合体の到着時間はガウス分布を示し、IMセルを通過する際に熱化されたことを示している。
ES-IM-MS 衝突断面積 (CCS) 解析。 CCSドリフト時間は、窒素との衝突の結果として実験的に見出された。これらの値は、既知の標準の検量線を使用してヘリウム由来のCCSドリフト時間に変換されました。PM6適合器のCCSを測定するために使用されるプログラムは、より一般的に使用されるヘリウム標準を必要とするため、これは不可欠です。
この手法の変更とトラブルシューティング
CRUNCH 入力テキスト ファイル形式。 CRUNCH プログラムに適した入力テキスト・ファイルを 図 7 に示します。ヘッダーは上から下に順に、ファイルの場所と CRUNCH のバージョンです。日付;エネルギーの数;最初のエネルギー列を除いたデータ系列の数。ソースファイル;前駆体複合体の質量;アルゴンの質量;実験の温度;作成日−1(質量中心衝突エネルギー)として指定されたxデータ。イオンビームの半値全幅(FWHM)である。これらの値は、TCID 実験ごとに変更する必要があります。イオンビームのFWHMエネルギー拡散とエネルギーゼロは、低電圧でCEをスキャンし、総イオン電流を監視することによって電位分析(RPA)を遅らせることによって決定する必要があります。しかしながら、現在の研究におけるIMの動作条件下では、イオン電流信号は、転送CEがその最低値に設定されたときに約50%しか減少しなかった。イオンビームエネルギーゼロおよびFWHMは、出口IMレンズを下げることによって追加のリターデーション時にのみ測定することができた。この後者の場合、RPA曲線の微分のFWHMは、ラボフレームで1.5Vまたは質量中心フレーム13で0.035eVの典型的なイオンエネルギー拡散を与えた。
圧力行はコリジョンセル内の圧力に関連しますが、ここでは使用しません。コリジョンセル内のアルゴンの圧力は変化させることができ、TCIDデータは3つの圧力で測定して単一の衝突条件に外挿することができます。しかし、この研究では1つの圧力しか使用されておらず、圧力は複数の衝突をもたらしました。単一の衝突のための新しいプラットフォームの開発は、進行中の研究の分野です。質量は、その強度が下の列にある2つの生成物イオンに関連しています。住居はデフォルトのままにすることができます。5つの列は質量中心衝突エネルギー(−1と指定)です。質量898.30 uの種のイオン強度の平均;種のイオン強度の標準偏差 898.30 u;質量253.53 uの種のイオン強度の平均;種のイオン強度の標準偏差は253.53 uである。
分子モデリング
コンフォーマーの数は、以前の研究9、10、11、12、13から派生したモデルを使用して最初に絞り込んだ。CRUNCHフィッティングでは、正確な閾値エネルギーを得るために、反応物、活性化分子、および遷移状態を慎重にスクリーニングする必要があります。これまでの研究9、10、11、12、13には、ここでのCRUNCHモデリングで使用されたパラメータで構造を取得するための[amb + M(II)]コンフォーマーの広範なスクリーニングが含まれていました。トランスペプチド結合を有する複合体のみが、IM-MS測定CCSHe10と一致するため、使用した。B3LYPおよびPM6分子モデリング法は、どちらも、Aa 1-Cys 2-Cys 7およびZn(II)またはNi(II)10,11,12,13のカルボキシレート末端配位を示す最低エネルギー[amb + M(II)]-コンフォーマーを予測します。既知のモデルの挙動に精通していたため、[amb+M(II)+NTA]-の新しい適合者をより効率的に決定することができました。コンフォーマの決定を支援するために、PM6法によって低エネルギーコンフォーマが見つかったため、最も実現可能で最低エネルギーコンフォーマが残るまで、それらはフィルタリングされ、体系的に再評価されました。
クランチモデリング
解離を観察するための時間窓。 この研究では、転写セルの開始からマルチチャンネルプレート検出器が配置されているTOF分析装置の終わりまでの50μsの時間窓を使用しました。活性化されたイオンがリフレクトロンTOF内でその間に解離すると、この準安定崩壊は異なるm / zで測定されるため、移送セル内の活性化とTOF質量分析器への入り口との間の実験的時間窓を使用する方がよいかもしれない。しかし、この研究では、マススペクトルで観察された生成物イオンはすべて、図3に示す未修飾のm/z種として同定された。これは、準安定崩壊が問題ではなかったことを示しています。さらなる研究は、高い閾値を有する既知の反応を調べ、50μsの時間窓およびRRKMモデリングを用いて正しい閾値エネルギーが得られることを確認することによってこれを調査することができる。
振動数のスケーリング係数。 PM6(1.062)振動周波数のNIST推奨スケーリング係数が使用された。これらは、[A+Zn(II)+NTA]-、[A+Ni(II)+NTA]-、および[H+Zn(II)+NTA]-のデータを当てはめるのに満足のいくものでした。より高いエネルギーチャネルが低エネルギーチャネルよりもエントロピー的に好まれるいくつかのケースでは、第2のチャネルの周波数をさらにスケーリングすることが必要な場合がある。1つのアプローチは、周波数を900cm-1未満にスケーリングして(これらは最も精度が低いため)、周波数を緩め、TSをよりエントロピー的に好むようにすることです。
パラメータの最適化。Yes オプションを使用して任意のパラメーターを現在の値で保持すると、データを正常に適合させるのに役立ちます。最初の適合では、E 0(2) が保持され、CONST、E0(1)、および N 個の変数を最適化することによってモデル TCID がデータに適合されます。適切な適合が見つかったら、パラメータオプションと任意のパラメータを現在値で保持するを使用して、CONST、E 0(1)、およびNを保持しながら、E0(2)をデータに最適化することができます。最後に、E 0(2) が最適化されると、パラメーター・オプションで、4 つのパラメーター CONST、E 0(1)、E 0(2)、および N のすべてがデータに対して最適化できるようにする必要があります。
選択したTCIDモデルを実験データに当てはめるためのエネルギー範囲。 実験データの適合に使用されるエネルギー範囲は、閾値領域への良好な適合を維持しながら、できるだけ多くの実験強度データを再現すべきである。まず、実験データの閾値でTCIDモデルを小さなエネルギー範囲に当てはめることから始めることができます。上昇する強度閾値挙動の直前にバックグラウンド強度を示す開始エネルギーを選択することができる。TCID適合度が実験データ範囲に最適化されたら、範囲を0.1eV増加させ、適合度を再度最適化する必要があります。この手順は、しきい値領域の適合度を維持しながら、できるだけ多くのデータ範囲に収まるように繰り返す必要があります。
熱化学分析。TオプションにおけるデルタHおよびSからの熱化学的結果は、TCIDモデル適合の標準偏差を推定するために、データに対する一連の異なるエネルギー範囲適合度と比較する必要があります。比較する適合値には、最初の上昇しきい値強度によく適合する小さな範囲と、より高いエネルギーを含むより大きな範囲を持つ範囲を含める必要があります。
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Disclosures
著者らには開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この資料は、1764436、NSF REUプログラム(CHE-1659852)、NSF機器サポート(MRI-0821247)、成功のための物理学と天文学奨学金(PASS)NSFプロジェクト(1643567)、ウェルチ財団(T-0014)、エネルギー省(TX-W-20090427-0004-50)およびL3コミュニケーションズのコンピューティングリソースによってサポートされている作業に基づいています。著者らは、ケント・M・アービン(ネバダ大学リノ校)とピーター・B・アーメントラウト(ユタ大学)がCRUNCHプログラムを共有し、PBAからのフィッティングに関するアドバイスをくれたことに感謝します。著者らは、シグマプログラムを共有してくれたカリフォルニア大学サンタバーバラ校のMichael T. Bowerのグループに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile HPLC-grade | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
| Alternative metal binding (amb) peptides | PepmicCo (www.pepmic.com) | designed peptides were synthized by order | |
| Ammonium acetate (ultrapure) | VWR | 97061-014 | |
| Ammonium hydroxide (trace metal grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
| Driftscope 2.1 software program | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| Gaussian 09 | Gaussian | Electronic Structure Modeling Software | |
| GaussView | Gaussian | Graphical Interface to Visualize Computations | |
| Glacial acetic acid (Optima grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A465-250 | |
| Ion-scaled Lennard-Jones (LJ) method | Sigma | Michael T. Bowers’ group of University of California at Santa Barbara | |
| MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL, polypropylene |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 87003-298 | 2.0 mL, polypropylene |
| Ni(II) nitrate hexahydrate (99% purity) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A15540 | |
| Poly-DL-alanine | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | P9003-25MG | |
| Waters Synapt G1 HDMS | Waters (www.waters.com) | quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer | |
| Zn(II) nitrate hexahydrate (99%+ purity) | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 12313 |
References
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- Plattner, D. Electrospray mass spectrometry beyond analytical chemistry: Studies of organometallic catalysis in the gas phase. International Journal of Mass Spectrometry. 207 (3), 125-144 (2001).
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