Summary
Den nuværende protokol beskriver transmissionselektronmikroskop (TEM) modifikationer med et lysbelysningssystem, fremstilling af flydende celler og in situ TEM-observationer af lysinducerede interaktioner mellem bakterieceller og en fotosensibilisator. Prøveforberedelsesmetoderne, elektronstråleskader og billeddannelse diskuteres også.
Abstract
Den nuværende protokol beskriver ændringerne af transmissionselektronmikroskopet (TEM) opsætning til in situ lysinducerede observationer. En optisk glasfiber indsat i elektronsøjlen over objektivlinsens polstykke og en laser, en justerbar lyskilde, blev brugt til at fremstille enheden. Efter at belysningen er kalibreret ved hjælp af et eksternt målesystem, giver det en mulighed for at justere belysningens intensitet til behovene i den observerede proces. Dette belysningssystem blev brugt til at afbilde antimikrobielle fotodynamiske terapifænomener, som i øjeblikket er genstand for intens forskning. Prøven blev fremstillet ved at spotte en suspension af bakterier på et carbon-, grafen- eller siliciumnitridsubstrat, blotte den overskydende opløsning, spotte fotosensibilisatoropløsningen, blotte den overskydende væske igen og derefter samle væskecellen med et andet substrat eller grafenfilm. Processen med selve billeddannelseseksperimentet omfatter valg af det rigtige sted til observation ved brug af lav forstørrelse og en minimumsdosis elektroner og derefter cyklisk aktivering af lyskilden for at tage efterfølgende billeder med bestemte intervaller med den mindste mængde elektroner, der er nødvendig. Elektrondosis for hver eksponering og tid og intensitet af den anvendte belysning skal registreres omhyggeligt på grund af kompleksiteten af de observerede fænomener, da processen samtidig er både lys- og elektrondrevet. Efter at det faktiske forsøg er udført, skal der foretages yderligere kontrolobservationer, hvor de samme doser elektroner anvendes, men uden yderligere lyspåvirkning, og mindre doser elektroner anvendes til højere doser lys. Dette gør det muligt at skelne lysinducerede mikrostrukturelle virkninger fra dem, der er forårsaget af elektroner inden for både livs- og materialevidenskab.
Introduction
Lysinducerede fænomener i høj opløsning er interessante inden for mange områder såsom nanoengineering 1,2,3, katalyse 4,5 og biofotonik6. Nogle originale designs, der tillader sådanne eksperimenter, kan findes i litteraturen, herunder ændringer af prøveindehaverne 1,4,7,8,9 og den optiske fiber, der er fastgjort til mikroskopet 10,11.
Kombinationen af lysbelysning, et flydende miljø og transmissionselektronmikroskopi (TEM) giver en fantastisk mulighed for detaljerede, dynamiske undersøgelser af fotoinducerede processer. Imidlertid er højvakuumtilstanden inde i mikroskopet ret ugunstig for mange væsker, især vandopløsninger. Væskeindkapsling, som beskytter den mod miljøet, kan opnås ved hjælp af nogle få teknikker, der hovedsageligt er baseret på grafen 12, siliciumnitrid13 eller kulstof14 substrater. Ud over forskning i materialevidenskab2 giver såkaldte flydende celler mulighed for at udføre ukonventionelle mikroskopiske observationer af biologiske prøver nær deres oprindelige forhold15. Sådanne observationer er ekstremt krævende, især for levende mikroorganismer såsom bakterieceller. Elektronstrålen som ioniserende stråling forårsager irreversibel skade på de hydrerede prøver, så elektrondosis skal specificeres16. Dette er nødvendigt for at minimere ugunstige virkninger, kontrollere skaden og undgå forvirrende artefakter. Den optimale maksimale elektrondosis, der tillader observationer af levende celler, er stadig et tvivlsomt emne16, men dosis på 30 e-/nm2 ser ud til at være tærskelværdien, i det mindste for bakterier17.
Nogle af emnerne af interesse for sådanne mikroskopiske undersøgelser er processer under antimikrobiel fotodynamisk terapi (APDT)18. Kort sagt fortsætter terapien som følger. Bakteriecellerne er omgivet af den lysfølsomme væske kaldet fotosensibilisator. Når lysbelysning gives ved en bestemt bølgelængde, genereres de cytotoksiske reaktive iltarter (ROS) fra energi- eller ladningsoverførsel fra de ophidsede fotosensibilisatormolekyler til det ilt, der er naturligt til stede i opløsningen. Patogener udsat for ROS inaktiveres hurtigt med meget høj effektivitet uden bivirkninger19. Responsen på terapien varierer for forskellige mikrober - for eksempel kan virkningen af den samme fotosensibilisator være helt forskellig for grampositive og gramnegative bakterier20. Generelt er det blevet fastslået, at hovedmålet for ROS er cellernes ydre strukturer, hvor skader resulterer i funktionelle lidelser i cellemembranen og følgelig fører til bakteriedød21,22. Imidlertid kan skader på nukleinsyrer og proteiner også betragtes som en årsag til inaktivering18, så det er stadig ukendt, hvilke cellestrukturer der er de vigtigste mål under denne proces19. En dybere forståelse af de skadelige processer kan bidrage til at forbedre denne endelige terapi. Sammenlignet med de lysmikroskopimetoder, der anvendes i APDT-forskning23, giver TEM-teknikker flere muligheder for at se på APDT-mekanismen med højere opløsning og forstørrelse24. TEM er allerede med succes blevet brugt til celleobservation under igangværende behandling, hvilket gjorde det muligt for os at studere grampositive bakterier og beskrive ændringerne i cellevæggen i detaljer 6,25.
Den nuværende protokol præsenterer en passende eksperimentel opsætning til højopløsningsbilleddannelse af lysinduceret bakterieinaktivering ved hjælp af TEM, hvilket kræver et ordentligt lysbelysningssystem, indkapsling af celler med en væske og streng elektrondosiskontrol. Bakterierne, der blev brugt til observationen, var Staphylococcus aureus, og en methylenblå opløsning blev brugt som fotosensibilisator. Den specielle lysbelysningsopsætning består af en justerbar halvlederlaser, der er forbundet direkte til mikroskopsøjlen ved hjælp af lysfiberen. Dette design giver ensartet bestråling i hele prøven på grund af den næsten parallelle placering af den optiske fiber til mikroskopaksen. Monokromatisk lys med høj intensitet genereret af laseren kan derefter bruges til at studere forskellige fotokemiske effekter. Lyset, der blev brugt i eksperimentet, havde en bølgelængde svarende til 660 nm, fordi methylenblåt i det synlige område har absorptionstoppe ved 613 nm og 664 nm26. Protokollen for væskeindkapsling er baseret på kulstofsubstrater, hvilket gør proceduren hurtig og ukompliceret. Endelig præsenteres en metode til lavdosis in situ TEM-observation af celler i væske. Vanskelighederne med prøveforberedelse, elektrondosiseffekterne på den følsomme prøve og rimelig billedfortolkning diskuteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Modifikation af transmissionselektronmikroskop
- Transformér transmissionselektronmikroskopet ved at forbinde den optiske fiber (se Materialetabel) til mikroskopkolonnen øverst på objektivlinsen. Tillad et par centimeter mellemrum mellem objektivlinsen og kondensatorlinsen plus en gratis plads til tilbehør.
BEMÆRK: En dedikeret prøveholder4 eller en holder til katodoluminescerende observationer i omvendt konfiguration1 kan også anvendes. - Kontroller systemet for lækager ved hjælp af ru vakuumpumper. Hvis systemet ikke viser en vakuumlækage, skal du teste systemet under et højt vakuum.
- Kontroller, at aktiveringen af vakuumsystemet ikke afviger fra standardventilmikroskopstart. I tilfælde af problemer med udførelse, montering eller idriftsættelse af modulet skal du kontakte autoriseret servicepersonale eller enhedsproducenten.
BEMÆRK: Den korrekt fremstillede og monterede belysning skjuler ikke elektronstrålen. Hvis strålen skifter successivt under mikroskopets drift, vil den ikke-ledende optiske fiber ikke være tilstrækkeligt dækket af et metalskjold og akkumulere en elektrisk ladning. I dette tilfælde skal du skubbe den optiske fiber dybt ind i den ledende jakke.
- Kontroller, at aktiveringen af vakuumsystemet ikke afviger fra standardventilmikroskopstart. I tilfælde af problemer med udførelse, montering eller idriftsættelse af modulet skal du kontakte autoriseret servicepersonale eller enhedsproducenten.
- Mål lysintensiteten ved hjælp af fotodiodeeffektsensoren (se Materialetabel). Hvis mellemrummet mellem polstykkerne i objektivlinsen ikke tillader måling inde i mikroskopet, måles prøvens geometri og belysningen og gengives disse forhold i en ekstern måleopsætning.
- Hvis mikroskopet ikke er udstyret med et elektrondosismålingssystem, udføres kalibreringen ved at måle strålestrømmen med en Faraday-kop (se Materialetabel) og numerisk beregne tætheden af elektroner, der rammer prøven27.
2. Indkapsling af bakterier med fotosensibilisatoren
- Placer to ubehandlede TEM-gitre dækket med amorft kulstof mellem to krydsede pincetter, der vender mod den kulbelagte side mod toppen. Hold gitterene så tæt på kanten som muligt.
BEMÆRK: For visse kombinationer af substrat, opløsning og prøve kan det være en fordel at bruge glødudladning på en eller begge masker for at fjerne urenheder fra fabrikken og opnå en maksimal hydrofil overflade28. Ved hjælp af eksemplet med S. aureus-bakterier og methylenblåopløsning blev det fastslået, at de bedste og mest reproducerbare resultater blev opnået på nyt, ikke-behandlet kulstof på kobbergitter uden yderligere glødudladning eller plasmarensning6. - Sæt 4 μL bakterieopløsning på et af gitterene. Den optiske tæthed af prøven skal ligge i området 5-10.
BEMÆRK: De bakterier, der blev anvendt i undersøgelsen, blev renset fra kulturen og spredt i PBS-buffer. Det anbefales stærkt at kontrollere koncentrationen af bakterier i den friske prøve hver gang ved hjælp af den, f.eks. ved hjælp af negative farvningsmetoder, efter de etablerede protokoller, der er tilgængelige 29,30,31. - Vent i 60 s og tør forsigtigt væsken ved hjælp af filterpapir. Prøv at sprede væsken gennem hele gitteroverfladen under denne proces.
- Sæt 4 μL fotosensibilisator på samme gitter.
BEMÆRK: Methylenblåt i en koncentration på 2 μg/ml blev anvendt som fotosensibilisator til denne undersøgelse. - Efter 5 s skal du slette væsken. Efterlad et meget tyndt lag væske på underlaget.
- Placer hurtigt det tørre gitter oven på det, der er dækket af væske.
- Flyt forsigtigt det øverste gitter til kanten af det andet, og klem substraterne ved kanterne ved hjælp af pincet.
BEMÆRK: Noget væske kan strømme ud af prøven på dette stadium, hvilket betyder, at der ikke blev drænet nok. Dette betyder dog ikke nødvendigvis, at dannelsen af den flydende celle vil mislykkes. - Gentag forsigtigt klemmen.
BEMÆRK: Det er lettere at udføre dette trin ved at dreje pincetten med 90°, så de ligger vinkelret på bordet, og begge pincetspidser forbliver i samme højde, ikke afhængigt af åben/luk position. - Lad væskecellen stå mellem pincetten i 1 min.
- Prøven indsættes i TEM-holderen lige efter afslutningen af tilberedningen.
BEMÆRK: Spændingen på holderens monteringsplade/ring hjælper underlagene med at klæbe og holde væsken inde.- Hvis det er muligt, pumpes prøveholderen ind i en ekstern pumpestation for at reducere forureningen af mikroskopet ved at fordampe væske.
3. In situ TEM-observationer af bakterieceller i væske-elektrondosiseffekt
- Prøven indsættes i mikroskopet.
- Start observationerne i lav forstørrelsestilstand for at finde et passende observationsområde.
BEMÆRK: Mørkere områder er mest tilbøjelige til at være flydende på grund af elektronstrålespredning.- Under observationerne skal du holde elektrondosis så lav som muligt. Udvid eksponeringstiden (op til 2 s for en accelererende spænding på 150 kV og en forstørrelse på 5.000x). Forstørrelsen på 5.000x for det bundmonterede kamera (omtrentligt synsfelt er 10 μm) er tilstrækkelig til at afbilde bakterier med en diameter på ~ 1 μm.
BEMÆRK: Nogle gange er det ikke let at skelne væsken, så i begyndelsen af observationerne er det nyttigt at fokusere elektronstrålen, hvor den sandsynligvis vil være flydende. Væsken skal bevæge sig på en fokuseret elektronstråle, og boblerne vises. Efter denne verifikation er det nødvendigt at finde et andet område for yderligere observationer.
- Under observationerne skal du holde elektrondosis så lav som muligt. Udvid eksponeringstiden (op til 2 s for en accelererende spænding på 150 kV og en forstørrelse på 5.000x). Forstørrelsen på 5.000x for det bundmonterede kamera (omtrentligt synsfelt er 10 μm) er tilstrækkelig til at afbilde bakterier med en diameter på ~ 1 μm.
- Find cellerne omgivet af væske ved den passende forstørrelse med forlænget eksponeringstid, og tag det første billede med det samme. Hold elektrondosis konstant og saml billeder hver 30. s for at observere ændringerne.
- Undersøg omhyggeligt billederne og beregn den samlede elektrondosis27 , der svarer til de første synlige ændringer i cellerne.
4. In situ TEM-observationer af lysinducerede processer mellem bakterieceller og fotosensibilisator
- Før du starter eksperimentet, skal du indstille laserlysintensiteten ved at justere den aktuelle værdi. Vælg den passende bølgelængde i henhold til fotosensibilisatorens absorptionsspektrum. I henhold til det forrige kalibreringsplot (trin 1.4.) skal du vælge den aktuelle værdi svarende til den laveste lysintensitet.
BEMÆRK: Den lysbølgelængde, der blev brugt i denne undersøgelse, var 660 nm. - Prøven indsættes i mikroskopet, og observationsområdet findes efter trin 3.2. i det foregående afsnit.
- Tag det første billede af cellen, før du starter belysningen af prøven, og brug stråleblankeren til at slukke for elektronstrålen for at undgå virkningerne af elektronbestråling.
- Tænd laseren. Start med en kort belysningstid (her 30 s), da laserlyset har relativt høj intensitet. Efter den tid skal du slukke for lyskilden.
- Sluk for stråleblanketten, og tag billedet med det samme. Hvis det er muligt, skal du bruge en automatisk algoritme til kun at udsætte prøven for den tid, der er nødvendig for at tage billedet. Mål omhyggeligt elektronbestrålingstiden for at beregne elektrondosis27 , der anvendes til billeddannelse.
- Gentag trin 4.4. og trin 4.5. for at opnå den forventede lysbelysningstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle opsætning blev designet til at observere de lysinducerede processer, der forekommer i en væske med høj opløsning. Den konkurrencedygtige analyse af billederne tillod os at skelne skaden forårsaget af elektronstrålen fra ændringer relateret til den fotokemiske reaktion. Elektronstrålens virkning på den følsomme prøve (i dette tilfælde cellerne indkapslet med væske) var synlig over hele det bestrålede område, da elektronerne trængte ensartet igennem det. Selvfølgelig afhænger effekten af elektrondosis, så mere signifikante ændringer i prøvemorfologien kan observeres hurtigere for en mere fokuseret stråle. Sammenlignet med denne alvorlige skade forekom de faktiske destruktive virkninger af fotodynamisk inaktivering kun i bestemte dele af celler i områder omgivet af den belyste fotosensibilisator.
I eksemplet med bakteriebilleddannelse og ifølge litteraturen synes dosis på 30 e-/nm2 at være den dødelige tærskelværdi for bakterier17, som blev stærkt overskredet i forfatternes tidligere undersøgelser 6,25. De synlige ændringer i cellen blev imidlertid ikke bemærket, før de nåede elektrondosis på 6000 e−/nm2. Resultaterne viste en bemærkelsesværdig nedbrydning af det ydre lag af cellen forårsaget af de reaktive iltarter genereret ved let bestråling af fotosensibilisatoren efter 1 minut (figur 1). Yderligere lysbelysning gjorde ændringerne mere synlige (figur 1D,G).
Indkapslingen af cellerne mellem kulstofsubstraterne var tilstrækkelig til at udføre konstante observationer i mindst 1 time. Korrekte observationspletter med tilstrækkelig væske kan let findes ved lav forstørrelse, da disse områder ser mørkere og slørede ud (angivet med rammerne i figur 2A). De væskedækkede bakterier er mindre synlige end de tørre, men kan stadig skelnes (figur 2B). Det er nyttigt at se på væskegrænsen under billeddannelsen, og dens bevægelse kan let detekteres, hvilket indebærer, at det valgte område kan være uegnet og ustabilt (figur 3). Et andet problem under observationer er fordampningen af vandet og udfældningen af opløsningen, som kan forekomme i tilfældige områder af prøven, herunder områderne omkring bakterierne (figur 3B, C).
Figur 1: Eksemplariske resultater af den fotodynamiske behandling af bakterier. (A) Ordningen for den flydende celle indeholdende bakterieceller og methylenblåt. (B) Cellen før lysbelysning. (C) Cellen efter belysning i 1 min. (D) Cellen efter belysning i 10 min. (E-G) De forstørrede områder fra (B-D). Elektrondosis var lig med henholdsvis 1600 e−/nm 2, 2500 e−/nm 2 og 6000 e−/nm 2. Figuren er gengivet fra Żak et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: TEM-billeder af S. aureus indkapslet med methylenblåt mellem to carbonfilm . (A) Billede med lav forstørrelse viser begge områder med en høj mængde væske (angivet med de gule rammer) og tørre pletter. En hurtig undersøgelse af prøven ved denne forstørrelse giver oplysninger om, hvorvidt indkapslingen var vellykket eller ej. (B) Væskegrænsen er tydeligt synlig i det forstørrede område, og bakterierne, der er dækket af fotosensibilisatoren, kan skelnes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: TEM-billeder af ugunstige virkninger, der kan opstå under billeddannelse . (A) I begyndelsen var cellen ensartet omgivet af væsken, som dækkede det meste af observationsområdet. (B) Baseret på den konstante elektronstrålebestråling kan væskens bevægelse og fordampning og starten af udfældningen fra opløsningen bemærkes. (C) Fortsættelsen af processerne fører til irreversibel bevægelse, skumdannelse og opløsning af fotosensibilisatoren, hvilket gør yderligere observationer umulige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: De ugunstige virkninger, der fører til forkerte konklusioner . (A) Den krystalliserede væske. (B) Forureningen satte sig på cellen. (C) Skumdannelse forårsaget af elektronstrålen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Installation og idriftsættelse af belysningen kræver grundlæggende servicekendskab og kan beskadige mikroskopet. Den enkleste måde at introducere lyset til mikroskopet er at forbinde den optiske fiber fra toppen af objektivlinsen, hvor der normalt er plads til TEM-afbøjningsspolerne og yderligere detektorer. Der kan også forventes mere ledig plads fra ældre topindgangsenheder, hvor det samme sted huser prøvevakuumlåsen og prøveinstallationsmekanismen. Denne konfiguration er bredt beskrevet i en tidligere rapport25, som indeholder et eksemplarisk belysningsdesign. Hvis mikroskopets indre ikke tillader installation af den optiske fiber over objektivlinsen, kan belysningen installeres inde i objektivlinsens stangstykke fra siden32. Andre løsninger forudsætter anvendelse af en dedikeret prøveholder4 eller omvendt anvendelse af holderen til katodoluminescerende observationer1.
Generelt er forberedelsen af flydende prøver til TEM kompliceret og kræver erfaring og manuelle færdigheder. Det kritiske trin i væskecelleforberedelse er trin 2.6. af protokollen. Det er vigtigt at placere det andet gitter hurtigt for at undgå fordampning af væsken. Metoden, der præsenteres her, er enkel og kræver ikke usædvanlige materialer; det passer dog muligvis ikke til alle væsker. I nogle tilfælde er det gavnligt at rense substratet med plasma for at øge dets hydrofilicitet. For flydende prøver, især vandopløsninger, som ikke indeholder partikler og / eller celler, der kan tjene som afstandsstykke mellem carbonfilmene, kan indkapslingen mislykkes, da al væsken kan strømme ud mellem de flade overflader. Brug af en grafenvæskecelle fremstillet ved hjælp af et hullet substrat, der skaber små "lommer" til væske, kan være mere egnet33.
TEM-observationer udført i væske kan forstyrres af nogle få faktorer relateret til prøveforberedelsen og de ugunstige virkninger forårsaget af elektronstrålen. Den første omfatter løsrivelse af substrater og bevægelse af væsken, ofte efterfulgt af brud på carbonfilmen, som forekommer for høje væskevolumener i området og / eller ved elektronbestråling. Dette kan undgås ved at minimere væskevolumenet i trin 2.5. af protokollen.
Bestrålingen med meget energiske elektroner fører til energioverførsel, hvilket resulterer i opvarmning eller radiolyse. Efter interaktion med stråling nedbrydes vand til radikaler (H· og OH·), H2 og opløste elektroner. Disse arter deltager i yderligere reaktioner og genererer således forskellige produkter og forårsager skade på prøven34. Derfor er det meget vigtigt at holde elektrondosis lav under observationerne (trin 3.2.), især for følsomme prøver som celler. Andre virkninger forårsaget af elektronstrålen er nedbør fra opløsningen (figur 4A) og skumdannelse af væsken (figur 4C). Sænkning af elektrondosis hjælper med at undgå disse to negative virkninger, men nogle gange er det ikke muligt at fjerne dem. Der kan også være en vis strålingsfølsom forurening i opløsningen, som sætter sig på cellen (figur 4B) og ændrer sig ved elektronstrålepåvirkning. Dette er ugunstigt, da urenheden kan tages som en del af cellen, som er beskadiget ved lysbestrålingen, hvilket fører til forkerte konklusioner. Den bedste måde at opnå pålidelige billeder på er at finde et uforurenet område og holde elektrondosis så lav som muligt.
Pålidelige in situ TEM-undersøgelser af fotoreaktioner kræver en god sammenligning mellem de processer, der induceres af lys, med dem, der er forårsaget af elektronstrålen. Bortset fra at sænke elektrondosis beskrevet i trin 3.2., er det nyttigt at slukke for elektronkilden for tidspunktet for lysbelysning, så de uforstyrrede resultater kan observeres, som understreget i trin 4.3. af protokollen.
Den nuværende protokol kan bruges til at observere lysinducerede reaktioner (især i væske), for eksempel lys på metal nanoklynger2, lysinducerede katalyseprocesser1 og lysets indflydelse på biologiske prøver (f.eks. celler med en fotosensibilisator, kloroplaster).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskningen blev støttet af Miniatura-bevillingen (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
References
- Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
- Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
- Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
- Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
- Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
- Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
- Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
- Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
- Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
- Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
- Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
- Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
- Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
- Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
- De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
- Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
- Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
- Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
- Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
- Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
- Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
- Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
- Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
- Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
- Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
