Summary
El presente protocolo describe modificaciones del microscopio electrónico de transmisión (TEM) con un sistema de iluminación de luz, la fabricación de células líquidas y observaciones TEM in situ de interacciones inducidas por la luz entre células bacterianas y un fotosensibilizador. También se discuten los métodos de preparación de muestras, el daño del haz de electrones y las imágenes.
Abstract
El protocolo actual describe las modificaciones de la configuración del microscopio electrónico de transmisión (TEM) para observaciones in situ inducidas por la luz. Una fibra óptica de vidrio insertada en la columna de electrones sobre el poste de la lente del objetivo, y un láser, una fuente de luz ajustable, se utilizó para fabricar el dispositivo. Después de que el iluminador ha sido calibrado utilizando un sistema de medición externo, permite ajustar la intensidad de la iluminación a las necesidades del proceso observado. Este sistema de iluminación se utilizó para obtener imágenes de fenómenos de terapia fotodinámica antimicrobiana, que actualmente son objeto de una intensa investigación. La muestra se preparó detectando una suspensión de bacterias en un sustrato de carbono, grafeno o nitruro de silicio, borrando el exceso de solución, detectando la solución fotosensibilizadora, secando el exceso de líquido nuevamente y luego ensamblando la celda líquida con un segundo sustrato o película de grafeno. El proceso del experimento de imágenes en sí incluye elegir el lugar correcto para la observación con el uso de un aumento bajo y una dosis mínima de electrones, y luego la activación cíclica de la fuente de luz para capturar imágenes posteriores a intervalos específicos con la cantidad mínima de electrones necesarios. La dosis de electrones de cada exposición y el tiempo y la intensidad de la iluminación utilizada deben registrarse cuidadosamente debido a la complejidad de los fenómenos observados, ya que, al mismo tiempo, el proceso es impulsado tanto por la luz como por los electrones. Después de realizar el experimento real, se deben realizar observaciones de control adicionales, en las que se usan las mismas dosis de electrones pero sin influencia de luz adicional y se usan dosis más pequeñas de electrones para dosis más altas de luz. Esto permite distinguir los efectos microestructurales inducidos por la luz de los causados por los electrones tanto en el campo de la vida como en el de la ciencia de los materiales.
Introduction
Los fenómenos inducidos por la luz en alta resolución son interesantes en muchos campos como la nanoingeniería 1,2,3, la catálisis 4,5 y la biofotónica6. Algunos diseños originales que permiten tales experimentos se pueden encontrar en la literatura, incluyendo modificaciones de los portamuestras 1,4,7,8,9 y la fibra óptica unida al microscopio 10,11.
La combinación de iluminación de luz, un ambiente líquido y microscopía electrónica de transmisión (TEM) brinda una gran oportunidad para estudios detallados y dinámicos de procesos fotoinducidos. Sin embargo, la condición de alto vacío dentro del microscopio es bastante desfavorable para muchos líquidos, especialmente soluciones de agua. La encapsulación líquida, que lo protege del medio ambiente, se puede lograr utilizando algunas técnicas basadas principalmente en sustratos de grafeno 12, nitruro de silicio13 o carbono14. Además de la investigación en ciencia de materiales2, las llamadas células líquidas ofrecen posibilidades para realizar observaciones microscópicas no convencionales en especímenes biológicos cerca de sus condiciones nativas15. Tales observaciones son extremadamente exigentes, especialmente para microorganismos vivos como las células bacterianas. El haz de electrones como radiación ionizante causa daños irreversibles a las muestras hidratadas, por lo que la dosis de electrones debe especificarse16. Esto es necesario para minimizar los efectos desfavorables, controlar el daño y evitar artefactos confusos. La dosis máxima óptima de electrones que permite observaciones de células vivas sigue siendo un tema cuestionable16, pero la dosis de 30 e−/nm2 parece ser el valor umbral, al menos para las bacterias17.
Algunos de los temas de interés para tales estudios microscópicos son los procesos durante la terapia fotodinámica antimicrobiana (APDT)18. En resumen, la terapia procede de la siguiente manera. Las células bacterianas están rodeadas por el líquido fotosensible llamado fotosensibilizador. Cuando la iluminación de la luz se da a una longitud de onda específica, las especies reactivas citotóxicas de oxígeno (ROS) se generan a partir de la transferencia de energía o carga de las moléculas fotosensibilizadoras excitadas al oxígeno naturalmente presente en la solución. Los patógenos expuestos a ROS se inactivan rápidamente con una eficiencia muy alta, sin efectos secundarios19. La respuesta a la terapia varía para distintos microbios; por ejemplo, el impacto del mismo fotosensibilizador puede ser bastante diferente para las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas20. En general, se ha establecido que el objetivo principal de ROS son las estructuras externas de las células, donde el daño resulta en trastornos funcionales de la membrana celular y, en consecuencia, conducen a la muerte de las bacterias21,22. Sin embargo, el daño a los ácidos nucleicos y proteínas también puede considerarse una causa de inactivación18, por lo que aún se desconoce qué estructuras celulares son los principales objetivos durante este proceso19. Una comprensión más profunda de los procesos dañinos podría ayudar a mejorar esta terapia definitiva. En comparación con los métodos de microscopía óptica utilizados en la investigación de APDT23, las técnicas TEM ofrecen más posibilidades de observar el mecanismo APDT con mayor resolución y aumento24. TEM ya se ha utilizado con éxito para la observación celular durante la terapia en curso, lo que nos permitió estudiar el daño bacteriano grampositivo y describir los cambios que ocurren dentro de la pared celular en detalle 6,25.
El protocolo actual presenta una configuración experimental adecuada para imágenes de alta resolución de la inactivación de bacterias inducida por la luz utilizando TEM, que requiere un sistema de iluminación de luz adecuado, la encapsulación de células con un líquido y un estricto control de la dosis de electrones. La bacteria utilizada para la observación fue Staphylococcus aureus, y se utilizó una solución de azul de metileno como fotosensibilizador. La configuración especial de iluminación de luz comprende un láser semiconductor sintonizable conectado directamente a la columna del microscopio utilizando la fibra de luz. Este diseño proporciona una irradiación uniforme en toda la muestra debido a la colocación casi paralela de la fibra óptica en el eje del microscopio. La luz monocromática de alta intensidad generada por el láser se puede utilizar para estudiar diversos efectos fotoquímicos. La luz utilizada en el experimento tenía una longitud de onda igual a 660 nm porque, en la región visible, el azul de metileno tiene picos de absorción a 613 nm y 664 nm26. El protocolo para la encapsulación líquida se basa en sustratos de carbono, lo que hace que el procedimiento sea rápido y sin complicaciones. Finalmente, se presenta un método para la observación de TEM in situ de baja dosis de células en líquido. Se discuten las dificultades con respecto a la preparación de la muestra, los efectos de la dosis de electrones en la muestra sensible y la interpretación razonable de la imagen.
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Protocol
1. Modificación del microscopio electrónico de transmisión
- Modifique el microscopio electrónico de transmisión conectando la fibra óptica (consulte la Tabla de materiales) a la columna del microscopio en la parte superior de la lente del objetivo. Permita unos pocos centímetros de espacio entre la lente del objetivo y la lente del condensador, además de una ranura libre para accesorios.
NOTA: También se puede emplear un portamuestras dedicado4 o un soporte para observaciones cattodoluminiscentes en configuración inversa1 . - Compruebe si el sistema tiene fugas utilizando bombas de vacío rugosas. Si el sistema no muestra una fuga de vacío, pruebe el sistema bajo un vacío alto.
- Compruebe que el accionamiento del sistema de vacío no se desvíe del inicio estándar del microscopio ventilado. En caso de problemas con la ejecución, montaje o puesta en marcha del módulo, póngase en contacto con el personal de servicio autorizado o con el fabricante del dispositivo.
NOTA: El iluminador correctamente fabricado y montado no oscurecerá el haz de electrones. Si el haz se desplaza sucesivamente durante el funcionamiento del microscopio, la fibra óptica no conductora no estará suficientemente cubierta con un blindaje metálico y acumulará una carga eléctrica. En este caso, deslice la fibra óptica profundamente en la cubierta conductora.
- Compruebe que el accionamiento del sistema de vacío no se desvíe del inicio estándar del microscopio ventilado. En caso de problemas con la ejecución, montaje o puesta en marcha del módulo, póngase en contacto con el personal de servicio autorizado o con el fabricante del dispositivo.
- Mida la intensidad de la luz utilizando el sensor de potencia de fotodiodo (consulte la Tabla de materiales). Si el espacio entre las piezas del polo de la lente del objetivo no permite la medición dentro del microscopio, mida la geometría de la muestra y del iluminador y reproduzca estas condiciones en una configuración de medición externa.
- Si el microscopio no está equipado con un sistema de medición de dosis de electrones, realice la calibración midiendo la corriente del haz con una copa de Faraday (consulte la Tabla de materiales) y calculando numéricamente la densidad de los electrones que golpean la muestra27.
2. Encapsulación de bacterias con el fotosensibilizador
- Coloque dos rejillas TEM sin tratar cubiertas con carbono amorfo entre dos pinzas cruzadas orientadas hacia el lado recubierto de carbono hacia la parte superior. Mantenga las rejillas lo más cerca posible del borde.
NOTA: Para ciertas combinaciones de sustrato, solución y muestra, puede ser beneficioso utilizar descarga luminosa en una o ambas mallas para eliminar las impurezas de fábrica y obtener una superficie hidrófila máxima28. Utilizando el ejemplo de la bacteria S. aureus y la solución de azul de metileno, se determinó que los mejores y más reproducibles resultados se obtuvieron en carbono nuevo, no tratado en rejillas de cobre sin descarga incandescente adicional o limpieza por plasma6. - Ponga 4 μL de solución bacteriana en una de las rejillas. La densidad óptica de la muestra debe estar en el rango de 5-10.
NOTA: Las bacterias utilizadas en el estudio se purificaron del cultivo y se dispersaron en tampón PBS. Se recomienda encarecidamente verificar la concentración de bacterias en la muestra fresca cada vez que se utilice, por ejemplo, utilizando métodos de tinción negativa, siguiendo los protocolos establecidos disponibles 29,30,31. - Espere 60 s y seque cuidadosamente el líquido con papel de filtro. Trate de esparcir el líquido por toda la superficie de la rejilla durante este proceso.
- Coloque 4 μL de fotosensibilizador en la misma rejilla.
NOTA: El azul de metileno a una concentración de 2 μg/ml se utilizó como fotosensibilizador para el presente estudio. - Después de 5 s, borre el líquido. Deje una capa muy delgada de líquido sobre el sustrato.
- Coloque rápidamente la rejilla seca encima de la cubierta con líquido.
- Mueva suavemente la rejilla superior hasta el borde de la segunda y apriete los sustratos en los bordes con pinzas.
NOTA: Algo de líquido puede fluir fuera de la muestra en esta etapa, lo que significa que no se drenó lo suficiente. Sin embargo, esto no significa necesariamente que la formación de la célula líquida no tendrá éxito. - Repita cuidadosamente el apretón.
NOTA: Es más fácil realizar este paso girando las pinzas 90° para que queden perpendiculares a la mesa y las puntas de ambas pinzas permanezcan a la misma altura, sin depender de la posición de apertura/cierre. - Deje la celda líquida entre las pinzas durante 1 minuto.
- Inserte la muestra en el soporte TEM justo después de terminar la preparación.
NOTA: La tensión de la placa / anillo de montaje del soporte ayudará a que los sustratos se adhieran y mantengan el líquido en el interior.- Si es posible, bombee el portamuestras a una estación de bombeo externa para reducir la contaminación del microscopio por evaporación del líquido.
3. Observaciones TEM in situ de células bacterianas en efecto de dosis de electrones líquidos
- Inserte la muestra en el microscopio.
- Inicie las observaciones en modo de bajo aumento para encontrar un área de observación adecuada.
NOTA: Las áreas más oscuras tienen más probabilidades de ser líquidas debido a la dispersión del haz de electrones.- Durante las observaciones, mantenga la dosis de electrones lo más baja posible. Amplíe el tiempo de exposición (hasta 2 s para una tensión de aceleración de 150 kV y un aumento de 5.000x). El aumento de 5.000x para la cámara de montaje inferior (el campo de visión aproximado es de 10 μm) es suficiente para obtener imágenes de bacterias con un diámetro de ~ 1 μm.
NOTA: A veces, no es fácil distinguir el líquido, por lo que, al comienzo de las observaciones, es útil enfocar el haz de electrones donde es probable que sea líquido. El líquido debe moverse sobre un haz de electrones enfocado, y aparecerán las burbujas. Después de esta verificación, es necesario encontrar otra área para observaciones adicionales.
- Durante las observaciones, mantenga la dosis de electrones lo más baja posible. Amplíe el tiempo de exposición (hasta 2 s para una tensión de aceleración de 150 kV y un aumento de 5.000x). El aumento de 5.000x para la cámara de montaje inferior (el campo de visión aproximado es de 10 μm) es suficiente para obtener imágenes de bacterias con un diámetro de ~ 1 μm.
- Encuentre las celdas rodeadas de líquido con el aumento apropiado con un tiempo de exposición prolongado y capture la primera imagen inmediatamente. Mantenga constante la dosis de electrones y recopile imágenes cada 30 s para observar los cambios.
- Examine cuidadosamente las imágenes y calcule la dosis total de electrones27 que corresponde a los primeros cambios visibles en las células.
4. Observaciones TEM in situ de procesos inducidos por la luz entre células bacterianas y fotosensibilizadores
- Antes de comenzar el experimento, ajuste la intensidad de la luz láser ajustando el valor actual. Elija la longitud de onda adecuada de acuerdo con el espectro de absorción del fotosensibilizador. De acuerdo con la gráfica de calibración anterior (paso 1.4.), elija el valor actual correspondiente a la intensidad de luz más baja.
NOTA: La longitud de onda de la luz utilizada en este estudio fue de 660 nm. - Inserte la muestra en el microscopio y encuentre el área de observación siguiendo el paso 3.2. en la sección anterior.
- Capture la primera imagen de la célula antes de comenzar la iluminación de la muestra y use la manta del haz para apagar el haz de electrones y evitar los efectos de la irradiación de electrones.
- Encienda el láser. Comience con un tiempo de iluminación corto (aquí 30 s) ya que la luz láser tiene una intensidad relativamente alta. Después de ese tiempo, apague la fuente de luz.
- Apague la manta de haz y capture la imagen inmediatamente. Si es posible, utilice un algoritmo automático para exponer la muestra sólo durante el tiempo necesario para tomar la imagen. Mida cuidadosamente el tiempo de irradiación de electrones para calcular la dosis de electrones27 utilizada para obtener imágenes.
- Repita el paso 4.4. y paso 4.5. para obtener el tiempo de iluminación de la luz esperado.
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Representative Results
La configuración experimental fue diseñada para observar los procesos inducidos por la luz que ocurren en un líquido con alta resolución. El análisis competitivo de las imágenes nos permitió distinguir el daño causado por el haz de electrones de los cambios relacionados con la reacción fotoquímica. El efecto del haz de electrones en la muestra sensible (en este caso, las células encapsuladas con líquido) fue visible en toda el área irradiada a medida que los electrones penetraban a través de ella uniformemente. Por supuesto, el efecto depende de la dosis de electrones, por lo que se pueden observar cambios más significativos en la morfología de la muestra más rápido para un haz más enfocado. En comparación con este daño severo, los efectos destructivos reales de la inactivación fotodinámica ocurrieron en partes específicas de las células solo en áreas rodeadas por el fotosensibilizador iluminado.
En el ejemplo de la imagen de bacterias, y de acuerdo con la literatura, la dosis de 30 e-/nm2 parece ser el valor umbral letal para las bacterias17, que fue altamente superado en los estudios previos de los autores 6,25. Sin embargo, los cambios visibles en la célula no se notaron antes de alcanzar la dosis de electrones de 6000 e−/nm2. Los resultados mostraron una notable degradación de la capa externa de la célula causada por las especies reactivas de oxígeno generadas por la irradiación de luz del fotosensibilizador después de 1 min (Figura 1). La iluminación adicional de la luz hizo que los cambios fueran más visibles (Figura 1D, G).
La encapsulación de las células entre los sustratos de carbono fue suficiente para realizar observaciones constantes durante al menos 1 h. Los puntos de observación adecuados con suficiente líquido se pueden encontrar fácilmente con un aumento bajo, ya que estas áreas aparecen más oscuras y borrosas (indicadas por los marcos de la Figura 2A). Las bacterias cubiertas de líquido son menos visibles que las secas, pero aún se pueden distinguir (Figura 2B). Es útil observar el límite del líquido durante la imagen, y su movimiento se puede detectar fácilmente, lo que implica que el área elegida puede ser inadecuada e inestable (Figura 3). Otro problema durante las observaciones es la evaporación del agua y la precipitación de la solución, que puede ocurrir en áreas aleatorias de la muestra, incluidas las áreas que rodean a las bacterias (Figura 3B, C).
Figura 1: Resultados ejemplares del tratamiento fotodinámico de bacterias. (A) El esquema de la célula líquida que contiene células bacterianas y azul de metileno. (B) La celda antes de la iluminación de la luz. (C) La celda después de la iluminación durante 1 min. (D) La celda después de la iluminación durante 10 min. (E-G) Las áreas ampliadas de (B-D). La dosis de electrones fue igual a 1600 e−/nm 2, 2500 e−/nm 2 y 6000 e−/nm 2, respectivamente. La figura se reproduce de Żak et al.25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes TEM de S. aureus encapsuladas con azul de metileno entre dos películas de carbono . (A) La imagen de bajo aumento presenta ambas áreas con una alta cantidad de líquido (indicado por los marcos amarillos) y manchas secas. Un examen rápido de la muestra con este aumento proporciona información sobre si la encapsulación fue exitosa o no. (B) El límite líquido es claramente visible en el área ampliada, y se pueden distinguir las bacterias cubiertas con el fotosensibilizador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes TEM de efectos desfavorables que pueden ocurrir durante la obtención de imágenes . (A) Al principio, la célula estaba rodeada uniformemente por el líquido, que cubría la mayor parte del área de observación. (B) Basado en la irradiación constante del haz de electrones, se puede notar el movimiento y la evaporación del líquido y el inicio de la precipitación de la solución. (C) La continuación de los procesos conduce a un movimiento irreversible, espuma y desintegración del fotosensibilizador, lo que hace imposible realizar más observaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los efectos desfavorables que conducen a conclusiones erróneas . (A) El líquido cristalizado. (B) La contaminación se asentó en la celda. (C) Espuma causada por el haz de electrones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La instalación y puesta en marcha del iluminador requieren conocimientos básicos de servicio y pueden dañar el microscopio. La forma más sencilla de introducir la luz en el microscopio es conectar la fibra óptica desde la parte superior de la lente del objetivo, donde generalmente hay espacio para las bobinas de deflexión TEM y detectores adicionales. También se puede esperar más espacio libre de los dispositivos de entrada superior más antiguos, donde la misma ubicación alberga el bloqueo de vacío de muestra y el mecanismo de instalación de muestras. Esta configuración se describe ampliamente en un informe anterior25, que contiene un diseño ejemplar de iluminador. Si el interior del microscopio no permite la instalación de la fibra óptica por encima de la lente del objetivo, el iluminador puede instalarse dentro del poste de la lente del objetivo desde el lado32. Otras soluciones suponen el uso de un portamuestras dedicado4 o el uso inverso del soporte para observaciones cattodoluminiscentes1.
En general, la preparación de muestras líquidas para TEM es complicada y requiere experiencia y habilidades manuales. El paso crítico en la preparación de células líquidas es el paso 2.6. del protocolo. Es importante colocar la segunda rejilla rápidamente para evitar la evaporación del líquido. El método presentado aquí es simple y no requiere materiales poco comunes; Sin embargo, es posible que no se adapte a todos los líquidos. En algunos casos, es beneficioso limpiar el sustrato con plasma para aumentar su hidrofilicidad. Para muestras líquidas, especialmente soluciones de agua, que no contienen partículas y / o células que puedan servir como espaciador entre las películas de carbono, la encapsulación podría no tener éxito ya que todo el líquido puede fluir entre las superficies planas. El uso de una célula líquida de grafeno preparada con un sustrato agujereado, que crea pequeñas "bolsas" para el líquido, podría ser más adecuado33.
Las observaciones TEM realizadas en líquido pueden verse perturbadas por algunos factores relacionados con la preparación de la muestra y los efectos desfavorables causados por el haz de electrones. El primero incluye el desprendimiento de sustratos y el movimiento del líquido, a menudo seguido por la ruptura de la película de carbono, que ocurre para altos volúmenes de líquido en el área y / o en la irradiación de electrones. Esto se puede evitar minimizando el volumen de líquido en el paso 2.5. del protocolo.
La irradiación con electrones altamente energéticos conduce a la transferencia de energía, lo que resulta en calentamiento o radiólisis. Después de la interacción con la radiación, el agua se descompone en radicales (H· y OH·),H2 y electrones solvatados. Estas especies participan en reacciones adicionales, generando así diferentes productos y causando daños a la muestra34. Por lo tanto, es muy importante mantener baja la dosis de electrones durante las observaciones (paso 3.2.), especialmente para especímenes sensibles como las células. Otros efectos causados por el haz de electrones son la precipitación de la solución (Figura 4A) y la formación de espuma del líquido (Figura 4C). Reducir la dosis de electrones ayuda a evitar estos dos efectos negativos, pero a veces no es posible eliminarlos. También puede haber alguna contaminación sensible a la radiación en la solución, que se asienta en la celda (Figura 4B) y cambia según la influencia del haz de electrones. Esto es desfavorable ya que la impureza podría tomarse como parte de la célula, que se daña con la irradiación de la luz, lo que lleva a conclusiones erróneas. La mejor manera de obtener imágenes confiables es encontrar un área no contaminada y mantener la dosis de electrones lo más baja posible.
Los estudios TEM in situ fiables de fotorreacciones requieren una buena comparación entre los procesos inducidos por la luz y los causados por el haz de electrones. Excepto para reducir la dosis de electrones descrita en el paso 3.2., es útil apagar la fuente de electrones durante el tiempo de iluminación de la luz para que se puedan observar los resultados inalterados, como se enfatiza en el paso 4.3. del protocolo.
El presente protocolo se puede utilizar para observar reacciones inducidas por la luz (especialmente en líquidos), por ejemplo, luz en nanoclusters metálicos2, procesos de catálisis inducida por luz1 y la influencia de la luz en muestras biológicas (por ejemplo, células con un fotosensibilizador, cloroplastos).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación fue apoyada por la beca Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, Centro Nacional de Ciencias, Polonia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
References
- Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
- Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
- Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
- Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
- Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
- Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
- Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
- Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
- Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
- Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
- Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
- Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
- Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
- Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
- De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
- Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
- Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
- Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
- Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
- Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
- Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
- Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
- Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
- Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
- Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
