用于组织工程应用的尺寸控制和无乳化壳聚糖 -染料木酚微凝胶的制备

Summary

本方案描述了一种基于非乳液的壳聚糖-杰尼平微凝胶的制造方法。这些微凝胶的大小可以精确控制，它们可以显示pH依赖性肿胀， 在体内降解，并加载治疗分子，这些分子会随着时间的推移而持续释放，使其与组织工程应用高度相关。

Abstract

壳聚糖微凝胶因其应用广泛，成本低廉和免疫原性而在组织工程中引起了人们的极大兴趣。然而，壳聚糖微凝胶通常使用需要有机溶剂冲洗的乳液方法制造，这些方法有毒且对环境有害。本方案提出了一种快速，无细胞毒性，非乳液的方法，用于制造壳聚糖 - 京尼平微凝胶，而无需有机溶剂冲洗。这里描述的微凝胶可以通过精确的尺寸控制来制造。它们表现出生物分子的持续释放，使其与组织工程，生物材料和再生医学高度相关。壳聚糖与京尼平交联形成水凝胶网络，然后通过注射器过滤器产生微凝胶。微凝胶可以被过滤以产生一系列尺寸，并且它们显示出pH依赖性肿胀并随着时间的推移而酶降解。这些微凝胶已被用于大鼠生长板损伤模型，并被证明可以促进软骨组织修复增加， 并在体内28天显示完全降解。由于其低成本，高便利性和易于用细胞相容性材料制造，这些壳聚糖微胶囊在组织工程中呈现出令人兴奋和独特的技术。

Introduction

生长板，也称为骨架，是位于长骨末端的软骨结构，介导儿童的生长。如果生长板受伤，可以形成称为“骨棒”的修复组织，这会中断正常生长并可能导致生长缺陷或角畸形。流行病学数据显示，所有儿童骨骼损伤中有15%-30%与生长板有关。骨条形成发生在高达30%的这些损伤中，使得生长板损伤及其相关治疗成为一个重要的临床表现问题^{1，2，3，4}。当发生骨棒形成时，最常见的治疗途径包括切除骨棒并插入介位材料，例如硅或脂肪组织⁵。然而，接受骨筋切除手术的患者通常对完全康复的预后较差，因为目前没有治疗方法可以完全修复受损的生长板^6，7，8。鉴于这些缺点，迫切需要有效的策略来治疗生长板损伤，无论是在防止骨棒的形成还是再生健康的骨骼软骨组织方面。

水凝胶微粒或微凝胶最近作为可注射支架引起了人们的兴趣，可以提供持续释放的治疗药物⁹。由于其高可调谐性和生物相容性，微凝胶也非常适合生物活性因子或细胞包封。微凝胶可以由各种材料制成，从合成聚合物（如聚乙二醇（PEG））到天然聚合物，如海藻酸盐或壳聚糖^10，11，12。壳聚糖已被证明对组织工程具有几种有益作用，例如其破坏革兰氏阴性菌外膜稳定性的能力，从而提供固有的抗菌活性^13，14。此外，壳聚糖具有成本效益，细胞相互作用，并且易于使用其含胺结构进行修饰。基于壳聚糖的微凝胶有望为药物递送和材料信号传导提供一种生物材料策略，可以促进组织再生，同时防止细菌感染。然而，壳聚糖微凝胶通常使用各种技术制造，需要特殊设备，乳液技术或细胞毒性溶剂冲洗。例如，一些研究已经用基于乳液的方法制造了壳聚糖微凝胶，但这些方案需要溶剂冲洗和细胞毒联剂，这可能会否定它们对临床环境的转化^15，16。其他研究已经使用微流体或电喷雾方法来制造壳聚糖微凝胶，这需要特殊的设备，制备和培训^17，18。壳聚糖微凝胶通常也通过交联剂滴加成壳聚糖溶液的过程制成;然而，该方法高度依赖于溶液粘度、聚合物浓度和流速，使得难以控制微凝胶^19，20的大小和分散度。相反，本文中描述的微凝胶制造方法不需要专门的设备或溶剂冲洗，使得这些微凝胶几乎可以在任何实验室或环境中进行制造。因此，这些微凝胶代表了高度相关的生物材料，可为许多应用提供快速，经济高效且易于生产的药物输送载体。

通过调节微凝胶的组成和材料特性，研究人员可以精确控制细胞微环境，从而以材料依赖性的方式指导细胞行为。微凝胶可以单独使用或与本体生物材料系统结合使用，以赋予特定的功能，例如生物活性因子的延长释放或天然或外源性细胞的精确特殊信号传导。生物材料和微凝胶已成为生长板损伤的有吸引力的治疗途径。已经投入了大量精力来开发基于海藻酸盐和壳聚糖的生物材料，以治疗生长板损伤^{21，22，23，24，25}。由于生长板骨化和骨伸长的动态时间性质，骨条形成的机制尚不完全清楚。因此，已经开发了几种动物模型来更好地阐明软骨内骨化和骨条形成的机制，例如在大鼠，兔子和绵羊中^26，27，28。一个这样的模型是大鼠生长板损伤模型，其利用大鼠胫骨中的钻孔缺陷以可预测和可重复的方式产生骨条，并在生长板^29，30的所有三个区域模拟人类损伤。已经使用该模型测试了几种基于生物材料的治疗生长板损伤的策略。此外，已经开发了两种不同的制备壳聚糖微凝胶的方法，其可用作可注射的生物材料系统，其以持续的方式释放治疗药物^10，31。这些微凝胶已被用于大鼠生理损伤模型，并且在释放SDF-1a和TGF-b3时显示软骨再生³¹ 有所改善。该协议中提供的技术描述了为制造这些壳聚糖微凝胶而开发的方法，然后可以将其用于各种组织工程应用。例如，最近的研究已经使用热或洋红色响应的壳聚糖微凝胶用于受控肿瘤药物递送应用^32，33。

Protocol

所有动物程序均由科罗拉多大学丹佛机构动物护理和使用委员会批准。6周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠用于本研究。大鼠生长板损伤模型是在先前发表的报告³⁰之后创建的。

1. 壳聚糖聚合物的制备

1. 从市售来源获得纯化和冻干的低分子量（LMW）壳聚糖（参见 材料表）。
2. 向1升烧杯中加入495 mL双蒸馏水（ddH₂O）和搅拌棒。加入5克壳聚糖（步骤1.1）并充分混合。
   注意：壳聚糖在生理pH下仅微溶于水溶液，因此壳聚糖在此步骤中不易溶解。
3. 向上述制备的壳聚糖溶液中加入5mL冰醋酸。
4. 以300rpm搅拌18小时，将烧杯置于保持在50°C的水浴中。
5. 使用 Büchner 烧瓶和漏斗，通过减小滤纸尺寸（22 μm、8 μm 和 2.7 μm）来过滤壳聚糖溶液（参见 材料表）。
6. 将过滤后的壳聚糖溶液加入纤维素透析管中（见 材料表），并在室温下以ddH₂O透析4天，每天更换ddH₂O。
   注意：最后一次更换时使用超纯 ddH₂O 水。
7. 将透析的壳聚糖溶液转移到烧杯中，并使用1M NaOH将pH调节至8.0。
8. 将壳聚糖等分到离心管中，并在室温下以4000× g 离心5分钟。
9. 将上清液倾析到废物流中，并将壳聚糖重悬于ddH₂O中，重复2倍。
10. 冷冻，然后冻干壳聚糖沉淀。
    1. 每天，取出冻干产物并记录质量。
       注意：当冻干产品的质量不再变化时，产品完全干燥，可以在-20°C下储存直至准备使用。

2. 壳聚糖水凝胶的制备

1. 将2mL 6%乙酸和120mg纯化壳聚糖（步骤1）加入10mL鲁尔锁注射器中，形成6%w / v壳聚糖溶液。
2. 使用母母鲁尔锁定连接器将鲁尔锁定注射器连接到另一个相同的注射器，并来回混合溶液30秒，或直到壳聚糖完全溶解在乙酸中。
3. 在交联之前，将任何治疗或生物活性剂添加到壳聚糖溶液中（如果需要）。对于本研究，在微凝胶中添加了200ng的SDF-1a和TGF-b3（参见 材料表）。
   注意：SDF-1a和TGF-b3是与生长板组织再生相关的生物活性剂。SDF-1a促进间充质干细胞向缺陷部位的迁移，TGF-b3作为软骨成因因子诱导这些干细胞沿着软骨系³¹分化。
   注意：在注射器之间再次混合壳聚糖以完全结合治疗。
4. 在100%乙醇中制备100mM京尼平的储备交联剂溶液（见 材料表）。
5. 将100μL制备的京尼平溶液（步骤2.4.）加入含壳聚糖的注射器中，并在注射器之间来回混合30秒。
6. 将混合物从注射器中挤出到35mm培养皿中，用石蜡膜覆盖，并在37°C下在加湿气氛中孵育过夜。
   注意：溶液将变成深蓝色，表明壳聚糖和吉尼平之间发生了交联反应，导致壳聚糖微凝胶的形成。
7. 按照以下步骤过滤制备的壳聚糖微凝胶。
   1. 用刮刀轻轻地将水凝胶破碎成更小的块。
      注意：这些碎片应足够小，可以转移到直径约1-2厘米的10 mL注射器的背面。
   2. 将所需网孔尺寸的过滤器放入干净的10 mL注射器的背面。
      注意：微凝胶的典型尺寸范围在50-200μm之间。
   3. 将破碎的凝胶片转移到装有过滤器的注射器中，并加入6 mL ddH₂O。
      注意：壳聚糖凝胶在水性介质中会显着膨胀，因此预计凝胶体积会发生很大变化。
   4. 通过鲁尔锁定连接器将注射器连接到另一个干净的 10 mL 注射器。
   5. 用过滤器将凝胶+水混合物通过注射器，以产生具有指定最大直径的微凝胶。
      1. 第一次过滤后，打开装有过滤器的注射器的背面，并将混合物挤出回该注射器中。
      2. 更换注射器的背面，再次迫使混合物通过过滤器。
      3. 重复过滤5-6次或直到通过过滤器的阻力很小。
8. 冲洗并纯化过滤后的微凝胶。
   1. 将过滤后的凝胶混合物转移到50 mL锥形管中，使总体积达到20 mL，ddH₂O，然后涡旋混合物以确保均匀分散。
   2. 在室温下以100× g 离心微凝胶5分钟，并倾析上部水相。
   3. 将微凝胶重悬于10mL 70%乙醇中，涡旋，并在紫外线下放置1小时以灭菌。
   4. 在室温下以1，000× g 离心微凝胶5分钟，弃去乙醇，并用ddH₂O冲洗3倍。

3. 用于 体外 或 体内 应用的微凝胶制备

注意：对于本研究，在大鼠模型中研究了生长板损伤中的软骨再生。有关详细信息，请参阅参考文献³¹。

1. 将微凝胶沉淀以1：1重悬于ddH₂O.微凝胶可以在4°C下在ddH₂O中储存长达1个月。 如果使用生物活性剂，必须立即使用微凝胶。
2. 按照先前发布的报告在动物中创建损伤部位³⁰。
3. 用盐水冲洗损伤部位，使动物未经治疗（用于对照研究）或仅注射壳聚糖微凝胶或装载有生物活性剂的微胶囊（步骤3.2）。
4. 关闭动物的伤口并施用术后镇痛药³⁰。
5. 在手术后第7天或第28天，通过CO₂ 过量对大鼠实施安乐死，切除四肢并进行组织学检查以评估损伤部位³¹的组织修复。

Representative Results

壳聚糖微凝胶的成功制造依赖于吉尼平和壳聚糖之间的交联反应，特别是涉及壳聚糖聚合物链上的胺。与其他微凝胶制造技术相比，该方法不需要乳液或溶剂冲洗，并且可以使用廉价的设备快速轻松地进行。成功制备微凝胶的一个标志性指标是在壳聚糖和吉尼平混合后从灰白色到深蓝色的明显颜色变化。京尼平与含胺化合物，如壳聚糖或其它蛋白质之间的交联反应，在文献³⁴中得到了很好的表征。简而言之，交联机理被认为是壳聚糖氨基的亲核攻击，其中京尼平作为具有稳定缩合产物³⁵的二醛。稳定的缩合染料木酚素的短链充当壳聚糖聚合物之间的交联桥。交联反应导致溶液变成深蓝色，可能是由于氧自由基诱导中间化合物的聚合和脱氢，其遵循来自亲核攻击³⁶的开环反应。

一旦微凝胶被过滤并在1：1的水稀释中重悬，它们就可以很容易地用于各种生物材料应用中。最近发表的工作是使用这些无乳液壳聚糖微胶囊来促进生长板损伤中的软骨再生。微凝胶按本文所述制备，并保持空或装载SDF-1a和TGF-b3，它们是与生长板组织再生相关的生物活性剂，SDF-1a促进间充质干细胞向缺陷部位的迁移，TGF-b3作为软骨成因因子诱导这些干细胞在软骨系³⁷中的分化^，38.通过ELISA在体外量化蛋白质的释放速率，并且这些分子的释放持续³¹。然后，将微凝胶注射到体内损伤的大鼠模型中的生长板中，并且注射的微凝胶阻止了体内早期骨条³¹的形成。这些可注射、经济高效且易于生产的壳聚糖微胶囊可以很容易地用于许多生物材料应用中。

尽管这种微凝胶制造工艺已针对简单的设置和应用进行了优化，但研究人员仍应注意的几个问题。聚合物和交联组分的混合不足是制造过程中不同结果的最可能原因。固体壳聚糖必须在注射器之间剧烈混合，并且在加入京尼平交联剂之前，所得壳聚糖溶液必须完全均匀。如果溶液不均匀，则残留在溶液中的固体壳聚糖块将形成结块，并且会发生不均匀的交联，从而阻止有效过滤并导致直径显着变化的聚分散微凝胶。在制造过程中要考虑的另一个重要因素是避免交联期间的蒸发，这必须通过石蜡膜或其他蒸发捕获技术来防止。如果壳聚糖水凝胶变干，在水冲洗过程中不会膨胀，也不会通过注射器过滤。最后，在过滤过程中，微凝胶必须悬浮在过量的水中，并在不使用时以4°C储存在水中。微凝胶不可挤出或注射，除非悬浮在至少1：1稀释的水中。

图1 显示了微凝胶制造过程的广泛概述。 图2再次描述了相同的过程，其中显示了该过程的照片，强调了仅从文本中难以理解的协议阶段。例如， 图2D 显示了如何将金属丝网过滤器插入10 mL注射器中。一旦完全固定在注射器的顶部，这种金属丝网过滤器就可以快速方便地过滤壳聚糖微凝胶，而无需专业设备或溶剂。类似地， 图2E 显示了水合壳聚糖凝胶通过网状过滤器的流动，这是微凝胶制造的基础。 图3 改编自我们之前关于这些微凝胶的出版物，并显示了它们的pH依赖性溶胀行为以及取决于网状过滤器孔径的微凝胶尺寸的差异。可以从制造商处订购不同的网孔尺寸，这样可以方便地控制微凝胶的尺寸。在设计具有明确定义的治疗负荷释放速率的药物递送系统时，这种对微凝胶尺寸的精确控制非常重要。以前对微凝胶的研究还表明，它们在2-4周³¹时在溶菌酶存在下显着降解。最后， 图4 显示了用装载有SDF-1a和TGF-b3的壳聚糖微凝胶治疗的大鼠生长板损伤模型中的组织学图像³¹ 。

图1：壳聚糖微凝胶制备的示意图。 该图是使用 biorender.com 创建的。 请点击此处查看此图的大图。

图2：微凝胶制造过程的照片， （A）使用鲁尔锁连接的注射器中的壳聚糖溶液。（B）将壳聚糖凝胶挤出到35mm培养皿中。（C）复联后壳聚糖凝胶从灰白色变为深蓝色。（D）注射器内部的自上而下视图，显示安装在注射器喷嘴上的金属丝网筛。（五）将壳聚糖凝胶通过网状过滤器压榨，生成微凝胶。（F）将微凝胶储存在锥形管中ddH₂O的1：1稀释液中。 请点击此处查看此图的大图。

图3：微凝胶的pH依赖性溶胀行为（A）Feret直径的正态分布图显示了微凝胶响应于pH值变化的溶胀行为。（B）使用200目（上图：<75μm大小的微凝胶）和100目（下图：75-150μm大小的微凝胶）制造的微凝胶的荧光图像。该图经参考文献³¹许可转载。请点击此处查看此图的大图。

图4：用装载SDF-1a和TGF-b3的壳聚糖微胶囊处理的大鼠生长板损伤模型中 的组织学图像.10x组织学图像显示完整（A）和（E），未处理的（B）和（F），微凝胶处理的（C）和（G），微凝胶+ SDF-1a处理的（D）和（H），以及微凝胶+ TGF-b3处理的（I） 四肢。没有第7天动物用微凝胶+ TGFb3处理。Alcian蓝色苏木精（ABH）将骨染成橙色至红色，纤维组织粉红色，软骨蓝色。微凝胶表现为深红色纤维状组织。比例尺 = 500 μm。该图经参考文献³¹许可转载。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

近年来，微凝胶因其对各种用途的高度适用性（例如药物递送或细胞包封^）而得到了广泛的研究 9.微尺度生物材料构建体的易于制造在组织工程中具有重要意义，因为它允许研究人员在特定尺寸和时间尺度上开发基于水凝胶的策略。然而，大多数制造壳聚糖微凝胶的方法需要昂贵的设备和试剂，乳液或细胞毒性溶剂冲洗，这阻止了它们转化为临床用途^{15，16，17，18，19，20}。这些微凝胶在制造方面表现出色，无需乳化技术或溶剂冲洗。此外，这些微凝胶保留了组织工程结构的理想特性，例如pH依赖性肿胀和药物负荷，调谐的降解行为以及治疗药物的持续释放。

制造这些壳聚糖微凝胶的最关键步骤是注射器之间的过滤。这些微凝胶从散装水凝胶开始，并使用金属丝网过滤器过滤到特定尺寸范围。如果不进行过滤，微凝胶的适用性，机械性能和药物释放特性将显着不同。过滤步骤允许精确控制水凝胶的大小，并且还允许高通量制造表现出pH依赖性肿胀和持续释放治疗药物的微凝胶。

该过程的局限性在于过滤步骤没有导致具有完美球形的水凝胶，这可能是某些应用需要考虑的重要因素。为此，使用Feret直径（图3）描述了微凝胶的特征尺寸，其可用于量化不规则形状的颗粒³⁹。虽然微凝胶的几何形状不是一个完美的球体，但根据注射器过滤器的网格尺寸，颗粒的平均尺寸很容易控制，并且对于许多应用，不需要具有完全球形的颗粒。使用从大量颗粒（n = 74）获得的费雷特直径标准差与平均费雷特直径的平方比来量化微凝胶的多分散性指数（PDI）。PDI使用等式计算为0.076

PDI = （s/D）²

其中 s 是平均费雷特直径的标准差，D 是平均费雷特直径⁴⁰。由于在此过程中进行的过滤以及将Feret直径用于不规则形状的颗粒，这些颗粒的多分散指数相当低，以至于它们可以被认为是单分散的。

对于未来的研究，可以对该协议进行一些修改，以更好地适应给定的研究需求。例如，只有两种蛋白质SDF1-a和TGF-b3被研究用于这些微凝胶的对照释放。先前的工作表明，这些生物活性因子 在体外 持续释放长达约30天。然而，也可以探索其他相关疗法，例如纳米颗粒，RNA干扰（RNAi）分子，其他生物制剂或小分子药物，以量化其释放速率和功效，当应用这种壳聚糖微凝胶技术时。未来可以研究的另一个变量是改变微凝胶的尺寸范围，这只需通过改变注射器过滤器的网孔尺寸即可完成。这也可能对微凝胶中治疗药物的释放速率产生重大影响，从而可以在不改变交联化学性质的情况下方便地控制释放动力学。此外，该协议可以使用较大的注射器和过滤器或真空过滤技术轻松放大，以生产大量的壳聚糖微凝胶。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh