Fabricage van maatgecontroleerde en emulsievrije Chitosan-Genipin-microgels voor tissue engineering-toepassingen

Summary

Het huidige protocol beschrijft een niet-emulsie-gebaseerde methode voor de fabricage van chitosan-genipin microgels. De grootte van deze microgels kan nauwkeurig worden gecontroleerd en ze kunnen pH-afhankelijke zwelling vertonen, in vivo afbreken en worden geladen met therapeutische moleculen die in de loop van de tijd op een duurzame manier vrijkomen, waardoor ze zeer relevant zijn voor tissue engineering-toepassingen.

Abstract

Chitosan microgels zijn van groot belang in tissue engineering vanwege hun brede scala aan toepassingen, lage kosten en immunogeniciteit. Chitosan-microgels worden echter vaak vervaardigd met behulp van emulsiemethoden die organische oplosmiddelspoelingen vereisen, die giftig en schadelijk zijn voor het milieu. Het huidige protocol presenteert een snelle, niet-cytotoxische, niet-emulsie-gebaseerde methode voor het vervaardigen van chitosan-genipin microgels zonder de noodzaak van organische oplosmiddelspoelingen. De hierin beschreven microgels kunnen worden vervaardigd met nauwkeurige maatcontrole. Ze vertonen aanhoudende afgifte van biomoleculen, waardoor ze zeer relevant zijn voor weefseltechnologie, biomaterialen en regeneratieve geneeskunde. Chitosan is gekruist met genipin om een hydrogelnetwerk te vormen en vervolgens door een spuitfilter te gaan om de microgels te produceren. De microgels kunnen worden gefilterd om een reeks maten te creëren en ze vertonen pH-afhankelijke zwelling en degraderen in de loop van de tijd enzymatisch. Deze microgels zijn gebruikt in een rattengroeiplaatletselmodel en er werd aangetoond dat ze een verhoogd kraakbeenweefselherstel bevorderen en volledige afbraak vertonen na 28 dagen in vivo. Vanwege hun lage kosten, hoge gemak en gemak van fabricage met cytocompatibele materialen, presenteren deze chitosan microgels een opwindende en unieke technologie in tissue engineering.

Introduction

De groeischijf, ook bekend als de physis, is de kraakbeenstructuur aan het einde van lange botten die de groei bij kinderen bemiddelt. Als de groeischijf gewond raakt, kan zich herstelweefsel vormen dat bekend staat als een “benige staaf”, die de normale groei onderbreekt en groeiafwijkingen of hoekige misvormingen kan veroorzaken. Epidemiologische gegevens hebben aangetoond dat 15% -30% van alle skeletletsels bij kinderen gerelateerd zijn aan de groeischijf. Benige staafvorming komt voor bij maximaal 30% van deze verwondingen, waardoor groeischijfletsels en de bijbehorende behandeling een significant klinisch manifestatieprobleem^zijn 1,2,3,4. Wanneer benige staafvorming optreedt, is de meest voorkomende behandelingsweg het resectie van de benige staaf en het inbrengen van een interpositief materiaal, zoals silicium of vetweefsel⁵. Patiënten die een benige staafresectieoperatie ondergaan, hebben echter vaak een slechte prognose voor volledig herstel, omdat er momenteel geen behandeling is die een gewonde groeischijf volledig kan herstellen ^6,7,8. In het licht van deze tekortkomingen is er een kritieke behoefte aan effectieve strategieën voor de behandeling van groeischijfletsels, zowel bij het voorkomen van de vorming van een benige staaf als bij het regenereren van gezond feyseaal kraakbeenweefsel.

Hydrogel microdeeltjes, of microgels, hebben onlangs belangstelling gekregen als injecteerbare steigers die langdurige afgifte van therapeutica kunnen bieden⁹. Vanwege hun hoge tonijnbaarheid en biocompatibiliteit zijn microgels ook zeer geschikt voor bioactieve factor of celinkapseling. Microgels kunnen worden gemaakt van verschillende materialen, variërend van synthetische polymeren, zoals polyethyleenglycol (PEG), tot natuurlijke polymeren zoals alginaat of chitosan 10,11,12. Van Chitosan is aangetoond dat het verschillende gunstige effecten heeft voor tissue engineering, zoals het vermogen om het buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën te destabiliseren, waardoor inherente antimicrobiële activiteit^{wordt geboden 1 3,14}. Bovendien is chitosan kosteneffectief, cel-interactief en gemakkelijk te wijzigen met behulp van de amine-bevattende structuur. Op Chitosan gebaseerde microgels beloven een biomateriaalstrategie voor medicijnafgifte en materiaalsignalering die weefselregeneratie kan bevorderen en tegelijkertijd bacteriële infecties kan voorkomen. Chitosan-microgels worden echter vaak vervaardigd met een breed scala aan technieken die speciale apparatuur, emulsietechnieken of cytotoxische oplosmiddelspoelingen vereisen. Sommige studies hebben bijvoorbeeld chitosan-microgels gefabriceerd met op emulsie gebaseerde methoden, maar deze protocollen vereisen oplosmiddelspoelingen en cytotoxische crosslinkers, waardoor hun vertaling naar klinische instellingen mogelijk teniet wordt^{gedaan 15,16}. Andere studies hebben microfluïdica of elektrospraybenaderingen gebruikt om chitosan-microgels te fabriceren, waarvoor speciale apparatuur, voorbereiding en training vereist^{is 17,18}. Chitosan microgels worden ook vaak gemaakt met een druppelsgewijs proces van crosslinker in chitosan-oplossing; deze methode is echter sterk afhankelijk van de viscositeit van de oplossing, de polymeerconcentratie en de stroomsnelheid, waardoor het moeilijk is om de grootte en dispersie van de microgels^{te regelen 19,20}. Omgekeerd vereist de hierin beschreven methode voor de fabricage van microgels geen gespecialiseerde apparatuur of oplosmiddelspoelingen, waardoor deze microgels levensvatbaar zijn voor fabricage in bijna elk laboratorium of elke omgeving. Daarom vertegenwoordigen deze microgels zeer relevante biomaterialen voor een snel, kosteneffectief en gemakkelijk te produceren medicijnafgiftevoertuig voor vele toepassingen.

Door de samenstelling en materiaaleigenschappen van een microgel te moduleren, kunnen onderzoekers nauwkeurige controle krijgen over de cellulaire micro-omgeving, waardoor het celgedrag op een materiaalafhankelijke manier wordt gestuurd. Microgels kunnen op zichzelf worden gebruikt of worden gecombineerd met bulkbiomateriaalsystemen om specifieke functionaliteiten te geven, zoals de verlengde afgifte van bioactieve factoren of nauwkeurige speciale signalering voor inheemse of exogene cellen. Biomaterialen en microgels zijn naar voren gekomen als aantrekkelijke behandelingsmogelijkheden voor groeischijfletsels. Aanzienlijke inspanningen zijn gewijd aan de ontwikkeling van op alginaat en chitosan gebaseerde biomaterialen om groeischijfletsels te behandelen 21,22,23,24,25. Vanwege de dynamische temporele aard van groeischijfverbeening en botverlenging, is het mechanisme van benige staafvorming niet volledig begrepen. Daarom zijn verschillende diermodellen ontwikkeld om de mechanismen van endochondrale ossificatie en benige staafvorming, zoals bij ratten, konijnen en schapen, beter te verduidelijken 26,27,28. Een dergelijk model is een rattengroeischijfletselmodel, dat een boorgatdefect in het tibia van de rat gebruikt om op een voorspelbare en reproduceerbare manier een benige staaf te produceren en menselijke verwondingen nabootst in alle drie de zones van de groeischijf^29,30. Verschillende op biomaterialen gebaseerde strategieën voor de behandeling van groeischijfletsels zijn getest met behulp van dit model. Daarnaast zijn er twee verschillende methoden ontwikkeld voor het fabriceren van chitosan microgels, die kunnen worden gebruikt als een injecteerbaar biomateriaalsysteem dat therapeutica op een duurzame manier vrijgeeft^10,31. Deze microgels zijn gebruikt in een feyseaal letselmodel van ratten en ze vertoonden verbeterde kraakbeenregeneratie³¹ bij het vrijgeven van SDF-1a en TGF-b3. De technieken in dit protocol beschrijven methoden die zijn ontwikkeld om deze chitosan-microgels te fabriceren, die vervolgens kunnen worden gebruikt in een breed scala aan tissue engineering-toepassingen. Recente studies hebben bijvoorbeeld thermo- of magento-responsieve chitosan-microgels gebruikt voor gecontroleerde oncologische medicijnafgiftetoepassingen^32,33.

Protocol

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee. 6 weken oude mannelijke Sprague-Dawley ratten werden gebruikt voor de huidige studie. Het model voor kankerletsel op de groeischijf van ratten is gemaakt naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport30. 1. Bereiding van het chitosanpolymeer Verkrijg gezuiverde en gelyofiliseerde laagmoleculaire gewicht (LMW) chitosan …

Representative Results

Succesvolle fabricage van chitosan microgels is afhankelijk van de crosslinking reactie tussen genipin en chitosan, met name met betrekking tot de amines op de chitosan polymeerketens. In tegenstelling tot andere microgelfabricagetechnieken vereist deze methode geen emulsies of oplosmiddelspoelingen en kan deze snel en gemakkelijk worden uitgevoerd met goedkope apparatuur. Een kenmerkende indicator voor succesvolle microgelfabricage is de duidelijke kleurverandering van gebroken wit naar donkerblauw nadat de chitosan en …

Discussion

Microgels zijn de afgelopen jaren op grote schaal onderzocht vanwege hun hoge mate van toepasbaarheid voor verschillende doeleinden, zoals medicijnafgifte of celinkapseling⁹. Het gemak van de productie van biomateriaalconstructies op microschaal is van groot belang in tissue engineering, omdat het onderzoekers in staat stelt om op hydrogel gebaseerde strategieën te ontwikkelen op een specifieke grootte en tijdschaal. De meeste methoden voor het vervaardigen van chitosan-microgels vereisen echter …

Materials

Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh